專利名稱：一種兒茶素的葡萄糖甙化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種兒茶素的葡萄糖甙化合物及其制備的方法和用途。
粘委陵菜(Potentilla viscosa J.Den.)屬薔薇科，是一種野生草本植物，大量生長于我國東北地區(qū)，主要生長區(qū)是吉林省白城和延邊地區(qū)，多年來都是作為一種草藥被民間用來治療肝炎，且臨床證明有一定的療效。但是有關(guān)粘委陵菜的藥理及有效成分的研究至今未見報(bào)道。粘委陵菜作為一種極具藥用價(jià)值的野生資源，其綜合利用尤其是在深加工方面的研究和開發(fā)一直是空白，作為一個(gè)中醫(yī)藥大國不能說不是一個(gè)遺憾。
本發(fā)明人從對粘委陵菜的抗肝損傷作用的藥理研究入手，對其中的有效活性成分進(jìn)行研究探索，分離出了一種兒茶素的葡萄糖甙化合物，并通過藥效學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該化合物具有明顯抗肝損傷作用。
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有抗肝損傷的化合物。本發(fā)明的另一目的是提供以粘委陵菜為原料制備該化合物的方法。本發(fā)明的再一目的是提出該化合物在治療肝病方面的用途。
本發(fā)明提供的化合物是一種兒茶素的葡萄糖甙化合物，具有如下結(jié)構(gòu)
該化合物的化學(xué)名稱為右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙。
本發(fā)明提供的化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙是從薔薇科植物粘委陵菜(Potentilla viscosaJ.Den.)中分離得到。
本發(fā)明中的化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙的分離制備通過以下過程實(shí)現(xiàn)(1)、將原料粘委陵菜粉碎加入60～80％的丙酮溶液室溫浸提2～3次，每次浸提時(shí)間12～36小時(shí)，丙酮溶液的用量為原料量的3～8倍，各次的浸提液過濾后合并，回收丙酮并控制于50℃以下進(jìn)行減壓濃縮；(2)、過濾濃縮液，濾液進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，先用水洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇水溶液梯度洗脫，收集10→60％的甲醇溶液的洗脫液，減壓濃縮干燥；
(3)、干燥產(chǎn)物用少量70％乙醇溶液溶解后再次進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用70％乙醇溶液洗脫，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，進(jìn)行減壓濃縮干燥；(4)、干燥產(chǎn)物溶于少量水中，進(jìn)入MCl-gel色譜柱，用水→50％甲醇溶液梯度洗脫，收集合并5～50％的甲醇溶液洗脫液，減壓濃縮干燥；(5)、干燥產(chǎn)物用少量95％乙醇溶液溶解后進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用95％乙醇洗脫，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，合并進(jìn)行減壓濃縮干燥；(6)、濃縮產(chǎn)物溶于少量水，進(jìn)入MCI-gel色譜柱，用水→50％甲醇溶液梯度洗脫，反復(fù)過柱、洗脫2～3次，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，合并進(jìn)行減壓濃縮干燥；(7)、干燥產(chǎn)物用少量95％乙醇溶液溶解后進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用95％乙醇洗脫，分段接收洗脫液，并進(jìn)行薄層色譜檢測，收集有同一斑點(diǎn)的對應(yīng)洗脫液，進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶。
經(jīng)以上過程得到的產(chǎn)品是無色針狀晶體，通過薄層色譜鑒定，結(jié)構(gòu)如(Ⅰ)式所示。
本發(fā)明中多次用到色譜柱(Sephadex LH-20分子篩色譜柱和MCI-gel色譜柱)，柱的規(guī)格依加樣量而定，一般條件下，色譜柱的高度與直徑之比約為10～20∶1，加樣量約為分子篩量的1/50。
本發(fā)明的產(chǎn)品是鞣質(zhì)化合物，分離過程中需隨時(shí)檢測中間產(chǎn)物是否含有鞣質(zhì)成分，棄去非鞣質(zhì)成分，檢測方法可以是常規(guī)的或任意可行的方法。較好的方法是采用硅膠G薄層色譜板，苯-甲酸乙酯-甲酸作展開劑，比例為1～2∶7∶1，展開、取出、晾干，用1％三氯化鐵甲醇溶液作顯色劑，顯暗綠色斑點(diǎn)者即為鞣質(zhì)成分。
