專利名稱：被動服用的可提高飼料轉(zhuǎn)化效率的抗體的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域一種可提高動物中飼料轉(zhuǎn)化效率的飼料添加劑。
背景討論在動物產(chǎn)業(yè)中，抗生素通常用于防止感染、提高動物生產(chǎn)性能和治療感染性疾病。而用于代替抗生素來提高動物生產(chǎn)性能的替換方法還無法商業(yè)性地獲得。
目前，用于動物生產(chǎn)的大多數(shù)抗生素與用于人類治療的不同。然而，由于出現(xiàn)對用于動物的任何抗生素都有抗藥性的多抗性細(xì)菌，使得曾一直用于人類治療的抗生素不再能夠使用。持續(xù)使用抗生素作為預(yù)防劑或生長促進(jìn)劑也導(dǎo)致了動物農(nóng)產(chǎn)品中的藥物殘留問題與日益增長的環(huán)境污染問題。研究表明，所服用抗生素的75％可通過尿和糞排回到環(huán)境中(Addison,1984)已經(jīng)有人證明了給母雞注射外源抗原會產(chǎn)生特異性抗體，并且抗體將沉積在蛋黃中。當(dāng)口服刺激時，動物可產(chǎn)生對沙門氏菌、大腸桿菌以及其他類型細(xì)菌的特異性抗體(Rick等，1988；Neighbor等1991)。當(dāng)把這些抗體施用于動物后，再用細(xì)菌去感染，該抗體可防止感染(Bartz等，1980；Sherman等，1983；Tacket等，1988；Kuhlmann等，1988；Yolker等，1988；Shmidt等，1989；Wiedemann等，1990；Hatta等，1993a和1993b；Kuroki等，1993)。Pimentel等在1991年與Pimentel及Cook在1988年報道，注射了刀豆脲酶的母禽所產(chǎn)的小雞與幼禽加快了生長。
抗體防止感染至少有兩種可能的機(jī)理。已有報道說抗體能通過阻礙細(xì)菌附著于腸壁而減少胃腸道中細(xì)菌的數(shù)目?？贵w也可以通過與腸壁上的特異受體或者與細(xì)菌本身結(jié)合，阻礙細(xì)菌增殖，從而降低細(xì)菌的數(shù)目(Ishida等，1992)?？贵w預(yù)防疾病的兩種作用機(jī)理都是可減少菌苗數(shù)。而且抗體不會導(dǎo)致抗性菌株的出現(xiàn)，也不會因?yàn)樵趧游镛r(nóng)產(chǎn)品中有討厭的殘留物而留下威脅。
發(fā)明概述一種提高哺乳動物飼料轉(zhuǎn)化效率的方法，包括用一種含有有效劑量的抗體的飼料喂養(yǎng)哺乳動物，該抗體可結(jié)合脲酶。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本性涉及一種通過在動物飼料中添加可結(jié)合脲酶的抗體而提高動物中飼料轉(zhuǎn)化效率的方法。用于獲取抗體的優(yōu)選抗原是可從Sigma化學(xué)公司商購的刀豆脲酶。我們已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用含有抗脲酶的抗體(其劑量為每公斤飼料中抗體提取物為25-500mg，優(yōu)選25-100mg/kg)的飼料連續(xù)喂養(yǎng)哺乳動物特別是豬三至四周，則其飼料轉(zhuǎn)化效率有所提高。在豬中飼料轉(zhuǎn)化效率平均提高9到15點(diǎn)，或者更多?？贵w提取物在例2中有描述。作為一個替代的方法，如例7中所述，可不需先分離抗體而是直接將蛋干燥并混入飼料中。如果用含有抗脲酶抗體飼料喂養(yǎng)?；蜓?，其生長也伴有有所提高的飼料轉(zhuǎn)化效率。
喂養(yǎng)含有抗脲酶抗體的家禽飼料后，家禽包括雞和火雞的生長率和飼料轉(zhuǎn)化效率均有所提高。
可通過給動物比如嚙齒類動物或兔等注射脲酶，然后收集含有抗體的血清而得到抗脲酶抗體。然而，這種方法花費(fèi)較高，并且對動物刺激太大。
現(xiàn)已有一種非刺激性而且較經(jīng)濟(jì)可行的一般方法可用于生產(chǎn)抗體。據(jù)觀察，蛋中含有50-150mg的各種抗體。當(dāng)用一特殊抗原注射母禽時，從蛋中所分離的抗體的10-20％對該抗原有特異性(Losch等，1986；Kuhlmann等，1988；Bardsallet all,1990；Gassmann等，1990)。蛋中產(chǎn)生的免疫球蛋白種類鑒定為IgY，它與哺乳動物產(chǎn)生的IgG相類似。小豬以與同源性豬抗體相似的方式吸收蛋黃抗體。Wiedemann等(1990)觀察到用含有抗體的凍干蛋黃來喂養(yǎng)的8周大的小豬，則在其整個末端空腸都發(fā)現(xiàn)有抗體。當(dāng)給動物提供可降低胃內(nèi)酸度的碳酸氫鈉，則可提高抗體的活性。據(jù)報道相對于噴霧干燥的強(qiáng)化抗體，包含于噴霧干燥的整個蛋中的抗體更耐腸內(nèi)酸性的降解。Yokoyama等(1993)報道在給小豬(28日齡)口服小雞抗體兩小時后，從其胃直至回腸內(nèi)均有活性抗體。在一相關(guān)研究中，Ishida等(1992)證明了用注射了人類腸細(xì)菌的超免疫牛產(chǎn)生的乳汁喂養(yǎng)8和18月齡的小鼠，其腸內(nèi)腸桿菌的生長受到顯著抑制。將雞抗體包裹于脂質(zhì)體中可使其進(jìn)一步免于胃酸和胰酶水解。
