專利名稱：具有增強(qiáng)貯存穩(wěn)定性的水溶性的三取代1,2－二噁丁環(huán),合成方法以及中間產(chǎn)品的制作方法
關(guān)于相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)是申請(qǐng)人1996年11月8日申請(qǐng)的同時(shí)待審的美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)08/748,107的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而這一申請(qǐng)又是申請(qǐng)人1995年7月31日申請(qǐng)的同時(shí)待審的美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)08/509,305的部分繼續(xù)申請(qǐng)。發(fā)明背景(1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地描述了能被包括酶在內(nèi)的化學(xué)試劑觸發(fā)，以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的穩(wěn)定的1,2-二噁丁環(huán)(dioxetanes)和組合物。二噁丁環(huán)包括一個(gè)以上的是烷氧取代基一部分的電離基團(tuán)。該二噁丁環(huán)還包括一個(gè)取代了烷氧取代基上一個(gè)氫原子的氟原子或低級(jí)烷基，其可改進(jìn)二噁丁環(huán)的貯存穩(wěn)定性。特別是本發(fā)明還涉及這種二噁丁環(huán)的合成方法。
根據(jù)本發(fā)明合成方法制備的二噁丁環(huán)可用在包括二噁丁環(huán)、一種陽(yáng)離子表面活性劑和一種任選的可提高所產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光量的熒光增白劑的組合物中。本發(fā)明的二噁丁環(huán)和增強(qiáng)組合物可用在發(fā)光(化學(xué)發(fā)光)方法和檢測(cè)被分析物存在和數(shù)量的分析方法中。重要的是可電離基團(tuán)提供了一種更溶于水的二噁丁環(huán)，解決了膠囊(capsule)化學(xué)分析系統(tǒng)中意想不到的化學(xué)攜帶問題，在此同時(shí)，氟原子和低級(jí)烷基的存在改善了二噁丁環(huán)的貯存穩(wěn)定性。(2)相關(guān)技術(shù)的描述a．酶催觸發(fā)的二噁丁環(huán)最早的酶觸發(fā)二噁丁環(huán)的實(shí)例敘述在美國(guó)專利申請(qǐng)(A.P.Schaap，美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)887,139)和一系列論文中(A.P.Schaap,R.S.Handley和B.P.Giri，《四面體通訊》935(1987)；A.P.Schaap,M.D.Sandison和R.S.Handley，《四面體通訊》1159(1987)和A.P.Shcaap，《光化學(xué)、光生物學(xué)》47S,50S(1988))。在高度穩(wěn)定的金剛烷基取代的二噁丁環(huán)上承載有被保護(hù)的芳醚取代基，該二噁丁環(huán)在酶和水性緩沖劑的作用下觸發(fā)分解，同時(shí)發(fā)射光，給出強(qiáng)烈貢獻(xiàn)電子的芳醚陰離子，這種芳醚陰離子可顯著增加二噁丁環(huán)的分解速率。結(jié)果在幾個(gè)數(shù)量級(jí)的強(qiáng)度上產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，這是由被保護(hù)形式的二噁丁環(huán)的緩慢熱分解引起的。在授予Schaap的美國(guó)專利5,068,339中公開了有共價(jià)鍵連接的熒光增白劑基團(tuán)的酶觸發(fā)的二噁丁環(huán)，其分解的結(jié)果為通過能量向熒光增白劑的轉(zhuǎn)移而增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光。Bronstein的美國(guó)專利5,112,960、5,220,005和PCT申請(qǐng)(WO88/00695)公開了承載取代金剛烷基的可觸發(fā)的二噁丁環(huán)。Edwards的美國(guó)專利4,952,707中公開了磷酸酯鹽取代的二噁丁環(huán)。Bronstein的PCT申請(qǐng)(WO94/26726)中公開了承載苯基或萘基的金剛烷基二噁丁環(huán)，在苯基和萘基的非共軛位置上取代有不穩(wěn)定的OX基團(tuán)，并且在芳環(huán)上還有另外的基團(tuán)。
其它可觸發(fā)的二噁丁環(huán)公開在Wang的PCT申請(qǐng)(WO94/10258)中。在Wang公開的二噁丁環(huán)中包括一個(gè)可以是單取代的烷氧基和一個(gè)取代的苯基-OX基團(tuán)，其中除可觸發(fā)的OX基團(tuán)外，苯環(huán)取代基上還存在于一個(gè)或多個(gè)非氫基團(tuán)。
所有前述出版物中公開的二噁丁環(huán)均產(chǎn)生一種發(fā)光的羰基化合物，包括芳香羧酸的烷基酯，通常是羥基苯甲酸甲酯或羥基萘甲酸甲酯，或者羥基芳基酮。
申請(qǐng)人在于1995年7月31日申請(qǐng)的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)08/509,305(′305申請(qǐng))中，公開了二取代的二噁丁環(huán)，其中的羥基二噁丁環(huán)顯示有增強(qiáng)的水溶性，本發(fā)明引入其全部作為參考。
b．由于可觸發(fā)二噁丁環(huán)的化學(xué)發(fā)光的表面活性劑增強(qiáng)在水溶性物質(zhì)(包括銨表面活性劑和一種熒光增白劑)的存在下，由于酶觸發(fā)分解穩(wěn)定的1,2-二噁丁環(huán)而引起的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)已經(jīng)有報(bào)道了(A.P.Schaap,H.Akhavan和L.J.Romano,Clin.Chem.,35(9),1863(1989))。由溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)和5-(N-十四酰)-氨基熒光素組成的熒光膠束在膠束疏水的環(huán)境中，借助于能量從陰離子形式的激發(fā)態(tài)酯到熒光素化合物的有效轉(zhuǎn)移，俘獲中間產(chǎn)品羥基取代的二噁丁環(huán)，并導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)額增加了400倍。
在美國(guó)專利4,959,182和5,004,565中，Schaap描述了另外的實(shí)例，即在季銨表面活性劑CTAB形成的膠束的存在下，由于穩(wěn)定的二噁丁環(huán)的化學(xué)和酶觸發(fā)而導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)。熒光性膠束也增強(qiáng)了羥基和乙酸基取代二噁丁環(huán)的堿觸發(fā)分解的發(fā)光。
在美國(guó)專利5,145,772中，Voyta公開了1,2-二噁丁環(huán)在只有側(cè)季銨基團(tuán)或混有熒光素的聚合物存在下，酶催化所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)。已報(bào)道的其它增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)包括球狀蛋白質(zhì)，如牛血清清蛋白和季銨表面活性劑。其它的陽(yáng)離子聚合物在一定程度上可有效用作化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑；非離子聚合物通常沒有有效性，而陰離子聚合物則顯著地減少了光的發(fā)射。Bronstein在PCT申請(qǐng)(WO94/21821)中描述了前述聚合的季銨表面活性劑增強(qiáng)劑和增強(qiáng)型添加劑混合物的使用。
在CTAB的存在下，由羥基芘磺酸(pyranine)引起的非觸發(fā)二噁丁環(huán)的增強(qiáng)和催化現(xiàn)象已有描述(Martin Josso，博士論文，Wayne州立大學(xué)(1992)Diss.Abs.Int.,Vol.53,No.12B,p.6305)。
在Akhavan-Tafti的美國(guó)專利5,393,469中，公開了1,2-二噁丁環(huán)在任由熒光性能量接受體取代的聚合季鏻鹽的存在下，酶催化所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)。
在歐洲專利申請(qǐng)順序號(hào)94108100.2中公開了1,2-二噁丁環(huán)在雙陽(yáng)子鏻鹽的存在下酶催化所產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)。沒有文件公開過陰離子熒光增高劑和可提高觸發(fā)二噁丁環(huán)化學(xué)發(fā)光的雙陽(yáng)離子增強(qiáng)劑的組合體。也沒有報(bào)道過本發(fā)明類型的增強(qiáng)型取代二噁丁環(huán)實(shí)例。
c．具有改進(jìn)水溶性的可觸發(fā)的二噁丁環(huán)酶催化觸發(fā)的二噁丁環(huán)目前已在眾多應(yīng)用中廣泛用作標(biāo)記酶的基質(zhì)，這些應(yīng)用包括免疫測(cè)定法，基因表達(dá)研究，西式吸印(Westem blotting)，南式吸印(Southem blotting),DNA序列和病原體中核酸節(jié)段的鑒定。盡管這些化合物的用途仍在增長(zhǎng)，但在一些測(cè)定方法中的使用仍有一些限制。期望的是可觸發(fā)二噁丁環(huán)中脫保護(hù)形式的羥基二噁丁環(huán)更溶于水。如下列結(jié)構(gòu)式所示，特別理想的是通過堿性磷酸酶使磷酸酯鹽二噁丁環(huán)脫磷酸而形成的羥基二噁丁環(huán)在水溶液和含化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)物質(zhì)的水溶液中高度溶解。這種二噁丁環(huán)和組合物在用于檢測(cè)水解酶或水解酶共軛物的某種溶液測(cè)定法中非常重要。
在本發(fā)明深層背景和下述更詳細(xì)解釋的實(shí)例中，可以發(fā)現(xiàn)根據(jù)膠囊化學(xué)分析原則在自動(dòng)檢測(cè)儀上進(jìn)行的測(cè)定中，常見化學(xué)發(fā)光的二噁丁環(huán)試劑使用的結(jié)果是試劑從一流體段攜帶到另一流體段，最終結(jié)果是潛在的測(cè)量不準(zhǔn)確、錯(cuò)誤的結(jié)果和由于不可再現(xiàn)而帶來(lái)的不準(zhǔn)確性。膠囊化學(xué)分析敘述在美國(guó)專利5,399,497中，本發(fā)明引入其全部作為參考。已假定在其它可能克服攜帶的方法中，特別是具有增強(qiáng)水溶性的羥基二噁丁環(huán)可能會(huì)消除或者使這種發(fā)光的反應(yīng)中間體向膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中相鄰流體段的攜帶最小化。
工業(yè)用的二噁丁環(huán)化合物中沒有在烷氧基上引入增溶基團(tuán)。這樣，這些二噁丁環(huán)在需要零攜帶的測(cè)定方法中是不適用的。在美國(guó)專利5,220,005中曾建議向二噁丁環(huán)中引入增溶基團(tuán)。在金剛烷取代基上取代有羧基的二噁丁環(huán)已經(jīng)要求(claim)過，但是還沒有有關(guān)這種二噁丁環(huán)制備的描述。重要的是，沒有公開過加入羧基后在二噁丁環(huán)的溶解性和其它特性方面的效果(如果有)。而且在本領(lǐng)域內(nèi)沒有任何有關(guān)需要多少個(gè)增溶基團(tuán)或者可能有怎樣特殊的優(yōu)點(diǎn)的學(xué)說。如果增溶基團(tuán)的使用干擾了引發(fā)光發(fā)射的保護(hù)基團(tuán)的除去，或者在另一方面干擾了光的產(chǎn)生，則這種增溶基團(tuán)的使用是沒有任何價(jià)值的。同樣地，如果增溶基團(tuán)會(huì)在發(fā)光反應(yīng)中被除去，則這樣的增溶基團(tuán)也是沒有用的。
在申請(qǐng)人同時(shí)待審的′305申請(qǐng)中，已證明引入一個(gè)離子增溶基團(tuán)不足以消除由磷酸酯鹽二噁丁環(huán)脫磷酸而產(chǎn)生的羥基二噁丁環(huán)有關(guān)的攜帶問題。磷酯鹽二噁丁環(huán)的羥基二噁丁環(huán)產(chǎn)品是高度水溶性的，因此提供含這種磷酸酯鹽二噁丁環(huán)的增強(qiáng)型組合物來(lái)解決這個(gè)問題。接下來(lái)發(fā)現(xiàn)提供攜帶問題解決方案的二噁丁環(huán)在室溫下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性不足。因此本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的二噁丁環(huán)均不能同時(shí)擁有羥基二噁丁環(huán)的高度溶解性和長(zhǎng)期的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
申請(qǐng)人在08/748,107中公開了用氟原子或低級(jí)烷基取代承載兩個(gè)離子增溶基團(tuán)的烷氧基團(tuán)上的氫原子，可顯著改善這些二噁丁環(huán)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。制備這種二噁丁環(huán)的合成方法也已公開。在本申請(qǐng)中，公開了改進(jìn)的方法及所用的中間產(chǎn)品。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種酶觸發(fā)的具有改進(jìn)儲(chǔ)存穩(wěn)定性的1,2-二噁丁環(huán)，它的羥基二噁丁環(huán)產(chǎn)物由觸發(fā)酶作用形成，在水溶液中高度溶解。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供的二噁丁環(huán)取代有兩個(gè)或更多個(gè)增加水溶性的離子基團(tuán)，并且在二噁丁環(huán)結(jié)構(gòu)的烷氧取代基上排列有氟原子或低級(jí)烷基，其可提供優(yōu)越儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
本發(fā)明的又一目的是提供包含二噁丁環(huán)，一種非聚合陽(yáng)離子增強(qiáng)劑和任選的一種熒光增白劑的組合物，用來(lái)提供強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，其中的二噁丁環(huán)為氟原子或低級(jí)烷基取代的，并帶有兩個(gè)或多個(gè)增加水溶性的離子基團(tuán)。本發(fā)明的再一目的是提供的二噁丁環(huán)和組合物在用于在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)上使用的測(cè)試法中時(shí)，可消除試劑攜帶問題并具有持久的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種合成方法和在制備取代有兩個(gè)或多個(gè)水增加水溶性的離子基團(tuán)，并且在二噁丁環(huán)結(jié)構(gòu)上的烷氧取代基上排列有氟原子或低級(jí)烷基的1,2-二噁丁環(huán)中所用的中間體。


