專利名稱：環(huán)狀粘著抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式Ⅰ的新環(huán)肽環(huán)-(Arg-Gly-Asp-X-Y)Ⅰ，其中X是Cha,Nal,Phe,2-R1-Phe,3-R1-Phe,4-R1-Phe，高-Phe,Phg,Thi,Trp,Tyr或者Tyr的衍生物，OH基可能被1-18個(gè)碳原子的烷基醚化，同樣所論及的氨基酸殘基可能被額外衍生化，R1是NH2,NO2,I,Br,Cl,F，具有1-18個(gè)碳原子的烷基，Ar,Ar-O或者3H，Y是Gly,αN原子可能被R2取代和/或αC原子可能被R3和/或R4取代，其條件是Gly以指明的方式至少取代一次，Ar是苯基，其可以也可以不被NH2,NO2,I,Br,Cl,F,具有1-6個(gè)碳原子的烷基或者3H取代一次或者兩次，R2,R3或R4各自分別是具有1-18個(gè)碳原子的烷基，或者在每種情況下，R2和R3或R3和R4一起是支鏈或者無支鏈的具有3-18個(gè)碳原子的亞烷基鏈，以便αN原子和αC原子與亞烷基鏈一起，或αC原子單獨(dú)與亞烷基鏈一起形成環(huán)，這里當(dāng)涉及旋光性氨基酸和氨基酸衍生物的殘基時(shí)，包括D和L構(gòu)型兩者，以及衍生物，尤其是天冬氨酸β-酯或精氨酸的N-胍-?；苌?，或前藥及它們生理上可接受的鹽。
從例如EP0406428和FEBS Lett.291,50-54(1991)可以知道類似的化合物。
本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)了具有有價(jià)值的性質(zhì)的新化合物，尤其是可用于藥物生產(chǎn)的那些。
人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，式Ⅰ的化合物和其鹽有十分有價(jià)值的性質(zhì)。尤其是，它們作為整聯(lián)蛋白抑制劑，在這種情況下它們特別是抑制β3-或β5-整聯(lián)蛋白受體與配體的相互作用。該化合物在αvβ3,αvβ5和αⅡβ3整聯(lián)蛋白的情況下特別有活性，但也與αvβ1-,αvβ6-和αvβ8受體有關(guān)。例如，根據(jù)由J.w.Smith等在生物化學(xué)雜志265,12267-12271(1990)中所描述的方法可顯示這些作用。此外，有消炎作用。
P.C.Brooks,R.A.Clark和D.A.Cheresh在科學(xué)264,569-71(1994)中描述了關(guān)于血管整聯(lián)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間相互作用的血管形成發(fā)展的依賴性。
P.C.Brooks,A.M.Montgomery,M.Rosenfeld,R.A.Reisfeld,T,-Hu,G.Klier和D.A.Cheresh在細(xì)胞79,1157-64(1994)中描述了，通過環(huán)肽抑制這種相互作用和血管細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡相關(guān)性引發(fā)的可能性。
阻止整聯(lián)蛋白受體和配體，例如血纖蛋白原與血纖蛋白原受體(糖蛋白Ⅱb/Ⅲa)相互作用的式Ⅰ的化合物，作為GPⅡb/Ⅲa拮抗劑防止腫瘤細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移的傳播。以下的觀察顯示這一點(diǎn)腫瘤細(xì)胞與血小板的相互作用形成小顆粒(微血栓)引起腫瘤細(xì)胞從局部腫瘤進(jìn)入血管系統(tǒng)的傳播。小顆粒所提供的保護(hù)屏蔽腫瘤細(xì)胞，且其不被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞所識(shí)別。
小顆粒能夠附在血管壁上，利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入組織的進(jìn)一步侵入。由于微血栓的形成是由在活化的血小板上血纖蛋白原結(jié)合到血纖蛋白原受體上而介導(dǎo)的，因此GPⅡa/Ⅲb拮抗劑可被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的有效抑制劑。
在使用生物材料，移植物，導(dǎo)管或者起博器的手術(shù)情況下，也可采用式Ⅰ的化合物作為抗茵物。在這種情況下它們有殺菌作用?？挂鸹钚缘男?yīng)可用P.valentin-Weigund等在感染和免疫性2851-2855(1988)中描述的方法證實(shí)。
因?yàn)槭舰竦幕衔飿?gòu)成血纖蛋白原結(jié)合的抑制劑，從而構(gòu)成血小板上的血纖蛋白原受體的配體，它們可在體內(nèi)血管系統(tǒng)中作為診斷劑用于檢測(cè)和定位血栓，只要它們被例如，放射性或者UV-可檢測(cè)的基團(tuán)所取代。
作為血纖蛋白原結(jié)合抑制劑的式Ⅰ的化合物，同樣有利于研究不同活化階段血小板的代謝或血纖蛋白原受體的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制代謝。摻入標(biāo)記的可檢測(cè)單位例如3H同位素標(biāo)記，在結(jié)合到受體上之后，使所說的機(jī)制能被研究。
因此，該化合物有抑制天然或合成配體結(jié)合整聯(lián)蛋白，尤其是整聯(lián)蛋白αvβ3,αvβ5和αⅡbβ3，及αvβ1,αvβ6-和αvβ8的性質(zhì)。
此外，它們優(yōu)于Y-氨基酸的α-N-烷基化或α-C-烷基化引起代謝穩(wěn)定化且增加脂肪-溶解性這一現(xiàn)有技術(shù)。由于例如N-烷基不能作為C=O的H供體，所以因可能的氫橋減少穿透膜的能力得到提高，這樣就可能獲得增加的口服吸收性；而且，增加的血漿蛋白質(zhì)結(jié)合可能發(fā)生。
Y-氨基酸單位的α-N-烷基化或α-C-烷基化提高了化合物的抑制效力，并且提高了對(duì)特異性整聯(lián)蛋白的抑制選擇性。選擇性尤其會(huì)受到N-烷基的影響。
