專利名稱：來普亭(鄂畢肽)片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新化合物，具體地說，本發(fā)明涉及新肽，含所述化合物的組合物以及所述化合物在藥物中的用途。
有關(guān)身體-食物攝入對能量輸出的能量平衡的生理調(diào)節(jié)機制-是多年來討論的對象。在最近的《自然》雜志中，Y.Zhang等人提出(自然，372,425-431,1994)在能量平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的一種分子是ob(鄂畢)蛋白質(zhì)。Zhang等人還報道克隆并定序了小鼠和人ob基因蛋白質(zhì)或leptin。
在英國專利申請GB2292382(公開號)中公開了人leptin(來普亭)或(人ob蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)以及其在調(diào)節(jié)動物體重方面的用途。該申請還公開了認為能夠調(diào)節(jié)體重的特定leptin片段。
Collins等(自然，380卷，677頁，1996)認為leptin減輕體重的特性是通過增加能量的利用，同時減少食物攝入達到的。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了leptin的某些新片段，所述片段令人驚奇地基本上通過提高能量消耗可調(diào)節(jié)體重。因此，認為這些片段在治療營養(yǎng)性和代謝性疾病，特別是肥胖和糖尿病中是特別有用的。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來調(diào)節(jié)體重的肽或其功能衍生物、類似物或變體。
優(yōu)選地，體重的調(diào)節(jié)是體重的減輕。
優(yōu)選地，能量消耗的調(diào)節(jié)是經(jīng)提高能量消耗來實現(xiàn)的。
優(yōu)選地，所述肽是ob蛋白質(zhì)，主要是人ob蛋白質(zhì)，的片段，或其功能衍生物、類似物或變體。
下文，根據(jù)人ob蛋白質(zhì)的氨基酸序列，用下列類似物縮寫，來命名蛋白質(zhì)片段(或肽)將“由氨基酸殘基1-6組成的蛋白質(zhì)片段”縮寫為“ob1-6”。
具體的肽包括ob21-26(MVPIQK),ob27-32(VQDDTK),ob33-36(TLIK),ob(37-41(TIVTR),ob42-54(INDISHTQSVSSK),ob55-56(QK),ob57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK),ob93-105(NVIQISNDLENLR),ob106-115(DLLHVLAFSK),ob116-149(SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSR)和ob150-167(LQGSLQDMLWQLDLSPGC)，特別是ob57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK)。
適宜地，本發(fā)明還包括從前述任何一種或多種具體肽形成的肽。
有利的是，本發(fā)明包括從任意兩個連續(xù)的前述具體肽形成的肽。
如所說明的，本發(fā)明還包括本文所述肽的功能衍生物、類似物和變體。
功能衍生物包括本文所述肽的鹽和溶劑化合物以及通過連接基團或部分而化學修飾的本發(fā)明的肽，所述修飾是為了提高所述蛋白質(zhì)的物理特性如穩(wěn)定性或治療特性如藥物動力學特性。
功能類似物包括功能類似物，其中本文所述肽的一個或多個氨基酸被其他氨基酸取代。
其他氨基酸包括與ob蛋白質(zhì)中的氨基酸的立體化學不同的氨基酸。
功能類似物還包括本文所述肽的小分子激動劑或拮抗劑。用已知方法，如GB2292382中公開的那些方法可以制備并測試所述化合物。
鹽包括可藥用的鹽，特別是可藥用的酸加成鹽。
在適宜溶劑中，從母體化合物和過量的酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸，用標準方法制備所述肽的酸加成鹽。乙酸鹽形式是特別有用的。一些化合物形成可接受的內(nèi)鹽或兩性鹽。通過用過量堿試劑如含適宜陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或醇鹽處理母體化合物來制備陽離子鹽。陽離子如Na2+,K+,Ca2+和NH42+是在可藥用鹽中存在的陽離子的實例。
溶劑化物包括可藥用溶劑化物，如水合物。
應(yīng)理解本發(fā)明包括肽和非肽化合物。
