專利名稱：糖修飾的缺口寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于激發(fā)RNase H活性(用于相反鏈中的鏈切割)的寡核苷酸的合成方法和用途。包括在本發(fā)明中的是這樣一些寡核苷酸，其中所說寡核苷酸的至少一些核苷單位是核酸酶抗性功能化的，所說寡核苷酸的至少一些核苷單位包括加強寡核苷酸與核酸互補鏈雜交的取代基，以及所說寡核苷酸的至少一些核苷單位包括2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖組分。所說的寡核苷酸可用于治療學(xué)、診斷學(xué)和作為研究試劑。
背景技術(shù)：
已知寡核苷酸與單鏈的DNA或者RNA分子雜交。雜交是寡核苷酸的核堿基(nucleobase)與靶DNA或者RNA的核堿基的序列特異性堿基對氫鍵結(jié)合。一般認為這樣的核堿基對是相互互補的。
在測定寡核苷酸與互補核酸的雜交程度時，通過測定特定的雜交復(fù)合體的解鏈溫度，可以比較寡核苷酸與互補核酸結(jié)合的相對能力。作為雙螺旋的一個特征物理性質(zhì)，解鏈溫度(Tm)表示當50％螺旋(雜交的)-卷曲(未雜交的)形式出現(xiàn)時的溫度(攝氏度)。通過利用紫外光譜測定雜交復(fù)合體的形成和斷裂(解鏈)來測量Tm。在雜交期間發(fā)生的堿基堆積伴隨著紫外吸收的減弱(減色性)。因而，紫外吸收的減弱表明更高的Tm。Tm越高，鏈之間的鍵強度越大。
通過利用胞內(nèi)酶RNase H，寡核苷酸可以用來實現(xiàn)靶RNA的酶促切割。一般認為這樣的RNase H切割的機理要求2’-脫氧呋喃核糖基寡核苷酸與靶RNA雜交。所產(chǎn)生的DNA-RNA雙螺旋激活RNase H酶，并且該活化的酶切割RNA鏈。RNA鏈的切割破壞了RNA的正常功能。一般認為硫代磷酸寡核苷酸經(jīng)由這類機理操縱。然而，對于有用于RNase H的細胞活化的DNA寡核苷酸來說，優(yōu)選地，寡核苷酸對核酸酶是相當穩(wěn)定的以便在細胞中存活足以使RNase H活化的一段時間。對于非細胞用途(如作為研究試劑的寡核苷酸用途)來說，這樣的核酸酶穩(wěn)定性可以是不必要的。
數(shù)種出版物描述了RNase H和寡核苷酸的相互作用。尤其感興趣的是(1)Dagle等，核酸研究，1990,18,4751；(2)Dagle等，反義研究與發(fā)展，1991,1,11；(3)Eder等，生物化學(xué)雜志，1991,266,6472；以及(4)Dagle等，核酸研究，1991,19,1805。按照這些出版物，既具有未修飾磷酸二酯核苷間鍵合也具有修飾硫代磷酸酯核苷間鍵合的DNA寡核苷酸是細胞RNase H的底物。由于它們是底物，因此它們激活靶RNA的RNase H切割。然而，作者還注意到在非洲蟾蜍屬胚胎中，磷酸二酯鍵合以及硫代磷酸酯鍵合都易于為外切核酸酶降解。這樣的核酸酶降解是有害的，因為它迅速耗盡可供RNase H活化使用的寡核苷酸。
如參考文獻(1)、(2)和(4)中所描述的，為了使抗核酸酶降解的寡核苷酸穩(wěn)定而又能提供RNase H活化作用，人們構(gòu)建了具有短區(qū)段的磷酸二酯鍵合核苷(位于氨基磷酸酯、烷基膦酸酯或者磷酸三酯鍵合的區(qū)段之間)的2’-脫氧寡核苷酸。當使包含氨基磷酸酯的寡核苷酸抗外切核酸酶穩(wěn)定時，在參考文獻(4)中作者特別提到每一種氨基磷酸酯鍵合在包含氨基磷酸酯的寡核苷酸的Tm測量值方面導(dǎo)致1.6℃的損失。在Tm值方面的這種減少表明在寡核苷酸和其靶鏈之間的雜交方面的減少。
其它作者曾評論了在寡核苷酸和其靶鏈之間的雜交的這種損失所可能有的影響。Saison-Behmoaras等(EMBO雜志，1991,10,1111)觀察到盡管寡核苷酸可以是RNase H的底物，但是由于寡核苷酸與mRNA之間的弱雜交，RNase H的切割效率是低的。作者也注意到在寡核苷酸的3’末端包含的吖啶取代保護了寡核苷酸免受外切核酸酶的影響。
美國專利5,013,830(1991年5月7日頒發(fā))揭示了包含RNA寡聚體或者其衍生物的混合寡聚體，該混合寡聚體經(jīng)由磷酸二酯鍵合與DNA寡聚體連結(jié)。RNA寡聚體也攜帶2’-O-烷基取代基。然而，正是由于磷酸二酯，使得寡聚體對核酸酶切割敏感。
歐洲專利申請339,842(1989年4月13日遞交)揭示了包括2’-O-甲基核糖寡核苷酸硫代磷酸酯衍生物的2’-O-取代的硫代磷酸酯寡核苷酸。上述申請也揭示了缺乏核酸酶抗性的2’-O-甲基磷酸二酯寡核苷酸。
美國專利5,149,797(1992年9月22日頒發(fā))揭示了混合的磷酸酯主鏈寡核苷酸，其包括為磷酸二酯鍵所結(jié)合的、并為一部分修飾DNA或者RNA序列在每一側(cè)面上側(cè)結(jié)合的脫氧核苷酸的內(nèi)部部分。側(cè)翼序列包括膦酸甲酯、嗎啉磷酸酯(phosphoromorpholidate)、哌嗪磷酸酯(phosphoropiperazidate)或者氨基磷酸酯鍵。
美國專利5,256,775(1993年10月26日頒發(fā))描述了摻入氨基磷酸酯鍵和硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯鍵的混合寡核苷酸。
當人們認識到靶RNA鏈的切割(利用寡核苷酸和RNase H)將是有用的時候，寡核苷酸的核酸酶抗性和雜交的保真性在寡核苷酸治療學(xué)的發(fā)展中是十分重要的。因此，長期以來一直感到需要一些方法和材料，當同時保持或者改進雜交性質(zhì)并提供核酸酶抗性時，這些方法和材料能夠激活RNase H。這樣的寡核苷酸也要求作為研究試劑和診斷試劑。
發(fā)明概要按照本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供了由核苷單位的序列形成的寡核苷酸。該寡核苷酸摻入增加寡核苷酸的核酸酶抗性的功能化的至少一個核苷單位。此外，寡核苷酸的至少一些核苷單位是用取代基功能化的，以增加寡核苷酸與靶核糖核酸的結(jié)合親和性，同時至少一些核苷單位具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。
在本發(fā)明的優(yōu)選的寡核苷酸中，增加結(jié)合親和性功能化的核苷單位包括2’-取代基。在優(yōu)選的實施方案中，2’-取代基包括氟基、C1-C20烷氧基、C1-C9氨基烷氧基(包括氨基丙氧基)、烯丙氧基、咪唑烷氧基和聚乙二醇。優(yōu)選的烷氧基取代基包括甲氧基、乙氧基和丙氧基。一個優(yōu)選的氨基烷氧基單位是氨基丙氧基。一個優(yōu)選的咪唑烷氧基取代基是咪唑丙氧基。一個優(yōu)選的聚乙二醇取代基是-O-乙基-O-甲基或者甲氧基乙氧基(-O-CH2-CH2-O-CH3)。
本發(fā)明的寡核苷酸包括由帶電磷鍵(選自由磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵組成的組中)連接的核苷單位。
本發(fā)明的寡核苷酸包括許多攜帶取代基(增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性)的結(jié)合核苷單位。在某些優(yōu)選的實施方案中，具有攜帶這樣的取代基的核苷單位的寡核苷酸序列可以劃分成第一亞序列和第二亞序列，其中第一亞序列具有攜帶2’-取代-赤型-呋喃戊糖基糖組分的結(jié)合核苷單位而第二亞序列具有攜帶2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分的結(jié)合核苷單位。優(yōu)選地，所說的第二亞序列具有至少三個核苷單位，更優(yōu)選地，具有至少五個核苷單位。在其它優(yōu)選的實施方案中有第三亞序列，其中的核苷單位選自那些可由第一亞序列選擇的核苷單位。優(yōu)選的是，第二亞序列位于第一和第三亞序列之間。本發(fā)明的這樣的寡核苷酸也稱作“嵌合體”或者“嵌合的”或“有缺口的”寡核苷酸。
在本發(fā)明的其它優(yōu)選寡核苷酸中，攜帶增加結(jié)合親和性的取代基的核苷單位位于寡核苷酸的一或兩個3’或5’末端。可以有一個至大約八個為取代基取代的核苷單位。優(yōu)選地，至少五個核苷單位攜帶2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。
本發(fā)明的寡核苷酸的核苷單位包含由磷鍵(如磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵)與2’-取代和2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分結(jié)合的核堿基。本發(fā)明的優(yōu)選的核堿基包括嘌呤和嘧啶(如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶)以及其它合成的和天然的核堿基(如黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、氨基、巰基、硫代烷基、羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶以及7-甲基鳥嘌呤)。其它嘌呤和嘧啶包括那些在美國專利3,687,808中所揭示的嘌呤和嘧啶、那些在聚合物科學(xué)和工程的簡明百科全書(第858-859頁，Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley和Sons,1990)中所揭示的嘌呤和嘧啶以及那些由Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613所揭示的嘌呤和嘧啶。
本發(fā)明也提供了用于治療患有疾病(以產(chǎn)生不需要的蛋白質(zhì)為特征)的有機體的方法。這些方法包括使有機體與具有核苷單位的序列的寡核苷酸相接觸，所說的核苷單位的序列能夠特異地與核酸的互補鏈雜交，所說的核酸具有至少一個增加寡核苷酸對核酸酶的核酸酶抗性的功能化的核苷單位、具有位于其上以增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性的取代基、以及具有許多有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分的核苷單位。
按照本發(fā)明，還提供了包括藥學(xué)上有效量的寡核苷酸的組合物，所說的寡核苷酸具有能夠特異地與核酸的互補鏈雜交的核苷單位的序列，所說的核酸具有至少一個增加寡核苷酸對核酸酶的核酸酶抗性的功能化的核苷單位，其中許多核苷單位具有位于其上以增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性的取代基，以及其中許多核苷單位具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。該組合物還包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑或者載體。
按照本發(fā)明，還提供了序列特異性核酸的體外修飾方法，該方法包括使包含RNase H酶和上述核酸的試液與具有核苷單位(能夠特異地與核酸的互補鏈雜交)的序列的寡核苷酸接觸，其中至少一個核苷單位是增加寡核苷酸對核酸酶的核酸酶抗性功能化的，其中許多核苷單位具有位于其上以增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性的取代基，并且其中許多核苷單位具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。
也提供了同時增強有機體中的雜交和RNase H酶活化作用的方法，該方法包括使有機體與具有核苷單位(能夠特異地與核酸的互補鏈雜交)的序列的寡核苷酸相接觸，其中至少一個核苷單位是增加寡核苷酸對核酸酶的核酸酶抗性功能化的，其中許多核苷單位具有位于其上以增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性的取代基，以及其中許多核苷單位具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。
本發(fā)明還提供了用于在有機體或者細胞中檢測反常RNA分子的存在或缺乏、或者正常RNA分子的反常或者不適當表達的診斷方法。
附圖簡要描述

圖1是顯示本發(fā)明的寡核苷酸和參比化合物的劑量反應(yīng)活性的線狀圖表。
圖2是顯示本發(fā)明的寡核苷酸和參比化合物的劑量反應(yīng)活性的柱狀圖表。
圖3是顯示幾個2’-O-甲基嵌合的寡核苷酸對PKC-αmRNA水平的影響的柱狀圖表。斜線柱表示8.5kb轉(zhuǎn)錄物，空白柱表示4.0kb轉(zhuǎn)錄物。
圖4是顯示幾個2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸對PKC-αmRNA水平的影響的柱狀圖表。斜線柱表示8.5kb轉(zhuǎn)錄物，空白柱表示4.0kb轉(zhuǎn)錄物。
圖5是顯示附加的2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸對PKC-αmRNA水平的影響的柱狀圖表。斜線柱表示8.5kb轉(zhuǎn)錄物，空白柱表示4.0kb轉(zhuǎn)錄物。
圖6a和6b是顯示2’甲氧基乙氧基修飾的、具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸對在A549細胞中的PKC-αmRNA水平的影響的線狀圖表。圖6a顯示與脫氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)作比較的ISIS9605的影響。圖6b顯示與脫氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)作比較的ISIS9606的影響。
圖7a和7b是顯示具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸對在裸鼠中的人結(jié)腸癌(Colo205)腫瘤異種移植的生長的影響的線狀圖表。圖7a顯示脫氧硫代磷酸酯化合物(ISIS3521)的影響。圖7b顯示2’甲氧基乙氧基修飾的化合物(ISIS12723)的影響。
圖8a和8b是顯示ISIS5132(圖6a)和CGP69845(相同序列的2’甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)形式)(圖6b)對在裸鼠中的A549肺腫瘤異種移植的生長的影響的線狀圖表。
圖9是顯示一種對照化合物與兩種本發(fā)明化合物的小鼠血漿濃度的線狀圖表。血漿濃度對時間作圖。
圖10是顯示一種對照化合物在小鼠的各種組織中的分布的三維柱狀圖表。具體的組織顯示在一個軸上，時間在第二個軸上和劑量百分比在第三個軸上。該化合物通過靜脈注射傳送。
圖11是顯示本發(fā)明的一種化合物在小鼠的各種組織中的分布的三維柱狀圖表。具體的組織顯示在一個軸上，時間在第二個軸上和劑量百分比在第三個軸上。該化合物通過靜脈注射傳送。
圖12是顯示本發(fā)明的另一種化合物在小鼠的各種組織中的分布的三維柱狀圖表。具體的組織顯示在一個軸上，時間在第二個軸上和劑量百分比在第三個軸上。該化合物通過靜脈注射傳送。
發(fā)明的詳盡描述按照本發(fā)明的目的，提供了新的寡核苷酸，該寡核苷酸增加了核酸酶抗性和與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性，并且是RNase H的底物。本發(fā)明的寡核苷酸由許多核苷單位裝配。本發(fā)明的每一種寡核苷酸包括至少一個增加寡核苷酸的核酸酶抗性功能化的核苷單位。此外，在本發(fā)明的一些實施方案中，至少一些核苷單位攜帶增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性的取代基。另外，至少一些核苷單位包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。