在人和獸醫(yī)醫(yī)藥業(yè)，該化合物可以用作為藥物有效成分，特別是用于循環(huán)紊亂，血栓癥，心肌梗塞，動(dòng)脈硬化，炎癥，中風(fēng)，心絞痛胸痛，腫瘤紊亂，骨質(zhì)溶解紊亂，尤其是骨質(zhì)疏松，血管生成及血管生成導(dǎo)致的紊亂，例如血管成形術(shù)后，眼的糖尿病性視網(wǎng)膜疾病，眼科疾病，斑點(diǎn)退化，近視，眼組織胞漿菌病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，發(fā)紅性青光眼，及潰爛性結(jié)腸炎，Crohn疾病，多發(fā)性硬化癥，牛皮癬和restenosis的預(yù)防和治療。另外在微生物感染和急性腎衰竭中的情況下，該化合物可用于提高和促進(jìn)傷口愈合過程。
如借助于從文獻(xiàn)中知道的方法可顯示這些作用，例如P.C.Brooks等在細(xì)胞79,1157-1164(1994)或者科學(xué)264,569-571所描述的方法。
上述和下列氨基酸殘基的縮寫表示下面的氨基酸的殘基Abu 4-氨基丁酸Achaα-氨基環(huán)己烷羧酸AcpAα-氨基環(huán)戊烷羧酸Aha 6-氨基己酸
Ahds 16-氨基十六烷酸Aib 3-氨基異丁酸Ala 丙氨酸Aos 8-氨基辛酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Asp(或) 天冬氨酸(β酯)Arg 精氨酸N-Ac-Arg N-胍基酰基精氨酸Cha 3-環(huán)己基丙氨酸Dab 2,4-二氨基丁酸Dap 2,3-二氨基丙酸Deg 二乙基甘氨酸Gln 谷氨酰胺Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸hPro 2-哌啶酸His 組氨酸Ile 異亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 賴氨酸Nal 3-(2-萘基)丙氨酸Nhdg N-十六烷基甘氨酸Nle 正亮氨酸Phe 苯丙氨酸homoPhe 同型苯丙氨酸4-Hal-Phe 4-鹵代苯丙氨酸Phg 苯基甘氨酸Pro 脯氨酸
Sar 肌氨酸(N-甲基甘氨酸)Tia 3-(2-噻吩基)丙氨酸Tic 四氫異喹啉-3-羧酸Thr 蘇氨酸Tle 叔-亮氨酸(Cα-叔-丁基甘氨酸)Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 纈氨酸。
此外，以下縮寫的意義如下BOC 叔-丁氧羰基Bzl 芐基DCCI環(huán)己基碳化二亞胺DMF 甲基甲酰胺EDCIN-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺xHClEt 乙基Fmoc9-芴基甲氧羰基HOBt1-羥基苯并三唑Me 甲基Mtr 4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基硫酰NMe N-甲基化α-氨基OBut叔-丁基酯OMe 甲酯OEt 乙酯POA 苯氧基乙?；鵗BTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽TFA 三氟乙酸。
上述氨基酸可以以一些對(duì)映體形式存在，所有這些形式和它們的混合物(如DL形式)包括在上述和下文中，例如作為式Ⅰ的化合物的成分。氨基酸(如作為式Ⅰ的化合物的成分)也能以大家本質(zhì)上所熟悉的適當(dāng)保護(hù)基被提供。
此外，本發(fā)明也包括氨基酸殘基完全或部分被衍生化的那些肽。術(shù)語″衍生化″可被理解為所謂的前藥，例如Arg的N-胍基-?；苌?，Asp的β-酯，賴氨酸的Nε-鏈烷基，Nε-氨基鏈烷基及Nε-巰基鏈烷基衍生物(只列出了幾個(gè))也包括在內(nèi)。此外，氨基酸殘基可以部分地被C-α-烷基化或者，例如為達(dá)到診斷目的，可以進(jìn)行同位素-標(biāo)記。也包括那些式Ⅰ的化合物，其中X和Y單位側(cè)鏈被氨基，羧基或者巰基附加衍生化，如為了達(dá)到免疫和抗體產(chǎn)生的目的，這些衍生物對(duì)于更高分子量綴合物制備是重要的起始化合物。另外還可能利用一定的氨基酸殘基或衍生的氨基酸殘基側(cè)鏈中的官能團(tuán)使聚合物材料上的肽固定化，以制備親合色譜柱，或者利用官能團(tuán)和診斷的輔助試劑(如熒光取代基)進(jìn)行衍生化作用。
本發(fā)明另外涉及根據(jù)權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物或者其鹽之一的制備方法，其特征在于通過用溶劑解或氫解劑處理從它的功能衍生物之一中釋放出所述的化合物，或者其特征在于用環(huán)化劑處理式Ⅱ肽H-Z-OHⅡ，其中Z是-Arg-Gly-Asp-X-Y--Gly-Asp-X-Y-Arg--Asp-X-Y-Arg-Gly--X-Y-Arg-Gly-Asp-或-Y-Arg-Gly-Asp-X-，或這種肽的反應(yīng)性衍生物，或者其特征在于通過烷基化，酰化或者酯化衍生化一種環(huán)肽，該環(huán)肽本身符合式Ⅰ，但具有一個(gè)或多個(gè)游離氨基，酸基和/或活化的α碳原子，和/或其特征在于通過用酸或堿處理將式Ⅰ的堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化成其鹽之一。
上述和以下文中，基團(tuán)X和Y為式Ⅰ和式Ⅱ所給出的含意，除非以其它方式明確地說明。用于各基團(tuán)中的字母與編碼氨基酸的單字母密碼無關(guān)。
在上述式中，烷基優(yōu)選地是甲基，乙基，異丙基，正丁基，仲丁基或者叔丁基。然而，烷基進(jìn)一步優(yōu)選地為正戊基，異戊基，新戊基，正己基，正庚基，正辛基，正壬基，正癸基或者正十六烷基。
X基優(yōu)選Phe，也優(yōu)選D-Phe，且優(yōu)選Phe(4-Hal)，尤其是Phe(4-F)或者Phe(4-Cl)和，同型-Phe或者Phg,D構(gòu)型也同樣優(yōu)選。
Y優(yōu)選為疏水氨基酸殘基，尤其是Gly,Ala,Val,Leu,Nle或者Ile。
因此，本發(fā)明特別涉及其中提到的至少一個(gè)基團(tuán)有上述優(yōu)選含意之一的式Ⅰ的化合物。