圖1是一個(gè)膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)的圖解，其中確定攜帶是一個(gè)問題。
圖2是一個(gè)在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中相鄰段的分布圖(profile)，顯示了由于攜帶而觀測(cè)到的發(fā)光，這在下面實(shí)施例中將更全面地描述。
圖3在實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的相鄰段的另一分布圖，其將在下面實(shí)施例中詳細(xì)敘述，經(jīng)確認(rèn)攜帶不是光學(xué)性的。
圖4在實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的相鄰段又一分布圖，其會(huì)在下面的實(shí)施例中詳細(xì)敘述，經(jīng)確認(rèn)攜帶的實(shí)質(zhì)是化學(xué)性的。
圖5描繪在25℃時(shí)氟代二噁丁環(huán)、氯代二噁丁環(huán)、甲基取代二噁丁環(huán)和一個(gè)不含鹵素的參考二噁丁環(huán)分解相對(duì)速率的曲線圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及具有提高貯存穩(wěn)定性的二噁丁環(huán)，其羥基二噁丁環(huán)產(chǎn)物是由觸發(fā)酶作用形成的，它在水溶液中是高度溶解的，并且它是由酶觸發(fā)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的。在美國(guó)專利5,399,497中描述了，這種可觸發(fā)的二噁丁環(huán)在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中消除或者最小化了發(fā)光的羥基二噁丁環(huán)向相鄰段的攜帶。攜帶能由低水溶性發(fā)光材料的增溶作用、沉積或沉降作用從而進(jìn)入在膠囊化學(xué)系統(tǒng)中起隔離流體作用的碳氟油中引起。試劑攜帶會(huì)導(dǎo)致不精確的測(cè)量，錯(cuò)誤的結(jié)果和由于不可重復(fù)性而導(dǎo)致誤差。
在同時(shí)待審的′305申請(qǐng)中指出，下式的二噁丁環(huán)1在水溶液中堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)中非常有效。

作為比較，制備了只引入一個(gè)可電離基團(tuán)的二噁丁環(huán)2。這種二噁丁環(huán)不會(huì)消除上述討論的攜帶問題。
在美國(guó)專利5,399,497中描述的測(cè)試系統(tǒng)中，二噁丁環(huán)1的使用會(huì)導(dǎo)致攜帶問題的完全消除。但是，接下來(lái)意想不到的發(fā)現(xiàn)在水緩沖劑中的二噁丁環(huán)1溶液表現(xiàn)出不理想的貯存穩(wěn)定性，在堿性緩沖劑中含二噁丁環(huán)1的溶液，在25℃貯存兩星期后，顯著分解。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)二噁丁環(huán)1的穩(wěn)定性明顯低于有關(guān)的化合物，如下示的Lumigen PPD，其在烷氧基上沒有離子增溶基團(tuán)。

據(jù)申請(qǐng)人目前所知，在二噁丁烷化學(xué)領(lǐng)域中沒有任何學(xué)說可以解釋1式較低穩(wěn)定性的原因。在結(jié)構(gòu)上改進(jìn)1，改善其儲(chǔ)存穩(wěn)定性，同時(shí)保留它其它有益特性的方法披露于申請(qǐng)人同時(shí)待審的申請(qǐng)順序號(hào)08/748,107中。本發(fā)明引入其全部作為參考。
定義貯存穩(wěn)定性是指由于自發(fā)反應(yīng)而產(chǎn)生的二噁丁環(huán)的分解速率，其是一個(gè)固有的性質(zhì)。可觸發(fā)的二噁丁環(huán)的分解，也可由痕量試劑的存在而引起，這種試劑可催化除去保護(hù)基團(tuán)，從而引發(fā)分解。二噁丁環(huán)的貯存穩(wěn)定性可以通過在定期的時(shí)間間隔測(cè)定存在于已知樣品中的二噁丁環(huán)的量來(lái)估計(jì)。測(cè)量可采取任意已知的形式，其測(cè)定了與二噁丁環(huán)量有關(guān)的性質(zhì)。典型的技術(shù)如分光光度測(cè)定法、NMR光譜測(cè)定法及類似的技術(shù)。測(cè)定所產(chǎn)生光量的常見方式為將已知量的二噁丁環(huán)與一種觸發(fā)劑在一組標(biāo)準(zhǔn)條件下反應(yīng)而得。
貯存穩(wěn)定性是指以純品形式和作為緩沖溶液中溶液或配方的二噁丁環(huán)的穩(wěn)定性。該配方中還能包括可提高產(chǎn)生光量或可改善酶觸發(fā)劑活性的各種添加劑。所期望的是，配方中的二噁丁環(huán)，在外界溫度下，經(jīng)歷一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間沒有發(fā)生明顯的分解。用于自動(dòng)分析儀的組合物理想的是應(yīng)穩(wěn)定存在至少一個(gè)星期。當(dāng)在0-5℃時(shí)冷藏時(shí)，期望至少在2-3月內(nèi)觀測(cè)不到明顯的分解。更理想的是，用于自動(dòng)分析儀的組合物在大約2-4周內(nèi)應(yīng)該表現(xiàn)出不超過2-3％的變化，這種變化通過貯存穩(wěn)定性的指示器觀測(cè)。
已發(fā)現(xiàn)貯存穩(wěn)定性問題在具有式Ⅰ的二噁丁環(huán)中得到了解決，

其中Z選自氟原子和有1-4個(gè)碳原子的烷基，M是從氫原子，堿金屬離子或季銨或鏻離子中選出的；其中R3和R4都是從無(wú)環(huán)的、單環(huán)的和多環(huán)的有機(jī)基團(tuán)中選出，這些基團(tuán)可以被雜原子任意地取代，并且為二噁丁環(huán)提供穩(wěn)定性；其中的R2是選自苯基或萘基的芳環(huán)基團(tuán)，其可以包括另外的選自鹵素、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、羰基、羧基、氨基和烷基氨基的取代基；其中的X是一保護(hù)基，其能被活化劑除去形成一個(gè)氧陰離子取代的二噁丁環(huán)，該二噁丁環(huán)分解并產(chǎn)生光和兩個(gè)含羰基的化合物，其中一個(gè)是含兩個(gè)羧酸鹽基團(tuán)的氧陰離子取代酯化合物，如下所示

當(dāng)M是H時(shí)，認(rèn)為相應(yīng)的二噁丁環(huán)化合物將優(yōu)選只在一定的pH條件下使用，此時(shí)羧酸官能團(tuán)是電離的，即pH約≥7。優(yōu)選M是堿金屬離子，最優(yōu)選是鈉離子。
在另一實(shí)施方案中，R3和R4基團(tuán)結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)烷基R5，R5含6-30個(gè)碳原子并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其可提供熱穩(wěn)定性且能包含另外的非氫取代基。

基團(tuán)R5更優(yōu)選為多環(huán)基團(tuán)，優(yōu)選是金剛烷基或是有一個(gè)或多個(gè)取代基R6的金剛烷基，以共價(jià)鍵結(jié)合的取代基R6選自鹵素、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、羰基、羧基、苯基、取代苯基、氨基和烷基氨基。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基團(tuán)R2是苯基或萘基。尤其優(yōu)選R2是苯基，其中OX基定位于二噁丁環(huán)基的間位上，如下所示。苯環(huán)還可以包含另外的環(huán)取代基R7，R7可以獨(dú)立地從鹵素、烷基、取代烷基、烷氧基、取代烷氧基、羰基、羧基、氨基和烷基氨基中選出。一些典型的結(jié)構(gòu)如圖示


后面兩種結(jié)構(gòu)式的化合物中，如下所示R6為H或Cl,R7為Cl的化合物被認(rèn)為是更優(yōu)選的化合物。

OX基團(tuán)的性質(zhì)受檢測(cè)中使用的觸發(fā)劑支配，可選自羥基、O-M+基(其中M從氫原子、堿金屬離子或季銨或鏻離子中選出)、OOCR8(其中R8是從包括1-8個(gè)碳原子和可任意地含雜原子的烷基和芳香基團(tuán)中選擇)、OPO3-2鹽、OSO3-鹽，β-D-半乳糖苷氧(galactosidoxy)和β-D-葡萄糖苷酸基氧基團(tuán)。OX基團(tuán)優(yōu)選是OPO32-鹽基團(tuán)。
本發(fā)明的二噁丁環(huán)具有下式

其中R2、R3、R4、M和Z如前文所述，其能用審請(qǐng)人同時(shí)待審的申請(qǐng)?zhí)?8/748,107中所述的方法和二噁丁環(huán)化學(xué)領(lǐng)域中已知的其它方法制備。例如，具有下式的酮和酯(其中，RG是一個(gè)可替換的原子或基團(tuán)，X′也是一可替換的原子或基團(tuán)如氫、烷基或三甲基甲硅烷基)，可以通過低價(jià)鈦試劑偶合而生成一種乙烯基醚中間體?？沙サ幕鶊F(tuán)包括離去基團(tuán)，如選自Cl、Br和Ⅰ的鹵素原子、硫酸鹽、磺酸鹽如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽和triflates(三氟磺酸鹽)、季銨基團(tuán)和疊氮化物。