鞣質(zhì)化合物遇高溫及易聚合，所以分離過程中，對每次過柱后的洗脫液進(jìn)行回收溶劑及濃縮干燥的溫度均以不超過50℃為好，所以均采用減壓操作，回收溶劑過程中，可滴加正丁醇防止暴沸。溶解遇到困難時(shí)可采用超聲處理方法。重結(jié)晶的目的是進(jìn)一步純化產(chǎn)品，如產(chǎn)品較純，可省卻此步驟。


圖1所示為本發(fā)明方法的流程示意圖。
本發(fā)明還涉及該化合物的醫(yī)藥用途，即通過藥效實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有明顯的抗肝損傷作用，可以用來制備治療肝炎的藥物。
通過對動物小鼠各種肝損傷情況下的藥效實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙對小鼠四氯化碳(CCl4)和硫代乙酰胺(TAA)引起的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)升高和肝糖元的降低有抑制作用；對四氯化碳(CCl4)和硫代乙酰胺(TAA)中毒小鼠肝組織SOD活性的降低及丙二醛(MDA)含量升高有明顯的抑制作用；可明顯增加四氯化碳(CCl4)和硫代乙酰胺(TAA)中毒小鼠肝細(xì)胞色素P-450含量；可明顯降低酒精中毒小鼠肝組織丙二醛(MDA)含量；可明顯縮短小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和增加肝微粒體細(xì)胞色素P-450含量；對乙硫氨酸所致小鼠肝臟甘油三酯升高有明顯降低作用；該化合物還可促進(jìn)正?；蛩穆然?CCl4)中毒小鼠肝臟排泄溴磺肽鈉(BSP)功能；促進(jìn)小鼠膽汁分泌。
該化合物的有效劑量為100～200mg/kg體重。有關(guān)藥效實(shí)驗(yàn)的方法和結(jié)果將在實(shí)施例中詳細(xì)展示。
綜合以上結(jié)論可以看出，化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙確有明顯的抗肝損傷作用，其作用機(jī)制是通過以下幾方面(1)抗脂質(zhì)過氧化作用；(2)維持核酸、蛋白質(zhì)和糖元代謝正常化；(3)增強(qiáng)肝臟解毒和排泄功能；(4)促進(jìn)肝臟分泌功能。
此外，本發(fā)明人在研究過程中還發(fā)現(xiàn)化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙同時(shí)具有明顯的抗感冒病毒的作用。
本發(fā)明提供的化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙是從天然植物中分離制備，且在保肝、降酶、利膽、退黃方面作用顯著，所以該化合物有很好的藥用價(jià)值，特別是用來制備治療肝炎的新型藥物，將有很好的前景。
總之，本發(fā)明首次從粘委陵菜中發(fā)現(xiàn)并分離出來一種具有獨(dú)特的保肝、降酶、利膽、退黃功效的生物活性成分--右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙，填補(bǔ)了有關(guān)粘委陵菜活性成分研究的空白，可以帶動和促進(jìn)對粘委陵菜的藥用價(jià)值的更深一步研究，這一野生資源的綜合開發(fā)利用將會產(chǎn)生較大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。而右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙用于抗肝炎的醫(yī)藥用途的研究，也為制備一種治療肝炎的新藥提供了可能。
制備實(shí)施例1取自然干燥，并經(jīng)粉碎的粘委陵菜根7.46kg，加60％丙酮溶液于室溫下浸提3次，3次所用的丙酮溶液分別為25800ml、22500ml、22500ml，浸提時(shí)間分別為36小時(shí)、18小時(shí)、12小時(shí)，3次的浸提液分別過濾后合并，于40℃下回收丙酮并濃縮浸提液，過濾掉雜質(zhì)，取濾液于SephadexLH-20色譜柱頂端(柱高約2米，直徑約20厘米)，先用約4000ml水洗去雜質(zhì)，再依次用10→100％、梯度為10％甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度的甲醇用量為2000ml，收集10～60％的甲醇洗脫液，40℃下減壓濃縮干燥；干燥產(chǎn)物加少量70％乙醇溶液于超聲儀上振蕩溶解后，加入Sephadex