更為優(yōu)選的一組化合物可以由亞式Ⅰa來表示，其符合式Ⅰ但其中X是D-Phe,Phe,D-同型Phe，同型Phe,D-Phg,Phg,Phe(4-F),D-Phe(4-F),D-Phe(4-Cl)或者Phe(4-Cl)，并且Y是Nle,hPro,Ahds,Aos,Nhdg,Acha,Aib,Acpa,Tle,Ala,Leu或者Ile,D和L構(gòu)型同樣優(yōu)選。
另一更為優(yōu)選的一組化合物可以由亞式Ⅰb來表示，其符合式Ⅰ但其中X是D-Phe或者Phe和Y是Ahds,hPro,Aos,Nhdg,Acha,Aib,Acpa或者Tle,D和L構(gòu)型同樣優(yōu)選，并且所有氨基酸殘基Arg,Gly或Asp均以天然L構(gòu)型出現(xiàn)。
進(jìn)一步優(yōu)選的一組化合物可以由亞式Ⅰc表示，其符合亞式Ⅰa和Ⅰb和式Ⅰ，但其中僅一個(gè)氨基酸殘基X或者Y以D構(gòu)型存在，而所有其它的為L構(gòu)型。
此外，特別優(yōu)選的為符合亞式Ⅰa,Ⅰb和Ⅰc的化合物的所有生理上相容的鹽。
此外，特別是在已知和適合所說反應(yīng)的條件下，式Ⅰ的化合物及制備它們的起始材料可用大家熟悉的方法制備，如文獻(xiàn)中所描述的(例如權(quán)威著作Houben-Weyl，有機(jī)化學(xué)方法Georg-Thieme-Verlag,Stuttgart)。在此，也可利用已知的其它方法，其在這里沒有被非常詳細(xì)地論及。
若需要，也可就地形成起始物質(zhì)，以便它們不必與反應(yīng)混合物分離，而是立即進(jìn)一步反應(yīng)以產(chǎn)生式Ⅰ的化合物。
經(jīng)過溶劑解，尤其是水解或氫解，通過由它們的功能衍生物釋放能夠獲得式Ⅰ的化合物。
溶劑解或者氫解的優(yōu)選起始材料是那些含有合適被保護(hù)的氨基和/或羥基的而不是含有一個(gè)或多個(gè)游離氨基和/或羥基的化合物，優(yōu)選的那些攜帶氨基保護(hù)基而不是連接在氮原子上的氫原子，例如那些符合式Ⅰ但是，不含NH2基而含有NHR′基的化合物(其中R′是氨基保護(hù)基如BOC或CBZ)。
其它更為優(yōu)選的起始材料是那些攜帶羥基保護(hù)基而非羥基的氫原子，例如那些符合式Ⅰ但是，其攜帶R″O-苯基(其中R″是羥基保護(hù)基)而不是羥苯基的化合物。
起始材料的分子中也可能存在兩個(gè)或者多個(gè)相同或不同的被保護(hù)的氨基和/或羥基。如果存在的保護(hù)基互不相同，則在許多情況下可將它們選擇性地去除。
″氨基保護(hù)基″的表述廣為人知，涉及適合于保護(hù)(封閉)化學(xué)反應(yīng)中的氨基的基團(tuán)，但其在所需的化學(xué)反應(yīng)已在分子的其它位置完成之后能容易除去。這類基團(tuán)的代表尤其是，非取代或者取代的酰基，芳基，芳烷氧基甲基或者芳烷基。由于氨基保護(hù)基在所需反應(yīng)(或反應(yīng)序列)之后被除去，所以它們的性質(zhì)及大小不是很關(guān)鍵的；然而，優(yōu)先選擇是那些具有1-20，特別是1-8個(gè)碳原子的。術(shù)語″酰基″在與當(dāng)前方法相關(guān)時(shí)以最廣的意義來作解釋。它包括衍生于脂肪族，芳脂族，芳香族或者雜環(huán)羧酸或磺酸的?；停绕涫?，烷氧羰基，芳氧羰基和，首先是芳烷氧羰基。這樣的酰基例子是烷?；缫阴；?，丙?；?，丁?；?；芳烷?；绫揭阴；环减；绫郊柞；蚣妆锦；?；芳氧基烷?；鏟OA；烷氧羰基如甲氧羰基，乙氧羰基，2,2,2-三氯乙氧羰基,BOC,2-碘代乙氧羰基；芳烷氧羰基如CBZ(芐氧羰基)，4-甲氧基芐氧羰基，F(xiàn)MOC；和芳基磺酰基如Mtr。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是BOC和Mtr，及CBZ,Fmoc，芐基和乙?；?。
″羥基保護(hù)基″的表述也廣為人知，涉及適合于保護(hù)(封閉)化學(xué)反應(yīng)中的羥基，但其在所需的化學(xué)反應(yīng)已在分子的其它位置完成之后能夠容易除去。這類基團(tuán)的代表是上述非取代或者取代的芳基，芳烷基或者?；?，還有烷基。由于羥基保護(hù)基在所需反應(yīng)(或反應(yīng)序列)之后被除去，所以它們的性質(zhì)及大小不是很關(guān)鍵的；然而，優(yōu)先選擇是那些具有1-20，特別是1-10個(gè)碳原子的。羥基保護(hù)基的例子包括芐基，對(duì)硝基苯甲酰基，對(duì)甲苯磺酰基，叔丁基及乙酰基，尤其優(yōu)先選擇芐基和叔丁基。天冬氨酸和谷氨酸中的COOH基優(yōu)選以它們的叔丁基酯的形式被保護(hù)(如Asp(OBut))。
用作為起始材料的式Ⅰ的化合物的功能衍生物可以用氨基酸和肽合成的通常的方法制備，如，在所提到的專利申請(qǐng)與權(quán)威著作中所描述的方法，包括例如根據(jù)Merrifield(B.F.Gysin和R.B.Merrifield，美國化學(xué)會(huì)雜志，94,3102ff.(1972))的固相方法。
用如強(qiáng)酸，有利的是三氟乙酸或者高氯酸，及其它強(qiáng)無機(jī)酸，如鹽酸或者硫酸，強(qiáng)有機(jī)羧酸，如三氯乙酸，或者磺酸如苯-或?qū)妆交撬?取決于所利用的保護(hù)基)，從它們的功能衍生物中釋放出式Ⅰ的化合物。附加惰性溶劑的存在是可能的但不總是必要的。合適的惰性溶劑優(yōu)選為有機(jī)溶劑，例如羧酸，如醋酸，醚諸如四氫呋喃或者二噁烷，酰胺如DMF，鹵代烴如二氯甲烷，及醇如甲醇，乙醇或者異丙醇，以及水。上述溶劑的混合物也合適。三氟乙酸為優(yōu)選的是過量使用而不需加另一種溶劑，高氯酸則優(yōu)選以乙酸和70％高氯酸9∶1的混合物形式使用。有利的斷裂反應(yīng)溫度是在約0℃和約50℃之間；優(yōu)選的是在15℃和30℃之間(室溫)。
在15-30℃優(yōu)選采用如二氯甲烷中的TFA或二噁烷中的約3-5N的HCl可除去BOC,OBut和Mtr基，而FMOC基可用合適的DMF中的二甲胺，二乙胺或者哌啶的約5-50％溶液除去。