另外，本發(fā)明還包括具體肽ob21-26、ob27-32、Ob33-36、ob37-41、ob42-54、ob55-56、ob57-74、ob93-105、ob106-115、ob116-149和ob150-167、尤其ob57-74的亞片段；或從所述具體肽的任何一個或多個、優(yōu)選任何兩個連續(xù)成員形成的肽；或其功能衍生物、類似物或變體。
適宜的肽或亞片段含有至少4個氨基酸。
通過常規(guī)的消化方法、合成技術(shù)或利用標準表達方法，可以制備本發(fā)明的肽。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供了制備肽或其功能衍生物的方法，所述方法包括下列步驟將肽，尤其是ob蛋白質(zhì)，特別是人ob蛋白質(zhì)水解成至少兩個肽片段；分離所述肽片段；此后，任選地制備其功能衍生物。
通過酶消化如利用胰蛋白酶適當?shù)赝瓿伤龅鞍踪|(zhì)的水解。
通過適宜的色譜法如柱色譜很容易分離所需的肽。
根據(jù)所用具體試劑的性質(zhì)來確定處理ob蛋白質(zhì)所需的具體反應(yīng)條件，只要它們與所需產(chǎn)物的穩(wěn)定性相稱，例如，試劑為胰蛋白酶時，通常在25-40℃pH7-9，優(yōu)選37℃pH7.4下完成反應(yīng)。
如所說明的，通過常規(guī)合成法，如利用液相或固相肽合成法，也可制備本發(fā)明的肽。
因此，本發(fā)明提供了合成肽或其功能衍生物、類似物或變體，它們主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來調(diào)節(jié)體重。
本文所述的任何肽作為合成肽構(gòu)成本發(fā)明的部分。
與本發(fā)明有關(guān)的蛋白質(zhì)的肽結(jié)合單元可利用肽合成儀(Atherton,E.and Sheppard,R.C.(編)(1989)固相肽合成法實踐方法，LRL出版社，牛津)，通過標準肽合成技術(shù)，然后用適宜于直接的二硫鍵或酰胺鍵形成方法來合成。
Ali等藥物化學雜志(J.Med.Chem.),29:984(1986)和藥物化學雜志(J.Med.Chem.),30:2291(1987)描述了熟知的肽合成法，所述文獻引入本文作為參考。優(yōu)選通過Merrifield的固相技術(shù)(美國化學會志(J.Am.Chem.Soc).85:2149(1964)制備所述肽。但是，可將固相和溶液合成法聯(lián)用，作為一種集中的合成法，其中用固相合成可制備三，四或五肽片段，然后用溶液合成法偶聯(lián)或進一步修飾。
在合成過程中，在偶聯(lián)反應(yīng)中，保護側(cè)鏈功能基團(如-NH2,-COOH,-OH,-SH)。通常將α-氨基暫時保護為芴基甲氧基羰基(Fmoc)，但也可使用其他酸-或堿活潑的保護基，如叔丁氧基羰基(Boc)。將賴氨酸的氨基側(cè)鏈保護為叔丁氧基羰基，芐氧基羰基或?qū)β绕S氧基羰基(Z或Cl-Z)。將乙酰氨基甲基、三苯甲游基、叔丁基、S-叔丁基或?qū)谆S基(p-MBz)保護用于半胱氨酸。將羥基保護為丁基或芐基醚，將羧基保護為丁基、芐基(Bz)或環(huán)己基酯。
從C末端或N-末端，優(yōu)選從前者合成肽。在偶聯(lián)前，將(α-羧基(適宜保護的氨基酸的)激活。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用許多方法激活被保護的基團。例如，一種方法可以使用N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC),2(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(uronium)(HBTU)六氟磷酸鹽，對硝基苯基酯(pNp)，羥基苯并三唑酯(HOBt)，N-羥基琥珀酰亞胺酯(OSu)混合的酐或?qū)ΨQ的酐。
用常規(guī)方法完成肽的溶液合成以形成酰胺鍵。通常任選地在存在1-羥基苯并三唑(HOBT)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的條件下，用適宜的碳化二亞胺偶聯(lián)劑，如N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，將帶有游離羧基的被保護的Boc-氨基酸與帶有游離氨基的被保護氨基酸偶聯(lián)。
在液相合成中，優(yōu)選在如二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，四氫呋喃(THF)，乙腈(ACN)或二噁烷之類的溶劑中，在較低的溫度(如-20℃)完成偶聯(lián)反應(yīng)。
如果使用固相法，從羧基末端開始合成肽，向所述肽的氨基末端反應(yīng)。固相合成是從將被保護氨基酸的C末端與適宜的樹脂如4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基樹脂(Rink酰胺樹脂，H.Rink，四面體通訊28,3787(1987)),4-芐氧基芐基醇樹脂(Wang樹脂，S.S.Wang,JACS,95,1328(1973))或4-羥基甲基苯氧基乙酸樹脂共價偶聯(lián)開始。