結(jié)合上述闡述，本發(fā)明的寡核苷酸的每一個核苷單位(可選擇地稱作為“核苷”或者“亞單位”)可以是“天然的”或者“合成的”組分。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“寡核苷酸”指的是由許多結(jié)合的核苷單位形成的寡聚體。核苷單位經(jīng)由磷鍵(如磷酸二酯或者硫代磷酸酯鍵)結(jié)合在一起。核苷單位由天然或者非天然存在的核堿基和呋喃戊糖基糖組分形成。因此術(shù)語“寡核苷酸”有效地包括由天然存在的核苷單位形成的天然存在的產(chǎn)物或者合成的產(chǎn)物。
本發(fā)明的寡核苷酸也可以包括修飾的亞單位。修飾可以發(fā)生在核苷的核堿基部分上、核苷的糖部分上或者一個核苷與下一個核苷結(jié)合的鍵上。
在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)通過在寡核苷酸的核苷單位中摻入取代基，可以增加本發(fā)明的寡核苷酸的結(jié)合親和性。優(yōu)選的取代基是2’取代基，即位于本發(fā)明的寡核苷酸的核苷單位的呋喃戊糖基糖組分的2’位置的取代基。目前優(yōu)選的取代基包括氟基、烷氧基、氨基烷氧基、烯丙氧基、咪唑烷氧基和聚乙二醇。烷氧基和氨基烷氧基一般包括低級烷基，具體地說是C1-C9烷基。聚乙二醇具有(O-CH2-CH2)n-O-烷基結(jié)構(gòu)。特別優(yōu)選的取代基是式(-O-CH2-CH2)n-O-烷基的聚乙二醇取代基，其中n=1，烷基=CH3。
通過利用在組成本發(fā)明寡核苷酸的核苷單位中的一些修飾的核堿基，也能夠增加結(jié)合親和性。這樣的修飾的核堿基可以包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。預(yù)計其它修飾的嘧啶與嘌呤堿基也可以增加寡核苷酸與核酸的互補鏈的結(jié)合親和性。
2’-取代基的利用增加了本發(fā)明的取代的寡核苷酸的結(jié)合親和性。一項已發(fā)表的研究(2’-dRIBO-F修飾的寡核苷酸的合成和生物物理研究，關(guān)于核酸治療學(xué)的會議，Clearwater,FL,1991年1月13日)曾報道每個取代的核苷單位(組成在寡核苷酸的五個核苷單位上具有2’-氟基取代基的15鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸)有1.6℃的結(jié)合親和性增加量。當寡核苷酸的11個核苷單位攜帶2’-氟基取代基時，每個取代的核苷單位的結(jié)合親和性增加至1.8℃。
在上述的研究中，使15鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸衍生為對應(yīng)的硫代磷酸酯類似物。當把15鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸與硫代磷酸酯類似物比較時，發(fā)現(xiàn)硫代磷酸酯類似物僅僅具有15鏈節(jié)磷酸二酯寡核苷酸的結(jié)合親和性的大約66％。換句話說，在使寡核苷酸衍生成為它的硫代磷酸酯類似物的過程中損失了部分結(jié)合親和性。然而，當使2’-氟基取代基位于15鏈節(jié)硫代磷酸酯寡核苷酸的11個核苷時，2’-取代基的結(jié)合親和性不僅克服了所注意到的由15鏈節(jié)寡核苷酸衍生為它的硫代磷酸酯類似物所產(chǎn)生的減少。在這一化合物(即有11個核苷單位為2’-氟基取代基取代的15鏈節(jié)硫代磷酸酯寡核苷酸)中，結(jié)合親和性增加至每個取代基2.5℃。在這一研究中，沒有設(shè)法包括具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分(其將引起互補于該研究的寡核苷酸的RNA靶的RNase H酶促切割)的核苷單位的適當?shù)倪B續(xù)序列。
為了引起靶RNA的RNase H酶促切割，本發(fā)明的寡核苷酸必須包括節(jié)段或者亞序列(其中它是DNA型節(jié)段)。換句話說，本發(fā)明的寡核苷酸的至少一些核苷亞單位必須具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分。具有三個以上核苷亞單位(包含連續(xù)地結(jié)合的2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基)的亞序列是必要的以便在本發(fā)明的寡核苷酸與靶RNA的雜交方面引起RNase H活性。目前，優(yōu)選的是在本發(fā)明的寡核苷酸中具有三個或多個包含連續(xù)2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞單位的亞序列。特別優(yōu)選是至少五個包含連續(xù)2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞單位的利用。
RNase H的作用機理是DNA-RNA雙螺旋的識別，其后為該雙螺旋的RNA鏈的切割。如以上“發(fā)明背景”部分所指出的，本領(lǐng)域的其它研究者曾利用修飾的DNA鏈來向DNA鏈傳遞核酸酶穩(wěn)定性。為了達此目的，他們利用了修飾的磷鍵(其傳遞增加的核酸酶穩(wěn)定性但是降低雜交性能)。
本發(fā)明識別一定的標準，該標準必須滿足確定RNase H識別和引起RNA鏈的切割。首先是在切割位點的RNA鏈必須具有其經(jīng)由磷鍵(攜帶負電荷)連接的核苷單位。此外，在切割位點的核苷的糖組分必須是β-呋喃戊糖基糖組分，并且也必須是2’內(nèi)向構(gòu)象。符合這一標準的最理想的核苷是由磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯鍵連接的2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基β-核苷。
對于用于制備這樣的結(jié)構(gòu)單位來說，合適的核堿基包括嘌呤和嘧啶(如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶)以及其它合成的和天然的核堿基(如黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵代、氨基、巰基、硫代烷基、羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤)。其它嘌呤和嘧啶包括那些在美國專利3,687,808中所揭示的嘌呤和嘧啶、那些在聚合物科學(xué)和工程的簡明百科全書(第858-859頁,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley和Sons,1990)中所揭示的嘌呤和嘧啶以及那些由Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613所揭示的嘌呤和嘧啶。
本發(fā)明的寡核苷酸在至少一個核苷的2’位置上包含甲氧基乙氧基(-OCH2CH2OCH3)修飾。已顯示出這一修飾增加了寡核苷酸與其靶的親和性以及寡核苷酸的核酸酶抗性。按照本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選包含大約5至大約50個核苷單位。在本發(fā)明的上下文中可以理解為寡核苷酸包括非天然存在的寡聚體(如前所描述，具有5至50個核苷單位)。更加優(yōu)選的是本發(fā)明的寡核苷酸包含大約15至大約25個核苷單位。正如將得到理解的，“核苷單位”是通過磷鍵與鄰近的亞單位適當?shù)亟Y(jié)合的核堿基和糖的結(jié)合物。術(shù)語“亞單位”與術(shù)語“核苷單位”可互換使用。為了引起RNase H響應(yīng)(如上所說明)，總的來說寡核苷酸的序列總長度將是多于三個(優(yōu)選為五個或更多個)核苷單位(包含連續(xù)地結(jié)合的2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基)的亞序列。
目前優(yōu)選的是在寡核苷酸中摻入包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞序列，結(jié)果是在寡核苷酸中其它包含2’-取代的呋喃戊糖基的核苷亞序列位于包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞序列的任一側(cè)面上。在這樣一種構(gòu)建中，包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞序列也稱作為“中央?yún)^(qū)”，而包含2’-取代的呋喃戊糖基的核苷亞序列稱作為“側(cè)翼區(qū)”。
在本發(fā)明的一些實施方案中，如果核苷單位的其余部分的每一個包括增加結(jié)合親和性的2’-取代基，那么包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞序列將定位在具有2’-取代基的核苷單位的第一亞序列和具有2’-取代基的核苷單位的第二亞序列之間。其它構(gòu)建也是可能的，包括在本發(fā)明的寡核苷酸的3’或者5’末端之任一處定位包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基的核苷亞序列。
按照本發(fā)明所利用的寡核苷酸可以通過眾所周知的固相合成技術(shù)方便地按常規(guī)制得[Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504]。這樣合成的設(shè)備由數(shù)個賣主(包括Applied Biosystems)出售。也可以使用這樣合成的任何其它方法。寡核苷酸的實際合成完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之一。利用類似的技術(shù)制備其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是眾所周知的。利用類似的技術(shù)和市售的修飾亞酰胺化物(amidite)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)品(如生物素、熒光素、吖啶或者咖啡因修飾的亞酰胺化物和/或CPG(由Glen Research,Sterling VA提供))合成熒光標記的、生物素?；幕蛘咂渌B結(jié)的寡核苷酸，這也是眾所周知的。
本發(fā)明的化合物可以用作為診斷劑、治療劑和用作為研究試劑以及試劑盒。通過在合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或者載體中加入有效量的本發(fā)明的寡核苷酸，它們能夠用于藥物組合物。它們還能夠用于治療具有以產(chǎn)生不需要的蛋白質(zhì)為特征的疾病的有機體。可以使有機體與本發(fā)明的寡核苷酸(具有能夠特異地與靶核酸鏈(編碼不需要的蛋白質(zhì))雜交的序列)相接觸。
一般認為治療組合物的配制和其隨后的施用屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之一。一般來說，對于治療學(xué)，以每kg體重的0.01μg至100g的用量范圍(取決于患者的年齡和正在治療的疾病嚴重程度)，給需要這樣治療的患者施用按照本發(fā)明的寡核苷酸(通常在藥學(xué)上可接受的載體中)。此外，該治療法可以持續(xù)一段時間，時間長短取決于具體疾病的性質(zhì)及其嚴重程度以及患者的整個狀況，并且可以從每日一次擴展至每20年一次。在治療之后，患者在他/她的狀況方面的變化和疾病的癥狀減輕得到監(jiān)控?？梢曰蛘咴黾庸押塑账岬膭┝?如果患者不對當前的劑量水平作出明顯的反應(yīng))，或者減少劑量(如果觀察到疾病的癥狀減輕，或者如果疾病消失)。
在某些情況下，可以更有效的是利用與其它傳統(tǒng)治療用藥程式結(jié)合的本發(fā)明的寡核苷酸治療患者。例如，可以結(jié)合AZT給正在接受AIDS治療的患者施用寡核苷酸，或者可以在血管成形術(shù)以后利用本發(fā)明的寡核苷酸治療粥樣硬化的患者以阻止得到治療的動脈再閉塞。
在成功治療之后，可能需要使患者接受維持治療以阻止疾病復(fù)發(fā)，其中以維持劑量(用量變化于每kg體重0.01μg至100g，每日一次或多次至每20年一次)施用寡核苷酸。
可以用多種方法施用本發(fā)明的藥物組合物，這取決于是否需要進行局部或者全身治療以及取決于將要治療的區(qū)域。用藥可以是局部的(包括眼的、陰道的、直腸的、鼻內(nèi)的、經(jīng)皮的)、口服的或者腸胃外的。腸胃外用藥包括靜脈滴注，皮下、腹膜內(nèi)或者肌內(nèi)注射，或者鞘內(nèi)或心室內(nèi)用藥。
局部用藥的制劑可以包括經(jīng)皮的膜片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥物載體，水性的、粉末的或者油性的基質(zhì)，增稠劑等等可以是必要的或者需要的。有被避孕套、手套等等也可以是有用的。
口服的組合物包括粉劑或者顆粒劑、在水或者無水介質(zhì)中的懸浮液或者溶液、膠囊、香囊或者片劑。增稠劑、增香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或者粘合劑也可以是需要的。
鞘內(nèi)或者心室內(nèi)施用的組合物可以包括無菌水溶液，該水溶液也可以包含緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑。
腸胃外用藥的配制可以包括無菌水溶液，該溶液也可以包含緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑。
用藥劑量取決于將要治療的疾病的嚴重程度和反應(yīng)性，治療過程可持續(xù)幾天至幾個月或者直到治愈或達到疾病減輕。最佳劑量程序表可以從患者身體中的藥物積累量的測量值計算。一般技術(shù)人員就可以容易地測定最佳劑量、配藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可以變化，這取決于個體寡核苷酸的相對效能，并且一般可以基于EC50s(發(fā)現(xiàn)其在體外和體內(nèi)動物模型中是有效的)估計最佳劑量。一般來說，劑量是每kg體重0.01μg至100g，并且可以每日、每周、每月、或者每年施用一次或多次，或者甚至每2至20年施用一次。
可以在各種有機體(范圍從單細胞原核和真核有機體到多細胞真核有機體)中實施這樣的治療。利用DNA-RNA轉(zhuǎn)錄或者RNA-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯作為其遺傳、代謝或者細胞運轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)部分的任何有機體對這樣的治療和/或預(yù)防治療是敏感的。從表面上看來，各種有機體(如細菌、酵母、原生動物、藻類、植物以及高等動物(包括溫血動物))都可以以這種方式治療。此外，由于多細胞真核生物的每個細胞也包括DNA-RNA轉(zhuǎn)錄和RNA-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯作為它們的細胞活性的完整部分，因此這樣的治療學(xué)和/或者診斷學(xué)也可以在這樣的細胞群體上實踐。此外，真核細胞的許多細胞器(例如線粒體和葉綠體)也包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯機制。同樣地，單細胞、細胞群體或者細胞器也可以包括在有機體(能夠利用本發(fā)明的治療或者診斷寡核苷酸治療)的定義之內(nèi)。如本文所使用的，治療學(xué)指的是包括疾病的根除，有機體(如細菌、原生動物或者其它感染)的殺滅，或者異常的或不需要的細胞生長或表達的控制。