由氫解可除去的保護(hù)基(例如CBZ或者芐基)可以被除去，例如，在催化劑(例如貴金屬催化劑諸如鈀，優(yōu)選在支持體諸如炭上)存在下用氫處理。在這一情況下的合適溶劑是以上所論及的那些，尤其是，例如，醇如甲醇或者乙醇或者酰胺如DMF。通常在溫度約0℃和100℃之間和壓力約1和200巴間進(jìn)行氫解，優(yōu)選地在20-30℃和1-10巴之間。例如，CBZ基的氫解易于在20-30℃下在甲醇中的5-10％Pd-C上進(jìn)行或者利用甲酸銨(代替H2)在甲醇/DMF中的Pd-C上進(jìn)行。
在肽合成的條件之下，式Ⅰ的化合物也可由式Ⅱ化合物的環(huán)化而獲得。在這種情況下，依據(jù)所描述的肽合成的通常方法(例如，在Houben-Weyl,1.c.,15/Ⅱ卷，第1-806頁(1974)中)有助于進(jìn)行該反應(yīng)。
反應(yīng)優(yōu)選地在脫水劑，例如碳化二亞胺如DCCI或EDCI，以及另外丙烷膦酸酐(參見Angew.Chem.92,129(1980))，聯(lián)苯磷?；B氮化物或者2-乙氧基-N-乙氧羰基-1,2-二氫喹啉的存在下在惰性溶劑(例如鹵代烴諸如二氯甲烷，醚如四氫呋喃或者二噁烷，酰胺如DMF或者二甲基乙酰胺，腈如乙腈，或者這些溶劑的混合物)中，溫度在-10℃和40℃之間，優(yōu)選為0℃和30℃之間進(jìn)行。為了促進(jìn)分子內(nèi)環(huán)化超過分子間肽的結(jié)合，在稀釋的溶液(稀釋原理)中進(jìn)行有利。
代替Ⅱ，在反應(yīng)中也可采用這些物質(zhì)的合適的反應(yīng)衍生物，例如那些其反應(yīng)性基團(tuán)被保護(hù)基中間封閉的。例如，氨基酸衍生物Ⅱ可以便于就地形成(如通過加入HOBt或者N-羥基琥珀酰亞胺)的它們的活化酯形式使用。
一般來說，式Ⅱ的起始材料是新的。它們可用已知方法制備，例如上述肽合成的方法，和保護(hù)基的去除方法。
一般來說，首先合成式R′-Z-OR″的被保護(hù)的五肽酯，例如BOC-Z-OMe或者BOC-Z-OEt，其先被水解以形成式R′-Z-OH的酸，例如BOC-Z-OH；從這些酸中除去R′保護(hù)基以形成式H-Z-OH(Ⅱ)的游離肽。
本身符合式Ⅰ的化合物的環(huán)肽的衍生化同樣用其本身已知的方法進(jìn)行，如所了解的胺類的烷基化，羧酸的酯化或者脂族碳原子的親核取代，及任何有機(jī)化學(xué)的教科書中所描述的方法，例如J.March，高等有機(jī)化學(xué)，John Wiley & Sons N.Y.(1985)。
利用酸可將式Ⅰ的堿轉(zhuǎn)化成相關(guān)的酸的加成鹽。適合于這一反應(yīng)的酸，尤其是，那些產(chǎn)生生理上可接受的鹽的酸。因而可利用無機(jī)酸，例子是硫酸，硝酸，氫鹵酸如鹽酸或者氫溴酸，磷酸如正磷酸，氨基磺酸，以及有機(jī)酸，尤其是脂肪族，脂環(huán)族，芳脂族，芳香族或者雜環(huán)一元或者多元羧酸，磺酸或者硫酸，例如甲酸，乙酸，丙酸，新戊酸，二乙基醋酸，丙二酸，丁二酸，庚二酸，延胡索酸，馬來酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，苯甲酸，水楊酸，2-或3-苯基丙酸，檸檬酸，葡糖酸，抗壞血酸，煙酸，異煙酸，甲烷-或者乙烷磺酸，乙烷二磺酸，2-羥基乙烷磺酸，苯磺酸，對(duì)甲苯磺酸，萘-單-和-二磺酸，十二烷基硫酸。與生理上不接受的酸(例如苦味酸)所成的鹽可用于分離和/或純化式Ⅰ的化合物。
此外，通過與堿反應(yīng)，式Ⅰ的酸可以被轉(zhuǎn)變成其生理上可接受的金屬或者銨鹽之一。在這一情況下特別合適的鹽是鈉，鉀，鎂，鈣，和銨鹽，及取代的銨鹽，例如二甲基-，二乙基-或者二異丙基銨鹽，單乙醇-，二乙醇-或者三乙醇銨鹽，環(huán)己基銨鹽，二環(huán)己基銨鹽，二芐基亞乙基二銨鹽，并且，例如，與N-甲基-D-葡糖胺或與精氨酸或者賴氨酸所成的鹽。
將式Ⅰ的新化合物和它們的生理上可接受的鹽與至少一種賦形劑或助劑一起(如果需要，與一種或多種其它有效成分一起)配成合適的劑量形式，可用于藥物制劑的生產(chǎn)中。這樣得到的制劑可用于人或者獸醫(yī)藥業(yè)。合適的賦形劑物質(zhì)是有機(jī)或者無機(jī)物質(zhì)，其適合于經(jīng)腸胃(例如口或者直腸)，腸胃外(例如靜脈注射)或者局部(例如體表，皮膚，眼或鼻)的施用或者以吸入噴霧形式的施用，并且不與新化合物發(fā)生反應(yīng)，例子是水或者含水的等滲鹽水溶液，低級(jí)醇，植物油，芐基醇，聚乙二醇類，三乙酸甘油酯以及其它脂肪酸甘油酯，明膠，大豆卵磷脂，碳水化合物如乳糖或者淀粉，硬脂酸鎂，滑石，纖維素和礦脂。對(duì)于口服應(yīng)用，普通片劑，包衣片劑，膠囊，糖漿，汁或者滴劑特別有用；具腸衣或者膜殼的片劑和膠囊是非常有益的。栓劑用于直腸施用，溶液用于腸胃外施用，優(yōu)選地為油溶液或者水溶液，及懸浮液，乳狀液或者植入物。適于局部施用形式的例子是溶液，可使用滴眼劑形式的溶液，以及例如，懸浮液，乳狀液，乳膏，軟膏或者敷布。對(duì)于吸入噴霧形式的施用，可利用含有溶解于或懸浮于推進(jìn)氣體或者推進(jìn)氣體混合物(例如CO2或者氟氯烴替代物)中的有效成分的噴霧劑。在這種情況下，有效成分可能在一種或多種附加的生理上相容的溶劑，如乙醇的存在下，以微顆粒化形式被有效地利用。吸入溶液借助于通常的吸入器而吸入。新化合物也可被凍干而且所形成的凍干品用于例如制備注射制劑。這種注射劑可作為大輸液或以連續(xù)注入形式(例如靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，以及腔內(nèi))給藥?？蓪⑺鲋苿┻M(jìn)行滅菌和/或其可包括輔助劑如防腐劑，穩(wěn)定劑和/或潤濕劑，乳化劑，影響滲透壓的鹽，緩沖劑物質(zhì)，著色劑和/或調(diào)味劑。如果需要，它們可含有一種或多種其它活性組分，包括例如一種或多種維生素。
一般來說，根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)其施用可以類似于其它已知的市售肽，尤其相似于在US4,472,305中所描述的化合物，每劑量單位優(yōu)選用量為約0.05和500mg，特別優(yōu)選為0.5和100mg之間。每日劑量優(yōu)選為在約0.01到2mg/kg體重之間。然而，每一特殊患者的具體劑量取決于各種因素，例如，所使用的具體化合物的活性，年齡，體重，一般的健康狀況，性別，飲食，施用時(shí)間及途徑，排泄的速率，藥物的結(jié)合和所治療的特殊疾病的嚴(yán)重程度。腸胃外施用為優(yōu)選。