在固相合成中，通常將第一個氨基酸殘基與不溶性聚合物相連。例如兩種常用的聚合物是聚苯乙烯(與二乙烯基苯以1％交聯(lián)的)和1％交聯(lián)的聚丙烯酰胺。將這些聚合物功能化，使其含有活潑基團如-OH、-NH2和-CH2Cl以便連接靶肽的第一個氨基酸(即羧基末端)。第一個氨基酸與聚合物之間的鍵的選擇由所述肽的羧基末端來決定。例如將在C末端帶有羧基的肽通過酯鍵相連，對于帶有甲酰胺末端的肽應(yīng)使用酰胺鍵。
將第一個被保護的氨基酸與所需樹脂偶聯(lián)后，通過用仲胺如哌啶處理來去除氨基保護基，然后將第二個(被保護的)氨基酸的游離羧基與所述氨基偶聯(lián)。該過程可連續(xù)進行，不需分離中間產(chǎn)物，直到形成所想要的肽。然后，以任意順序?qū)⒑铣傻碾拿摫Ｗo和/或從樹脂上裂解。
用于偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)選溶劑包括，但不限于，二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。當所需的序列合成后，用三氟乙酸或三氟甲磺酸將肽脫保護并從樹脂上裂解下來。
從載體樹脂上裂解肽的優(yōu)選方法是，將載有肽的樹脂用三氟乙酸在存在適宜陽離子和碳陽離子清除劑如苯酚、茴香醚、硫代茴香醚、乙二硫醇、水或乙基甲基硫醚的條件下進行處理。
為了得到本發(fā)明的化合物，可將合成的肽用本領(lǐng)域公知的方法環(huán)化/偶聯(lián)。
例如，通過將一條鏈上的游離硫醇與另一條鏈上適當活化了的半胱氨酸衍生物反應(yīng)，可以以選擇性的方式將均含有半胱氨酸殘基的兩條直鏈肽通過二硫鍵偶聯(lián)。特別適于作為可被替代的保護基的基團是，S-(甲酯基-烴硫基(sulphenyl))衍生物。該方法的例子是，將兩條直鏈肽的半胱氨酸殘基均用乙酰氨基甲基(Acm)保護。將一條鏈依次用乙酸汞(Ⅱ)和β-巰基乙醇處理除去乙酰氨基甲基保護基。將第二條鏈用甲酯基烴硫基氯化物處理進行活化。將兩種肽在pH值約7-8的稀水溶液中攪拌，從而脫除甲酯基烴硫基并形成鏈間的二硫化物。
如果要形成分子內(nèi)二硫化物，則可將相應(yīng)的直鏈肽完全脫保護形成二硫醇。本領(lǐng)域已知的可將二硫醇轉(zhuǎn)變?yōu)槎蚧锏娜魏窝趸瘎┚墒褂?。所述氧化劑的例子是，堿金屬鐵氰化物(鐵氰化鉀或鐵氰化鈉)、氧氣、二碘甲烷或碘。反應(yīng)在適宜的惰性溶劑如甲醇水溶液或水中、在0至約40℃的溫度下、在高度稀釋的條件下進行。pH值通常保持在約7-8。環(huán)化反應(yīng)可以在仍連接在載體樹脂上或其它功能基仍被保護的肽上進行，但優(yōu)選在脫保護后的游離肽上進行。
當要在兩條直鏈肽之間形成二硫化物時，可使用兩種類型的半胱氨酸保護基，例如Acm和三苯甲基。每一種肽含有其中一種類型的保護基，從而要偶聯(lián)的一對半胱氨酸用三苯甲基保護，另一對用Acm保護。從各肽上單獨脫除三苯甲基可生成兩種單硫醇衍生物，將一種肽上的硫醇用2,2’-二吡啶基二硫化物活化然后加入另一種單硫醇肽將上述兩種單硫醇衍生物偶聯(lián)，生成二(S-乙酰氨基-甲基)二硫鍵連接的肽。將該產(chǎn)物按照Kamber(B.Kamber，瑞士化學學報(Helv.Chim.Acta),54,927,(1971))和Kamber等(B.Kamber等，瑞士化學學報，63,899,(1980))的描述，直接用碘氧化可以得到第二二硫化物。
還可以用連接基如-NH(CH2)nCO-將肽鏈偶聯(lián)。這很容易通過將相應(yīng)氨基酸(NH2(CH2)nCOOH)的Na-Fmoc衍生物在常規(guī)固相合成過程中摻入到增長的肽鏈中來完成?？梢岳妙愃频姆桨赣盟嵝园被崛绻劝彼岬膫?cè)鏈羧基和堿性氨基酸如賴氨酸的側(cè)鏈氨基來偶聯(lián)肽鏈。在該情況下，可將化合物例如如下的N6-g谷氨?；嚢彼嵫苌镌诔Ｒ?guī)固相合成過程中摻入到增長的肽鏈中。
將其通過谷氨酸殘基上的羧基偶聯(lián)到增長的肽鏈上，脫除賴氨酸上的Fmoc基團后，氨基提供了供其它氨基酸加成的起點。
或者，可將Na-三苯甲基保護基用于谷氨酸殘基，偶聯(lián)后，可用80％乙酸來脫除該保護基并用乙酸酐進行N-乙?；?。進一步偶聯(lián)可按照以上的描述進行。
通過將脫除氨基保護基后蛋白質(zhì)化的游離氨基用乙酸酐乙?；?，可引入N-末端N-乙酰基。通過使用適宜的固相合成樹脂如Rink酰胺樹脂可以得到C-末端甲酰胺基團。
如上所述，本發(fā)明的肽還可以用重組DNA技術(shù)，通過表達編碼多肽序列的DNA進行制備。