以前關(guān)于雞抗體在預(yù)防豬中細(xì)菌感染的功效的研究已有報道。在體外研究中，Jungling等(1991)觀察到蛋黃抗體能有效降低產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌粘附到分離的豬腸細(xì)胞上。體內(nèi)測試中，含有抗大腸桿菌抗體的噴霧干燥蛋黃提取物預(yù)防了新生小豬和牛犢內(nèi)大腸桿菌病(Yokoyama等，1992和1993,Erhard等，1993)并降低了豬腹瀉天數(shù)(Kellner等，1994)。
盡管通常知道雞抗體能保護(hù)接種動物免受細(xì)菌感染，卻沒有抗體顯示出能提高飼料轉(zhuǎn)化效率，即能將一定量的飼料轉(zhuǎn)化為更多的體重增長。本發(fā)明提供了一種利用抗酶(脲酶)抗體以提高哺乳動物中飼料利用率(飼料轉(zhuǎn)化效率)以及體重增長的方法，所述酶存在于哺乳動物胃腸道中。
下述范例性實(shí)施方案是對本發(fā)明的舉例說明而非旨在限定。在對這些實(shí)施范例的描述中，本發(fā)明的其他特點(diǎn)也將是顯而易見的。實(shí)施例1A．這個實(shí)施例描述了抗脲酶的特異性抗體的制備。在17周齡(將母雞置于籠中)時，給母雞注射0.2mg的Ⅱ-c型脲酶(Sigma ChemicalCompany)。將酶溶解于0.2ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS:pH7.3)和0.2ml完全弗氏佐劑中制備接種物。將抗原制劑肌肉內(nèi)注射入兩個位點(diǎn)，在右和左每一胸肌注射0.2ml。每只母雞總共注射0.4ml抗原制劑。第二次注射安排在第一次注射后5-6周(約50％的蛋產(chǎn)量)。第二種抗原制劑中，用不完全弗氏佐劑代替完全弗氏佐劑。每兩個月或是當(dāng)確定抗體效價低時給母雞再次注射抗原制劑。用ELISA方法每4周測定抗體效價。在第二次注射1周后收集含有特異性抗體的蛋。為了將外界污染減至最小，將母雞保持于隔離的房間里。它們處在類似于商業(yè)化裝置般有序的接種程序之下。
B．在另一實(shí)驗(yàn)中，給母雞注射三次抗原，增加了蛋中抗脲酶的平均產(chǎn)量。實(shí)施例2照Kwan等(1991)建議的方法純化抗體。簡而言之，1體積的實(shí)施例1A中的蛋黃與9體積的蒸餾水混合，置于4℃過夜。接著將含水部分以4000rpm離心10分鐘，并用奶酪布過濾除去多余的脂肪。將液體冷凍以備將來冷凍干燥之用。冷凍干燥后，抗體經(jīng)熱處理(50℃～70℃1小時)以提高穩(wěn)定性。用ELISA鑒定抗體活性。在進(jìn)行ELISA之前，用Bradford法測定蛋提取物中蛋白質(zhì)濃度并調(diào)節(jié)至1mg/ml。實(shí)例施3以下是ELISA的操作步驟1．用溶于碳酸鹽緩沖液的100μl脲酶溶液(10μg/ml)覆蓋平板。用棋盤滴定法測定確切的抗原濃度。在4℃下溫育過夜后，該平板用1.5％牛血清白蛋白于室溫封閉4小時。
2．每孔加入100μl濃度為每毫升1毫克蛋白的蛋提取物，將平板置于室溫下溫育30分鐘。
3．用PBS-Tween20溶液洗滌平板。將100μl連有辣根過氧化物酶的稀釋度為1∶20,000的兔抗雞IgG加入每個孔中。將該板在室溫下溫育30分鐘。用棋盤滴定法測定酶-抗體連接物的準(zhǔn)確濃度。
4．用PBS-Tween洗滌平板，然后向每孔加入100μlTMB底物。將平板在室溫下溫育15分鐘。
5．用100μl2M硫酸終止反應(yīng)。
6．用ELISA平板讀數(shù)計在455nm下對平板讀數(shù)。
7．最后稀釋度的反比確定為效價，其中最后稀釋度是指該免疫蛋在該稀釋度下的O.D.值與未免疫的對照的O.D.值相似(O.D.＜.100)。實(shí)施例4此研究用表說明了在哺乳動物飼料中加入純化抗體的效果。兩個實(shí)驗(yàn)均用初生的(6周齡)小豬。對照和經(jīng)抗體處理的飼料均使用4周?？贵w劑量是50mg/kg食物。水和飼料均無限制地供給。每星期測量飼料攝入量和體重，每星期計算飼料轉(zhuǎn)化并表示為飼料攝入/體重增長量。這兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1至表4表1(實(shí)驗(yàn)1)<
個實(shí)驗(yàn)組由3只豬的兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)值組成。實(shí)驗(yàn)前稱量動物體重，并根據(jù)性別和體重分配到豬圈中。
表2(實(shí)驗(yàn)1
p><p>表3(實(shí)驗(yàn)2)
表4(實(shí)驗(yàn)2 )