這種乙烯基醚中間體在一步或更多步過程中轉(zhuǎn)化成前體乙烯基醚磷酸鹽。為合成的方便，期望的是一個(gè)可除去基團(tuán)用另一個(gè)可除去基團(tuán)代替?；鶊F(tuán)RG是通過與Z取代的丙二酸酯反應(yīng)和隨后的酯基團(tuán)的皂化反應(yīng)而被CZ(COOM)代替。在X′和X基團(tuán)不相同的情況下，通過除去X′并與具有添加X基團(tuán)或保護(hù)形式的X基團(tuán)的試劑反應(yīng)，基團(tuán)X′轉(zhuǎn)化為X基團(tuán)。例如，當(dāng)X′是H，X是PO3Na2時(shí)，經(jīng)過堿處理以脫質(zhì)子，接下來(lái)與磷酸化試劑反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)磷酸三酯保護(hù)的乙烯基醚，它可以通過三酯轉(zhuǎn)化為二鈉鹽的水解作用而轉(zhuǎn)化成磷酯鹽。在這個(gè)多步過程中，兩個(gè)或多個(gè)操作可能會(huì)發(fā)生在同一個(gè)操作步驟中，例如羧酸酯和磷酸酯的水解同在同一步驟實(shí)施。

前體乙烯基醚磷酯鹽通過已知的反應(yīng)，直接轉(zhuǎn)化成二噁丁環(huán)。已知反應(yīng)包括，例如添加由染料敏化作用產(chǎn)生的單態(tài)氧。

在下述具體實(shí)例中，通過圖解的方式，舉例說明了每一個(gè)過程。尤其是，流程圖1根據(jù)前文所述步驟制備二噁丁環(huán)3-5的合成路線的流程，其公開和體現(xiàn)在前述748,107申請(qǐng)中。
流程圖1

本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及制備式Ⅳ的二噁丁環(huán)鹽化合物的過程，

式Ⅳ化合物具有提高的貯存穩(wěn)定性，其中R3和R4每一個(gè)都是從無(wú)環(huán)、單環(huán)和多環(huán)的有機(jī)基團(tuán)中選出的，這些有機(jī)基團(tuán)可任意地被雜原子取代，R3和R4可以任意地連接在一起形成單環(huán)或多環(huán)的基團(tuán)，螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其中的R2是從能包含附加取代基的苯基或萘基中選出的芳環(huán)基，其中的Z是從由鹵素原子和1-4個(gè)碳原子的烷基中組成的組中選出的，而M則是從氫、堿金屬原子或季銨或鏻離子選出的，該制備過程包括下列步驟a)將具有下式的第一烯烴化合物，其中RG是可除去基團(tuán)，

與Z取代的丙二酸酯和一種堿反應(yīng)，給出具有下式的丙二酸酯取代的烯烴化合物，其中R’是有1-4個(gè)碳的烷基；

b)將該丙二酸酯取代的烯烴與式為WP(O)Y2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中的W和Y均可以是鹵素原子，形成具有下式的磷酸化的烯烴化合物；

c)將此磷酸化的烯烴化合物與式為Y′-OH的羥基化合物反應(yīng)，其中Y′選自取代或未取代的烷基，形成具有下式的第二磷酸化的烯烴化合物；

d)在水性溶劑中，在一種式為M-Q的堿的存在下，其中Q是堿性陰離子，水解第二磷酸化的烯烴化合物，形成具有下式的烯烴鹽化合物；和

e)在氧和烯烴鹽化合物水溶液的存在下，通過照射一種光敏劑從而將該烯烴鹽化合物光氧化，形成二噁丁環(huán)鹽化合物。
更優(yōu)選使用這種方法制備的二噁丁環(huán)中，R3和R4結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)R5，并且R5螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，則二噁丁環(huán)鹽化合物具有下式

在其它優(yōu)選的方法中，基團(tuán)R2是間苯基，Z是鹵素或有1-4個(gè)碳原子的烷基，更優(yōu)選Z是F或CH3，且M是堿金屬離子，更優(yōu)選M是Na。
目前已發(fā)現(xiàn)具有增強(qiáng)儲(chǔ)存穩(wěn)定性的式Ⅳ化合物能通過包括下列步驟的

改進(jìn)方法而有利地制備出。其中R3和R4均可選自無(wú)環(huán)、單環(huán)和多環(huán)的有機(jī)基團(tuán)，這些有機(jī)基團(tuán)能任選地由雜原子取代，且R3和R4能任選地連在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其中R2是芳環(huán)基團(tuán)，選自能包括附加取代基的苯基或萘基，其中Z選自鹵素原子和有1-4個(gè)碳原子的烷基，且M選自氫、堿金屬離子或季銨或鏻離子。
a)將具有下式的第一烯烴化合物，其中RG是可除去基團(tuán)，

與Z取代的丙二酸酯和一種堿反應(yīng)，給出具有下式的丙二酸酯取代的烯烴化合物，其中R′是有1-4個(gè)碳原子的烷基；

b)在氧和丙二酸酯取代的烯烴化合物的存在下，通過照射一種光敏劑，從而將丙二酸酯取代的烯烴化合物光氧化，形成具有下式的丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)；

c)將丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)與具有式WP(O)Y2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中W選自鹵素，Y選自鹵素原子、取代或未取代的烷氧基、芳氧基、芳烷氧基和三烷基甲硅烷氧基，形成具有下式的磷酸化的二噁丁環(huán)化合物；和

d)將水溶液中的磷酸化的二噁丁環(huán)，在一種式為M-Q堿的存在下水解，其中Q是堿性陰離子，形成二噁丁環(huán)鹽化合物。
更優(yōu)選的是使用這種方法制備的二噁丁環(huán)中，R3和R4結(jié)合在一起形成一個(gè)單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)R5并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，并且其能包含附加的取代基，該二噁丁環(huán)鹽具有下式

在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法被用來(lái)制備一種二噁丁環(huán)，其中R2基團(tuán)是能包含附加取代基的間位苯基，Z是鹵素原子或具有1-4個(gè)碳原子的烷基，更優(yōu)選Z是F或CH3,M是一種堿金屬離子，更優(yōu)選是Na。
第一烯烴化合物與Z取代的丙二酸酯CHZ(COOR′)2和一種堿反應(yīng)，生成丙二酸酯取代的烯烴化合物的這一步通常是在極性的非質(zhì)子溶劑如DMSO、DMF、N-N二甲基乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮(Pyrollidone)中，使用一種弱親核堿，優(yōu)選氫化鈉或氫化鉀而進(jìn)行的。該反應(yīng)通常是在提高溫度減少反應(yīng)時(shí)間的情況下進(jìn)行，反應(yīng)一般在50-150℃之間，更普遍地是在80-120℃之間進(jìn)行可除去的基團(tuán)包括離去基團(tuán)，如選自Cl、Br和I的鹵素、硫酸鹽、如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽和triflate(三氟磺酸鹽)的磺酸鹽、季銨基團(tuán)和疊氮化物。
在所述改進(jìn)方法中，用在中間產(chǎn)品丙二酸酯取代的烯烴上進(jìn)行光氧化這步代替了為總體方法中的最終步驟的光氧化磷酯鹽烯烴這一步(其敘述在申請(qǐng)748,107中)。在這一步中，承載苯酚基團(tuán)的丙二酸酯取代的烯烴化合物溶解在有機(jī)溶劑中，在氧與敏化劑存在下經(jīng)照射，形成丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)。用光，通常為可見光，照射敏化劑和氧，產(chǎn)生了單態(tài)氧，這種單態(tài)氧與丙二酸酯取代烯烴的乙烯醚型雙鍵反應(yīng)。敏化劑可以溶解在溶劑中，或者優(yōu)選固定在本領(lǐng)域公知的一種聚合物顆粒上。用于產(chǎn)生單態(tài)氧敏化劑包括，但不限制為，玫瑰紅(四氯四碘熒光素)、亞甲藍(lán)、曙紅(四溴熒光素)、四苯基卟啉(TPP)、TPP的金屬配合物(特別是鋅和錳)和C60。優(yōu)選的有機(jī)溶劑包括如CH2Cl2、CHCl3和CCl4的鹵化碳、氘化鹵化碳，低分子量的酮和它們的氘化類似物，脂肪烴和芳香烴及其氘化同類物。最優(yōu)選的是CH2Cl2。在有機(jī)溶劑中進(jìn)行光氧化作用，有利地提供了一種反應(yīng)介質(zhì)，在這種反應(yīng)介質(zhì)中單態(tài)氧的生存期被最大化。這對(duì)減少反應(yīng)時(shí)間和使光氧化更容易完成起到了明顯的效果。同樣也促進(jìn)了產(chǎn)品分離，在大多數(shù)情況下只需要簡(jiǎn)單地過濾敏化劑和蒸發(fā)溶劑即可。
丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)與式WP(O)Y2的磷酸化試劑反應(yīng)(其中W是從鹵素中選出的，Y是從鹵素原子、取代的或未取代的烷基氧和三烷基甲硅烷基氧基團(tuán)中選出的)，生成磷酸化的二噁丁環(huán)化合物的這步反應(yīng)是在一種有機(jī)溶劑，優(yōu)選如CH2Cl2或CHCl3的鹵化碳，或如二乙基醚或四氫呋喃(THF)的醚中，在一種胺堿的存在下實(shí)施的。有用的胺堿包括(并不限于)吡啶和三乙胺。當(dāng)Y是取代的或未取代的烷氧基，芳氧基，芳烷氧基或三烷基甲硅烷基氧基團(tuán)時(shí)，具有代表性的Y基團(tuán)包括，借助于實(shí)施例，如OCH3、OCH2CH3和諸如此類的烷氧基、如氰乙氧基(OCH3CH2N)，或三甲基甲硅烷基乙氧基OCH2CH2Si(CH3)3的取代烷氧基，苯氧基，取代苯氧基，芐氧基、三甲基甲硅烷基氧和其它一些普通有機(jī)化學(xué)工作者熟知的化合物。也能將兩個(gè)基團(tuán)Y連接在一起成為單個(gè)基團(tuán)。如出現(xiàn)在試劑

中的亞乙二氧基。優(yōu)選基團(tuán)Y是氰乙氧基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Y是鹵素，優(yōu)選Y和W都是Cl。
磷酸化作用步驟是在從-78℃到25℃的溫度下在溶液中進(jìn)行的。大約0-5℃的溫度是非常有利的。磷酸化試劑WP(O)Y2以一種可控方式加入，以免引起反應(yīng)溶液變熱。磷酸化試劑在加入過程中最好與胺堿同時(shí)加入，胺堿優(yōu)選是吡啶。
水解或去保護(hù)作用步驟伴隨有在具有堿的水性溶劑中水解磷酸化的二噁丁環(huán)，堿式為M-Q，其中Q是堿性陰離子，其量足以除去保護(hù)基團(tuán)Y和R′，形成二噁丁環(huán)鹽的化合物。溶劑可包括水、水性緩沖劑以及水和一種或多種有機(jī)溶劑的混合物。優(yōu)選的有機(jī)溶劑是如甲醇、乙醇、丙酮和THF的水混溶溶劑。通常需要4當(dāng)量的堿，但為了方便，可以使用過量的堿。可順序地或同步地進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的除去。根據(jù)特定的基團(tuán)Y、R′和堿，可能或不可能分離出部分水解的中間體。
堿性去保護(hù)劑的選擇，在一定程度上，取決于可被除去的基團(tuán)Y和R′的性質(zhì)。去保護(hù)劑必須不能引起不希望有的副反應(yīng)產(chǎn)生，如在乙烯基醚磷酸酯鹽開始制出的過程中，乙烯基醚基團(tuán)的水解或在制備被保護(hù)二噁丁環(huán)的過程中，二噁丁環(huán)環(huán)基團(tuán)的分解。優(yōu)選的去保護(hù)劑包括有機(jī)的和無(wú)機(jī)的堿，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鉀、氨、氫氧化銨以及類似的堿，其它優(yōu)選的去保護(hù)劑包括象氰化物離子、氟化物離子的親核試劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)化合物與磷酸化試劑反應(yīng)的步驟包括以下幾步a)將丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)化合物與式WP(O)Y′2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中W和Y′均選自鹵素原子，形成具有下式的二噁丁環(huán)磷?；u化物；和

b)將二噁丁環(huán)磷酰鹵化物與式為Y-OH的羥基化合物反應(yīng)，其中Y選自取代或未取代的烷基，形成磷酸化的二噁丁環(huán)化合物。
二噁丁環(huán)磷酰鹵化物通過與至少2當(dāng)量，優(yōu)選過量的羥基化合物Y-OH反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成磷酸化的二噁丁環(huán)化合物。能用作羥基化合物Y-OH的典型化合物包括，但不限于，如甲醇和乙醇的低級(jí)醇，如3-羥基丙腈(HOCH2CH2CN)和2-三甲基甲硅烷基乙醇，苯酚，取代苯酚，芐醇的取代的低級(jí)醇以及已知的其它物質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明與用在制備本發(fā)明二噁丁環(huán)過程中所用的合成中間體有關(guān)。特別是下列新的烯烴中間體化合物是非常有用的。