因此，本發(fā)明還涉及主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來調(diào)節(jié)體重的重組肽或其功能衍生物、類似物或變體。
本文所述的所有的肽作為重組肽構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明化合物的方法，該方法包括將編碼所述化合物的DNA在重組宿主細胞中表達并回收產(chǎn)物。
含有編碼化合物的核苷酸序列的DNA聚合物也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
可通過常規(guī)的重組技術(shù)如Maniatis等，分子克隆-實驗室手冊；冷泉港，1982和DNA克隆，第Ⅱ、Ⅱ和Ⅲ卷(D.M.Glover編，IRLPress Ltd)完成本發(fā)明的方法。
具體地說，該方法包括下列步驟ⅰ)制備能夠在宿主細胞中表達DNA聚合物的復制型表達載體，所述DNA聚合物含有編碼所述化合物的核苷酸序列；ⅱ)用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；ⅲ)在可以表達所述DNA聚合物以產(chǎn)生所述化合物的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化宿主細胞；和ⅳ)回收所述化合物。
本發(fā)明還提供了通過縮合適宜的單-、二-或寡核苷酸單元來制備DNA聚合物的方法。
本發(fā)明通過化學法、酶促法或兩種方法聯(lián)用，適當?shù)脑?，在體外或體內(nèi)完成制備。因此，通過常規(guī)方法，如D.M.Roberts等在生物化學(Biochemistry)1985,24,5090-5098中描述的方法，用酶處理適宜的DNA片段可制備DNA聚合物。
通過用適宜限制酶消耗含所需核苷酸序列的DNA，通過化學合成，通過在DNA或RNA模板上進行酶促聚合，或通過這些方法的組合，可得到DNA片段。優(yōu)選使用DNA片段的全合成。
在20-70℃，在適宜緩沖液中，優(yōu)選在含0.1-10mg DNA的50毫升或小于50毫升體積中用限制酶進行消化。
按照需要，在10-37℃，在含核苷三磷酸dATP,dCTP,dGTP和dTTP的適宜緩沖液中，優(yōu)選以50毫升或小于50毫升的體積，用DNA聚合酶如DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)體外完成DNA的酶促聚合。
在4℃至室溫，于適宜緩沖液中，以50毫升或小于50毫升的體積，用DNA連接酶如T4 DNA連接酶完成DNA片段的酶促連接。
通過常規(guī)磷酸三酯、亞磷酸酯或氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)化學法，用例如下列固相技術(shù)完成DNA聚合物或片段的化學合成，所述固相技術(shù)見于“蛋白質(zhì)片段的化學和酶促合成-實驗室手冊(Chemical and Enzymatic Synthesis of ProteinFragments-A Laboratory Manual)”(H.G.Gassen and A.Lang編)，Verlag Chemie,Weinheim(1982)，或其他科學文獻，例如M.J.Gait,H.W.D.Matthes,M.Singh,B.S.Sproat,and R.C.Titmas，核酸研究(Nucleic Acids Research)1982,10,6243；B.S.Sproat andW.Bannwarth，四面體通訊(Tetrahedron Letters)1983,24,5771；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，四面體通訊(TetrahedronLetters)1980,21,719；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，美國化學會志(Journal of the American ChemicalSociety)1981,103,3185；S.P.Adams等，美國化學會志1983,105,661；N.D.Sinha,J.Biernat,J.McMannus和H.Koester，核酸研究，1984,12,4539；以及H.W.D.Matthes等，EMBO雜志，1984,3,801。優(yōu)選使用自動DNA合成儀。
優(yōu)選通過連接兩個或多個DNA分子來制備DNA聚合物，所述DNA分子都含有編碼所述化合物的DNA序列。
用適宜的限制酶消化攜帶所需編碼序列的載體可以達到DNA分子。