LH-20色譜柱頂端，以70％乙醇分段洗脫，洗脫液以硅膠G薄層板檢查，用比例為1∶7∶1的苯-甲酸乙酯-甲酸為展開劑，對每段的洗脫液展開、取出、晾干，噴以1％三氯化鐵甲醇溶液，薄層板上顯出若干暗綠色斑點(diǎn)，合并Rf值大于0.50的洗脫液部分，40℃下減壓濃縮干燥；干燥產(chǎn)物溶于少量水中加于MCI-gel色譜柱頂端(柱高約1米，直徑7厘米)，依次加入0→40％，梯度為5％的甲醇水溶液各300ml洗脫，合并5～40％甲醇水溶液的洗脫液，40℃下減壓濃縮干燥；產(chǎn)物溶于少量95％乙醇，加于Sephadex LH-20色譜柱頂端，用95％乙醇洗脫，同法收集含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，40℃下減壓回收乙醇并濃縮干燥；干燥產(chǎn)物溶于少量水中，進(jìn)入MCI-gel色譜柱，用水→甲醇溶液梯度洗脫，如此反復(fù)三次，收集含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，40℃下減壓濃縮干燥；產(chǎn)物溶于少量95％乙醇，加于Sephadex LH-20色譜柱頂端，用95％乙醇洗脫，同法用硅膠G薄層板檢測、合并具有同一斑點(diǎn)的洗脫液，40℃下減壓濃縮，放置數(shù)日，析出無色結(jié)晶。稱重4.77克。測定mp 227-228℃,[α]18D-13.3℃[Me2CO-H2O(1∶1)；c10]。
圖2給出該產(chǎn)品的氫譜核磁共振圖1HNMR(Me2CO-d6+D2O):δ2.73(2H,d-like,J=5Hz,H=4),4.32(1H.d.J=7Hz.glc.H-1),4.92(1H,d,J=6Hz,H-2),5.89(1H,d,J=2Hz,H-6),6.00(1H,d,J=2Hz,H8),6.64(1H,dd,J=2.8Hz,H-6｀),6.76(1H,d,J=8Hz,H-5｀),6.84(1H,d,J=2Hz,H-2｀).
該結(jié)晶產(chǎn)物為具有式(I)結(jié)構(gòu)的右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙。
制備實(shí)施例2粘委陵菜根3kg，加60％丙酮溶液于室溫下浸提3次，3次所用的丙酮溶液分別為9000ml、9000ml、9000ml，浸提時(shí)間分別為24小時(shí)、24小時(shí)、40小時(shí)，3次的浸提液分別過濾后合并，于40℃下回收丙酮并濃縮浸提液，過濾掉雜質(zhì)，取濾液于Sephadex LH-20色譜柱頂端，先用約2000ml水洗去雜質(zhì)，再依次用20→70％、梯度為10％甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度的甲醇用量為800ml，收集30～60％的甲醇洗脫液，40℃下減壓濃縮干燥；以下同實(shí)施例1，得到的結(jié)晶為淡黃色，將結(jié)晶溶于熱水進(jìn)行重結(jié)晶，即得純品約2.5克。
制備實(shí)施例3取鮮粘委陵菜根2.5kg，趁鮮切成薄片，加80％丙酮溶液于室溫下浸提3次，3次所用的丙酮溶液分別為15000ml、12000ml、12000ml，浸提時(shí)間分別為36小時(shí)、24小時(shí)、24小時(shí)，其他同實(shí)施例1。得到產(chǎn)品2.46克。
試驗(yàn)實(shí)施例用右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙(CGS)進(jìn)行動物小鼠的藥效試驗(yàn)，驗(yàn)證該化合物在抗肝損傷方面的作用。該化合物在試驗(yàn)前以生理鹽水配成所需濃度。
試驗(yàn)一、小鼠分成二批，每批分成4組，每組10只，雌雄各半，3天內(nèi)每天分別按200mg/kg和100mg/kg的劑量對3、4組小鼠皮下注射給藥一次，1、2組注射同體積生理鹽水。末次給藥1小時(shí)后，1組小鼠按10ml/kg腹腔注射豆油，對第一批小鼠，2～4組均按10ml/kg腹腔注射0.1％四氯化碳(CCl4)豆油溶液；對第二批小鼠，2～4組均按50ml/kg腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)。禁食16小時(shí)后，斷頸處死動物，取血和肝組織，進(jìn)行下列指標(biāo)測定1、測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)和肝組織的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白質(zhì)、脂肪和糖元含量，結(jié)果見表1。
2、測定肝組織的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，結(jié)果見表2。
3、測定肝微粒體部分細(xì)胞色素P-450含量，結(jié)果見表3。
試驗(yàn)二、小鼠分成4組，每組10只，雌雄各半，于3天內(nèi)每天分別按200mg/kg和100mg/kg的劑量對3、4組小鼠皮下注射給藥一次，1、2組注射同體積生理鹽水。末次給藥后禁食8小時(shí)，1組按15ml/kg灌胃生理鹽水，2～4組均按15ml/kg灌胃50％乙醇，禁食12小時(shí)后，斷頸處死動物，取肝組織，測定丙二醛(MDA)和甘油三酯含量，結(jié)果見表4。