此外，式Ⅰ的新化合物可作為生產(chǎn)親合色譜柱的整聯(lián)蛋白配體以制備純化形式的整聯(lián)蛋白。
在這種情況下，通過錨定功能團(tuán)將配體，即式Ⅰ的肽衍生物共價(jià)連接到聚合支持體上。
合適的聚合支持體材料是肽化學(xué)中所知道的聚合固體表面，優(yōu)選地為具親水性質(zhì)的，例如交聯(lián)的多糖如纖維素，瓊脂糖凝膠或者葡聚糖凝膠，丙烯酰胺，基于聚乙二醇或者Tentakel聚合物的聚合體。
連接到聚合支持體上的合適的錨定功能團(tuán)優(yōu)選為具2-12個(gè)碳原子的線型的亞烷基鏈，其能直接結(jié)合在聚合物的一端并且另一端具有官能團(tuán)，例如羥基，氨基，巰基，順丁烯二酰亞胺基或者-COOH并且適合于連接各自肽的C-及N-末端段。
在這種情況下，肽可能直接結(jié)合或同樣通過第二錨定功能團(tuán)結(jié)合到聚合物的錨上。對(duì)含具功能化側(cè)鏈的氨基酸殘基的肽來說也可能通過這些側(cè)鏈連接到聚合物的錨功能團(tuán)上。
此外，作為式Ⅰ肽成分的某些氨基酸殘基在其側(cè)鏈可被修飾，以便它們可通過例如，SH,OH,NH2或者COOH基有效地與聚合物的錨相錨定。
在這一方面，可能有不尋常的氨基酸，例子是苯丙氨酸衍生物其在苯環(huán)的第4位攜帶巰基，羥基，氨基或者羧基烷基鏈，官能團(tuán)定位在鏈的末端。
其側(cè)鏈可以直接用作錨功能團(tuán)的氨基酸殘基的例子是如，Lys,Arg,Asp,Asn,Glu,Gln,Ser,Thr,Cys或Tyr。
N-末端錨的例子是基團(tuán)如例如-CO-CnH2n-NH2,-CO-CnH2n-OH,-CO-CnH2n-SH或-CO-CnH2n-COOH此處n=2-12，亞烷基鏈的長度不是關(guān)鍵性的，如果需要，該鏈也有可能由適當(dāng)?shù)睦绶蓟蛘咄榉蓟〈?br> C-末端錨是，例如，-O-CnH2n-SH-,-O-CnH2n-OH,-O-CnH2n-NH2,-O-CnH2n-COOH,-NH-CnH2n-SH,-NH-CnH2n-OH,-NH-CnH2n-NH2或-NH-CnH2n-COO,n和亞烷基鏈均遵從上段中的注釋。
也可將N-和C-末端錨用作為氨基酸殘基的已功能化的側(cè)鏈的錨組分。在這種情況下，合適的氨基酸殘基是那些如Lys(CO-C5H10-NH2)，Asp(NH-C3H6-COOH)或Cys(C3H6-NH2)，錨總是被連接到側(cè)鏈的功能團(tuán)上。
在如為大家所熟悉的氨基酸縮合的常規(guī)條件下，且其已在制備式Ⅰ的化合物的段落中提到，來制備用于純化整聯(lián)蛋白的親合色譜的材料。
除了為固定于生產(chǎn)親合色譜柱的聚合物材料上利用環(huán)肽之外，還可用具有它們的功能化側(cè)鏈的化合物進(jìn)一步與診斷輔助試劑(例如熒光取代基)發(fā)生衍生化作用。
此外，也可引入官能團(tuán)諸如氨基，巰基或者羧基至基團(tuán)D和E的側(cè)鏈中，通過這些基團(tuán)然后可制備與蛋白質(zhì)或者其它高分子量物質(zhì)的綴合物，例如為了免疫目的和/或抗體產(chǎn)生。
上述和以下所指定的所有溫度均為℃。在下面的例子中，″常規(guī)操作″是指如果必要加入水，中和混合物并用乙醚或者二氯甲烷抽提，分離相，將有機(jī)相在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)濃縮和通過硅膠層析和/或結(jié)晶作用來純化殘基。RT=保留時(shí)間(分鐘)。通過HPLC在LichrosorbRP選擇B(7μm)-250×4mm柱上分析，洗脫液A:0.3％的TFA水溶液；洗脫液B:2-丙醇/水(8∶2)中的0.3％TFA，梯度1-99％B,50分鐘，1ml/分鐘的流速，并在215nm處檢測(cè)。M+=用″快原子轟擊″(FAB)方法獲得的質(zhì)譜中的分子峰。
實(shí)施例1用85ml二氯甲烷稀釋1.1克H-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-hPro-ONa[例如，可從Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-hPro-O-Wang(其中-O-Wang是用于改良的Merrifield技術(shù)的4-羥甲基-苯氧甲基聚苯乙烯樹脂的基團(tuán))中，通過用哌啶/DMF除去Fmoc基及用TFA/CH2Cl2(1∶1)除去樹脂獲得]的15mlDMF溶液，并加入50mgNaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷卻之后，加入40μl二苯基磷酰基疊氮化物。室溫下放置16小時(shí)后，濃縮溶液。將濃縮物凝膠-過濾(在異丙醇/水(8∶2)中的葡聚糖凝膠G10柱)，然后以通常的方式用HPLC純化。用TFA/H2O(98∶2)處理，給出環(huán)-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-hpro)；RT=18.5；FAB-MS(M+H):587。
下列物質(zhì)是通過環(huán)化對(duì)應(yīng)的線型肽和除去保護(hù)基而同樣地得到的環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nle)；RT=25.3；FAB-MS(M+H):589；