DNA分子的精確結(jié)構(gòu)和得到所述DNA分子的方法取決于所需產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。構(gòu)建編碼所述化合物的DNA分子之適宜策略的設(shè)計對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)的。
在重組宿主細胞中表達編碼所述化合物的DNA聚合物可通過在宿主細胞中能夠表達所述DNA聚合物的復制型表達載體來完成。所述表達載體是新的并構(gòu)成本發(fā)明的部分。
根據(jù)本發(fā)明，通過裂解與宿主細胞相容的載體以提供含有完整復制子的線性DNA，在連接條件下，將所述線性片段與一個或多個DNA分子相連，使所述DNA分子與所述線性片段一起編碼所述化合物，從而制備復制型表達載體。
根據(jù)需要，可同時或連續(xù)完成線性片段和一個以上DNA分子的連接。
因此，根據(jù)需要，DNA聚合物可在載體構(gòu)建的過程中預先形成或形成。
載體的選擇部分取決于宿主細胞，所述宿主細胞可以是原核的，如大腸桿菌，或真核的，如小鼠C127，小鼠骨髓瘤，中國倉鼠卵巢，真菌如絲狀真菌或單細胞酵母或昆蟲細胞如果蠅。宿主細胞還可以是轉(zhuǎn)基因動物。適宜的載體包括質(zhì)粒，嗜菌體，粘粒和衍生于如桿狀病毒或牛痘的重組病毒。
用用于DNA限制、聚合和連接的適宜酶，通過例如上述Maniatis等描述的方法，方便地完成復制型表達載體的制備。按上述有關(guān)DNA聚合物制備所述的方法完成聚合和連接。在20-70℃，優(yōu)選(proteinrally)在50ml或少于50ml含0.1-10mg DNA的適宜緩沖液中，完成用限制酶的消化。
在轉(zhuǎn)化條件下，用本發(fā)明的復制型表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞來制備本發(fā)明的重組宿主細胞。適宜的轉(zhuǎn)化條件是本領(lǐng)域熟知的并描述于例如上述Maniatis等的文獻中，或“DNA克隆(DNA Cloning)”Ⅱ卷，D.M.Glover編，IRL出版社，1985。
轉(zhuǎn)化條件的選擇由宿主細胞決定。因此，可將細菌宿主如大腸桿菌用CaCl2溶液(Cohen等，國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci)，1973,69,2110)或用含RbCl,MnCl2乙酸鉀和甘油的混合物組成的溶液，然后用3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸，RbCl和甘油處理。通過將載體DNA鈣共沉淀到細胞上來轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的哺乳動物細胞。
本發(fā)明還涉及含本發(fā)明化合物的載體。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明復制型表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
通常按照例如上述Maniatis等方法和“DNA克隆”所述，在可表達DNA聚合物的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞。因此，優(yōu)選給細胞提供營養(yǎng)并在低于45℃培養(yǎng)。
根據(jù)宿主細胞，用常規(guī)方法回收表達產(chǎn)物。因此，若宿主細胞是細菌如大腸桿菌，可將其經(jīng)物理、化學或酶促溶解，然后從所得的溶解產(chǎn)物中分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果產(chǎn)物是從細菌細胞中分泌的，可以從壁膜間隙或營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收。若宿主細胞是哺乳動物，可優(yōu)選(proteinrally)從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離產(chǎn)物。
可將DNA聚合物組裝到載體中，所述載體用于分離表達產(chǎn)物的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞系；如牛乳頭瘤病毒載體或在中國倉鼠卵巢細胞中擴增的載體(DNA克隆，Ⅱ卷，D.M.Glover編，IRL出版社1985；Kaufman,R.J.等，分子和細胞生物學(Molecular and CellularBiology)5,1750-1759,1985；Pavlakis G.N.and Hamer,D.H.,國家科學院院報(Proceedings of the National Academy ofSciences)美國80,397-401,1983；Goeddel,D.V.等，歐洲專利申請0093619,1983)。