在本發(fā)明的上下文中，“雜交”將意指在互補核堿基之間的氫鍵結(jié)合，該結(jié)合可以是Watson-Crick、Hoogsteen或者反向Hoogsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過氫鍵的形成配對的互補核堿基?！盎パa的”和“可特異地雜交的”(如本文所使用的)指的是在兩個包含核苷單位的核酸之間的序列互補性，其中一個核酸是寡核苷酸而另一個核酸是靶DNA或RNA分子。例如，如果在寡核苷酸的一定位置的核堿基能夠與在DNA或者RNA分子的相同位置的核堿基實現(xiàn)氫鍵結(jié)合，那么就認為該寡核苷酸和DNA或者RNA分子在該位置是相互互補的。當足夠數(shù)量的在每一個分子中的對應(yīng)位置為能夠相互氫鍵結(jié)合的核堿基所占據(jù)時，寡核苷酸和DNA或者RNA分子是相互互補的。因此，“可特異地雜交的”和“互補的”是用來表明足夠程度的互補性以致在寡核苷酸和靶DNA或者RNA分子之間發(fā)生穩(wěn)定的和特異性的結(jié)合的術(shù)語。可以理解為寡核苷酸不必100％地互補于可與其特異地雜交的靶DNA序列。當寡核苷酸與靶DNA或者RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或者RNA的正常功能從而造成效用的喪失，并且有足夠程度的互補性從而在需要特異性結(jié)合的條件下(即在生理學(xué)條件下在體內(nèi)測定或者治療處理的情況下或者在體外測定的情況下，在這些測定得以完成的條件下)避免寡核苷酸與非靶序列的非特異性結(jié)合時，寡核苷酸是可特異地雜交的。
為說明起見，本發(fā)明的化合物已用于利用ras螢光素酶反式激活的ras螢光素酶融合系統(tǒng)。如在國際公開號WO92/22651(1992年12月23日公開，并且與這一申請共同轉(zhuǎn)讓，其中的整個內(nèi)容并入本文作為參考)中所描述的，ras致癌基因是編碼相關(guān)蛋白質(zhì)(定位于質(zhì)膜的內(nèi)表面)的基因家族的成員。Ras蛋白質(zhì)顯示出在氨基酸水平方面是高度保守的，顯示出以高親和性和特異性與GTP結(jié)合，并且顯示出具有GTP酶活性。雖然ras基因產(chǎn)物的細胞功能是未知的，但是它們的生化性質(zhì)以及它們的與一類轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的蛋白質(zhì)(被認為是GTP結(jié)合蛋白或者G蛋白質(zhì))之間的重要的序列同源性表明ras基因產(chǎn)物在基本的細胞調(diào)節(jié)功能(與胞外信號穿過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān))中起著根本作用。
指定為H-ras、K-ras以及N-ras的三個ras基因已在哺乳動物基因組中得到鑒定。哺乳動物ras基因通過在它們的編碼序列之內(nèi)的單點突變獲得誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的性質(zhì)。在天然存在的ras致癌基因中的突變已定位于密碼子12、13和61。最通常檢測到的激活ras突變(在人體腫瘤中發(fā)現(xiàn))是在H-ras基因的密碼子12(其中從GGC至GTC的堿基變化導(dǎo)致在ras蛋白質(zhì)產(chǎn)物的GTP酶調(diào)節(jié)域中發(fā)生甘氨酸至纈氨酸的取代)中。一般認為這種單一的氨基酸變化消除了ras蛋白質(zhì)功能的正常控制，由此把一種正常調(diào)節(jié)的細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成為一種具有連續(xù)活性的細胞蛋白質(zhì)。據(jù)認為正常ras蛋白質(zhì)功能的去調(diào)節(jié)負責從正常向惡性生長的轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的寡核苷酸也曾用于調(diào)節(jié)raf基因的表達，raf基因是一種天然存在的細胞基因，其有時轉(zhuǎn)化成為活化形式(其已在反常細胞增殖和腫瘤形成中得到暗示)。
本發(fā)明的寡核苷酸也是可特異地與核酸(與蛋白激酶C(PKC)有關(guān))雜交的。已發(fā)現(xiàn)這些寡核苷酸調(diào)節(jié)PKC的表達。
下列實施例與方法用來說明本發(fā)明，但并無意于限制本發(fā)明。實施例1寡核苷酸合成利用標準的亞磷酰胺化學(xué)(具有碘氧化)在自動DNA合成儀(AppliedBiosystems model 380B)上合成未取代的和取代的寡核苷酸。對于硫代磷酸酯寡核苷酸，用0.2M 3H-1,2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮1,1-二氧化物的乙腈溶液代替標準的氧化瓶以便于亞磷酸酯鍵的逐步硫雜化。使硫雜化等待步驟增加至68秒，其后進行加帽步驟。在從CPG柱上切割下來和去封閉(在濃氨水中在55℃下(18小時))之后，通過用2.5體積乙醇從0.5 M NaCl溶液中沉淀兩次純化寡核苷酸。在20％丙烯酰胺、8M尿素、454mM Tris-硼酸鹽緩沖液(pH=7.0)中完成分析的凝膠電泳?；诰郾０纺z電泳，鑒定出寡核苷酸和硫代磷酸酯大于80％全長材料。實施例2具有位于中央2’-脫氧硫代磷酸酯區(qū)側(cè)翼的2’-取代區(qū)的寡核苷酸利用RNA流程在DNA測序儀上以正常方式制備序列5’GCGTTTTTTTTTTGCG 3’(SEQ ID NO:28)的15鏈節(jié)RNA靶。利用2’-取代的核苷前體，制備一系列在2’-脫氧區(qū)的側(cè)翼區(qū)中具有2’-取代的核苷單位的互補硫代磷酸酯寡核苷酸，其中核苷前體按已知文獻的方法制備(即2’-O-甲基)，或者按國際公開號92/03568(1992年3月公開)的方法制備。在DNA合成儀上以正常方式加入2’-取代的核苷作為它們的5’-O-二甲氧基三苯甲基-3’-亞磷酰胺?；パa寡核苷酸具有5’CGC AAA AAAAAA AAA ACG C 3’(SEQ ID NO:29)的序列。2’-取代基定位于這些寡核苷酸的CGC和CG區(qū)中。下列的2’-O-取代基得到利用2’-氟基、2’-O-甲基、2’-O-丙基、2’-O-烯丙基、2’-O-氨基丙氧基、2’-O-(甲氧基乙氧基乙基)、2’-O-咪唑丁氧基和2’-O-咪唑丙氧基。實施例3Ras螢光素酶報道基因裝配利用PCR技術(shù)裝配本研究所描述的ras螢光素酶報道基因。合成寡核苷酸引物以用作為突變(密碼子12)和非突變(野生型)人H-ras基因兩者的外顯子1的5’區(qū)的PCR克隆的引物。H-ras基因模板購自在Bethesda,MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC號41000和41001)。寡核苷酸PCR引物##5’-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-TTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3’(有義)(SEQ ID NO:15)和5’-GAG-ATC-TGA-AGC-TTC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3’(反義)(SEQ ID NO:16)用于利用突變和非突變H-ras基因作為模板的標準PCR反應(yīng)?？深A(yù)計這些引物將產(chǎn)生具有對應(yīng)于正常和突變H-ras的序列-53至+65(與轉(zhuǎn)譯起始位點有關(guān))(位于NheⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切核酸酶位點的側(cè)翼)的145個堿基對的DNA產(chǎn)物。利用標準過程凝膠純化、沉淀、洗滌上述PCR產(chǎn)物，并使之再懸浮于水中。
設(shè)計用于P.pyralis(螢火蟲)螢光素酶基因的克隆的PCR引物以便PCR產(chǎn)物編碼除氨基末端蛋氨酸殘基(其將為兩個氨基酸所取代，即一個氨基末端賴氨酸殘基，其后為亮氨酸殘基)外的全長螢光素酶蛋白質(zhì)。用于螢光素酶基因的克隆的寡核苷酸PCR引物是5’-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3’(有義)(SEQ IDNO:17)和5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT-CGA-3’(反義)(SEQ ID NO:18),##用于利用市售的包含螢光素酶報道基因的質(zhì)粒(pT3/T7-Luc)(Clontech)作為模板的標準PCR反應(yīng)?？深A(yù)計這些引物將產(chǎn)生對應(yīng)于螢光素酶基因的大約1.9kb(位于HindⅢ和BssHⅡ限制性內(nèi)切核酸酶位點的側(cè)翼)的產(chǎn)物。利用標準過程凝膠純化、沉淀、洗滌這一片段，并使之再懸浮于水中。
為了完成ras螢光素酶融合報道基因的裝配，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化ras和螢光素酶PCR產(chǎn)物，并通過利用限制性內(nèi)切核酸酶NheⅠ、HindⅢ和BssHⅡ三部分連接進入包含類固醇誘導(dǎo)的小鼠乳房腫瘤病毒MMTV啟動子的表達載體來克隆ras和螢光素酶PCR產(chǎn)物。所產(chǎn)生的克隆導(dǎo)致與螢火蟲螢光素酶基因符合讀框融合的H-ras 5’序列(-53至+65)的插入。所產(chǎn)生的表達載體編碼ras螢光素酶融合產(chǎn)物(其在類固醇誘導(dǎo)的MMTV啟動子的控制下得到表達)。實施例4用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞如Greenberg(分子生物學(xué)的當前方案，Ausubel等編著，JohnWiley和Sons,NY)所述完成轉(zhuǎn)染，具有下列改進以5×105細胞/平皿將HeLa細胞涂布于60mm培養(yǎng)皿上。每個平皿中加入總計為10μg的DNA，其中9μg是ras螢光素酶報道基因質(zhì)粒，1μg是在組成型Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子的控制之下表達大鼠糖皮質(zhì)激素受體的載體。在通過用包含3mM EGTA的Tris-緩沖鹽水[50mM Tris-Cl(pH7.5),150mM NaCl]洗滌16-20小時之后除去磷酸鈣-DNA共沉淀。然后在細胞中加入補加10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。此時，在用地塞米松激活報道基因表達之前用反義寡核苷酸預(yù)處理細胞。實施例5細胞的寡核苷酸處理在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后立即用OptiMEM(GIBCO)洗滌細胞三次，并將其預(yù)熱至37℃。在每個培養(yǎng)皿中加入包含10μg/mL N-[1-(2,3-二油氧基(dioleyloxy))丙基]-N,N,N,-三甲基氯化銨(DOTMA)(Bethesda ResearchLabs,Gaithersburg,MD)的2 mL OptiMEM，同時直接加入寡核苷酸并在37℃下培養(yǎng)4小時。然后除去并用適當?shù)募毎L培養(yǎng)基(包含寡核苷酸)替代OptiMEM。此時，通過用地塞米松處理細胞至0.2μM終濃度來激活報道基因表達。在類固醇處理后的12-16小時收獲細胞。實施例6螢光素酶測定如Greenberg(分子生物學(xué)的當前方案，Ausubel等編著，JohnWiley和Sons,NY)所述，通過用去污劑Triton X-100溶胞來從細胞中提取螢光素酶。用Dynatech ML1000發(fā)光計來測量當螢光素(Sigma)增加至625μM時的峰值發(fā)光。對于每一抽提物，利用不同量的抽提物進行多次螢光素酶測定以保證在測定的線型范圍中收集數(shù)據(jù)。實施例7ras螢光素酶基因表達的反義寡核苷酸抑制作用利用在前述實施例中所描述的ras螢光素酶報道基因系統(tǒng)，檢測一系列硫代磷酸酯寡核苷酸(定向活化H-ras的密碼子12點突變)。這一系列包含基本序列和該基本序列的類似物。如上述國際公開號WO92/22651中所報道的，上述基本序列具有已知活性。在基本序列和它的類似物兩者中，每一核苷單位摻入硫代磷酸酯鍵以提供核酸酶抗性。每一類似物摻入包含2’-O-甲基取代基和2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分的核苷單位。在類似物中，包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖的亞單位的亞序列在兩個末端上側(cè)接2’-O-甲基取代的亞單位的亞序列。根據(jù)包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖的核苷的亞序列的長度相互區(qū)別類似物。2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷亞序列集中在活化的ras的密碼子12點突變的點突變處。
寡核苷酸序列、序列參考號和序列ID號(所有都是硫代磷酸酯類似物)都顯示在表1中。在這個表中，那些用＂M＂鑒定的核苷包含2’-O-甲基取代基和用“d”鑒定的核苷都是2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷。
表1嵌合的2’-O-甲基P=S寡核苷酸寡核苷酸 序列 SEQ ID NO:2570CdCdAdCdAdCdCdGdAdCdGdGdCdGdCdCdCd13975CMCMAMCMAMCMCMGMAdCMGMGMCMGMCMCMCM13979CMCMAMCMAMCMCMGdA2CdGMGMCMGMCMCMCM13980CMCMAMCMAMCMCdGdAdCdGdGMCMGMCMCMCM13985CMCMAMCMAMCdCdGdAdCdGdGdCMGMCMCMCM13984CMCMAMCMAdCdCdGdAdCdGdGdCdGMCMCMCM1圖1顯示劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)，其中用表1的硫代磷酸酯寡核苷酸處理細胞。使寡核苷酸2570定向突變(活化的)H-ras RNA的密碼子12點突變。其它核苷具有位于其上以增加結(jié)合親和性(與各種長度的有間隙的2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的區(qū)段)的2’-O-甲基取代基。對照寡核苷酸是隨機的20鏈節(jié)硫代磷酸酯寡核苷酸。結(jié)果表示為在轉(zhuǎn)染的、未用寡核苷酸處理的細胞中的螢光素酶活性的百分比。如圖所示，用逐漸增加濃度的寡核苷酸2570處理細胞導(dǎo)致ras螢光素酶活性(在表達突變形式的ras螢光素酶的細胞中)的依賴劑量的抑制作用。與正常形式的ras螢光素酶相比，寡核苷酸2570對突變形式的ras螢光素酶顯示大約三倍選擇性。
如同在圖1中所進一步看見的一樣，寡核苷酸3980、3985和3984之每一個都顯示出比寡核苷酸2570大的ras螢光素酶活性的抑制作用。最大的抑制作用由具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的7鏈節(jié)亞序列的寡核苷酸3985顯示。寡核苷酸3980(具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷單位的5鏈節(jié)亞序列)顯示出第二大的抑制作用，其次是寡核苷酸3984(具有2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷單位的9鏈節(jié)亞序列)的抑制作用。