環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Ahds)；RT=35.1；FAB-MS(M+H):730；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Ahds)；RT=35.4；FAB-MS(M+H):730；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAhds)；RT=35.7；FAB-MS(M+H):730；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Aos)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DAos)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAos)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nhdg)；RT=36.7；FAB-MS(M+H):758；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Nhdg)；RT=36.5；FAB-MS(M+H):758；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DNhdg)；FAB-MS(M+H):758；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNhdg)；FAB-MS(M+H):758；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhg-Nhdg)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phg-Nhdg)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhg-DNhdg)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phg-DNhdg)；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Acha)；RT=25.2；FAB-MS(M+H):601；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Acha)；FAB-MS(M+H):601；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DAcha)；FAB-MS(M+H):601；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAcha)；FAB-MS(M+H):601；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Aib)；FAB-MS(M+H):575；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Aib)；RT=36.5；FAB-MS(M+H):575；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DAib)；FAB-MS(M+H):575；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAib)；FAB-MS(M+H):575；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Acpa)；RT=17.1；FAB-MS(M+H):587；
環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Acpa)；FAB-MS(M+H):587；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DAcpa)；FAB-MS(M+H):587；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAcpa)；FAB-MS(M+H):587；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Tle)；RT=19.1；FAB-MS(M+H):589；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Tle)；FAB-MS(M+H):589；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DTle)；FAB-MS(M+H):589；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DTle)；FAB-MS(M+H):589；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Dphe(4-C1)-Tle)；RT=23.2；FAB-MS(M+H):623；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe(4-C1)-Tle)；FAB-MS(M+H):623；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-C1)-DTle)；FAB-MS(M+H):623；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe(4-C1)-DTle)；FAB-MS(M+H):623；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Dphe(4-F)-Tle)；RT=20.2；FAB-MS(M+H):607；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe(4-F)-Tle)；FAB-MS(M+H):607；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-F)-DTle)；FAB-MS(M+H):607；環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe(4-F)-DTle)；FAB-MS(M+H):607。
實(shí)施例2將0.28g環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-DPhe-DhPro)[根據(jù)例1經(jīng)環(huán)化而獲得]的8.4mlTFA,1.7ml二氯甲烷及0.9ml苯硫酚溶液在室溫下放置4小時(shí)，然后濃縮，并用水稀釋殘余物，然后冷凍-干燥。SephadexG10上的凝膠過濾(醋酸/水1∶1)及隨后在所指明的條件下通過制備型HPLC純化，給出環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-DhPro)；FAB-MS(M+H):587。