如果需要，可用許多技術(shù)純化由上述方法制備的肽。優(yōu)選的實施方案包括凝膠過濾、色譜法、反相HPLC和結(jié)晶法，優(yōu)選使用色譜法。然后用HPLC，氨基酸分析，氨基酸定序和快原子轟擊和/或電噴射質(zhì)譜分析純化產(chǎn)物的純度。
通過與本文所述類似的常規(guī)方法可制備本文所述蛋白質(zhì)的功能衍生物、類似物和變體。
如所說明的，本發(fā)明化合物具有有用的藥物學特性。因此，還提供了作為活性治療物質(zhì)的本發(fā)明化合物。
具體地說，認為本發(fā)明化合物主要通過提高能量消耗來調(diào)節(jié)體重，因此，其在營養(yǎng)性和代謝性疾病、具體地說是肥胖癥和糖尿病的治療中有潛在的用途。
本發(fā)明還提供了治療營養(yǎng)性和代謝性疾病的方法，所述方法包括施用有效的、藥物可接受的且非毒性量的本發(fā)明化合物。
因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明化合物和可藥用載體的藥物組合物。
在使用中，盡管組合物的確切形式取決于給藥方式，但通常將活性化合物與人或獸的藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑一起以藥物組合物的形式使用。例如可將活性化合物以片劑、膠囊、糖錠或糖漿劑的形式用于口服給藥；以嗅劑、氣霧劑或可噴霧溶液的形式用于吸入；以無菌溶液的形式用于胃腸外給藥，或以乳膏、洗劑、搽劑、凝膠或噴霧劑的形式用于局部給藥。胃腸外給藥途徑包括靜脈、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮和腹膜內(nèi)給藥。
還包括適用于皮下植入泵或緩釋裝置，經(jīng)皮貼劑的上述衍生物的制劑和適用于鼻內(nèi)給藥的微細的粉末。
本發(fā)明化合物的給藥劑量范圍是對待治療疾病產(chǎn)生理想效果的范圍，劑量優(yōu)選(proteinrally)隨年齡、疾病的程度和嚴重性以及禁忌證(如果有的話)的不同而改變。劑量可以為0.001mg/kg/天-50mg/kg/天，但優(yōu)選0.01-1.0mg/kg/天。
固體口服劑量形式可含有常規(guī)賦形劑如稀釋劑例如乳糖、微晶纖維素、磷酸二鈣、甘露糖醇、碳酸鎂、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇和碳酸鈣；粘合劑如液體葡萄糖，糖漿，阿拉伯膠，明膠，淀粉膠漿，甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸鹽和預明膠化淀粉；崩解劑如淀粉，藻酸，微晶纖維素，果膠，交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮，淀粉羥乙酸鈉和羧甲基纖維素鈉；助流劑如滑石和二氧化硅；潤滑劑如硬脂酸和硬脂酸鎂；防腐劑如抗壞血酸和對羥苯甲酸甲酯或丙酯，或可藥用濕潤劑如十二烷基硫酸鈉。
膠囊由通常是明膠的殼與其他組分如甘油，山梨糖醇，表面活性劑，不透明填料，防腐劑，甜味劑，矯味劑和著色劑組成。膠囊的內(nèi)含物可包括稀釋劑，潤滑劑和崩解劑。片劑由壓制的粉末或顆粒組成，可以是包衣或未包衣的，并且可以設(shè)計成可以使該片劑在向患者給藥前溶解、分散或泡騰，或在吞咽后立即在胃腸道內(nèi)溶劑或分散，或者對于包有酸不溶包衣的片劑，在經(jīng)過一段時間后在胃腸道內(nèi)溶劑或分散。片劑通常含有賦形劑如稀釋劑、粘合劑、崩解劑、助流劑、潤滑劑，并可含有著色劑和矯味劑。泡騰片優(yōu)選(proteinrally)含有酸和碳酸鹽或碳酸氫鹽。片劑的包衣可由天然或合成樹脂，膠，不溶性填充劑，糖，增塑劑，多元醇和蠟組成，并可含有著色劑和矯味劑。糖錠和錠劑用于在口腔中溶解。糖錠可以是模制或壓制的，通常含有矯味基質(zhì)。錠劑從明膠和甘油或阿拉伯膠和蔗糖基質(zhì)中模制得到。其中可以含有防腐劑以及著色劑和矯味劑。
膜包衣樹脂包括纖維素衍生物、玉米醇溶蛋白、乙烯基聚合物和丙烯酸樹脂，包衣組合物通常包括增塑劑如蓖麻油或甘油三乙酸酯。腸溶包衣樹脂包括纖維素乙酸酯鄰苯二甲酸酯以及甲基丙烯酸的共聚物。
適于口服給藥的固體組合物可以通過混合、填充、造粒、壓片等常規(guī)方法制得。對于使用大量填充劑的組合物，可反復進行混合操作，以使活性成分分布在整個組合物中。
適于口服給藥的液體組合物可以是例如酏劑、混合物、濃縮溶液、混懸液、乳液或咳嗽藥水的形式。它們可以是用于在臨用前用水或其它適宜載體重新配制的干燥產(chǎn)物的形式。這樣的液體組合物可以含有常規(guī)賦形劑如懸浮劑，例如蔗糖、山梨糖醇、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、藻酸鈉、黃原膠、阿拉伯膠、角叉菜膠、硬脂酸鋁凝膠；乳化劑，例如卵磷脂、阿拉伯膠、脫水山梨醇單油酸酯；水性或非水性載體，包括食用油、油狀的酯例如甘油的酯、乙醇、甘油；緩沖劑，例如堿金屬的檸檬酸鹽或磷酸鹽；防腐劑，例如苯甲酸鈉、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；如需要，還可含有常規(guī)的矯味劑和著色劑。