另外，在制備本二噁丁環(huán)化合物中，下面一些新的二噁丁環(huán)化合物作為合成中間體是有很有用的。

本發(fā)明根據(jù)改進(jìn)方法合成二噁丁環(huán)的典型方法示于流程圖2中。
流程圖2

在前述合成過程中提到的起始原料(前體烯烴)具有如下的結(jié)構(gòu)，其可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備，

其中RG是可除去基團(tuán)。正如在美國(guó)專利4,983,779和4,982,192中描述的一個(gè)方法，乙烯基醚官能團(tuán)是通過酮R3R4C=O和酯HOR2COOCH2CH2-G在鈦催化劑作用下偶合來(lái)制備的，其中G可以是與RG相同的，或者可以被RG替換或轉(zhuǎn)化成RG的基團(tuán)。在下文中提供了一典型的合成過程，其中RG為碘原子，G為氯原子。進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，為了方便起見，偶合反應(yīng)的酯組分可以使用保護(hù)形式，在這種形式中羥基是以掩蔽的形式出現(xiàn)，如甲硅烷基醚或烷基醚的形式。在偶合反應(yīng)之后，使用標(biāo)準(zhǔn)的合成手段釋出游離的羥基。
申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些前體烯烴同樣可以通過一種新的，以前未報(bào)導(dǎo)過的過程制備這種類型乙烯基醚的方法制備。前述的鈦催化的方法需要制備承載G或RG基團(tuán)的單獨(dú)的酯化合物，增加了附加的復(fù)雜性和花費(fèi)，而新方法則使用一種可從市售的起始原料制備的普通的乙烯基醚中間體。
下面描述了通過新方法制備前體烯烴的反應(yīng)的實(shí)例。一種低級(jí)烷基乙烯基醚化合物在(其中低級(jí)烷基R9在此是指一個(gè)C1-C4直鏈或支鏈的烷基)與催化量的汞鹽，在至少1摩爾當(dāng)量的另一種醇R10-OH，例如一種具有式HOCH2CH2G的醇的存在下，制造出所期望的烯烴。

具有式CH2=CHORa的未取代乙烯基醚向另一種式CH2=CHORb的未取代乙烯基醚的轉(zhuǎn)化是已知的，并有敘述，例如在W.H.Watanabe和L.E.Conlon，“美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)期刊”，79,2828(1957)中。本方法中所用的通過汞鹽催化三取代烯烴的制備方法據(jù)申請(qǐng)人所知，沒有任何報(bào)導(dǎo)。
在這一反應(yīng)過程中，R3和R4都是從無(wú)環(huán)的、單環(huán)的和多環(huán)的有機(jī)基團(tuán)中選出的，這些有機(jī)基團(tuán)可以任意地被雜原子取代，并且R3和R4可以任意連接在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)R5，并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，R2是一個(gè)從可包括附加取代基的苯基或萘基中選出芳基環(huán)。利用汞催化反應(yīng)制備烯烴前體到本發(fā)明二噁丁環(huán)的一個(gè)實(shí)例是

其中G是一個(gè)氯原子。汞鹽是任意一種用來(lái)催化乙烯基醚基團(tuán)的二價(jià)汞鹽，并且優(yōu)選是一種弱酸鹽，如乙酸鹽或三氟乙酸鹽。汞鹽的用量為催化劑量，一般為每摩爾烯烴用0.01-0.5摩爾，更普遍的為0.05-0.25摩爾。醇組分R10-OH可以是任意的鏈烷醇、取代鏈烷醇、芐醇、不飽和醇，如烯丙醇。醇的使用是過量的，至少為每摩爾烯烴2摩爾醇，優(yōu)選每摩爾烯烴至少5mol。在優(yōu)選的過程中，醇被當(dāng)作反應(yīng)溶劑使用。反應(yīng)一般(但不是必要的)應(yīng)高于環(huán)境溫度，最高到溶劑沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選反應(yīng)溫度在大約70-120℃范圍內(nèi)。用于提高反應(yīng)劑的溶解性或者為改變極性或沸點(diǎn)目的，可使用一些附加的溶劑。
因此認(rèn)識(shí)到前述的汞-催化的乙烯基醚交換反應(yīng)，在中間體的制備過程中有特殊的用途，這些中間體是用來(lái)進(jìn)一步完善本發(fā)明的三取代二噁丁環(huán)的水溶性的，但它更普遍地是用于制備廣泛的各種烯烴或乙烯基醚化合物中。具體的實(shí)施方案制備出二噁丁環(huán)1的氟取代的類似物，標(biāo)為3，一個(gè)氯取代類似物4和一個(gè)甲基取代的類似物5，并在幾個(gè)星期內(nèi)評(píng)估其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。為對(duì)比，測(cè)量1溶液的貯存穩(wěn)定性。所有溶液都是用相同的組合物制備的，區(qū)別僅在于二噁丁環(huán)化合物的不同。通過用定體積的測(cè)試溶液和固定限定量的堿性磷酸酶和測(cè)量在25℃時(shí)穩(wěn)定期時(shí)光強(qiáng)度的化學(xué)發(fā)光的酶測(cè)試法來(lái)評(píng)估穩(wěn)定性。出乎意料的是，含有二噁丁環(huán)3和二噁丁環(huán)5的水溶液事實(shí)上要比1更穩(wěn)定，但二噁丁環(huán)4卻不行。二噁丁環(huán)3或5的水溶液在25℃歷經(jīng)四周之后，基本上沒有分解。令人驚異的是二噁丁環(huán)4的貯存穩(wěn)定性實(shí)際上比1的更差。

這四種二噁丁環(huán)化合物在性能上出現(xiàn)這些差異的原因，目前還不知道。特別重要的是，二噁丁環(huán)3和4結(jié)構(gòu)上的差異僅僅是具有不同的鹵素取代基，就會(huì)在貯存穩(wěn)定性上表現(xiàn)出如明顯的不同。申請(qǐng)人在二噁丁環(huán)化學(xué)領(lǐng)域沒有找到任何學(xué)說可以解釋和預(yù)測(cè)這些結(jié)果。
此外，測(cè)試二噁丁環(huán)3，結(jié)果顯示與二噁丁環(huán)1一樣，在膠囊化學(xué)測(cè)試系統(tǒng)中不引起任何攜帶。因此，承載一個(gè)含二羧酸鹽基團(tuán)取代基和或者為一個(gè)氟原子或一個(gè)低級(jí)烷基的取代基的如3和5的二噁丁環(huán)，以及含這種二噁丁環(huán)的組合物優(yōu)于其它已知的用于膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中的二噁丁環(huán)和組合物。
本發(fā)明的另一方面，提供了可增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的組合物。在需要最高分析靈敏度的測(cè)試中使用增強(qiáng)的組合物是有利的。在維持和減少?gòu)淖园l(fā)的二噁丁環(huán)分解中產(chǎn)生的外部光發(fā)射的同時(shí)，增加二噁丁環(huán)分解反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光有效性是一種提高或改善靈敏度的方式。
因此，本發(fā)明還涉及包含一種陽(yáng)離子增強(qiáng)劑和一種穩(wěn)定的1,2-二噁丁環(huán)的組合物，該1,2-二噁丁環(huán)如上所述，具有提高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，其能被觸發(fā)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。這種可以提供強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的組合物包括一個(gè)上述在水溶液中的二噁丁環(huán)，和一種非聚合的陽(yáng)離子增強(qiáng)劑物質(zhì)，該物質(zhì)與不存在增強(qiáng)劑時(shí)所產(chǎn)生的光相比，增加了二噁丁環(huán)和活化劑反應(yīng)所產(chǎn)生的光量。這種增強(qiáng)劑物質(zhì)優(yōu)選是一種具有下式的雙陽(yáng)離子表面活性劑++Y-R3ACH2-Link-CH2AR3Y-其中每一個(gè)A可獨(dú)立地從P和N原子之中選出，其中Link是一包含至少兩個(gè)碳原子的有機(jī)連接基團(tuán)，這些基團(tuán)是從取代的和未取代的芳基、烷基、鏈烯基和炔基中選出的，并且其中的Link可以包含雜原子，其中的R可選自含1至20個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或芳烷基，其中Y是一個(gè)陰離子。特別優(yōu)選增強(qiáng)劑物質(zhì)是具有下式的雙陽(yáng)離子表面活性劑，++Cl-(n-C4H9)3PCH2-Link-CH2P(n-C8H17)3Cl-其中Link是一個(gè)亞苯基。
為提供強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，本發(fā)明的組合物可以任意地包含至少一個(gè)熒光增白劑作為補(bǔ)充的增強(qiáng)劑。有用的熒光增白劑是那些能夠通過能量轉(zhuǎn)移增加所發(fā)光量的化合物。陰離子熒光增白劑被認(rèn)為是特別有效的，這是由于其與陽(yáng)離子增強(qiáng)物質(zhì)有利的靜電相互作用。特別優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子化合物和，但不限于，羥基芘磺酸和熒光素。
為了更全面地描述本發(fā)明的各個(gè)方面，以下提供了描述特定實(shí)施方案的非限制性實(shí)施例，用以舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1二噁丁環(huán)1的制備根據(jù)申請(qǐng)人的美國(guó)專利5,631,167中描述的反應(yīng)順序制備二噁丁環(huán)[4-(3,3-雙羧基)丙氧基]-4-(3-磷酰氧苯基)]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)-[3.3.1.13,7]癸烷]的四鈉鹽。直到中間體烯烴[(3-羥苯基)-(2-碘代乙氧基)-亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成基本上如美國(guó)專利申請(qǐng)5,013,827和5,068,339中所敘述的進(jìn)行。

實(shí)施例2 二噁丁環(huán)2的制備二噁丁環(huán)[4-(3-羧基丙氧基)-4-(3-磷酰氧苯基)]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)-[3.3.1.13,7]癸烷](2)是根據(jù)申請(qǐng)人的美國(guó)專利5,631,167中描述的反應(yīng)順序來(lái)制備。直到中間體烯烴[(3-羧基丙氧基)-(3-羥苯基)-亞甲基]-三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成方法基本上如美國(guó)專利5,013,827和5,068,339中所敘述方法進(jìn)行。

實(shí)施例3 二噁丁環(huán)3的制備這種二噁丁環(huán)是根據(jù)下述反應(yīng)順序制備。直到中間體烯烴[(3-羥苯基)-(2-碘代乙氧基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成如實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行。