圖2顯示類似于圖1的結(jié)果，除它是以柱狀圖表形式表示外。在圖2中可進一步看見寡核苷酸3975和寡核苷酸3979的活性。這些寡核苷酸具有長度分別為1和3個核苷的2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷單位的亞序列。如從圖2可明顯看出，任一寡核苷酸都顯示出重要的活性。在最高濃度劑量下觀察到寡核苷酸3979(具有3鏈節(jié)脫氧亞序列)具有可測量的活性。
與寡核苷酸2570相比，寡核苷酸3980、3985和3984的活性的增加歸因于結(jié)合親和性(由定位于這些化合物上的2’-O-甲基取代基傳遞給這些化合物)的增加和Rnase H活化(通過在核苷的主序列中摻入2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷的亞序列傳遞給這些化合物)。與本發(fā)明的活性化合物相比，令人感興趣的是注意到與那些活性寡核苷酸2570、3980、3985和3984等同但具有磷酸二酯鍵(而不是本發(fā)明的活性寡核苷酸的硫代磷酸酯鍵)的序列不顯示任何活性。這是因為磷酸二酯化合物是核酸酶的底物，該核酸酶降解磷酸二酯化合物從而阻止它們可能激活RNase H。
其它糖修飾除2’-O-甲基取代基外的其它2’糖修飾對在嵌合的寡核苷酸中的反義活性的影響已得到檢驗。這些修飾與Tm值(當使具有2’-修飾核苷側(cè)翼7鏈節(jié)脫氧亞序列(或7鏈節(jié)脫氧缺口)的17鏈節(jié)寡核苷酸與25鏈節(jié)寡核糖核苷酸補體雜交(如實施例8所描述)時獲得)一同列在表2中。觀察到這些寡核苷酸的在2’位置的烷基長度和Tm之間的關(guān)系。隨著烷基長度的增加，Tm減少。2’-氟基嵌合的寡核苷酸顯示出該系列的的最高Tm值。
表2Tm與反義活性2’修飾的、具有7-脫氧缺口的17-鏈節(jié)CCACACCGACGGCGCCC(SEQ ID NO:1)的相互關(guān)系2’修飾 Tm(℃) IC50(nM)脫氧 64.2150O-戊基68.5 150O-丙基70.4 70O-甲基74.7 20氟基 76.9 10利用實施例9所描述的反式激活報道基因分析方法檢測這些2’修飾的寡核苷酸的抗H-ras的反義活性。所有這些2’修飾的嵌合化合物都抑制ras表達，其中2’-氟基7鏈節(jié)的帶缺口的化合物具有最大活性。具有5鏈節(jié)中央脫氧缺口的2’-氟基嵌合寡核苷酸也具有活性。
將具有SEQ ID NO:1(具有2’-O-丙基亞序列側(cè)翼5鏈節(jié)或者7鏈節(jié)脫氧亞序列)的嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸與2’-O-甲基嵌合寡核苷酸比較。在T24細胞中的ras表達受到2’-O-甲基和2’-O-丙基嵌合寡核苷酸(具有7鏈節(jié)脫氧缺口和均勻硫代磷酸酯主鏈)的抑制。當使脫氧缺口減少至五個核苷時，僅有2’-O-甲基寡核苷酸抑制ras表達。
在癌細胞中的H-ras基因表達的反義寡核苷酸抑制作用如同實施例10所描述的一樣，兩個互補于ras AUG區(qū)的硫代磷酸酯寡核苷酸(2502,2503)與具有相同序列和以2’-O-甲基亞序列為側(cè)翼的7鏈節(jié)脫氧亞序列的嵌合寡核苷酸(4998,5122)一同得到檢測。這些嵌合寡核苷酸顯示在表3中。
表3具有2’-O-甲基末端(粗體)和中央脫氧缺口(AUG靶)的嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸寡核苷酸 #脫氧序列 SEQ ID NO:2502 20 CTTATATTCCGTCATCGCTC 24998 7 CTTATATTCCGTCATCGCTC 22503 20 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 35122 7 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG 3化合物2503抑制71％的在T24細胞中的ras表達，嵌合化合物(4998)甚至更強烈地抑制ras mRNA(達到84％抑制)?；衔?502(也互補于AUG區(qū))降低26％的ras RNA水平，這一寡核苷酸的嵌合形式(5122)顯示出15％的抑制作用。兩個定向突變體密碼子12的寡核苷酸也包括在這一測定中?；衔?570(SEQ ID NO:1)降低82％的ras RNA，這一寡核苷酸(具有7鏈節(jié)脫氧亞序列(3985))的2’-O-甲基嵌合形式降低95％的rasRNA。
也檢測寡核苷酸2570和2503以便測定它們對在HeLa細胞(其具有野生型(即未活化的)H-ras密碼子12)中的ras表達的影響。當這兩種寡核苷酸抑制在T24細胞(具有激活的密碼子12)中的ras表達時，僅有可特異地與ras AUG雜交的寡核苷酸(2503)抑制在HeLa細胞中的ras表達。可特異地與活化的密碼子12雜交的寡核苷酸2570(SEQ ID NO:1)并不抑制在HeLa細胞中的ras表達，因為這些細胞缺乏活化的密碼子12靶。
寡核苷酸2570(互補于活化H-ras的密碼子12區(qū)的17鏈節(jié)硫代磷酸酯寡核苷酸)與嵌合硫代磷酸酯2’-O-甲基取代的寡核苷酸3980、3985和3984(它們具有與2570一樣的序列，并且具有分別為5、7和9個核苷單位的脫氧亞序列(顯示在表1中))一同被檢測在T24細胞中的ras表達的抑制作用。均勻2’-脫氧寡核苷酸2570和三種嵌合寡核苷酸都降低T24細胞中的ras mRNA水平。化合物3985(7鏈節(jié)脫氧缺口)和3984(9鏈節(jié)脫氧缺口)降低81％ras mRNA；化合物3980(5鏈節(jié)脫氧缺口)降低61％rasmRNA。具有這一序列的、但是具有2’-氟基取代的核苷側(cè)翼5鏈節(jié)脫氧(4689)或者7鏈節(jié)脫氧(4690)亞序列的嵌合寡核苷酸抑制在T24細胞中的ras mRNA表達，其中7鏈節(jié)的脫氧亞序列是優(yōu)選的(82％抑制作用，與5鏈節(jié)脫氧亞序列的2’-氟基嵌合體的63％抑制作用相比較而言)。
癌細胞的增殖的反義寡核苷酸抑制作用檢測三種具有相同序列(SEQ ID NO:1)的17鏈節(jié)寡核苷酸(互補于活化ras的密碼子12區(qū))對T24癌細胞增殖的影響(如實施例11所描述)。寡核苷酸3985是具有以2’-O-甲基取代的核苷為側(cè)翼的7鏈節(jié)脫氧亞序列的均勻硫代磷酸酯，4690是具有以2’-氟基取代的核苷為側(cè)翼的7鏈節(jié)脫氧亞序列(缺口)的均勻硫代磷酸酯(CFCFAFCFAFCdCdGdAdCdGdGdCFGFCFCFCF,SEQ IDNO:1，用“F”識別的核苷包含2’-氟基取代基，用“d”識別的核苷是2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基核苷)。與它們對ras mRNA表達的影響有很好相關(guān)性的這些寡核苷酸對癌細胞增殖的影響由Northern印跡分析顯示出來寡核苷酸2570抑制61％的細胞增殖，2’-O-甲基嵌合寡核苷酸3985抑制82％的細胞增殖，2’-氟基嵌合類似物抑制93％的細胞增殖。
在這些寡核苷酸對細胞增殖的劑量-反應(yīng)研究中，顯示出在25nM至100nM范圍中抑制作用是依賴劑量的。44nM、61nM和98nM的IC50值可以分別歸因于寡核苷酸4690、3985和3984。隨機寡核苷酸對照在所檢測的劑量下沒有任何效應(yīng)。
ISIS 2570對細胞增殖的影響是細胞型特異性的。這種寡核苷酸對T24細胞增殖的抑制作用比相同寡核苷酸對HeLa細胞的抑制作用強烈四倍(100nM寡核苷酸濃度)。使ISIS 2570定向活化(突變的)ras密碼子12，該活化密碼子存在于T24中但在HeLa細胞(具有野生型密碼子12)中缺乏。
嵌合主鏈修飾的寡核苷酸以前的實施例中所討論的寡核苷酸都具有均勻硫代磷酸酯主鏈。以上所討論的2’修飾的嵌合寡核苷酸在均勻磷酸二酯主鏈中都是沒有活性的。合成嵌合寡核苷酸(ISIS 4226)而使之具有2’-O-甲基取代區(qū)側(cè)翼5鏈節(jié)脫氧缺口，其中缺口區(qū)具有P=S鍵而側(cè)翼區(qū)具有P=O鍵。另一在缺口中具有P=O主鏈和在側(cè)翼區(qū)中具有P=S的嵌合寡核苷酸(ISIS 4223)也得到制備。這些寡核苷酸都顯示在表4中。
也合成了具有均勻2’-脫氧核苷單位的寡核苷酸。這些寡核苷酸在分子的中央?yún)^(qū)中具有與單個磷酸二酯鍵(ISIS 4248)、兩個磷酸二酯鍵(ISIS4546)、三個磷酸二酯鍵(ISIS 4551)、四個磷酸二酯鍵(ISIS 4593)、五個磷酸二酯鍵(ISIS 4606)或者十個磷酸二酯鍵(ISIS-4241)之任一配合的硫代磷酸酯鍵。這些寡核苷酸也都顯示在表4中。
表4具有2’-O-甲基側(cè)翼(粗體)和中央脫氧缺口的嵌合主鏈(P=S/P=O)寡核苷酸(主鏈鍵由s(P=S)或者o(P=O)指示)寡核苷酸 #P=S 序列 SEQ ID NO:2570 16CsCsAsCsAsCsCsGsAsCsGsGsCsGsCsCsC14226 5 CoCoAoCoAoCsCsGsAsCsGoGoCoGoCoCoC14233 11CsCsAsCsAsCoCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC14248 15CsCsAsCsAsCsCsGsAoCsGsGsCsGsCsCsC14546 14CsCsAsCsAsCsCsGoAoCsGsGsCsGsCsCsC14551 13CsCsAsCsAsCsCsGoAoCoGsGsCsGsCsCsC14593 12CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGsGsCsGsCsCsC14606 11CsCsAsCsAsCsCoGoAoCoGoGsCsGsCsCsC14241 6 CsCsAsCoAoCoCoGoAoCoGoGoCoGsCsCsC1在37℃下在HeLa細胞粗提物中培養(yǎng)寡核苷酸以測定它們對核酸酶降解的靈敏度(如Dignam等，核酸研究，1983,11,1475-1489中所描述)。具有5鏈節(jié)磷酸二酯中央?yún)^(qū)和硫代磷酸酯/2’-O-甲基取代的側(cè)翼區(qū)的寡核苷酸(4233)具有7小時的T1/2。具有5鏈節(jié)硫代磷酸酯中央?yún)^(qū)和硫代磷酸酯/2’-O-甲基取代的側(cè)翼區(qū)的寡核苷酸具有30小時的T1/2。在具有1至10個磷酸二酯二酯鍵的寡核苷酸系列中，具有單個磷酸二酯鍵的寡核苷酸(4248)對核酸酶的穩(wěn)定性如同均勻硫代磷酸酯寡核苷酸(ISIS2570，其在5小時之后在HeLa細胞抽提物中不顯示任何降解)一樣。具有2鏈節(jié)、3鏈節(jié)和4鏈節(jié)磷酸二酯中央?yún)^(qū)的寡核苷酸分別具有大約5.5小時、3.75小時和3.2小時的T1/2，具有5鏈節(jié)或者10鏈節(jié)磷酸二酯中央?yún)^(qū)的寡核苷酸分別具有1.75小時和0.9小時的T1/2。
嵌合主鏈修飾的寡核苷酸的反義活性不要求均勻硫代磷酸酯主鏈是反義活性的。ISIS 4226和ISIS 4233與ISIS 2570(均勻硫代磷酸酯/均勻脫氧)、ISIS 3980(均勻硫代磷酸酯，具有脫氧中央?yún)^(qū)的2’-O-甲基側(cè)翼區(qū))以及ISIS 3961(均勻磷酸二酯，具有脫氧中央?yún)^(qū)的2’-O-甲基側(cè)翼區(qū))一同在ras螢光素酶報道基因系統(tǒng)中被檢測對ras表達的影響。所有具有P=S(核酸酶抗性的)中央?yún)^(qū)的寡核苷酸都抑制ras表達。也分析了上述兩種具有硫代磷酸酯鍵(在分子的中央包含1個磷酸二酯鍵(ISIS 4248)或者10個磷酸二酯鍵(ISIS 4241))的均勻2’-脫氧寡核苷酸的活性。包含單一P=O的寡核苷酸具有與包含所有硫代磷酸酯鍵(均勻P=S寡核苷酸)的寡核苷酸恰好一樣的活性，而包含10個P=O鍵的相同寡核苷酸則是完全無活性的。
制得SEQ ID NO:1的嵌合硫代磷酸酯寡核苷酸，該寡核苷酸在7鏈節(jié)脫氧中央?yún)^(qū)(缺口)中具有硫代磷酸酯主鏈以及在側(cè)翼區(qū)中具有磷酸二酯鍵(其或者是2’-O-甲基或者是2’-O-丙基取代的)。具有2’-O-丙基取代的磷酸二酯側(cè)翼區(qū)的寡核苷酸能夠抑制ras表達。實施例8解鏈曲線利用Gilford 260分光光度計(與IBM PC計算機接口)和GilfordResponseⅡ分光光度計在260nm測量吸光度-溫度曲線。緩沖液包含100mM Na+、10mM磷酸鹽和0.1mM EDTA,pH7。寡核苷酸濃度是4μM，每一鏈由85℃下的吸光度測定，并按照Puglisi和Tinoco，酶學(xué)方法，1989,180,304-325計算消光系數(shù)。Tm值、雙螺旋形成的自由能和締合常數(shù)獲自數(shù)據(jù)擬合(用線型斜率基線對一個二狀態(tài)模型進行擬合)。Petersheim,M.和Turner,D.H.，生物化學(xué)，1983,22,256-263。所報道的參數(shù)是至少三個實驗的平均值。對于一些寡核苷酸來說，雙螺旋形成的自由能也獲自Tm-log10(濃度)圖中。Borer,P.N.,Dengler,B.,Tinoco,I.,Jr.和Uhlenbeck,O.C.，分子生物學(xué)雜志，1974,86,843-853。實施例9ras反式激活報道基因系統(tǒng)表達質(zhì)粒pSV2-oli(在組成型SV40啟動子的控制之下包含活化的(密碼子12,GGC-＞GTC)H-ras cDNA插入片段)是來自Bruno Tocque博士(Rhone-Poulenc Sante,Vitry，法國)的禮物。將這一質(zhì)粒用作為模板以便在類固醇誘導(dǎo)的小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子的調(diào)節(jié)之下構(gòu)建(由PCR)H-ras表達質(zhì)粒。為了獲得H-ras編碼序列，由PCR擴增H-ras基因的570bp編碼區(qū)。用在它們的5’區(qū)中的獨特的限制性內(nèi)切核酸酶位點設(shè)計PCR引物以便有利于克隆。凝膠純化、消化和在克隆之前再一次凝膠純化包含H-ras密碼子12突變癌基因的編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物。通過克隆插入表達質(zhì)粒pMAMneo(Clontech Laboratories,CA)的插入片段完成這一構(gòu)建。
ras效應(yīng)報道基因pRDO53用于檢測ras表達。Owen等，美國國家科學(xué)院院報，1990,87,3866-3870。實施例10體內(nèi)ras表達的Northern印跡分析人泌尿膀胱癌細胞系T24得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(RockvilleMD)。在McCoy的5A培養(yǎng)基(具有L-谷氨酰胺(Gibco BRL,GaithersburgMD)，補加10％的熱滅活的胎牛血清和各為50U/mL的青霉素和鏈霉素)中培養(yǎng)細胞。將細胞接種在100mm平板上。當它們達到70％融合時，利用寡核苷酸處理它們。用10mL預(yù)熱的PBS和5mL OptiMEM減少血清培養(yǎng)基(包含2.5μL DOTMA)洗滌平板。然后加入寡核苷酸至所需的濃度。在4小時的處理之后，以McCoy的培養(yǎng)基代替上述培養(yǎng)基。在寡核苷酸處理后48小時收獲細胞，并利用標準的CsCl純化方法分離RNA。Kingston,R.E.，分子生物學(xué)當前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl編著)，JohnWiley和Sons,NY。