該組合物還可皮下植入，例如，以壓制片劑或緩釋膠囊的形式皮下植入。
或者，適于注射的組合物可以是溶液、混懸液或乳液的形式，或用于在臨用前溶解或懸浮在適宜載體中的干燥粉末。
液體單位劑型用化合物和無熱原的無菌載體制得。根據(jù)所用的載體和濃度，化合物可以溶解或懸浮在載體中。溶液劑可用于所有的胃腸外給藥形式，特別是用于靜脈內(nèi)注射。在制備溶液時，可將化合物溶于載體中，如需要，通過加入氯化鈉將溶液調(diào)至等滲，用無菌技術(shù)通過用無菌濾器過濾進行滅菌后將其填充到適宜的無菌小瓶或安瓿中并密封。或者，如果溶液具有足夠的穩(wěn)定性，可將溶液在密封其的容器中通過高壓釜滅菌。還可以在載體中溶解添加劑，例如緩沖劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、懸浮劑或乳化劑和/或局部麻醉劑。
用于在臨用前溶解或懸浮在適宜載體中的干燥粉末可以通過將預先滅菌的藥物和其它成分通過無菌技術(shù)在無菌區(qū)內(nèi)填充到無菌容器中進行制備。或者，可將藥物和其它成分溶解在含水載體中，將溶液通過過濾滅菌并用無菌技術(shù)在無菌區(qū)內(nèi)分到適宜的容器中。然后將產(chǎn)物冷凍干燥并將容器無菌密封。
適于肌肉內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)注射的胃腸外給藥的混懸液以基本相同的方式制備，所不同的是將無菌化合物懸浮而不是溶解在無菌載體中，并且不能通過過濾進行滅菌?？蓪⒒衔镆詿o菌狀態(tài)進行分離，或可以在分離后進行滅菌，例如通過γ輻射進行滅菌。有利的是，可在組合物中加入懸浮劑如聚乙烯吡咯烷酮以促進化合物的均勻分布。
另一方面，本發(fā)明提供治療營養(yǎng)和代謝性疾病的方法，該方法包括向患者施用有效、無毒量的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的化合物在生產(chǎn)用于治療營養(yǎng)和代謝性疾病、例如肥胖和糖尿病的藥物中的用途。
將本發(fā)明的化合物按照本發(fā)明的描述進行給藥時，沒有意想不到的毒理學作用。
以下實施例說明本發(fā)明的化合物。藥理學方法按照下面所列方法評估本發(fā)明化合物的活性Leptin片段對SD大鼠食物攝取的影響外科手術(shù)在麻醉前，將大鼠用Synulox(0.1ml/100g)預處理約1小時，然后用Domitor(0.04ml/100g，肌肉內(nèi))和芬太尼(0.9ml/100g，腹膜內(nèi))將其麻醉。在無菌條件下，將套管趨實體性(stereotaxically)植入每個大鼠的側(cè)腦室中。用Antisedan和Nubain(50％v/v:50％v/v0.02ml/100g)腹膜內(nèi)逆轉(zhuǎn)麻醉。手術(shù)后，每只大鼠接受0.05ml Zenecarp。試驗方法試驗1手術(shù)后，在整個過程中每天監(jiān)測每只動物的體重。
為了確定套管在側(cè)室，靜脈內(nèi)注射血管緊張素Ⅱ(100ng/5μl)并在注射后監(jiān)測水攝取5分鐘。
在手術(shù)后5和6天，測量24食物攝取。在第6天，將動物根據(jù)其體重分成3組(a,b和c，每組8只大鼠)并禁食過夜。在試驗當天(第7天)，按如下給大鼠進行靜脈內(nèi)注射a組-載體(PBS，磷酸鹽緩沖液，5μl/大鼠)；b組-人leptin(11.5μg/5μl)；和c組-leptin胰蛋白酶消化產(chǎn)物(30μg/5μl)。
在靜脈內(nèi)注射過程完成后，立即給大鼠提供超過日需要的已知數(shù)量的食物。24小時后，測量食物攝取和體重。所得結(jié)果列于表1。
試驗2完全按照上述方法制備各組動物，但在禁食后試驗當天，給每組大鼠注射如下成分
a組-載體(PBS 5μl/大鼠)；b組-人leptin(8.75μg/5μl)；c組-鼠leptin(10μg/5μl)；d組-ob57-74，序列VTGLDFIPGLHPILTLSK(3.33μg/5μl)；注射后，再提供超過每日需要的量的已知數(shù)量的食物；24小時后，記錄體重變化和食物消耗量。結(jié)果列于表2。結(jié)果表1腦室內(nèi)施用人leptin和其片段對SD大鼠體重和食物攝取的影響*P＜0.0524小時食物 體重變化攝取(g) (g/24小時)載體 36.68±2.531.44±1.2(5μl/大鼠，n=8)人-leptin 30.62±1.5*22.88±2.05*(11.5μg/大鼠，n=8)人-leptin 34.6+1.99 23.88±1.2*胰蛋白酶消化產(chǎn)物(30μg/大鼠，n=8)