(a)[((3-雙羰乙氧基)-3-氟代丙氧基)-(3-羥苯基)亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成。
氫化鈉(75mg 60％分散在油中)用正己烷清洗干凈至沒有油，真空下干燥并加到4mL的無(wú)水二甲基亞砜中。加入0.3g氟代丙二酸二乙酯，在氬氣(Ar)保護(hù)下，攪拌懸浮液15分鐘。再把溶解在5mL無(wú)水二甲基亞砜中的碘代乙氧基烯烴0.5g的溶液加入到反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)加熱至100℃并攪拌2小時(shí)。冷卻后，用30mL的乙酸乙酯稀釋該混合物。然后用水提取乙酸乙酯溶液3-4次，干燥并蒸發(fā)。用在正己烷中的5-20％乙酸乙酯作色層分離，得到期望的化合物0.25g，得率45％。1H NMR(CDCl3)δ1.28(t,6H),1.66-1.95(m,12H),2.45(t,1H),2.52(t,1H),2.67(brs,1H),3.20(brs,1H),3.52(t,2H),4.23-4.30(q,4H),6.74-7.22(m,4H)。

(b)[((3,3-雙羰乙氧基)-3-氟代丙氧基)-(3-(雙-(2-氰乙基)磷?；?苯基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成將一個(gè)有10mL CH2Cl2的燒瓶，在一層氬氣下用冰浴冷卻。加入1.71mL吡啶后，緩慢加入0.61mL POCl3，且持續(xù)攪拌15分鐘。將從步驟(a)中得到的烯烴0.972g溶于10mL CH2Cl2中，然后將由此得到的溶液逐滴加入其中。撤去冰浴并攪拌該溶液2.5小時(shí)。向該溶液中加入1.71mL吡啶和1.44mL2-氰基乙醇。攪拌該反應(yīng)混合物12-15小時(shí)，生成白色沉淀物。將該混合物用CH2Cl2稀釋并用4×50mL的水清洗。干燥和蒸發(fā)CH2Cl2提取液，通過使用在正己烷中的75％乙酸乙酯的色譜法純化粗產(chǎn)物。得到總計(jì)1.2g的油(88％)。1H NMR(CDCl3)δ1.29(s,6H),1.79-1.97(m,12H),2.46-2.53(2t,2H),2.63(brs,1H),2.83(t,4H),3.20(brs,1H),3.50(t,2H),4.24-4.31(q,4H),4.35-4.51(m,4H),7.13-7.36(m,4H)；31P NMR(CDCl3)δ9.49(P)。

(c)[(3,3-二羧基-3-氟代丙氧基)-(3-磷酰基氧苯基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]-癸烷四鈉鹽的合成方法。將從步驟(b)得到的烯烴1.2g溶解在20mL丙酮中。加入297mg NaOH在4mL水中的溶液。攪拌過夜，其間有沉淀生成。輕輕倒出上面液體，并且用10×5mL的丙酮洗滌固體。在真空下干燥，得到1.0g白色固體。1H NMR(D2O)δ1.75-1.89(m,12H),2.29(t,2H),2.37(t,2H),2.57(brs,1H),3.12(brs,1H),3.56(t,2H),6.99-7.30(m,4H)；31PNMR(D2O)δ0.69(S)。

(d)[4-(3,3-二羧基)-3-氟代丙氧基)-4-(3-磷?；醣交?]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]的四鈉鹽(3)的合成。將由步驟(c)得到的烯烴348.6mg溶解在10mL的D2O中。將聚合物粘合(polymerbound)的玫瑰紅懸浮在10mL p-二噁烷中，加入到水溶液中。將反應(yīng)混合物冷卻到5-8℃，開始氧氣鼓泡，混合物通過5密耳的KAPTON過濾器用鈉燈照射。共2.5小時(shí)之后，過濾掉聚合物球，蒸干溶液得到白色固體(3)。1H NMR(D2O)δ0.93-1.79(m,12H),2.19(brs,1H),2.41-2.49(m,2H),2.97(brs,1H),3.40-3.49(m,2H),7.19-7.42(m,4H)；31P NMR(D2O)δ0.575(S)。實(shí)施例4．二噁丁環(huán)4的制備這種二噁丁環(huán)是根據(jù)下面的反應(yīng)順序制備的。直到中間體烯烴[(3-羥苯基)-(3,3-二羰乙氧基)丙氧基亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成如實(shí)施例1所述。

(a)[((3,3-二羰乙氧基)-3-氯代丙氧基]-(3-羥苯基)亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成。在-78℃氬氣環(huán)境下，把1.2g(3,3-二羰基乙氧基丙氧基)-(3-羥基苯)亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷溶于10mL干燥THF中形成的溶液加入于25-30mL干燥THF2.4當(dāng)量的LDA中。反應(yīng)在-78℃下攪拌30分鐘，并用在15mL干燥THF中0.58gN-氯代琥珀酰亞胺的溶液處理。允許反應(yīng)混合物在一小時(shí)內(nèi)加熱至室溫，并且再攪拌1小時(shí)。然后在真空下除去THF，并把殘余物溶解在100mL乙酸乙酯中。用水洗滌有機(jī)溶液，然后干燥、蒸發(fā)，并用柱色譜分離粗物質(zhì)。1H NMR(CDCl3)δ1.23(t,6H),1.7-2.00(m,12H),2.57(t,2H),2.65(brs,1H),3.2(brs,1H),3.56(t,2H),4.22(q,4H),6.65-7.25(m,4H)。

(b)[((3,3-二羰乙氧基)-3-氯代丙氧基-(3-(二-(2-氰基乙基)磷?；?苯基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成。在一層氬氣下將有25mLCH2Cl2的燒瓶用冰浴冷卻。加入1.5g吡啶后，緩慢加入1.82g POCl3，持續(xù)攪拌15分鐘。逐滴加入在25mL CH2Cl2中的從步驟(a)得到的烯烴1.5g和1.5g吡啶的溶液。然后去掉冰浴，攪拌溶液1小時(shí)。再用冰浴冷卻該溶液，并順序地用3.0g吡啶和2.8g 2-氰基乙醇處理。反應(yīng)混合物攪拌12-15小時(shí)后，得到白色沉淀。混合物用CH2Cl2稀釋并用水洗滌。干燥和蒸發(fā)CH2Cl2提取液，使用在正己烷中的50％乙酸乙酯通過色譜法純化粗產(chǎn)品，得到總計(jì)1.4g的油。1H NMR(CDCl3)δ1.278(t,6H),1.80-1.97(m,12H),2.565(t,2H),2.63(brs,1H),2.826(t,4H),3.20(brs,1H),3.556(t,2H),4.271(q,4H),4.40-4.47(m,4H),7.15-7.36(m,4H)。

(c)[(3,3-二羧基-3-氯代丙氧基-(3-磷?；醣交?亞甲基)]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的四鈉鹽的合成。將從步驟(b)中得到的烯烴溶解在25mL丙酮中。加入3mL水中溶解有0.22g NaOH的溶液。將該溶液攪拌過夜，其間有沉淀形成。慢慢傾倒出液體，固體用丙酮研制。過濾白色固體，進(jìn)一步用丙酮洗滌并在真空中干燥。1H NMR(D2O)δ1.77-1.92(m,12H),2.422(t,2H),2.59(brs,1H),3.15(brs,1H),3.635(t,2H),7.02-7.33(m,4H)。

(d)[4-(3,3-二羧基)-3-氯代丙氧基]-4-(3-磷?；醣交?]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷]的四鈉鹽(4)的合成。從步驟(c)得到的烯烴35mg溶解在1.0mL D2O中。在1.0mL的p-二噁烷-d8中浸清聚合物粘合的玫瑰紅500mg5分鐘，然后加到水溶液中。將反應(yīng)混合物冷卻到0℃，開始通入氧氣泡并在經(jīng)過5密耳KAPTON過濾器時(shí)用鈉燈照射45分鐘，生成經(jīng)NMR鑒定的產(chǎn)物4。過濾混合物并在緩沖溶液中稀釋用于酶測(cè)試。1H NMR(D2O)δ1.05-1.96(m,12H),2.19(brs,1H),2.60-2.62(m,2H),3.07(br s,1H),3.56-3.58(m,2H),7.25-7.44(m,4H)。實(shí)施例5 二噁丁環(huán)5的制備這種二噁丁環(huán)通過下述的反應(yīng)順序制備。直到中間體烯烴[(3-羥基苯基)-(2-碘代乙氧基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成如實(shí)施例1所述。

(a)[((3,3-二羰乙氧基丁氧基)-(3-羥基苯基)亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成。氫化鈉(60％分散在油中，0.866g)用正己烷清洗至無(wú)油，真空下干燥，加入到15mL無(wú)水DMSO中。加入2.4g甲基丙二酸二乙酯，并在氬氣下攪拌懸浮液15分鐘。把溶于15mL無(wú)水DMSO中的2.8g碘代乙氧基烯烴溶液加入至反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)混合物加熱至100℃并攪拌2小時(shí)。冷卻后，用30mL乙酸乙酯稀釋混合物。乙酸乙酯溶液用水提取3-4次，然后干燥并蒸發(fā)。粗產(chǎn)品用在正己烷中的5-20％的乙酸乙酯經(jīng)色層分離，得到期望的化合物0.80g，收率25％。1HNMR(CDCl3)δ1.208(t,6H),1.347(s,3H),1.76-1.96(m,12H),2.20(t,2H),2.66(brs,1H),3.20(brs,1H),3.41(t,2H),4.09-4.17(q,4H),6.78-7.26(m,4H)。

(b)[((3,3-二羰乙氧基丁氧基-3-(二-(2-氰乙基)磷?；?苯基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷的合成。在一層氬氣下，用冰浴冷卻裝有15mL CH2Cl2的燒瓶。加入1.38g吡啶，接下來(lái)緩慢添加0.8gPOCl3后，繼續(xù)攪拌15分鐘。在15mL CH2Cl2中溶解從步驟(a)得到的烯烴0.8g，將得到的溶液逐滴加入燒瓶中。撤去冰浴并攪拌溶液1小時(shí)。向該溶液中加入1.38g的吡啶和1.24g的2-氰基乙醇。攪拌反應(yīng)混合物12-15小時(shí)，結(jié)果生成白色沉淀。混合物用CH2Cl2稀釋，并且用4×50mL水洗滌。干燥和蒸發(fā)CH2Cl2提取劑。粗產(chǎn)品使用在正己烷中的75％乙酸乙酯用色譜法純化。得到總計(jì)0.55g的油(55％)。1H NMR(CDCl3)δ1.208(t,6H),1.34(s,3H),1.78-1.97(m,12H),2.18(t,2H),2.61(brs,1H),2.81(t,4H),3.21(brs,1H),3.41(t,2H),4.09-4.16(q,4H),4.37-4.46(m,4H),7.14-7.34(m,4H)。

(c)[(3,3-二羧基丁氧基)-(3-磷?；醣交?亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷四鈉鹽的合成。把由步驟(b)得到的烯烴0.47g溶解在14mL的丙酮中。把1.5mL水中溶有0.117g NaOH的溶液加入其中。將該溶液攪拌過夜，其間有沉淀生成。慢慢傾倒出液體，固體用10×5mL的丙酮洗滌。在真空下干燥后，得到白色固體0.383g(92％)。1HNMR(D2O)δ1.09(s,3H),1.75-1.90(m,12H),2.00(t,2H),2.57(brs,1H),3.13(brs,1H),3.47(t,2H),7.01-7.29(m,4H)。