人上皮樣癌細胞系HeLa 229得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Bethesda,MD)。在Dulbecco改進Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(補加10％胎牛血清和100U/mL青霉素)中的6孔平板上維持HeLa細胞作為單分子層。利用寡核苷酸的處理和RNA的分離本質(zhì)上如同以上描述的對T24細胞的操作一樣。
Northern雜交在1.2％瓊脂糖/甲醛凝膠上電泳10μg的每種RNA,并且利用標準方法將其轉(zhuǎn)移(一夜)到GeneBind 45尼龍膜(PharmaciaLKB,Piscataway,NJ)上。Kingston,R.E.，分子生物學(xué)當前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl編著)，John Wiley和Sons,NY。使RNA與膜UV交聯(lián)。利用Prime(一種基因標記試劑盒(Promega,Madison WI))合成雙鏈的32P-標記的探針。ras探針是活化的(突變的)H-ras mRNA(在密碼子12具有GGC-＞GTC突變)的cDNA克隆的SalI-NheⅠ片段。對照探針是G3PDH。在68℃下使印跡與QuickHyb雜交溶液(Stratagene,La Jolla,CA)預(yù)雜交15分鐘。加入與100μl的10mg/mL鮭精DNA混合的熱變性的放射性探針(2.5×106計數(shù)/2mL雜交溶液)，并使膜在68℃下雜交1小時。在室溫下在2×SSC/0.1％SDS中兩次洗滌印跡15分鐘，以及在60℃下用0.1XSSC/0.1％SDS一次洗滌印跡30分鐘。使印跡放射自顯影，并利用ImageQuant PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)量化信號的強度。首先使Northern印跡與ras探針雜交，然后通過在0.1×SSC/0.1％SDS中煮沸15分鐘來剝離該印跡，并使之與對照G3PDH探針再雜交以檢查是否正確加樣。實施例11癌細胞的增殖的反義寡核苷酸抑制作用基本上如實施例10所述用寡核苷酸培養(yǎng)和處理細胞。將細胞接種在60mm平板上，當它們達到70％融合時，在DOTMA存在的情況下利用寡核苷酸處理細胞。時間過程實驗在第1天，用終濃度為100nM的單一劑量的寡核苷酸處理細胞。在第3天更換生長培養(yǎng)基一次，同時利用計數(shù)室每天計算細胞數(shù)目，計數(shù)5天。劑量-反應(yīng)實驗在細胞中加入各種濃度的寡核苷酸(10、25、50、100或者250nM)，并在其后的3天收獲和計算細胞。檢測寡核苷酸2570、3985和4690對T24癌細胞增殖的影響。實施例12嵌合的(帶脫氧缺口的)2’-O-甲基寡核苷酸對PKC-αmRNA表達的抑制作用合成具有SEQ ID NO:4的寡核苷酸作為均勻硫代磷酸酯嵌合的寡核苷酸(具有脫氧中央?yún)^(qū)或者不同長度的以2’-O-甲基取代的亞序列為側(cè)翼的脫氧缺口)。由Northern印跡分析檢測這些寡核苷酸(500nM濃度)對PKC-αmRNA水平的影響。在所有情況下，8個或者多個核苷的脫氧缺口引起PKC-αmRNA水平的最大限度降低(兩個轉(zhuǎn)錄物)。具有4個核苷長度的脫氧缺口的這些寡核苷酸減少大約83％的PKC-αmRNA，具有6個或者多個核苷長度的脫氧缺口的上述寡核苷酸則幾乎引起PKC-αmRNA的完全減少。
具有4鏈節(jié)或者6鏈節(jié)脫氧缺口的2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸對于PKC-αmRNA減少具有200nM至250nM的IC50(引起PKC-αmRNA水平減少50％所需要的寡核苷酸濃度)，如同均勻脫氧寡核苷酸一樣(所有都是均勻硫代磷酸酯)。具有8鏈節(jié)脫氧缺口的2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸具有大約85nM的IC50。
比較這一嵌合寡核苷酸(SEQ.ID NO:4)的幾個變體的降低PKC-αmRNA水平的能力。這些寡核苷酸顯示在表5中。
表5嵌合的2’-O-甲基/脫氧P=S寡核苷酸粗體=2’-O-甲基；s=P=S鍵，o=P=O鍵寡核苷酸序列 SEQ ID NO:
3522 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 45352 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC 46996 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC 47008 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC 47024 AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC 4這些寡核苷酸對PKC-αmRNA水平的影響顯示在圖3中。寡核苷酸7008、3522和5352都顯示出PKC-αmRNA的減少，其中5352具有最大活性。
合成一系列2’-O-丙基嵌合的寡核苷酸而使之具有SEQ ID NO:4。這些寡核苷酸顯示在表6中。
表6嵌合的2’-O-丙基/脫氧P=S寡核苷酸粗體=2’-O-丙基；s=P=S鍵，o=P=O鍵寡核苷酸 序列 SEQ ID NO:
7199 AsAsAsAsCsGsTsCsAsGsCsCsAsTsGsGsTsCsCsC47273 AoAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCoC47294 AsAoAoAoCoGsTsCsAsGsCsCsAsTsGoGoToCoCsC47295 AsAoAoAoCoGsToCsAoGsCoCsAsTsGoGoToCoCsC4比較這些2’-O-丙基取代的嵌合寡核苷酸與2’-O-甲基取代的嵌合寡核苷酸。在降低PKC-αmRNA水平方面，寡核苷酸7273和7294比它們的2’-O-甲基對應(yīng)物具有更大活性。這一結(jié)果顯示在圖4和5中。實施例13降低PKC-αmRNA表達的附加寡核苷酸設(shè)計和合成定向于人PKC-α3’非翻譯區(qū)的附加的硫代磷酸酯寡核苷酸。這些序列顯示在表7中。
表7定向于PKC-α3’-UTR的嵌合的2’-O-丙基/脫氧P=S寡核苷酸粗體=2’-O-丙基；s=P=S鍵，o=P=O鍵寡核苷酸 序列 SEQ ID NO:
6632 TsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 56653 TsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 56665 ToToCoTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsToToToC 57082 TsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 67083 TsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsC 67084 ToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsToToToC 6在降低PKC-αmRNA水平方面，寡核苷酸6632、6653、7082和7083都具有最大活性。實施例14具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸對PKC-αmRNA水平的影響在陽離子脂類DOTMA/DOPE存在的情況下用500nM硫代磷酸酯寡核苷酸處理A549細胞4小時，洗滌該細胞并使之再恢復(fù)20小時。提取全部RNA，同時在1.2％凝膠上分離每份20μg，并且將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用32P放射性標記的PKC-αcDNA探針探測這些印跡，然后剝離并用放射性標記的G3PDH探針再探測這些印跡以確認相等的RNA加樣。每種寡核苷酸[3520(SEQ ID NO:31)、3521(SEQ ID NO:30)、3522(SEQ ID NO:4)以及3527(SEQ ID NO:32)]都是雙份使用的。用PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)檢定和量化兩種主要的PKC-α轉(zhuǎn)錄物(8.5kb和4.0kb)。ISIS 3521(SEQ ID NO:30)引起較小轉(zhuǎn)錄物減少大約80％和引起較大轉(zhuǎn)錄物減少90％以上。
合成具有SEQ ID NO:30和8鏈節(jié)脫氧中央?yún)^(qū)(其每側(cè)為具有2′-OCH2CH2OCH3修飾的核苷側(cè)翼)的兩種寡核苷酸。為了容易合成，最后的核苷是脫氧核苷。這些化合物(顯示在表8中)的不同之處在于其中之一(ISIS 9606)具有均勻硫代磷酸酯主鏈，而另一化合物(ISIS 9605)在中央?yún)^(qū)(主鏈鍵7-14)中具有硫代磷酸酯主鏈以及在側(cè)翼區(qū)中具有磷酸二酯主鏈。檢測這些寡核苷酸的抑制PKC-αmRNA在A549細胞中表達的能力，并與硫代磷酸酯化合物(ISIS 3521)比較。結(jié)果顯示在圖6a和6b中。計算三種化合物的IC50(產(chǎn)生50％抑制作用的寡核苷酸濃度)。硫代磷酸酯化合物(ISIS 3521)顯示出大約170nM的IC50。兩種甲氧基乙氧基化合物(ISIS 9605和9606)顯示出大約25nM的IC50。具有甲氧基乙氧基修飾的化合物的效能的這種6-7倍增加表明了令人驚訝的活性。由于它們的極低IC50，因此甲氧基乙氧基化合物9605和9606是優(yōu)選的。
表8具有SEQ ID NO:30的寡核苷酸ISIS# 序列3521GsTsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA9605GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA9606GsTsTsCsTsCsGsCsTsGsGsTsGsAsGsTsTsTsCsA12723GoToToCoToCsGsCsTsGsGsTsGsAsGoToToToCoA粗體=2’-OCH2CH2OCH3s=硫代磷酸酯(P=S)鍵o=磷酸二酯(P=O)鍵實施例152’-甲氧基乙氧基寡核苷酸ISIS 12723對人Colo-205結(jié)腸腫瘤在裸鼠中的生長的影響通過在皮膚之下注射5×106Colo-205細胞，實現(xiàn)在裸鼠中的皮下的人Colo-205結(jié)腸癌異種移植。用ISIS 12723(SEQ ID NO:30，一種具有8鏈節(jié)脫氧中央?yún)^(qū)(在其每側(cè)為具有2’-OCH2CH2OCH3修飾的6鏈節(jié)亞序列側(cè)翼)、在中央?yún)^(qū)中具有硫代磷酸酯主鏈(主鏈鍵7-14)以及在側(cè)翼區(qū)中具有磷酸二酯主鏈的寡核苷酸)或者ISIS 3521(SEQ ID NO:30，均勻脫氧硫代磷酸酯)處理小鼠，每天一次靜脈內(nèi)施用，劑量為0.006、0.06、0.6或者6.0mg/kg。在這一研究中，與鹽水空白對照劑的對照相比，ISIS12723抑制腫瘤生長達95％以上(圖7b)，與對照相比ISIS 3521抑制腫瘤生長達83％以上(圖7a)。因此甲氧基乙氧基化合物ISIS 12723是優(yōu)選的。實施例16嵌合寡核苷酸對c-raf表達的抑制作用利用Genbank c-raf序列HUMRAFR(Genbank列表x03484)設(shè)計和合成具有SEQ ID NO:7的嵌合寡核苷酸，并利用Northern印跡分析檢測其對c-rafmRNA在T24膀胱癌細胞中表達的抑制作用。這些嵌合寡核苷酸具有6、8或者10個脫氧核苷中央“缺口’’區(qū)(其以兩個2’-O-甲基修飾的核苷區(qū)為側(cè)翼)，并顯示在表9中。主鏈是均勻硫代磷酸酯。如實施例20中所描述的，在Northern印跡分析中，所有這三種寡核苷酸(ISIS6720,6鏈節(jié)脫氧缺口；ISIS 6717,8鏈節(jié)脫氧缺口；ISIS 6729,10鏈節(jié)脫氧缺口)對c-rafmRNA在T24細胞中的表達都顯示出大于70％的抑制作用。這些寡核苷酸是優(yōu)選的。具有8鏈節(jié)脫氧缺口的寡核苷酸(6717)顯示出大于90％的抑制作用因而是更優(yōu)選的。
表9嵌合的2’-O-甲基P=S脫氧“缺口”寡核苷酸粗體=2’-O-甲基寡核苷酸 序列 靶位點SEQ ID NO:6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR76717 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR76729 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR7合成附加的嵌合寡核苷酸而使之具有一或多個2’-O-甲基修飾區(qū)和均勻硫代磷酸酯主鏈。這些都顯示在表10中。所有都是硫代磷酸酯；粗體區(qū)表示2’-O-甲基修飾區(qū)。
表10嵌合的2’-O-甲基P=Sc-raf寡核苷酸寡核苷酸 序列靶位點SEQ ID NO:7848TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT5’UTR87852TCCTCCTCCCCGCGGCGGGT5’UTR87849CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC5’UTR97851CTCGCCCGCTCCTCCTCCCC5’UTR97856TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC5’UTR107855TTCTCGCCCGCTCCTCCTCC5’UTR107854TTCTCCTCCTCCCCTGGCAG3’UTR117847CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT3’UTR127850CTGGCTTCTCCTCCTCCCCT3’UTR127853CCTGCTGGCTTCTCCTCCTC3’UTR139355CGGGAGGCGGTCACATTCGG5’UTR19當用Northern印跡分析檢測ISIS 7848、7849、7851、7856、7855、7854、7847和7853抑制C-rafmRNA的能力時，它們都顯示出大于70％的抑制作用，因而都是優(yōu)選的。其中7851、7855、7847和7853顯示出大于90％的抑制作用因而是更優(yōu)選的。
制備和檢測具有各種2’修飾的附加的嵌合寡核苷酸。這些顯示在表11中。所有都是硫代磷酸酯；粗體區(qū)表示2’修飾區(qū)。