表2腦室內(nèi)施用人leptin、鼠leptin和leptin片段57-74(VTGLDFIPGLHPILTLSK)對SD大鼠體重和食物攝取的影響*P＜0.0524小時食物攝取(g)體重變化(g/24小時)載體32.16±0.8 30.55±0.67(5μl/大鼠，n=8)人-leptin 33.7+1.6 24.5+3.7(8.75μg/大鼠，n=8)鼠-leptin 31.3+1.7 23.7±2.18*(10μg/大鼠，n=8)leptin片段 33.6±0.926.8±1.2*57-74(3.33μg/大鼠，n=8)
權(quán)利要求
1．肽或其功能衍生物、類似物或變體，它們主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來調(diào)節(jié)體重。
2．肽或其功能衍生物、類似物或變體，它們主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來減輕體重。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其中所述肽是ob蛋白質(zhì)的片段，或其功能衍生物、類似物或變體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的肽，選自下列人ob蛋白質(zhì)片段ob21-26、ob27-32、Ob33-36、ob37-41、ob42-54、ob55-56、ob57-74、ob93-105、ob106-115、ob116-149和ob150-167。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的肽，其中所述肽具有氨基酸序列VTGLDFIPGLHPILTLSK。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的肽，它從權(quán)利要求4的一個或多個肽形成。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的肽，它從權(quán)利要求4的兩個連續(xù)肽成員形成。
8．合成或重組肽，它是權(quán)利要求1至7的任一肽。
9．編碼權(quán)利要求1至7任一肽的核苷酸序列。
10．含編碼權(quán)利要求1至7任一肽之核苷酸序列的載體。
11．用權(quán)利要求9的復制型表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
12．制備權(quán)利要求1的肽或其功能衍生物的方法，該方法包括下列步驟將肽水解為至少2個肽片段；分離肽片段；此后任選地制備其功能衍生物。
13．制備權(quán)利要求1至7任一肽的方法，該方法包括在重組宿主細胞中表達編碼所述肽的DNA并回收產(chǎn)物。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，該方法包括下列步驟ⅰ)制備在宿主細胞中能夠表達DNA聚合物的復制型表達載體，所述DNA聚合物含有編碼所需肽的核苷酸序列；ⅱ)用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；ⅲ)在允許表達所述DNA聚合物以產(chǎn)生所述肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化宿主細胞；和ⅳ)回收所述肽。
15．含有權(quán)利要求1的化合物和可藥用載體的藥物組合物。
16．作為活性治療物質(zhì)的權(quán)利要求1的化合物。
17．用于治療營養(yǎng)性和代謝性疾病的權(quán)利要求15的化合物。
18．治療營養(yǎng)性和代謝性疾病的方法，該方法包括施用有效的藥物學可接受的非毒性量的權(quán)利要求1的化合物。
19．權(quán)利要求1的化合物用于制備治療營養(yǎng)性和代謝性疾病的藥物的用途。
全文摘要
leptin或ob肽或其功能衍生物、類似物或變體,所述肽主要通過調(diào)節(jié)能量消耗來調(diào)節(jié)體重;含所述化合物的藥物組合物,制備所述化合物的方法以及所述化合物在藥物中的用途。
文檔編號C07K14/435GK1221426SQ97195311
公開日1999年6月30日 申請日期1997年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月6日
發(fā)明者K·A·阿爾－巴拉詹吉, J·R·S·阿奇, P·卡米勒里, W·A·內(nèi)維協(xié) 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司