(d)[4-(3,3-二羧基丁氧基)-4-(3-磷?；醣交?]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)[3.3.1.13,7]-癸烷]的四鈉鹽(5)的合成。將從步驟(c)得到的烯烴65mg溶解在3mL的D2O中。將懸浮在3mLp-二噁烷中的聚合物粘合的玫瑰紅35mg加入到水溶液中。將反應(yīng)混合物冷卻至5-8℃，開始通入氧氣泡，并經(jīng)過5密耳的KAPTON過濾器用鈉燈照射1小時(shí)，得到產(chǎn)物(5)。過濾掉聚合物小球，溶液用于制備測(cè)試用的原料溶液。1H NMR(D2O)δ0.92-1.33(m,5H),1.38-2.21(m,13H),2.92(br,s,1H),3.19-3.32(m,2H),7.14-7.73(m,4H)。實(shí)施例6 可供選擇的二噁丁環(huán)3制備方法使用[(3-羥苯基)甲氧基亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷作為起始原料根據(jù)下述反應(yīng)順序制備二噁丁環(huán)。在美國(guó)專利4,983,779中描述過這種化合物的制備。
(a)將烯烴[(3-羥基苯基)甲氧基亞甲基三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷12g加入到100mL的2-氯乙醇中并攪拌。然后在氬氣環(huán)境下向混合物中加入催化劑量的Hg(OAC)22.8g。反應(yīng)在110℃攪拌5小時(shí)。在冷卻至室溫后，在真空下除去氯代乙醇。將固體溶解在EtOAc中并用水洗滌。EtOAc層通過Na2SO4進(jìn)行干燥并蒸發(fā)，生成[(3-羥苯基)-(2-氯代乙氧基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷。
(b)基本上如美國(guó)專利5,013,827和5,068,339所述，在上述化合物中用碘原子替換氯原子。
(c)在上述實(shí)施例3中描述了從[(3-羥苯基)-(2-碘代乙氧基)亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷合成[(3-羥苯基)-(3,3-二羰乙氧基)-3-氟代丙氧基亞甲基]三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷。

(d)從步驟(c)得到的氟代丙二酸酯烯烴0.375g用大約1mg在15mL CH2Cl2中的亞甲藍(lán)進(jìn)行光氧化。在通入氧氣并冷卻溶液至-78℃后，通過5密耳KAPTON過濾器用鈉燈照射45分鐘，然后允許加熱至室溫。蒸發(fā)掉CH2Cl2，殘余物用在CH2Cl2中的0-5％的EtAc作洗脫劑色層分離，生成[4-(3,3-二羰乙氧基-3-氟代丙氧基)-4-(3-羥苯基)]螺(1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)[3.3.1.13,7]-癸烷]。1H NMR(CDCl3)δ0.97-1.02(m,1H),1.21-1.33(m,7H),1.45-1.91(m,10H),2.23(brs,1H),2.48-2.80(m,2H),2.96(brs,1H),3.35-3.44(m,1H),3.65-3.75(m,1H),4.21-4.40(m,4H),6.85-7.40(m,4H)。

(e)將由前面步驟得到的二噁丁環(huán)用以下方法進(jìn)行磷酸化。2mL的無(wú)水吡啶和10mL的CH2Cl2的溶液在氬氣下冷卻至0℃，并滴加入在10mLCH2Cl2中的0.424gPOCl3的溶液。經(jīng)過15分鐘后，再滴加入在10mLCH2Cl2中的0.424g的二噁丁環(huán)溶液。允許溶液加熱至室溫，并攪拌4小時(shí)。再一次將溶液冷卻至0℃，滴加入在10mLCH2Cl2中的0.75g氰基乙醇的溶液。攪拌2.5小時(shí)后將該溶液加熱至室溫，在蒸干后，殘余物使用在正己烷中的50-100％乙酸乙酯作為洗脫劑色譜法分離。在真空下除去溶劑得到無(wú)色油，然后把二噁丁環(huán)溶解在100mL CH2Cl2中，并且Ⅰ型水洗滌三次。有機(jī)層用Na2SO4干燥后，過濾并蒸發(fā)，生成磷酸化的二噁丁環(huán)。1H NMR(CDCl3)δ0.90-0.95(m,1H),1.24-1.33(m,7H),1.46-2.20(m,11H),2.50-2.86(m,6H),2.96(brs,1H),3.32-3.41(m,1H),3.62-3.73(m,1H),4.20-4.48(m,8H),7.30-7.70(m,4H)；31P(CDCl3)-9.53(P)。