試驗(yàn)三、小鼠分成3組，每組10只，雌雄各半，24小時(shí)內(nèi)分別按200mg/kg和100mg/kg的劑量對2、3組小鼠皮下注射給藥二次(每隔12小時(shí)注射一次)，1組注射同體積生理鹽水。末次給藥1小時(shí)后，全部小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)，常溫下記錄每只小鼠翻正反射消失至恢復(fù)的時(shí)間間隔(即睡眠時(shí)間)，并于小鼠醒后2小時(shí)斷頸處死，取肝組織，測定肝微粒體部分細(xì)胞色素P-450含量，結(jié)果見表5。
試驗(yàn)四、小鼠分成4組，每組10只，雌雄各半，于3天內(nèi)每天分別按200mg/kg和100mg/kg的劑量對3、4組小鼠皮下注射給藥一次，1、2組注射生理鹽水10ml/kg。末次給藥6小時(shí)后，1組按10ml/kg灌胃生理鹽水，2～4組均按250ml/kg灌胃乙硫氨酸，24小時(shí)后，斷頸處死動物，取肝組織，測定甘油三酯含量，結(jié)果見表6。
試驗(yàn)五、小鼠分成二批，第一批分為2組，每組10只，雌雄各半，1組注射生理鹽水10ml/kg，2組按200mg/kg皮下注射給藥，3天內(nèi)每天注射一次，末次給藥后禁食16小時(shí)，給全部小鼠尾靜脈注射溴磺肽鈉(BSP)100mg/kg,15分鐘后斷頸處死動物，取血分離血清，測BSP滯留量，結(jié)果如表7上半欄所示。
第二批小鼠分為3組，每組10只，雌雄各半，第3組于3天內(nèi)每天按200mg/kg皮下注射給藥一次，另外2組注射同體積生理鹽水。末次給藥后1小時(shí)，2、3組按10ml/kg腹腔注射0.1％CCl4豆油溶液，1組注射同體積豆油溶液，禁食16小時(shí)后，給全部小鼠尾靜脈注射溴磺肽鈉(BSP)100mg/kg,15分鐘后斷頸處死動物，取血分離血清，測BSP滯留量，結(jié)果如表7下半欄所示。
試驗(yàn)六、小鼠分成3組，每組10只，雌雄各半，于3天內(nèi)每天分別按200mg/kg和100mg/kg的劑量對2、3組小鼠皮下注射給藥一次，1組注射同體積生理鹽水。末次給藥24小時(shí)后，將小鼠用乙醚麻醉，自劍突下打開腹腔，結(jié)扎輸膽管縫合腹壁，立即對2、3組再給藥一次，2小時(shí)后，拉斷頸椎處死動物，摘取膽囊，吸干后稱重，剪破膽囊令膽汁流盡，用濾紙吸干膽囊后稱重，以兩次之差作為膽汁分泌量，結(jié)果如表8所示。
表1X±SD
>表2 X±SD
表3X±SD
表4X±SD
表5X±SD
表6X±SD
表7X±SD
表8X±SD
注1、以上各表中，X±SD平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)差ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01；ΔΔΔP＜0.001與對照組比較；·P＜0.5；¨P＜0.01；…P＜0.001與各自第2組比較；2、以上試驗(yàn)中各指標(biāo)的測定方法是SGPT按改良King氏法；肝組織DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂肪等成分分離按Rowland法；DNA、RNA和蛋白質(zhì)含量分別按Burton、Schjeide和Lowry法測定；肝組織MDA含量按TAB法測定；SOD的分離和測定按Geller法測定；肝線粒體細(xì)胞色素P-450含量按Mitoma法測定。
以上藥效試驗(yàn)可以證明，右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙(CGS)對CCl4和TAA引起小鼠SGPT升高具有明顯抑制作用，并能增強(qiáng)肝組織中SOD活性，對CCl4、TAA和酒精中毒小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物--丙二醛(MDA)含量具有明顯降低作用；右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙(CGS)不但能增加CCl4和TAA中毒小鼠肝糖元含量，而且可明顯抑制CCl4中毒小鼠肝臟RNA和蛋白質(zhì)合成的紊亂，對乙硫氨酸所致小鼠肝臟甘油三酯升高也具有抑制作用，表明右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙對肝損傷小鼠肝臟組織代謝具有抑制和正常化作用；此外，右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙可明顯縮短小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和增加肝微粒體細(xì)胞色素P-450含量，表明該化合物對肝微粒體“藥酶，，有誘導(dǎo)作用，從而增強(qiáng)肝臟的解毒功能；右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙還可明顯促進(jìn)小鼠肝臟排泄功能和膽汁分泌功能。