實(shí)施例5用斷奶的豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用對照食物或抗體混合物喂養(yǎng)豬六個星期。將50mg抗體提取物混入1千克細(xì)磨的玉米中，接著與1噸飼料相混。飼料和水均無限制地供給。在2、4、6周測體重，結(jié)果示于表5。
表5
實(shí)施例6此實(shí)施例舉例說明了含有脲酶特異性抗體的噴霧干燥蛋的制備。勻漿含有抗體的蛋，然后噴霧干燥。與冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)方法相比，蛋經(jīng)噴霧干燥并未形響抗體活性。用于噴霧干燥的參數(shù)是進(jìn)氣溫度/出氣溫度為140℃/70℃，吹風(fēng)機(jī)在50％載量，壓縮機(jī)在75％載量，泵在30％載量，所有這些參數(shù)均得自實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用的Virtis噴霧干燥儀。為了除菌并提高抗體穩(wěn)定性(提高儲存期限)，將經(jīng)噴霧干燥的蛋在60℃下溫育7天。我們已測試了抗體樣品并發(fā)現(xiàn)這一過程沒有降低抗體活性。
因?yàn)閲婌F干燥產(chǎn)物含有脂肪，因而將1g產(chǎn)物與10ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混合，再加入10ml氯仿。充分混合該懸液，接著在4000rpm離心以從脂成分中分離蛋白質(zhì)。用牛γ-球蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物，采用Bradford方法測定上清中蛋白質(zhì)的含量。在按實(shí)施例1所述測定抗體活性和效價前將提取物用PBS稀釋至1mg蛋白/ml。實(shí)施例7用從6周齡至上市重量(200磅體重)的豬做兩個實(shí)驗(yàn)。這次抗體不是從蛋黃中分離的，而是在對整個蛋(蛋白和蛋黃)進(jìn)行勻漿并噴霧干燥(實(shí)施例6)得到的。與純化的抗體活性相同的干燥蛋的量是250mg/kg飼料。結(jié)果示于表6和7。
動物30只六周齡的豬(Dekalb株)，分兩個測試組。每個測試組有3個重復(fù)小組，每小組5只豬。
表6
表7
實(shí)施例8按照實(shí)施例4制備含有抗體的干燥蛋。將從初生階段到上市階段重量的豬在這個實(shí)驗(yàn)中保持16周。結(jié)果示于表8。
表8
實(shí)施例9這個研究說明了在室溫及高溫下儲存的噴霧干燥全蛋的抗體穩(wěn)定性。噴霧干燥蛋樣品(0.5-1.0gr)置于帶帽小瓶(4ml)中，貯于室溫(21℃)或37℃培養(yǎng)箱中，每星期均檢查保存于這兩種溫度下的小瓶中的抗體活性。并與保存于0℃的樣品的活性比較。結(jié)果示于表9。
表9
顯然，受上述教導(dǎo)內(nèi)容的啟發(fā)，本發(fā)明可能有汗多修飾和變化。因此應(yīng)理解在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)，除去文特別描述的方式之外，本發(fā)明還可按其它方式實(shí)施。
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權(quán)利要求
1．一種提高哺乳動物中飼料轉(zhuǎn)化效率的方法，包括用含有有效劑量的可結(jié)合脲酶的抗體的飼料喂養(yǎng)哺乳動物。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中脲酶為刀豆脲酶。
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中每千克該飼料中含有25-100mg純化的抗體。
4．按照權(quán)利要求1的方法，其中抗體是在蛋中產(chǎn)生的。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中抗體是在雞蛋中產(chǎn)生的。
6．按照權(quán)利要求4的方法，其中將蛋經(jīng)干燥后加入到飼料中。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的哺乳動物是豬。
8．按照權(quán)利要求3的方法，其中用所說的飼料喂養(yǎng)所說的哺乳動物至少連續(xù)4周。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所說的哺乳動物是豬。
10．按照權(quán)利要求6的方法，其中已對蛋進(jìn)行冷凍干燥，并在50°-70℃加熱以提高抗體穩(wěn)定性。
全文摘要
一種提高哺乳動物例如豬中飼料轉(zhuǎn)化效率的方法,其中給哺乳動物喂養(yǎng)的飼料中含有以脲酶作為抗原產(chǎn)生的抗體。
文檔編號C07K16/40GK1223590SQ97195833
公開日1999年7月21日 申請日期1997年5月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月24日
發(fā)明者J·皮門特爾 申請人:阿尼托克斯公司