相似地獲得下列物質(zhì)從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-DhPro)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DhPro)；FAB-MS(M+H):587；
從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhg-Tle)獲得環(huán)-(D-Arg-NMeGly-Asp-DPhg-Tle)；從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp(OEt)-DPhg-hPro)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhg-hPro);
從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-Phg-DAhds)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phg-DAhds)；從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-DPhg-Acpa)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhg-Acpa)；從環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-DPhg-Aos)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhg-Aos)。
實(shí)施例3將80mg環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-hPro)[根據(jù)例1獲得的]溶解在0.01mlHCl五至六次，并且在每次溶解操作后進(jìn)行冷凍-干燥。爾后用HPLC純化，給出環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-hPro)×HCl。
同樣地獲得以下物質(zhì)從環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nle)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nle):xHCl；從環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Ahds)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Ahds)xHCl；從環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Ahds)獲得環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Ahds)xHCl。
實(shí)施例4為了制備親和相，將0.9gN-順丁烯二酰亞胺基-(CH2)5-CO-NH-(CH2)3聚合物[通過N-順丁烯二酰亞胺基-(CH2)5-COOH與H2N-(CH2)3聚合物縮合而獲得的]懸浮在10ml 0.1M磷酸鈉緩沖液(pH為7)中，并且在4℃加入一當(dāng)量的環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-N-CO(CH2)2SH)-hPro)[通過環(huán)化H-DPhe(4-NH-BOC)-hPro-Arg(Mtr)-Gly-Asp-OH，并除去保護(hù)基及用，例如，Cl-CO(CH2)2SH?；@得的]。將反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)，同時(shí)溫?zé)嶂潦覝?，并過濾固體殘?jiān)看斡?0ml緩沖液(pH為7)洗滌兩次，接著分別用10ml水洗滌三次。這樣獲得了環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-N-CO(CH2)2S-3-(N-順丁烯二酰亞胺基-(CH2)5-CONH-(CH2)3聚合物)-hPro))。
實(shí)施例5與實(shí)施例4類似，聚合物-O-(CH2)3NH2(可購買到)和環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-N-CO(CH2)4-COOH)=hPro)[在實(shí)施例4的條件下，縮合己二酸與環(huán)-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-DPhe(4-NH-BOC)-hPro)而獲得)的縮合反應(yīng)給出下列聚合相環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-N-CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-O-聚合物-hPro。
以下實(shí)施例涉及藥物制劑。
實(shí)施例A注射藥瓶用2N的鹽酸，將100g式Ⅰ的環(huán)肽和5g磷酸氫二鈉在31雙蒸水中的溶液調(diào)整pH至6.5，并且無菌過濾，在無菌條件下分裝到注射藥瓶中并凍干，并且以無菌方式密封藥瓶。每一注射小瓶含有5mg有效成分。
實(shí)施例B栓劑熔化20g式Ⅰ的有效成分與100g大豆卵磷脂和1400g可可油的混合物，并將混合物注入模具，使其冷卻。每一栓劑含有20mg有效成分。
實(shí)施例C溶液在940ml雙蒸水中，用1g式Ⅰ的有效成分，9.38gNaH2PO4×2H2O,28.48g Na2HPO4×12H2O，以及0.1g苯扎氯銨制備溶液。調(diào)整pH為6.8，溶液量為1L，并照射殺菌。該溶液可以滴眼劑形式使用。