表11嵌合的2’修飾P=S c-raf寡核苷酸寡核苷酸 序列 靶位點 修飾 SEQ IDNO:6720 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR 2’-O-甲基 76717 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR 2’-O-甲基 76729 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR 2’-O-甲基 78097 TCTGGCGCTGCACCACTCTC3’UTR 2’-O-甲基 149270 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR 2’-O-丙基 79058 TCCCGCCTGTGACATGCATT3’UTR 2’-氟基 79057 TCTGGCGCTGCACCACTCTC3’UTR 2’-氟基 14其中，寡核苷酸6720、6717、6729、9720和9058是優(yōu)選的。寡核苷酸6717、6729、9720和9058是更優(yōu)選的。實施例17具有SEQ ID NO:7的2’-甲氧基乙氧基寡核苷酸對c-raf mRNA表達的影響合成兩種具有SEQ ID NO:7和包含2’-脫氧-赤型-呋喃戊糖基糖組分(其每側(cè)為具有2’-O-CH2-CH2-O-CH3修飾的6核苷單位亞序列側(cè)翼)的中央8核苷單位亞序列的寡核苷酸。這些化合物的不同之處在于它們之一，ISIS 10755(也已知為CIBA 1440)具有均勻硫代磷酸酯主鏈；另一個，ISIS 10754(也已知為CIBA 1439或者CGP 69845)在中央?yún)^(qū)中具有硫代磷酸酯鍵(鍵7-14)以及在側(cè)翼區(qū)中具有磷酸二酯鍵。檢測這些寡核苷酸的抑制c-raf mRNA在T24細胞中表達的能力。計算IC50(產(chǎn)生50％抑制作用的寡核苷酸濃度)，結(jié)果與Tm數(shù)據(jù)(顯示這些寡核苷酸與其補體的親和性)一同顯示在表12中。由于它們的極低IC50，因此ISIS 10755和ISIS10754是優(yōu)選的。通過眾所周知的固相合成技術(shù)可以方便地按常規(guī)制得按照本發(fā)明利用的寡核苷酸。(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504。)用于這樣合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems的數(shù)個賣主出售。也可以使用用于這樣合成的任何其它方法；上述寡核苷酸的實際合成完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之一。
表12在T24細胞中的反義活性和TmISIS#修飾 Tm(℃) IC50(nM)SEQ ID NO:5132 脫氧/P=S 62.2 125710755 2’-O-CH2CH2OCH3/P=S 76.120710754 2’-O-CH2CH2OCH3/P=S/P=O 77.5207實施例18ISIS 5132和CGP 69845對A549人肺腺癌腫瘤的影響在雄性Balb/c裸鼠中實現(xiàn)皮下的人A549肺腺癌異種移植，并用ISIS5132(SEQ ID NO:7)或者SEQ ID NO:7的甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)形式(CGP 69845)進行處理，兩者都是每日以靜脈注射方式施用，用藥劑量變化于0.006至6.0mg/kg之間。在所有劑量下ISIS 5132都以依賴劑量的方式減少腫瘤的大小，結(jié)果如圖6a和6b所示。甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)寡核苷酸(CGP 69845)在低劑量下具有與ISIS 5132類似的影響，甚至在6.0mg/kg的劑量下具有比ISIS 5132大的抑制作用。實施例19A549異種移植在裸鼠的大腿內(nèi)以皮下方式植入5×106個A549細胞。每日一次由靜脈注射施用懸浮在鹽水中的寡核苷酸(ISIS 5132和CGP 69845，也已知為ISIS 10754)，用藥劑量為0.006至6.0mg/kg。在第9、12、17和21天測量所產(chǎn)生的腫瘤，并計算腫瘤體積。實施例20c-raf mRNA表達的抑制作用的Northern印跡分析人泌尿膀胱癌細胞系T24得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(RockvilleMD)。使細胞生長在具有L-谷氨酰胺(Gibco BRL,Gaithersburg MD)的McCoy的5A培養(yǎng)基(補加有10％熱滅活胎牛血清以及各50U/mL的青霉素和鏈霉素)中。將細胞接種在100mm平板上。當它們達到70％融合時，用寡核苷酸處理它們。用10mL預(yù)熱的PBS和5mL OptiMEM減少的血清培養(yǎng)基(包含2.5μL DOTMA)洗滌平板。然后加入具有Lipofectin的寡核苷酸至所需的濃度。在4小時處理之后，用McCoy的培養(yǎng)基替換上述培養(yǎng)基。在寡核苷酸處理后24至72小時收獲細胞，并利用標準CsCl純化方法分離RNA。Kingston,R.E.,分子生物學(xué)當前方案(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman和K.Strahl編著)，John Wiley和Sons,NY。通過于CsCl墊層上離心細胞溶解產(chǎn)物分離全部RNA。通過1.2％瓊脂糖-甲醛凝膠電泳RNA樣品，并由毛細管擴散將其轉(zhuǎn)移到雜交膜上(歷時12-14小時)。在Stratalinker(Stratagene,La Jolla,CA)中通過暴露于紫外光下使RNA與膜交聯(lián)，并使之與隨機引發(fā)的32P標記的c-rafcDNA探針(得自ATCC)或者作為對照的G3PDH探針雜交。利用PhosphorImager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)量化RNA。實施例21Rev基因表達的寡核苷酸抑制作用用于這一分析的嵌合寡核苷酸顯示在下列的表13中。
表13定向于HIV rev基因的嵌合的2’-O-丙基/脫氧P=S寡核苷酸粗體=2’-O-丙基；s=P=S鍵；o=P=O鍵寡核苷酸序列 SEQ.ID NO:8907UoAoGoGoAoGoAsUsGsCsCsUsAsAoGoGoCoUoUoU208908GoCoUoAoUoGoUsCsGsAsCsAsCsCoCoAoAoUoUoC218909CoAoUoAoGoGoAsGsAsUsGsCsCsUoAoAoGoGoCoT22轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定使3T3細胞維持在具有葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉和10％胎牛血清(GIBCO)的DMEM中。對于所有實驗，都在前一天晚上以75,000個細胞/孔將細胞接種于6孔平板(Falcon)中。利用標準CaPO4方法完成轉(zhuǎn)染。對于每組平行實驗，沉淀15μg/mL的pSG5/rev質(zhì)粒、18μg/mL pHIVenu-luc以及2μg/mL Rep6，并將200μL此沉淀物滴在每一孔上。在37℃下使沉淀物在細胞上培養(yǎng)7小時。然后吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞一次，并加入新鮮的完全培養(yǎng)基用于一夜培養(yǎng)。在培養(yǎng)之后，除去培養(yǎng)基，用2mL OPTIMEM(GIBCO)和1mL包含2.5μg/mL Lipofectin(GIBCO-BRL)的OPTIMEM洗滌細胞，并加入寡核苷酸。在37℃下培養(yǎng)上述混合物4小時，此時自細胞中吸出上述混合物并加入完全培養(yǎng)基。在這一處理后兩小時，在所有孔中加入0.2μM/mL地塞米松(Sigma)以使得pHIVenu-luc的MMTV啟動子可以誘導(dǎo)。
24小時后進行螢光素酶分析，具體步驟如下用PBS洗滌孔兩次，并通過在200μL裂解緩沖液(1％曲通、25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA和1mM DTT)中的刮削(scraping)來收獲細胞。通過5分鐘的、11,500rpm的、低溫下的微量離心(microfuging)來澄清上述裂解物。然后在微量滴定板中將100μL裂解物與50μL分析緩沖液(25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mMMgSO4、4mM EGTA、15mM磷酸鉀、pH7.8、1mM DTT以及7.5mMATP)混合。利用微量滴定發(fā)光讀數(shù)器(Dynatech Laboratories)進行Luc檢測。通過注射50μL 1X螢光素酶溶液(Sigma)開始反應(yīng)。從10X貯存物(在10mM DTT中的10mM螢光素)，在使用前用螢光素緩沖液(25mM N-甘氨酰甘氨酸、pH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA和4mMDTT)稀釋上述1X溶液。計數(shù)樣品20秒。螢火蟲Luc光發(fā)射的動力學(xué)的特點為持續(xù)幾秒的閃光期，其后為持續(xù)幾分鐘的更低光強發(fā)射期。
Rev和RRE RNA合成pSG％-Rev包含與T7啟動子相鄰的Rev基因。BgⅢ線性化的pSG5-Rev用作為轉(zhuǎn)錄(利用T7 RNA聚合酶)的DNA模板。用于產(chǎn)生RRE RNA的模板由PCR產(chǎn)生。對于RNA合成，以0.2至1.0mg/mL濃度(具有各為5mM ATP、CTP和GTP,0.5mMUTP,10mM DTT,40mM Tris-HCl,pH7.5,6mM MgCl2,4mM亞精胺，500U/mL在20U/μL下的RNAsin,2500μCi/mL在10μCi/mL下的α32P UTP和1000U/mL T7 RNA聚合酶)利用DNA模板。在37℃下培養(yǎng)上述反應(yīng)1小時。通過加入甲酰胺加樣緩沖液終止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且在包含8M尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠中進行該反應(yīng)。按照Schwartz等(基因，1990,88,197)的方法從凝膠上洗脫RNA。實施例22抗病毒篩選的免疫測定將NHDF細胞以15,000個細胞/孔(在無血清FGM中)的密度接種在96孔培養(yǎng)平板中。在感染之前，用寡核苷酸在FGM中預(yù)處理所建立的單分子層一夜。在預(yù)處理之后，用新鮮的、預(yù)熱的FGM沖洗細胞三次，在100μL FGM/孔中加入病毒以便產(chǎn)生0.05PFU/細胞的MOI。在37℃下培養(yǎng)2小時之后，除去病毒，同時加入包含寡核苷酸的新鮮培養(yǎng)基(100μL/孔)。在感染后2天用包含寡核苷酸的新鮮培養(yǎng)基交換培養(yǎng)基，在感染后6天將細胞固定在無水乙醇中，并且使之在抗體染色的制備中干燥。將一個改進的方案用于一些測定(其中FGM補加有低水平的FBS(0.2％))，并將感染之后的培養(yǎng)期從6天縮短為3天。更短的測定消除了感染之后2天交換培養(yǎng)基的必需性。兩種測定都為50％有效濃度(EC50s)產(chǎn)生了可比值。
在包含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中封阻固定的細胞，并且在PBS-1％BSA中以1∶2000稀釋度加入小鼠單克隆抗體(1H10，由EisaiCo.,Ltd.，日本供給)。1H10抗體識別高豐度的大約65kDa大小的晚期HCMV多肽。用生物素?；纳窖蚩剐∈竺庖咔虻鞍譍 abd鏈霉親和素偶聯(lián)的β-半乳糖苷酶(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)使結(jié)合的單克隆抗體的檢測變得更為方便。將氯酚紅β-D-吡喃半乳糖苷用作為半乳糖苷酶的底物，通過用BioTex EL312e型微型平板讀數(shù)器測量個體孔的575nm的光密度來測定活性。
用于這一測定中的寡核苷酸顯示在下列的表14中。
表14嵌合的2’-O-甲基P=S寡核苷酸對CMV復(fù)制的抑制作用粗體=2’-O-甲基寡核苷酸 序列SEQ ID NO:4325GCG UUT GCT CTT CTT CUU GCG234326GCG UUU GCT CTT CTU CUU GCG24實施例23在HCV H8Ad17蛋白質(zhì)測定中的寡核苷酸270和330的評估開發(fā)了一種使用親和性純化的人多克隆抗HCV血清和125I結(jié)合的山羊抗人IgG的Western印跡分析以替代以前用來評價寡核苷酸對HCV核心蛋白質(zhì)水平的影響的ELISA分析。用H8細胞以3.5×105個細胞/孔接種六孔平板。使細胞生長一夜。在包含5μg/mL Lipofectin的Optimem中用寡核苷酸處理細胞4小時。用2mL H8培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞，并使之恢復(fù)一夜。為了收獲細胞，用2mLPBS(溶解在100μL Laemmli緩沖液中)洗滌細胞一次，并且通過刮削收獲細胞。對于電泳，煮沸細胞溶解產(chǎn)物，同時將10-14μL細胞裂解物加樣在16％聚丙烯酰胺凝膠的每一條泳道上。在電泳之后，將蛋白質(zhì)以電泳方式轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜封阻在包含2％山羊血清和0.3％Tween-20的PBS中，同時用一級抗體(人抗核心抗體2243和野兔抗G3PDH抗體)培養(yǎng)一夜，在緩沖液中洗滌膜5×5分鐘，然后用二級抗體(125結(jié)合的山羊抗人抗體和125I結(jié)合的山羊抗野兔抗體)培養(yǎng)4-8小時。在緩沖液中洗滌膜5×5分鐘，用塑料密封，并在PhosphorImager暗盒中暴光一夜。在PhosphorImager(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)上量化帶，使之標準化至G3 PDH表達水平，同時結(jié)果以未處理的對照細胞的百分比繪制成圖。
由這一Western印跡分析評估的寡核苷酸顯示在表15中。在所顯示的序列中，大寫字母表示堿基序列，小寫字母(o或者s)表示核苷間連鍵，分別為磷酸二酯(P=O)或者硫代磷酸酯(P=S)。粗體=2’-O-丙基。*=2’-O-丁基咪唑。+=2’-O-丙胺。