權(quán)利要求
1.一種兒茶素的葡萄糖甙化合物，特征是該化合物是具有如下結(jié)構(gòu)的右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙。
2.一種具有權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)的化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙的制備方法，特征是該化合物從粘委陵菜(Potentilla viscosaJ.Den.)中分離出來。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物的制備方法，特征是通過以下過程實(shí)現(xiàn)(1)、將原料粘委陵菜粉碎加入60～80％的丙酮溶液室溫浸提2～3次，每次浸提時(shí)間12～36小時(shí)，丙酮溶液的用量為原料量的3～8倍，各次的浸提液過濾后合并，回收丙酮并控制于50℃以下進(jìn)行減壓濃縮；(2)、過濾濃縮液，濾液進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，先用水洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇水溶液梯度洗脫，收集10→60％的甲醇溶液的洗脫液，減壓濃縮干燥；(3)、干燥產(chǎn)物用少量70％乙醇溶液溶解后再次進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用70％乙醇溶液洗脫，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，進(jìn)行減壓濃縮干燥；(4)、干燥產(chǎn)物溶于少量水中，進(jìn)入MCI-gel色譜柱，用水→50％甲醇溶液梯度洗脫，收集合并5～50％的甲醇溶液洗脫液，減壓濃縮干燥；(5)、干燥產(chǎn)物用少量95％乙醇溶液溶解后進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用95％乙醇洗脫，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，合并進(jìn)行減壓濃縮干燥；(6)、濃縮產(chǎn)物溶于少量水，進(jìn)入MCI-gel色譜柱，用水→50％甲醇溶液梯度洗脫，反復(fù)過柱、洗脫2～3次，收集經(jīng)薄層色譜檢查含有鞣質(zhì)成分的洗脫液，合并進(jìn)行減壓濃縮干燥；(7)、干燥產(chǎn)物用少量95％乙醇溶液溶解后進(jìn)入Sephadex LH-20分子篩色譜柱，用95％乙醇洗脫，分段接收洗脫液，并進(jìn)行薄層色譜檢測，收集有同一斑點(diǎn)的對應(yīng)洗脫液，進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的化合物的制備方法，特征在于，檢測洗脫液中含有鞣質(zhì)成分的方法是采用硅膠G薄層色譜板，苯-甲酸乙酯-甲酸作展開劑，比例為1～2∶7∶1，展開、取出、晾干，用1％三氯化鐵甲醇溶液作顯色劑，顯暗綠色斑點(diǎn)者即為鞣質(zhì)成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的化合物的制備方法，特征在于，對每次過柱后的洗脫液進(jìn)行回收溶劑及濃縮干燥的溫度均不超過50℃。
6.一種具有權(quán)利要求1所述結(jié)構(gòu)的化合物右旋兒茶素-3-O-葡萄糖甙的用途，特征是該化合物可用于制備治療肝炎的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種兒茶素的葡萄糖甙化合物及其制備的方法和用途。本發(fā)明提供的化合物是右旋兒茶素－3－O－葡萄糖甙,具有結(jié)構(gòu)式(Ⅰ),該化合物從薔薇科植物粘委陵菜(Potentilla viscosa J.Den.)中分離得到,并公開了它的制備方法。通過藥效實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有明顯的抗肝損傷作用,可以用來制備治療肝炎的藥物。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)為綜合開發(fā)利用粘委陵菜這一野生資源展示了很好的前景,也為制備一種治療肝炎的新藥提供了可能。
文檔編號C07H17/065GK1220994SQ9712580
公開日1999年6月30日 申請日期1997年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月23日
發(fā)明者張本 申請人:張本