實(shí)施例D軟膏在無菌條件下，將500mg式Ⅰ的有效成分與99.5g礦脂混合。
實(shí)施例E片劑用通常的方法，將100g式Ⅰ的環(huán)肽，1kg乳糖，600g微晶纖維素，600g玉米淀粉，100g聚乙烯吡咯烷酮，80g滑石和10g硬脂酸鎂的混合物壓成片劑，這樣每一片劑含有10g[sic]有效成分。
實(shí)施例F包衣片劑如實(shí)施例E所說明的壓成片劑，然后以通常的方法，用蔗糖，玉米淀粉，滑石，黃蓍膠和著色劑包衣。
實(shí)施例G膠囊以通常的方法，將式Ⅰ的有效成分裝進(jìn)硬明膠膠囊中，這樣每一膠囊含有5mg有效成分。
實(shí)施例H吸入噴霧劑用10l等滲NaCl溶液溶解14g式Ⅰ的有效成分，并將溶液裝入市售的具泵裝置的噴霧容器?？蓪⑷芤簢婌F至口或鼻中。一次噴射(約0.1ml)相當(dāng)于大約0.14mg的劑量。
權(quán)利要求
1．式Ⅰ的環(huán)肽環(huán)-(Arg-Gly-Asp-X-Y)Ⅰ，其中X是Cha,Nal,Phe,2-R1-Phe,3-R1-Phe,4-R1-Phe,高-Phe,Phg,Thi,Trp,Tyr或者Tyr的衍生物，OH基可能被1-18個(gè)碳原子的烷基醚化，同樣所論及的氨基酸殘基可能被額外衍生化，R1是NH2,NO2,I,Br,Cl,F，具有1-18個(gè)碳原子的烷基，Ar,Ar-O或者3H，Y是Gly,αN原子可能被R2取代和/或αC原子可能被R3和/或R4取代，其條件是Gly以指明的方式至少取代一次，Ar是苯基，其可以也可以不被NH2,NO2,I,Br,Cl,F,具有1-6個(gè)碳原子的烷基或者3H取代一次或者兩次，R2,R3或R4各自分別是具有1-18個(gè)碳原子的烷基，或者在每種情況下，R2和R3或R3和R4一起是支鏈或者無支鏈的具有3-18個(gè)碳原子的亞烷基鏈，以便αN原子和αC原子與亞烷基鏈一起，或αC原子單獨(dú)與亞烷基鏈一起形成環(huán)，這里當(dāng)涉及旋光性氨基酸和氨基酸衍生物的殘基時(shí)，包括D和L構(gòu)型兩者，以及衍生物，尤其是天冬氨酸β-酯或精氨酸的N-胍-酰基衍生物，或前藥及它們生理上可接受的鹽。
2．按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物的對(duì)映體或者非對(duì)映體。
3．按照權(quán)利要求1的(a)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Nle)；(b)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-hPro)；(c)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Tle)；(d)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-DAhds)；(e)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Phe-Nhdg)；(f)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Acha)；(g)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Dphe(4-Cl)-Tle)；(h)環(huán)-(Arg-Gly-Asp-Dphe(4-F)-Tle)；和它們的生理上可接受的鹽。
4．制備按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物或者其鹽之一的方法，其特征在于通過用溶劑解或氫解劑處理從它的功能衍生物之一中釋放出所述的化合物，或者其特征在于用環(huán)化劑處理式Ⅱ肽H-Z-OHⅡ，其中Z是-Arg-Gly-Asp-X-Y--Gly-Asp-X-Y-Arg--Asp-X-Y-Arg-Gly--X-Y-Arg-Gly-Asp-或-Y-Arg-Gly-Asp-X-，或這種肽的反應(yīng)性衍生物，或者其特征在于通過烷基化，酰化或者酯化衍生化一種環(huán)肽，該環(huán)肽本身符合式Ⅰ，但具有一個(gè)或多個(gè)游離氨基，酸基和/或活化的α碳原子，和/或其特征在于通過用酸或堿處理將式Ⅰ的堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化成其鹽之一。
5．生產(chǎn)藥物制劑的方法，其特征在于將按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物和/或其生理上可接受的鹽之一與至少一種固體，液體或半液性的賦形劑或助劑一起配成適當(dāng)?shù)膭┝啃问健?br> 6．藥物制劑，其特征在于其含有至少一種按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物和/或其生理上可接受的鹽之一。
7．按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物或者它們的生理上可接受的鹽在生產(chǎn)控制疾病的藥物上的用途。
8．按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物或者它們的生理上可接受的鹽在控制疾病上的用途。
9．按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物在制備用于親和性柱色譜的固定化配體上的用途。
10．按照權(quán)利要求1的式Ⅰ的化合物在通過親合色譜法純化整聯(lián)蛋白上的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(Ⅰ)的環(huán)肽:環(huán)－(Arg－Gly－Asp－X－Y),其中X是Cha,Nal,Phe,2－R
文檔編號(hào)C07K1/00GK1218478SQ97194526
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月6日
發(fā)明者A·莊采克, S·古德曼, B·迪芬巴赫, H·凱斯勒, M·考比茨 申請(qǐng)人:默克專利股份有限公司