表15寡核苷酸#序列SEQ ID NO:270AGsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG25270BGsTsAsCsCsAsCsAsAsGsGsCsCsTsTsTsCsGsCsG25** **270CGoToAoCoCoAoCoAoAoGoGoCoCoToToToCoGoCoG25++++270DGoToAoCoCoAoCoAoAoGoGoCoCoToToToCoGoCoG25330AGsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT26330BGsTsGsCsTsCsAsTsGsGsTsGsCsAsCsGsGsTsCsT26****330CGoToGoCoToCoAoToGoGoToGoCoAoCoGoGoToCoT26++++330DGoToGoCoToCoAoToGoGoToGoCoAoCoGoGoToCoT26實施例242,6-二氨基-9-(2-O-十八烷基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤的合成將2,6-二氨基-9-(β-D-呋喃核糖基)嘌呤(50g,180mmol)和氫化鈉(7g)在DMF(1L)中加熱至煮沸并沸騰2小時。在150℃下加入碘十八烷(100g)并使反應(yīng)混合物冷卻至RT。在RT下攪拌上述反應(yīng)混合物11天。蒸發(fā)溶劑并由硅膠色譜法純化殘渣。用5％MeOH/CH2Cl2洗脫產(chǎn)物。蒸發(fā)適當?shù)慕M分以產(chǎn)生產(chǎn)物(11g)。1H NMR(DMSO-d6)δ0.84(t,3,CH2)；1.22(m,32,O-CH2-CH2-(CH2)16)；1.86(m,2,O-CH2CH2)；3.25(m,2,O-CH2)；3.93(d,1,4’H),4.25(m,1,3’H)；4.38(t,1,2’H)；5.08(d,1,3’-OH)；5.48(t,1,5’-OH)；5.75(s,2,6-NH2)；5.84(d,1,1’-H)；6.8(s,2,2-NH2)；以及7.95(s,1,8-H)。實施例252’-O-十八烷基鳥苷的合成在RT下用腺苷脫氨酶(1.5g)處理在0.1M磷酸鈉緩沖液(50mL,pH7.4)、0.1M Tris緩沖液(1000mL,pH7.4)和DMSO(1000mL)中的2,6-二氨基-9-(2-O-十八烷基-β-D-呋喃核糖基)嘌呤(10g)。在第3天、第5天和第7天加入附加份量(分別為500mg、880mg和200mg)的腺苷脫氨酶。攪拌反應(yīng)總計9天,并由硅膠色譜法的純化產(chǎn)生產(chǎn)物(2g)。一種分析樣品自重結(jié)晶而得。MeOH1H NMR(DMSO-d6)δ0.84(t,3,CH3),1.22[s,32,O-CH2-CH2-(CH2)16],5.07(m,2,3’-OH和5’-OH)；5.78(d,1,1’-H)；6.43(s,2,NH2),7.97(s,1,8-H)和10.64(s,1,NH2)C28H49N5O5的分析計算值C,62.80；H,9.16；N,12.95。實測值C,62.54；H,9.18；N,12.95。實施例26N2-異丁酰-2’-O-十八烷基鳥苷的合成使在吡啶(150mL)中的2’-O-十八烷基鳥苷(1.9g)在冰浴中冷卻，并且用三甲基甲硅烷基氯化物(2g,5當量)和異丁酰氯化物(2g,5當量)處理。攪拌反應(yīng)混合物4小時，在此期間使之加熱至室溫。冷卻溶液，加水10mL，并再攪拌30分鐘。加入濃縮的氨水(10mL)，并在真空下濃縮上述溶液。由硅膠色譜法(用3％MeOH/EtOAc洗脫)純化殘渣從而產(chǎn)生1.2g的產(chǎn)物。1H NMR(DMSO-d6),δ0.85(t,3,CH3),1.15(m,38,O-CH2CH2(CH2)16,CH(CH3)2),2.77(m,1,CH(CH3)2,4.25(m,2,2’-H和3’-H)；5.08(t,1,5’-OH),5.12(d,1,3′-OH),5.87(d,1,1’-H),8.27(s,1,8-H),11.68(s,1,NH2)和12.08(s,1,NH2)。C32H55N5O6的分析計算值C,63.47；H,9.09；N,11.57。實測值C,63.53；H,9.20；N,11.52。在把這一產(chǎn)物摻入寡核苷酸之前，按照國際公開號WO94/02501(1994年2月3日公開)所描述的方法將該產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)镹2-異丁酰-5′-二甲氧基三苯甲基-2’-O-十八烷基鳥苷，然后轉(zhuǎn)變?yōu)閬喠柞０?。實施?7用于mRNA超表達的檢測的診斷測定在合成之后通過用多核苷酸激酶在5’末端進行32P標記來放射性標記寡核苷酸。Sambrook等[“分子克隆，實驗室手冊”，冷泉港實驗室出版社，1989，第2卷，pg.11.31-11.32]。在能夠發(fā)生特異性雜交的條件下使放射性標記的寡核苷酸與懷疑有mRNA超表達的組織或者細胞樣品(如來源于患者的樣品)相接觸，同時洗滌樣品以除去未結(jié)合的寡核苷酸。維持一種類似的對照，其中在使得特異性雜交可以發(fā)生的條件下使放射性標記的寡核苷酸與正常細胞或者組織樣品相接觸，并洗滌樣品以除去未結(jié)合的寡核苷酸。在樣品中殘留的放射性表明結(jié)合的寡核苷酸的存在，并利用閃爍計數(shù)器或者其它常規(guī)方法進行量化。在得自正常和病變細胞的樣品中殘留的放射性的比較表明存在mRNA的超表達。
本發(fā)明的放射性標記的寡核苷酸也有用于放射自顯影術(shù)。利用放射性標記的寡核苷酸處理組織切片，并如同以上描述一樣洗滌該組織切片，然后按照標準的放射自顯影術(shù)方法使之暴露于照相乳膠。也維持一個利用正常細胞或者組織樣品的對照。當被顯影時，乳劑在將要量化的超表達mRNA的區(qū)上產(chǎn)生銀粒圖象。通過用正常細胞與病變細胞所觀察到的銀粒的比較來測定mRNA超表達的程度。
用于mRNA表達的熒光檢測的類似分析利用本發(fā)明的寡核苷酸，該寡核苷酸用熒光素或者其它熒光標記標記。利用具有碘氧化的標準亞磷酰胺化學(xué)在自動DNA合成儀(Appliced Biosystems Model 380B)上合成標記的DNA寡核苷酸。β-氰乙基二異丙基亞磷酰胺購自Applied Biosystems(Forster City,CA)。熒光素標記的亞酰胺化物購自Glen Research(Sterling,VA)。如同用于放射性標記寡核苷酸的方法所描述的一樣(除利用熒光顯微鏡代替閃爍計數(shù)器來檢測熒光外)進行寡核苷酸和生物樣品的培養(yǎng)。在正常和病變細胞的樣品中所觀察到的熒光的比較使mRNA超表達的檢測能夠進行。實施例28反常mRNA表達的檢測用第一32P或者熒光素標記的寡核苷酸(其定向于野生型(正常)mRNA)培養(yǎng)懷疑有反常mRNA表達的組織或者細胞樣品。在特異性雜交能夠發(fā)生的條件下用第二標記的寡核苷酸(其定向于反常mRNA)培養(yǎng)細胞或者組織的同一樣品，洗滌樣品以除去未結(jié)合的寡核苷酸。上述樣品中殘留的標記表明存在結(jié)合的寡核苷酸，同時可以利用閃爍計數(shù)器、熒光計或者其它常規(guī)方法量化該標記。如果在第二而非第一樣品的情況下觀察到結(jié)合，那么表明存在反常mRNA。
雙重標記也能夠與特異地檢測反常mRNA表達的本發(fā)明的寡核苷酸和方法一起利用。在特異性雜交能夠發(fā)生的條件下，用第一32P標記的寡核苷酸(其定向于野生型mRNA)和第二熒光素標記的寡核苷酸(其定向于反常mRNA)培養(yǎng)單一組織樣品。洗滌樣品以除去未結(jié)合的寡核苷酸，并由閃爍計數(shù)和熒光測定法檢測上述標記。如果樣品沒有結(jié)合32P標記的寡核苷酸(即不是放射性的)但是確實維持有熒光標記(即是熒光的)，那么表明存在反常mRNA。實施例29在小鼠中的寡核苷酸的血漿吸收和組織分布制備下列寡核苷酸UsGsCsAsTsCsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27UsGsCsAsTsCsCsCsCsAsGsGsCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27UsGsCsAsTsCsCCCCAGGCsCsAsCsCsAsT,SEQ ID NO:27其中粗體類型表示2’-O-丙基取代基，“s”表示硫代磷酸酯鍵合，“s”的缺乏表示在各自的寡核苷酸中的磷酸二酯鍵。第一種寡核苷酸鑒定為ISIS 3082，第二種為ISIS 9045，第三種為ISIS 9046，顯示在圖9、10、11和12中。如同Graham等，核酸研究，1993,16,3737-3743的方法一樣，氚化寡核苷酸。
動物和實驗方法對于所研究的每一寡核苷酸，隨機地分配二十只重約25g的雄性Balb/c小鼠(Charles River)到四組處理之一中。在一周馴化之后，小鼠接收3H放射性標記的寡核苷酸(大約750nmoles/kg；變化于124-170μCi/kg)的單一尾靜脈注射(在磷酸鹽緩沖的鹽水(pH7.0)中施用)。在上述劑量溶液中的寡核苷酸濃度是大約60μM。從每一組中收集眼窩后流血(以0.25、0.5、2或者4小時后劑量)和末端流血(1、3、8或者24小時后劑量)。在氯胺酮/賽拉嗪麻醉以后通過心臟穿刺來收集末端流血。保存一小份的每一種血液樣品用于放射性測定，并將余下的血液轉(zhuǎn)移到涂布EDTA的收集管中并經(jīng)離心獲得血漿。以一定時間間隔(0-4、4-8和8-24小時)從上述組(終止在24小時)中收集尿和糞便。
終止時，從每一只小鼠中收集肝、腎、脾、肺、心臟、腦、骨胳肌肉樣品、部分小腸、皮膚樣品、胰腺、骨(包含骨髓的兩股骨)和兩個淋巴結(jié)并稱其重量。稱重糞便，然后利用Brinkmann Polytron勻化器(Westbury,NY)使之以1∶1比例與蒸餾水均勻混合。分離血漿、組織、尿以及糞便勻漿用于利用燃燒的放射性分析和完整的寡核苷酸含量的測定。在收集之后所有樣品立即凍結(jié)在干冰上并存儲在-80℃下直到分析。
在血漿、組織以及排泄物中的放射性的分析將血漿和尿樣品直接稱重至閃爍藥水瓶中，并在加入15mL BetaBlend(ICN Biomedicals,CostaMesa,CA)之后由液體閃爍計數(shù)直接分析該樣品。將所有其它樣品(組織、血液和勻化的糞便)稱重至燃燒舟皿中，并在Biological MaterialsOxidizer(Model OX-100；R.J.Harvey Instrument Corp.,Hillsdale,NJ)中氧化該樣品。在20mL混合物(由15mL BetaBlend和5mL Harvey氚混合物(R.J.Harvey Instrument Corp.,Hillsdale,NJ)組成)中收集3H2O。每日通過燃燒摻加有3H-甘露糖醇溶液的樣品來測定燃燒效率，該燃燒效率變化于73.9-88.3％之間。利用Beckman LS 9800或者LS 6500液態(tài)閃爍系統(tǒng)(Beckman Instruments,Fullerton,CA)進行液體閃爍計數(shù)。用自動淬滅校正計數(shù)樣品10分鐘。將每分鐘蛻變值校正為燃燒方法的效率。
數(shù)據(jù)的分析將在樣品中的放射性表達為每克樣品每分鐘蛻變值。這些值由放射性標記的比活性劃分以便以每克樣品的總寡核苷酸的納摩爾當量表達數(shù)據(jù)，然后將其換算成每一器官或者組織的施用劑量的百分率。假設(shè)組織密度為1g/mL，則將nmole/g數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成總μM濃度。為了計算在每個時間點在血漿、肝或者腎中的完整的寡核苷酸的濃度，平均的總μM濃度除以完整的寡核苷酸在劑量溶液中的百分率(82-97％)，再乘以在每個時間點完整的寡核苷酸的平均百分率(由CGE或者KPLC測定)。然后將這一數(shù)據(jù)用于由線性回歸計算組織的半衰期，并比較不同修飾的寡核苷酸的血漿藥動學(xué)。利用PCNONLN 4.0(Statistical Consultants,Inc.,Apex,NC)測定藥動學(xué)參數(shù)。在數(shù)據(jù)的檢查之后，選用單區(qū)室團狀輸入、一級輸出模型(文庫模型1)。
以圖表在圖9、10、11和12中說明動物血漿吸收與組織分布檢測的結(jié)果。如在圖9中所看見的，在整個二十四小時的檢測時期內(nèi)每種檢測寡核苷酸的血漿濃度從初始注射水平降低至較低水平。本發(fā)明的寡核苷酸的血漿濃度維持在相當于那些非結(jié)合的攜帶硫代磷酸酯的寡核苷酸的血漿水平。如在圖10、11和12中所顯示的，從血漿吸收所有檢測化合物至組織中。本發(fā)明的化合物在各種組織之間有不同的分布。圖10顯示對照寡核苷酸(鑒定為ISIS 3082，一種硫代磷酸酯寡核苷酸)的分布模式。圖11顯示本發(fā)明的第一種化合物(一種在每一核苷上具有2’-取代基的寡核苷酸，鑒定為ISIS 9045)的分布模式。圖12顯示本發(fā)明的另一種化合物(一種“帶缺口的”寡核苷酸，鑒定為ISIS 9046，其在寡核苷酸的“側(cè)翼”區(qū)段的每一核苷上具有2’-取代基和磷酸二酯鍵以及在中央或者缺口區(qū)具有2’-脫氧的硫代磷酸酯核苷)的分布模式。實施例302,2’-脫水[1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-甲基尿苷]在DMF(300mL)中加入5-甲基尿苷(核糖基胸腺嘧啶，通過Yamasa,Choshi，日本市售的)(72.0g,0.279M)，二苯基碳酸酯(90.0g,0.420M)和碳酸氫鈉(2.0g,0.024M)。隨著攪拌，加熱混合物至回流，使所放出的二氧化碳氣體以一種控制的方式釋放。在1小時之后，在減壓下濃縮稍稍變暗的溶液。將所產(chǎn)生的糖漿倒入乙醚(2.5L)，并不斷攪拌。產(chǎn)物形成樹膠。傾析出醚，并使殘渣溶解在最小量的甲醇(大約400mL)中。將上述溶液倒入新鮮的乙醚(2.5L)中從而產(chǎn)生稠厚的樹膠。傾析出醚，并在真空烘箱(60℃,1mm Hg,24小時)中干燥樹膠從而給出粉碎成淡黃褐色粉狀(57g,85％粗產(chǎn)率)的固體。NMR光譜與為苯酚所污染的結(jié)構(gòu)(作為它的鈉鹽(大約5％))是一致的。將上述材料用于進一步的反應(yīng)(或者利用在乙酸乙酯中的甲醇梯度(10-25％)由柱色譜法能夠進一步純化上述材料從而給出一種白色固體，熔點222-4℃)實施例312’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷在2L不銹鋼壓力容器中加入2,2’-脫水-5-甲基尿苷(195g,0.81M)、三(2-甲氧基乙基)硼酸鹽(231g,0.98M)和2-甲氧基乙醇(1.2L)，并將其放置在預(yù)熱的160℃油浴中。在155-160℃下加熱48小時之后，打開容器，同時將溶液蒸發(fā)至干燥并用MeOH(200mL)研磨。使殘渣懸浮在熱丙酮(1L)中。過濾不溶鹽，用丙酮(150mL)洗滌并蒸發(fā)上述濾液。將殘渣(280g)溶解在CH3CN(600mL)中并蒸發(fā)。用包含0.5％Et3NH的CH2Cl2/丙酮/MeOH(20∶5∶3)裝填硅膠柱(3kg)。將殘渣溶解在CH2Cl2(250mL)中，并使之在裝填到柱上之前吸附在二氧化硅(150g)上。用填充溶劑洗脫上述產(chǎn)物從而產(chǎn)生160g(63％)產(chǎn)物。通過再次加工不純組分獲得附加的材料。實施例322’-O-甲氧基乙基-5'-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷用吡啶(250mL)蒸發(fā)2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(160g,0.506M)，并在吡啶中溶解所干燥的殘渣(1.3L)。加入第一小份二甲氧基三苯甲基氯(94.3g,0.278M)，并在室溫下攪拌上述混合物一小時。加入第二小份二甲氧基三苯甲基氯(94.3g,0.278M)，并再攪拌上述反應(yīng)一小時。然后加入甲醇(170mL)以停止反應(yīng)。HPLC顯示大約70％產(chǎn)物的存在。蒸發(fā)溶劑，并用CH3CN(200mL)研磨。將殘渣溶解在CHCl3(1.5L)中，并用2×500mL飽和NaHCO3和2×500mL飽和NaCl提取。在Na2SO4上干燥有機相，過濾并蒸發(fā)。獲得275g殘渣。在3.5kg硅膠柱上純化上述殘渣，裝填并用包含0.5％Et3NH的EtOAc/己烷/丙酮(5∶5∶1)洗脫。蒸發(fā)上述純組分以給出164g產(chǎn)物。從不純組分中獲得大約20g附加產(chǎn)物以給出183g(57％)總產(chǎn)物。實施例333’-O-乙酰-2'-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷在室溫下混合和攪拌2′-O-甲氧基乙基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(106g,0.167M)、DMF/吡啶(750mL從562mL DMF和188mL吡啶制備的3∶1混合物)和乙酸酐(24.38mL,0.258M)24小時。通過首先由MeOH的加入淬滅薄層色譜法樣品，由薄層色譜法監(jiān)控上述反應(yīng)。