(f)烷基的除去是通過將前面步驟中得到的二噁丁環(huán)與溶于1mLⅠ型水中的47.2mg NaOH和10mL丙酮在氬氣下反應(yīng)過夜。從形成的油性殘余物中傾倒出溶劑。然后用2mL的丙酮清洗2次油，并用另外10mL丙酮研制以生成粉末狀白色固體。通過吸濾收集固體二噁丁環(huán)3，并另外用20mL丙酮清洗。
在可供選擇的過程中，步驟(d)的二噁丁環(huán)產(chǎn)物可直接由下面過程轉(zhuǎn)化成二噁丁環(huán)3。2mL的無(wú)水吡啶和10mL的CH2Cl2的溶液在氬氣環(huán)境下冷卻至0℃，并滴加溶解在10mL CH2Cl2中的0.424g POCl3的溶液。15分鐘之后，滴加溶解在10mL CH2Cl2中的0.424g二噁丁環(huán)的溶液。允許該溶液加熱至室溫并攪拌4小時(shí)。形成磷酸酯鹽，并通過將得到的二氯磷酯鹽二噁丁環(huán)與溶解在1mlⅠ型水中的47.2mgNaOH和10ml丙酮在氬氣下反應(yīng)過夜而水解掉酯基。從包含產(chǎn)物的殘余物中除去溶劑。然后用丙酮洗滌產(chǎn)物，如果需要，還可用丙酮研制以產(chǎn)生白色粉末固體。通過抽濾收集二噁丁環(huán)3。實(shí)施例7．在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中試劑攜帶問題的發(fā)現(xiàn)下面的實(shí)驗(yàn)是在基本上如Kumar等人的美國(guó)專利5,399,497中描述的原型膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)中進(jìn)行的，同時(shí)構(gòu)造了檢測(cè)系統(tǒng)用來(lái)測(cè)量光的發(fā)射(發(fā)光)。該方法和設(shè)備包括輸送液流段穿過特氟隆管，其中在管的內(nèi)表面有碳氟油的隔離層。樣品和試劑被吸入該管中，得到的液體段通過該管移動(dòng)。非均勻免疫測(cè)定法需要的分離步驟和清洗步驟通過磁體得到了促進(jìn)，其將磁性顆粒從一個(gè)水性段轉(zhuǎn)移另一水性段。檢測(cè)系統(tǒng)包括一個(gè)光子計(jì)數(shù)器和一個(gè)纖維光學(xué)讀數(shù)頭，其中的纖維在特氟降管周圍徑向排列以最大化光收集效果。
將TECHNICONIMMUNO 1TSH方法用作檢測(cè)發(fā)光試劑的具有代表性的免疫測(cè)定法。該方法的原理為將含抗原TSH和含熒光素標(biāo)記抗體的第一試劑(R1)，同時(shí)還有含抗體-堿性磷酸酶(ALP)共軛物的第二試劑(R2)保溫培養(yǎng)。每種抗體專門對(duì)應(yīng)TSH抗原上不同的抗原決定部位，所以在這二種抗體和TSH抗原之間促進(jìn)了“三明治”的形成。用含結(jié)合反熒光素(bound anti-fluorescein)的磁性顆粒俘獲該三明治，接下來(lái)清洗該顆粒以除去未結(jié)合的試劑。然后將該顆粒暴露在發(fā)光試劑中，該發(fā)光試劑中含有一種用于ALP的基質(zhì)，并且測(cè)量發(fā)光。
發(fā)光的R3試劑含有0.2mM CSPD即3-(4-甲氧基螺{1,2-二噁丁環(huán)-3,2′(5′-氯)三環(huán)[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉(Tropix,Inc.,Bedford,MA,USA),3mM pyranine(羥基芘磺酸)，1mM MgCl2,1M二乙醇胺緩沖劑(pH10.0),0.1％Triton(三硝基甲苯)X-100和0.1％的NaN3。在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)上作用的順序描繪在圖1中。流體膠囊或測(cè)試包裝含有六個(gè)液體段，每一個(gè)都有28μL的容積。將磁性顆粒(使用于TECHNICON IMMUNO1系統(tǒng)中的1.4μL的磁性顆粒試劑)吸入第一段(MP)，用剩余的液體作顆粒清洗緩沖劑(25mM Tris,pH7.5，包含0.2M NaCl,0.1％ Triton X-100和防腐劑)。將R1(含抗TSH的熒光素標(biāo)記的抗體的血清基溶液10.4μL)，R2(含抗與ALP共軛的TSH的抗體的血清基溶液10.4μL)和S(7.2μL的血清樣品)吸入第二段。接下來(lái)的兩段(W1和W2)包括與上述MP段中使用的相同的清洗緩沖劑。第5段是R3為如上所述的組合物，關(guān)鍵成分是發(fā)光的基質(zhì)和發(fā)光增強(qiáng)劑。第六段是中間測(cè)試(inter-test)緩沖劑(與前面描述的顆粒緩沖劑相同)，用于分隔相鄰的測(cè)試。磁性轉(zhuǎn)移用箭頭繪在圖1中。這些磁性轉(zhuǎn)移通過兩個(gè)磁性轉(zhuǎn)移組合體(M1或M2)的一個(gè)得到了促進(jìn)。在保溫13分鐘之后，保溫期間形成了“三明治”，M1將磁性顆粒轉(zhuǎn)移入R1+R2+S段以開始俘獲。在又經(jīng)過6分鐘后，M2將該顆粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入第一個(gè)清洗段。經(jīng)過12秒后，M2將該顆粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入第二個(gè)清洗段。再經(jīng)12秒后，M2將該顆粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入R3段。從這部分發(fā)出的光如水性段流一樣反復(fù)經(jīng)過光測(cè)量器的讀數(shù)頭從而被測(cè)量到。
由于特氟隆管是透光的，于是預(yù)料到具有光通道的問題(或稱“光攜帶”)。具體地說，一些從相鄰測(cè)試的R3段發(fā)射出的光量子能進(jìn)入特氟隆材料，沿著試管的長(zhǎng)度傳播，并在測(cè)量有意義的測(cè)試信號(hào)期間散射進(jìn)入檢測(cè)器。但是，當(dāng)在相鄰的測(cè)試中檢測(cè)到一個(gè)信號(hào)時(shí)，它并沒有按期望的方式發(fā)生。代替隨著與測(cè)試N的距離而迅速衰減的是，觀測(cè)到輸出光的峰是以相鄰測(cè)試包裝的R3段為中心環(huán)繞，如圖2所示。在圖2中，測(cè)試N發(fā)光程度較高，近似地有7.5×106CPS(每秒鐘的計(jì)數(shù))。將試驗(yàn)品N-1和N-2在試驗(yàn)品N之前吸入管，并先于N通過測(cè)光器，試驗(yàn)品N+1和N+2跟隨在N之后。分析系統(tǒng)記錄了氣流中每一個(gè)單獨(dú)的氣體和液體段的光量子。圖2的分布代表五個(gè)試驗(yàn)品10個(gè)重復(fù)組的平均值，每一個(gè)均對(duì)不存在ALP時(shí)所產(chǎn)生的背景發(fā)光信號(hào)作了修正。從每個(gè)數(shù)值點(diǎn)減去的試劑空白值是從5個(gè)試驗(yàn)品的10個(gè)重復(fù)組中得到的平均值。攜帶信號(hào)數(shù)值是通過把每一個(gè)相鄰測(cè)試的峰值CPS除以試驗(yàn)N中的峰值CPS來(lái)計(jì)算的，表示為每百萬(wàn)之一(ppm)。
這種情況的另一個(gè)可能的解釋是ALP從測(cè)試N中通過一種無(wú)意識(shí)的方式進(jìn)入相鄰測(cè)試的物理攜帶。這是可能發(fā)生的，例如，如果該管包含有沉積在其壁上的顆粒物質(zhì)，它能破壞液體段通過管的平穩(wěn)運(yùn)動(dòng)。但是，在相鄰測(cè)試的R3段中放置10mM的無(wú)機(jī)磷酸鹽，沒有影響相鄰測(cè)試中的信號(hào)值。由于在這些測(cè)試條件下，這種數(shù)量的磷酸鹽本來(lái)會(huì)抑制至少90％的ALP，所以物理攜帶的可能性被排除了。
為進(jìn)一步排除光學(xué)攜帶，只在試驗(yàn)N中省略熒光增強(qiáng)劑羥基吡磺酸，但其存在于鄰近測(cè)試中。結(jié)果，測(cè)試N中信號(hào)的量降低了大約10倍。但是，如附圖中圖3所示，相鄰試劑中峰的高度沒有明顯的變化。攜帶信號(hào)不在相鄰試劑中明顯的成比例的變化這一事實(shí)清楚地證明了這種攜帶不是光學(xué)的。
另外的和意想不到的攜帶類型是引起攜帶問題的原因。已發(fā)現(xiàn)羥基二噁丁環(huán)中間體在用于涂覆特氟隆內(nèi)表面的碳氟油中是充分可溶的，結(jié)果是攜帶歸結(jié)于由于溶解的羥基二噁丁環(huán)中間體通過油轉(zhuǎn)移進(jìn)入相鄰測(cè)試的R3段。這一過程是通過改變?cè)谙噜徳噭┲蠷3段的緩沖劑，從pH10的1M DEA到pH7的1M Tris來(lái)檢測(cè)的。當(dāng)pH7時(shí)，在R3段中溶解的羥基二噁丁環(huán)中間體是穩(wěn)定的并且不發(fā)射光。如附圖中圖4所示，這種在pH方面的改變的結(jié)果是徹底消除了邊帶發(fā)光。在N+1和N-1測(cè)試中剩余的較少的攜帶是由預(yù)計(jì)的光學(xué)攜帶引起。這些結(jié)果證明了在相鄰的測(cè)試中峰的光發(fā)射源是羥基二噁丁環(huán)的“化學(xué)攜帶”，而羥基二噁丁環(huán)是來(lái)源于CSPD，進(jìn)入鄰近測(cè)試的R3段。實(shí)施例8 觀察到的有二羧基酸取代二噁丁環(huán)1的化學(xué)攜帶的消除表1表示了在反應(yīng)中間體的化學(xué)攜帶問題上，使用其它三種二噁丁環(huán)的效果。LUMIGEN PPD[4-(甲氧基)-4-(3-磷酰基氧苯基)]螺[1,2-二噁丁環(huán)-3,2′-三環(huán)[3.3.1.13,7]-癸烷](Lumigen Inc.,Southfield,MI,USA)，二噁丁環(huán)2(一個(gè)單羧酸衍生物)和二噁丁環(huán)1(一個(gè)二羧酸衍生物)，均以相同濃度用在測(cè)試配方中。ppm欄是N+1測(cè)試的信號(hào)，其代表了最壞的情況。發(fā)現(xiàn)未改性的母體化合物(PPD)的攜帶是所觀察到的CSPD的2倍多。令人驚奇地是單羧酸衍生物，二噁丁環(huán)3，顯示化學(xué)攜帶的數(shù)量只有84％的減少。這表明，單個(gè)帶電基團(tuán)不足以完全阻止反應(yīng)中間體在碳氟油中的溶解。但是，二羧酸衍生物卻是100％有效的，表明兩個(gè)帶電基團(tuán)可充分達(dá)到所期望的結(jié)果。表1．化學(xué)攜帶的減少化合物 ppm 減少％LUMIGEN PPD1640二噁丁環(huán)2 260 84二噁丁環(huán)1 0100實(shí)施例9 增強(qiáng)劑的作用作為基于二噁丁環(huán)1試劑的最優(yōu)化的一部分，檢驗(yàn)了許多增強(qiáng)劑材料。在pH值為9.6時(shí)，增強(qiáng)劑A(1-三辛鏻甲基-4-三丁基鏻甲基苯二氯化物)提高發(fā)了光信號(hào)6.2倍，增強(qiáng)劑B(聚(乙烯基芐基三丁基鏻二氯化物))提高了信號(hào)19.7倍。pH為10.0時(shí)，增強(qiáng)劑A提高了信號(hào)4.8倍，而增強(qiáng)劑B提高了信號(hào)18.9倍。
盡管事實(shí)是增強(qiáng)劑B可獲得更高的光強(qiáng)度，但還是優(yōu)選增強(qiáng)劑A用于分析系統(tǒng)，因?yàn)樗且环N小分子量的單體化合物。聚合物，特別地如果它們是聚陽(yáng)離子的，會(huì)與血清組分相互作用，引起沉降，這會(huì)給分析系統(tǒng)的操作帶來(lái)明顯的問題。
已發(fā)現(xiàn)熒光素和羥基芘磺酸都可以有效地用作與增強(qiáng)劑A結(jié)合的補(bǔ)充的熒光增白劑。這些熒光增白劑單獨(dú)使用時(shí)，必須在相對(duì)較高的濃度3mM，以為了達(dá)到10倍的提高。但是，結(jié)合增強(qiáng)劑A后，觀測(cè)到協(xié)同效果，此時(shí)得到可比較的提高，而熒光增白劑的濃度與無(wú)增強(qiáng)劑時(shí)相比，降低了100倍。表2和表3顯示了由羥基芘磺酸和熒光素引起的增加量，增強(qiáng)劑的存在量分別為1mg/mL。表2．通過具有增強(qiáng)劑A的羥基芘磺酸的提高[羥基芘磺酸](mM)提高倍數(shù)0.013.70.027.30.039.80.0412.20.0513.7表3．通過具有增強(qiáng)劑A的熒光素的提高[熒光素](mM)提高倍數(shù)0.012.60.024.00.057.10.108.7實(shí)施例10 膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)的優(yōu)化配方上面的觀察結(jié)果導(dǎo)致膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)優(yōu)化配方的研制。這種配方包括0.1-1mM二噁丁環(huán)1，0-0.05mM的羥基芘磺酸，0.1-5mg/mL的增強(qiáng)劑A，0-1mM Mg+2，0.1-1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇(pH10.0)和0.01-1％TritonX-100。使用這一配方的結(jié)果為化學(xué)攜帶問題的完全消除和增強(qiáng)的性能。實(shí)施例11 用酶檢驗(yàn)法測(cè)定二噁丁環(huán)1,3,4和5的穩(wěn)定性分別地制備含0.1mg/mL增強(qiáng)劑A,0.88mM Mg+2,0.2M2-氨基-2甲基-1-丙醇(pH10)，0.1％TritonX-100和0.5M的二噁丁環(huán)1,3,4和5，并在4℃、25℃和40℃下分別保存在不透明的聚乙烯瓶中。從每一個(gè)瓶中吸取24個(gè)100μL的等分試樣，放入具有96套管板(well plate)的套管(well)中，將該溶液在37℃保溫，向每一個(gè)套管中注入10μL包含8×10-17摩爾AP的溶液，對(duì)經(jīng)過5小時(shí)的光強(qiáng)度求積分。數(shù)據(jù)是所有24個(gè)套管的平均值。對(duì)每一種二噁丁環(huán)，在指定的時(shí)間間隔重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。在圖5的結(jié)果顯示在25℃時(shí)三種配方比較的穩(wěn)定性。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)事實(shí)上氟取代的二噁丁環(huán)3比氯取代的二噁丁環(huán)4和非鹵素取代的二噁丁環(huán)1表現(xiàn)出更好的貯存穩(wěn)定性，在40℃時(shí)二噁丁環(huán)3和5也基本上比1和4更穩(wěn)定。表4．配方的貯存穩(wěn)定性時(shí)間(星期)剩余的二噁丁環(huán)％1 3450 100 100 100 1001 94.81002 91.1 77.0 99.83 87.5 99.1 66.04 84.1 65.6 99.45 81.86 80.79 76.5 96.910 57.51296.71493.82193.6實(shí)施例12 二噁丁環(huán)3的性能在如實(shí)施例7所述的測(cè)試系統(tǒng)中，評(píng)估了摻入二噁丁環(huán)3的檢測(cè)試劑。該測(cè)試材料是熒光素標(biāo)記的堿性磷酸酶，其被俘獲到磁性顆粒上。使用含3試劑的AP的測(cè)定法與使用二噁丁環(huán)1的結(jié)果相比，得到的結(jié)果具有靈敏性。動(dòng)力范圍和精確性。
前面的實(shí)施例僅僅是舉例說明，不能用來(lái)限制本發(fā)明。本發(fā)明的范圍只在所附的權(quán)利要求書和同等材料中指出。
注Ac乙?；鵇MF二甲基甲酰胺DMSO二甲基亞砜Et乙基EtOAc乙酸乙酯THF四氫呋喃
權(quán)利要求
1．一種制備具有下式的二噁丁環(huán)鹽化合物的方法，