當上述反應(yīng)完成時(如以薄層色譜法判斷)，加入MeOH(50mL)并在35℃下蒸發(fā)上述混合物。將殘渣溶解在CHCl3(800mL)中，并用2×200mL飽和NaHCO3和2×200mL飽和NaCl提取。用200ml CHCl3反萃取水相。用硫酸鈉干燥合并的有機物，并蒸發(fā)從而給出122g殘渣(大約90％產(chǎn)物)。在3.5kg硅膠柱上純化殘渣并利用EtOAc/己烷(4∶1)洗脫。蒸發(fā)上述純產(chǎn)物組分從而產(chǎn)生96g(84％)產(chǎn)物。從后一組分中回收附加的1.5g產(chǎn)物。實施例343’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷通過在CH3CN(700mL)中溶解3’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基尿苷(96g,0.144M)來制備第一種溶液并將其放在一邊。在CH3CN(1L)的三唑(90g,1.3M)溶液中加入三乙胺(189mL,1.44M)，冷卻至-5℃，并利用塔頂攪拌器攪拌0.5小時。滴加POCl3(歷時30分鐘)至維持在0-10℃之間的攪拌的溶液中，將所產(chǎn)生的混合物再攪拌2小時。滴加第一種溶液(歷時45分鐘)至后一種溶液中。使所產(chǎn)生的反應(yīng)混合物在冷室中存儲一夜。從上述反應(yīng)混合物中過濾出鹽，并蒸發(fā)溶液。使殘渣溶解在EtOAc(1L)中，通過過濾除去不溶固體。用1×300mL NaHCO3和2×300mL飽和NaCl洗滌濾液，在硫酸鈉上干燥濾液并蒸發(fā)。用EtOAc研磨殘渣以給出上述標題化合物。實施例352′-O-甲氧基乙基-5′-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷在室溫下攪拌在二噁烷(500mL)和NH4OH(30mL)中的3’-O-乙酰-2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基-4-三唑尿苷(103g,0.141M)的溶液2小時。蒸發(fā)二噁烷溶液，并使殘渣與MeOH(2×200mL)共沸。使殘渣溶解在MeOH(300mL)中，并將其轉(zhuǎn)移到一個2升不銹鋼壓力容器中。加入以NH3氣體飽和的MeOH(400mL)，并加熱容器至100℃并維持2小時(薄層色譜法顯示出完全轉(zhuǎn)變)。蒸發(fā)容器內(nèi)含物至干，同時使殘渣溶解在EtOAc(500mL)中，并用飽和NaCl(200mL)洗滌一次。在硫酸鈉上干燥有機物，并蒸發(fā)溶劑以給出85g(95％)上述標題化合物。實施例36N4-苯甲?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷將2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(85g,0.134M)溶解在DMF(800mL)中并隨著攪拌加入苯甲酸酐(37.2,0.165M)。在攪拌3小時之后，薄層色譜法顯示反應(yīng)完成大約95％。蒸發(fā)溶劑，并使殘渣與MeOH(200mL)共沸。將殘渣溶解在CHCl3(700mL)中并用飽和NaHCO3(2×300mL)和飽和NaCl(2×300mL)提取，在MgSO4上干燥提取物并蒸發(fā)以給出殘渣(96g)。利用包含0.5％Et3NH作為洗脫溶劑的EtOAc/己烷(1∶1)在1.5kg二氧化硅柱上用色譜法純化殘渣。蒸發(fā)純產(chǎn)物組分以給出90g(90％)上述標題化合物。實施例37N4-苯甲?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷-3-亞酰胺化物將N4-苯甲?；?2’-O-甲氧基乙基-5’-O-二甲氧基三苯甲基-5-甲基胞苷(74g,0.10M)溶解在CH2Cl2(1L)中。在氮氣環(huán)境下，隨著攪拌加入四唑二異丙胺(7.1g)和2’-氰乙氧基-四(異丙基)亞磷酸酯(40.5mL,0.123M)。在室溫下將所產(chǎn)生的混合物攪拌20小時(薄層色譜法顯示反應(yīng)完成95％)。用飽和NaHCO3(1×300mL)和飽和NaCl(3×300mL)提取上述反應(yīng)混合物。用CH2CL2(300mL)反萃取上述含水洗滌物，同時混合上述提取物，在MgSO4上干燥并濃縮該提取物。利用作為洗脫溶劑的EtOAc/己烷(3∶1)在1.5kg二氧化硅柱上用色譜法純化所獲得的殘渣?；旌霞兘M分以給出90.6g(87％)上述標題化合物。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人ISIS藥物公司和Novartis AG(ⅱ)發(fā)明名稱糖修飾的缺口寡核苷酸(ⅲ)序列數(shù)32(ⅳ)通訊地址(A)收信人Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz&Norris(B)街道One Liberty Place-46th Floor(C)城市費城(D)州賓西法尼亞(E)國家美國(F)ZIP:19103(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸盤，720Kb(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件5.1 WordPerfect(ⅵ)當前申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朜/A(B)申請日與此一道(C)分類號N/A(ⅶ)在先申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?0,011,620(B)申請日1996年2月14日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Joseph Lucci(B)注冊號33,307(C)證書號
(ⅸ)電訊信息(A)電話215-568-3100(B)傳真215-568-3439(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CCACACCGAC GGCGCCC(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2CTTATATTCC GTCATCGCTC(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TCCGTCATCG CTCCTCAGGG(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO∶4:AAAACGTCAG CCATGGTCCC(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTCTCGCTGG TGAGTTTC(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TCTCGCTGGT GAGTTTC(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TCCCGCCTGT GACATGCATT(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TCCTCCTCCC CGCGGCGGGT(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CTCGCCCGCT CCTCCTCCCC(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:TTCTCCTCCT CCCCTGGCAG(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:CTGGCTTCTC CTCCTCCCCT(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:CCTGCTGGCT TCTCCTCCTC(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:TCTGGCGCTG CACCACTCTC(2)SEQ ID NO:15的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度47個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:ACATTATGCT AGCTTTTTGA GTAAACTTGT GGGGCAGGAGACCCTGT(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GAGATCTGAA GCTTCTGGAT GGTCAGCGC(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:GAGATCTGAA GCTTGAAGAC GCCAAAAACA TAAAG(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:ACGCATCTGG CGCGCCGATA CCGTCGACCT CGA(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CGGGAGGCGG TCACATTCGG(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:UAGGAGAUGC CUAAGGCUUU(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GCUAUGUCGA CACCCAAUUC(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:CAUAGGAGAU GCCUAAGGCT(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:GCGUUTGCTC TTCTTCUUGC G(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:GCGUUUGCTC TTCTUCUUGC G(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GTACCACAAG GCCTTTCGCG(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型
(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GTGCTCATGG TGCACGGTCT(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:UGCATCCCCC AGGCCACCAT(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:GCGTTTTTTT TTTGCG(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:CGCAAAAAAA AAAAAACGC(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:AAAACGTCAG CCATGGTCCC(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CCCCAACCAC CTCTTGCTCC(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型
(ⅳ)反義是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:GAGACCCTGA ACAGTTGATC
權(quán)利要求
1．一種可特異地與包含以共價鍵結(jié)合的核苷單位的線型序列的DNA或者RNA雜交的寡核苷酸，其中所說的序列包含具有2’-O-CH2-CH2-O-CH2糖組分的第一核苷亞序列和具有2’-脫氧糖組分的第二核苷亞序列；并且所說的第一和第二亞序列的核苷單位是由磷酸二酯或者硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的。
2．權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所說的第一和第二亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的。
3．權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所說的第一亞序列的所說核苷單位是由磷酸二酯鍵共價結(jié)合的，并且所說的第二亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的。
4．權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所說的第一亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的，并且所說的第二亞序列的所說核苷單位是由磷酸二酯鍵共價結(jié)合的。
5．權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所說的第二亞序列包含至少三個核苷單位。
6．權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所說的第二亞序列包含至少五個核苷單位。
7．權(quán)利要求1的寡核苷酸，該寡核苷酸具有5至50個核苷單位。
8．權(quán)利要求1的寡核苷酸，該寡核苷酸還包含具有2’-O-CH2-CH2-O-CH3糖組分的第三核苷亞序列，其中所說的第二亞序列位于所說的第一和第三亞序列之間。
9．權(quán)利要求8的寡核苷酸，其中所說的第一、第二和第三亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的。
10．權(quán)利要求8的寡核苷酸，其中所說的第一和第三亞序列的所說核苷單位是由磷酸二酯鍵共價結(jié)合的，并且所說的第二亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的。
11．權(quán)利要求8的寡核苷酸，其中所說的第一和第三亞序列的所說核苷單位是由硫代磷酸酯鍵共價結(jié)合的，并且所說的第二亞序列的所說核苷單位是由磷酸二酯鍵共價結(jié)合的。
12．權(quán)利要求8的寡核苷酸，其中所說的第二亞序列包含至少三個核苷單位。
13．權(quán)利要求8的寡核苷酸，其中所說的第二亞序列包含至少五個核苷單位。
14．權(quán)利要求8的寡核苷酸，該寡核苷酸具有5至50個核苷單位。
全文摘要
本發(fā)明提供了一些寡核苷酸,這些寡核苷酸具有增加的核酸酶抗性,具有增加對互補核酸鏈的結(jié)合親和性的取代基,并且具有激活RNaseH的2’－脫氧－赤型－呋喃戊糖基核苷的亞序列。這些寡核苷酸在診斷學(xué)和其它目的的研究中,在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在有機體中的表達上,和在診斷、檢測與治療對寡核苷酸治療敏感的其它疾病上是有用的。
文檔編號C07H21/00GK1214688SQ97193129
公開日1999年4月21日 申請日期1997年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者P·D·庫克, B·莫尼亞, K-H·奧特曼, P·馬丁 申請人:伊希斯藥物有限公司, 諾瓦提斯公司