其具有高貯存穩(wěn)定性，其中R3和R4均可選自非環(huán)、單環(huán)、多環(huán)有機(jī)基團(tuán)，這些有機(jī)基團(tuán)能任意地被雜原子取代，并且R3和R4可任意地連接在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)，并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上；其中R2是一個(gè)芳環(huán)基，可選自苯基和萘基，其可以包含附加的取代基，其中Z選自鹵素原子和有1-4個(gè)碳原子的烷基，M選自氫，堿金屬離子或季銨或季鏻離子，該方法包括以下步驟a)將具有下式的第一烯烴化合物與一種Z-取代丙二酸酯和一種堿反應(yīng)，
其中RG是一個(gè)可除去基團(tuán)，生成丙二酸酯取代的烯烴化合物，如下式
其中R′是一個(gè)有1-4個(gè)碳的烷基；b)在氧和丙二酸酯取代的烯烴化合物的存在條件下，通過照射敏化劑來(lái)光氧化丙二酸酯取代的烯烴化合物，形成一丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)，如下式
c)將丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)與式為WP(O)Y2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中，W和Y均是從鹵素原子，取代或非取代烷氧基，芳氧基，芳烷氧基和三烷基甲硅烷基氧基中選出，生成具有下式的磷酸化的二噁丁環(huán)化合物；和
d)在水性溶劑中用式為M-Q的堿水解磷酸化的二噁丁環(huán)，其中Q是堿性陰離子，形成二噁丁環(huán)鹽化合物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)化合物與磷酸化試劑反應(yīng)這步包含下面幾個(gè)步驟a)將丙二酸酯取代的二噁丁環(huán)化合物與具有式WP(O)Y′2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中Y′是鹵素原子，生成具有下式的二噁丁環(huán)磷酰基鹵化物；和
b)將二噁丁環(huán)磷酰基鹵化物與具有式Y(jié)-OH的羥基化合物反應(yīng)，其中Y是從取代或者未取代烷基中選出的，生成磷酸化的二噁丁環(huán)化合物。
3．權(quán)利要求1的方法，其中試劑WP(O)Y2為POCl3。
4．權(quán)利要求1的方法，其中R3和R4是結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)并螺合到二噁丁環(huán)環(huán)上的R5基團(tuán)，并且該二噁丁環(huán)鹽化合物具有如下結(jié)構(gòu)
5．權(quán)利要求4的方法，其中R5是一個(gè)取代或者未取代的金剛烷基。
6．權(quán)利要求1的方法，其中R2是一個(gè)取代或未取代的間苯基。
7．權(quán)利要求1的方法，其中Z是從F和CH3是選出的，而M是Na。
8．權(quán)利要求5的方法，其中Z是從CH3和F中選出的，M是Na,R2是一個(gè)取代或未取代的間苯基。
9．權(quán)利要求5的方法，其中Z是CH3，M是Na，R2是一個(gè)未取代的間苯基，R5是一個(gè)未取代的金剛烷基，并且該二噁丁環(huán)鹽化合物具有如下結(jié)構(gòu)
10．權(quán)利要求5的方法，其中Z是F,M是Na,R2是一個(gè)未取代的間苯基，R5是一個(gè)未取代的金剛烷基，并且該二噁丁環(huán)鹽化合物具有如下結(jié)構(gòu)
11．制備一個(gè)具有下式的二噁丁環(huán)鹽化合物的方法，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性，其中R3和R4均可選自非環(huán)、單環(huán)和多環(huán)基團(tuán)，這些有機(jī)基團(tuán)可以任意地被雜原子取代，且R3和R4可以任意地連接在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)，并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其中R2是一個(gè)芳基環(huán)，可選自苯基和萘基，其可包含附加的取代基，其中Z是從鹵素原子和有1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，M是從氫、堿金屬離子、季銨或鏻離子中選出的，該方法包括以下幾個(gè)步驟a)具有下式的第一烯烴化合物與一Z取代的丙二酸酯和一種堿反應(yīng)，
其中RG是一個(gè)可除去基團(tuán)，生成具有下式的丙二酸酯取代的烯烴化合物，其中R′是有1-4個(gè)碳原子的烷基；
b)丙二酸酯取代的烯烴與式為WP(O)Y2的磷酸化試劑反應(yīng)，其中W是從鹵素中選出的，而Y是一個(gè)鹵素原子，生成一個(gè)具有下式的磷酸化的烯烴化合物
c)磷酸化的烯烴化合物與式為Y′-OH的羥基化合物反應(yīng)，其中Y′是從取代的或未取代的烷基中選出的，生成第二磷酸化的烯烴化合物，結(jié)構(gòu)如下
d)第二磷酸化的烯烴在含有堿的水性溶劑中水解，形成一個(gè)具有下式的烯烴鹽化合物，其堿式為M-Q，其中Q是一個(gè)堿性陰離子；和
e)烯烴鹽化合物在氧和烯烴鹽化合物水溶液存在下，通過照射敏化劑發(fā)生光氧化反應(yīng)，形成二噁丁環(huán)鹽化合物。
12．權(quán)利要求11的方法，其中R3和R4結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)R5并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，該二噁丁環(huán)鹽化合物具有下式
13．權(quán)利要求12的方法，其中R5是一個(gè)取代的或未取代的金剛烷基團(tuán)。
14．權(quán)利要求11的方法，其中R2是一個(gè)取代的或未取代的間苯基。
15．權(quán)利要求11的方法，其中Z是從F和CH3中選出的，且M是Na。
16．權(quán)利要求13的方法，其中Z是從F和CH3中選出的，M是Na，R2是一個(gè)取代的或未取代的間苯基。
17．權(quán)利要求13的方法，其中Z是CH3，R2是一個(gè)未取代的間苯基，R5是未取代的金剛烷基，并且該二噁丁環(huán)鹽化合物具有下式
18．權(quán)利要求13的方法，其中Z是F，R2是一個(gè)未取代的間苯基，R5是未取代的金剛烷基，并且該二噁丁環(huán)鹽化合物具有下式
19．一種具有下式的烯烴化合物，
其中Z是從鹵素原子和具有1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，每個(gè)R′都是有1-4個(gè)碳原子的烷基。
20．權(quán)利要求19的化合物，其中Z是F，R′是乙基。
21．權(quán)利要求19的化合物，其中Z是CH3，R′是乙基。
22．一種具有下式的烯烴化合物，
其中Z是從鹵素原子和含1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，每個(gè)R′都是含1-4個(gè)碳原子的烷基，每個(gè)Y都是從鹵素原子，取代或未取代的烷氧基、芳氧基、芳烷氧基和三烷基甲硅烷基氧基團(tuán)中選出的。
23．權(quán)利要求22的化合物，其中Z是F，每個(gè)Y都是2-氰乙基。
24．權(quán)利要求22的化合物，其中Z是CH3，每個(gè)Y都是2-氰乙基。
25．一種具有下式的烯烴化合物，
其中Z是從鹵原子和含1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，每個(gè)R′都是含1-4個(gè)碳原子的烷基，并且M是從鹵素，堿金屬離子、季銨或鏻離子選出的。
26．權(quán)利要求25的化合物，其中Z是F，并且每個(gè)M均是鈉原子。
27．權(quán)利要求25的化合物，其中Z是CH3，并且每個(gè)M均是鈉原子。
28．一種具有下式的二噁丁環(huán)化合物，
其中Z是從鹵原子和具有1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，每個(gè)R′均是一個(gè)含1-4個(gè)碳原子的烷基。
29．權(quán)利要求28的化合物，其中Z是F，R′是乙基。
30．權(quán)利要求28的化合物，其中Z是CH3，R′是乙基。
31．一種具有下式的二噁丁環(huán)化合物，
其中Z是從鹵原子和含1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，每個(gè)R′均是一個(gè)含1-4碳原子的烷基，并且每個(gè)Y均是從Cl原子和2-氰乙基中選出的。
32．權(quán)利要求31的化合物，其中Z是F，Y是Cl,R′是乙基。
33．權(quán)利要求31的化合物，其中Z是CH3，Y是Cl,R′是乙基。
34．權(quán)利要求31的化合物，其中Z是F，Y是2-氰乙基，R′是乙基。
35．權(quán)利要求31的化合物，其中Z是CH3，Y是2-氰乙基，R′是乙基。
36．一種具有下式的二噁丁環(huán)，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性，其中R3和R4每一個(gè)都是從非環(huán)、單環(huán)和多環(huán)有機(jī)基團(tuán)中選出的，這些有機(jī)基團(tuán)可任意地被雜原子取代，并且R3和R4可以任意地結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)，且螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其中R2是一個(gè)可以從能包含附加取代基的苯基和萘基中選出的芳基環(huán)，其中Z是從氟原子和具有1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，M是從氫，堿金屬離子或季銨或鏻離子中選出的，并且其中X是一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其可以被一活化劑除去以產(chǎn)生光。
37．一種具有下式的穩(wěn)定的二噁丁環(huán)，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性，其中R5選自單環(huán)和多環(huán)烷基，且螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其含有6-30個(gè)碳原子，同時(shí)它還能任意地包括附加的取代基，其中R2是從苯基和萘基中選出的，其可以任意地包含附加的取代基，其中Z是從氟原子和具有1-4個(gè)碳原子的烷基中選出的，M是從氫、堿金屬離子、季銨或鏻離子中選出的，X是一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其可被活化劑除去以產(chǎn)生光。
38．權(quán)利要求37的二噁丁環(huán)，其具有下式
39．任一項(xiàng)權(quán)利要求36、37或38中的二噁丁環(huán)，其中OX基團(tuán)選自O(shè)-M+基團(tuán)，OOCR8基團(tuán)，OPO3-2鹽、OS3-鹽、β-D-半乳糖苷氧和β-D-葡萄糖苷酸氧基團(tuán)，在OM+基團(tuán)中M是從氫、堿金屬離子、季銨或季鏻離子中選出的，在OOCR8基團(tuán)中，R8是從含有2-8個(gè)碳原子的烷基和芳基中選出的，其可任意地包含雜原子。
40．一種具有下式的二噁丁環(huán)，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性。
41．一種具有下式的二噁丁環(huán)，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性。
42．一種用來(lái)產(chǎn)生光的組合物，在水溶液中其包括(a)一種具有下式的穩(wěn)定的二噁丁環(huán)，
其具有提高的貯存穩(wěn)定性，其中R3和R4每一個(gè)均是從由非環(huán)、單環(huán)和多環(huán)有機(jī)基團(tuán)組成的組中選出，這些有機(jī)基團(tuán)可任意地被雜原子取代，并且R3和R4可以任意地結(jié)合在一起形成單環(huán)或多環(huán)的基團(tuán)，并螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，其中R2是從由苯基和萘基組成的組中選出的，該基團(tuán)能包含附加的取代基，其中Z是從由氟原子和具有1-4個(gè)碳原子烷基組成的組中選出的，M是從氫、堿金屬離子、季銨或季鏻離子中選出的，X是一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，其可以被活化劑除去以產(chǎn)生光；和(b)一種非聚合的陽(yáng)離子增強(qiáng)劑物質(zhì)，與不存在增強(qiáng)劑的情況相比，它可以提高二噁丁環(huán)與活化劑反應(yīng)所產(chǎn)生的光量。
43．權(quán)利要求42的組合物，其中增強(qiáng)劑物質(zhì)是下式的二陽(yáng)離子表面活性劑，+ +Y-R3ACH2-Link-CH2AR3Y-其中每個(gè)A均是獨(dú)立地從由P和N原子組成的組中選出的，其中Link是至少含有兩個(gè)碳原子的有機(jī)連接基團(tuán)，它是從由取代和未取代的芳基，烷基，鏈烯基，炔基組成的組中選出的，且其中的連接基團(tuán)能任意地包含雜原子，R是從含有1-20個(gè)碳原子的低級(jí)烷基或芳烷基中選出的，Y是一個(gè)陰離子。
44．權(quán)利要求45的組合物，其中增強(qiáng)劑物質(zhì)是具有下式的二陽(yáng)離子表面活性劑，+ +Cl-(n-C4H9)3PCH2-Link-CH2P(n-C8H17)3Cl-其中Link是亞苯基。
45．權(quán)利要求42、43或44中任一項(xiàng)的組合物，其中二噁丁環(huán)具有下式
其中R5是從單環(huán)或多環(huán)烷基中選出的，且R5螺合到二噁丁環(huán)的環(huán)上，R5包含6-30個(gè)碳原子，并能任意地包含附加取代基。
46．權(quán)利要求45的組合物，其中R5是從金剛烷基和取代金剛烷基中選出。
47．權(quán)利要求45的組合物，其中二噁丁環(huán)具有下式
48．權(quán)利要求45的組合物，其中二噁丁環(huán)具有下式
全文摘要
本發(fā)明提供了穩(wěn)定的酶催觸發(fā)化學(xué)發(fā)光的1,2－二噁丁環(huán),其具有改進(jìn)的水溶性和貯存穩(wěn)定性,本發(fā)明還提供了其合成方法和制備中所用的中間體。該二噁丁環(huán)進(jìn)一步用兩個(gè)或多個(gè)排列于該二噁丁環(huán)結(jié)構(gòu)上的水溶性基團(tuán)和另外的氟原子或低級(jí)烷基取代,其在用于在膠囊化學(xué)分析系統(tǒng)上使用的測(cè)試法中時(shí),通過消除試劑攜帶問題而提供了優(yōu)越的性能。這些二噁丁環(huán)表現(xiàn)出基本改進(jìn)的貯存穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了包含這些二噁丁環(huán),一種非聚合陽(yáng)離子表面活性增強(qiáng)劑和一種任選的熒光增白劑的組合物,用以提供強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。
文檔編號(hào)C07F9/655GK1208399SQ97191624
公開日1999年2月17日 申請(qǐng)日期1997年11月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月8日
發(fā)明者哈希姆·阿克海瓦-塔費(fèi)蒂, 扎拉·阿格哈瓦尼, 雷努卡·德席爾瓦, 庫(kù)馬·撒庫(kù)爾 申請(qǐng)人:魯米根公司