專利名稱：轉(zhuǎn)錄沉默元件及其結(jié)合因子的制作方法
根據(jù)聯(lián)邦贊助研究的陳述本發(fā)明部分由政府基金支持進行，因此政府對所述發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
本申請涉及核苷酸調(diào)節(jié)序列及其結(jié)合因子。
植物進化出一系列各異的保護機制以抵御各種各樣的致病生物。引起一系列保守防御反應(yīng)的受體識別病原體衍生的信號，諸如誘出物(elicitins)、harpins、真菌細胞壁片段、無毒(avr)基因產(chǎn)物及avr基因產(chǎn)物特化的代謝物。這些信號的感受誘導蛋白質(zhì)磷酸化變化，人們認為這影響了各種各樣的防御反應(yīng)。這樣的防御反應(yīng)包括細胞壁木質(zhì)化、誘導諸如那些編碼殼多糖酶和葡聚糖酶的致病相關(guān)(PR)基因、產(chǎn)生抗微生物植物病毒素、誘導系統(tǒng)獲得抗病性以及產(chǎn)生參與細胞壁蛋白交聯(lián)的活性氧類和誘導編程性細胞死亡。這些反應(yīng)有助于抑制所述植物宿主中病原體的生長和擴散。
這些防御反應(yīng)中的許多依賴于對合適信號反應(yīng)的特定基因的轉(zhuǎn)錄誘導。例如，當病原體攻擊或不同的病原體因子誘導(elicit)諸如煙草和土豆的茄科植物時，發(fā)生主要的代謝轉(zhuǎn)變，其中抑制固醇產(chǎn)生和誘導倍半萜植物抗毒素合成。倍半萜植物抗毒素生物合成特有的第一步是借助于酶環(huán)化類異戊二烯中間體FPP，所述酶從種屬上稱為倍半萜環(huán)化酶。在煙草中，所述倍半萜環(huán)化酶5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)合酶(EAS)產(chǎn)生5-表-馬兜鈴烯，接著加入兩個羥基產(chǎn)生殼體二醇(capsidiol)。所述類異戊二烯生物合成途徑的固醇特異支路也從中間體FPP延伸出來。固醇生物合成的衰變與角鯊烯合酶活性的抑制和倍半萜環(huán)化酶活性誘導的倍半萜生物合成誘導有關(guān)。因為這兩種酶處于所述途徑中一般認定的分支點的位置上，所以認為所述一種酶的誘導和所述另一種酶的抑制是控制碳流動的一種重要機制，并因此形成最終產(chǎn)物。
發(fā)明概述概括而言，本發(fā)明描述了包括類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件的分離核酸序列的特征。最好是，這個分離核酸序列包括序列5′NTACNNTACN3′(其中N為A、T、G或C)(SEQ ID NO:1)；例如，5′CTACAGTACT3′(SEQ ID NO:2)。在最佳實施方案中，本發(fā)明的核酸包括5′TCTACAGTACT3′(SEQ ID NO:3)或5′ACTCTACAGTACTC3′(SEQ IDNO:4)序列。在其它最佳方案中，所述類異戊二烯合酶是倍半萜合酶(例如，表-5-馬兜鈴烯合酶(EAS))。
在最佳實施方案中，所述核酸序列來自雙子葉植物(例如一種所述茄科植物，諸如煙草)。在其它最佳實施方案中，所述核酸序列來自單子葉植物、裸子植物或松柏類植物。
在相關(guān)方面，本發(fā)明描述了包含類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件的載體或轉(zhuǎn)基因植物(或其種子或其植物細胞)的特征。一般而言，包含本發(fā)明沉默元件的載體降低或消除了操作性地連接的核苷酸序列在含有載體的細胞(例如，轉(zhuǎn)基因植物細胞)內(nèi)的表達。
在另一方面，本發(fā)明描述了減少轉(zhuǎn)基因植物中DNA序列轉(zhuǎn)錄的方法。這個方法包括下述步驟(a)提供包含所述類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件的核酸的轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述調(diào)節(jié)元件處于減少DNA序列轉(zhuǎn)錄的位置并整合到轉(zhuǎn)基因植物細胞的基因組中；及(b)由所述轉(zhuǎn)基因植物細胞培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
在另一方面，本發(fā)明描述了與類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件結(jié)合的因子，例如多肽。
所述“基因沉默調(diào)節(jié)元件”是指能夠負調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物表達的核酸序列。這種沉默元件起降低或消除所述基因表達的作用。基因沉默調(diào)節(jié)元件的抑制作用引起所述基因表達的激活，例如本文所述的EAS4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄。一般來說，基因沉默調(diào)節(jié)元件位于基因的5′區(qū)，例如位于所述啟動子區(qū)。多拷貝的這種基因沉默元件也可以用來降低或消除基因表達。
所述“處于減少DNA序列轉(zhuǎn)錄的位置”是指沉默調(diào)節(jié)元件位于減少或消除基因表達的位置，所述基因表達是處于這種調(diào)節(jié)元件的控制之下。一般來說，這種沉默元件足以賦子細胞或組織特異性基因表達或由外部信號或介質(zhì)誘導的基因表達的依賴于啟動子的可控基因表達；這種元件可能位于基因的5′或3′區(qū)。另外，減少或抑制轉(zhuǎn)錄的沉默元件的位置與其方向和距轉(zhuǎn)錄起始位點的距離都無關(guān)。一般來說，本發(fā)明的沉默元件至少減少基因表達轉(zhuǎn)錄10％。與不包含沉默元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)相比，優(yōu)選至少減少所述轉(zhuǎn)錄20％，更優(yōu)選至少減少40％，而最優(yōu)選至少減少90％。
所述“從基因獲得”是指調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列是以序列信息為基礎(chǔ)，所述序列信息包括天然存在的植物基因(例如煙草的EAS4啟動子區(qū))。一旦鑒定出所述沉默調(diào)節(jié)元件，就可以從自然資源中獲得根據(jù)本發(fā)明的沉默調(diào)節(jié)元件，或者可以按照任何標準方法(例如，通過重組方法或化學合成)制備。
所述“類異戊二烯合酶基因”是指編碼下述多肽的基因，所述多肽能夠催化涉及形成二磷酸烯丙酯底物(例如，二磷酸C10、C15或C20烯丙酯底物)分子內(nèi)的C-C鍵產(chǎn)生類異戊二烯產(chǎn)物(例如，單萜、雙萜、倍半萜或固醇產(chǎn)物)的反應(yīng)。這種類異戊二烯合酶基因的例子包括但不限于單萜合酶(例如檸檬烯合酶)、雙萜合酶(例如，casbene合酶)及倍半萜合酶(例如，5-表-馬兜鈴烯合酶、vetispiradiene合酶及杜松烯合酶)，它們分別引起二磷酸香葉酯(GPP)、二磷酸香葉基香葉酯(GGPP)、二磷酸金合歡酯(FPP)的環(huán)化。
所述“表-5-馬兜鈴烯合酶”或“EAS”是指能夠催化二磷酸反，反-金合歡酯環(huán)化形成雙環(huán)中間體表-5-馬兜鈴烯的酶。
所述“操作性地連接”是指類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件和植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)以這樣一種方式連接，以便當合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄蛋白)和所述沉默調(diào)節(jié)序列結(jié)合在一起時，降低或消除基因表達。
所述“多肽”是指任何氨基酸鏈，與長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)無關(guān)。
所述“轉(zhuǎn)化植物細胞”是指利用重組DNA技術(shù)(例如本文所述的那些技術(shù))引入重組核苷酸序列(例如所述EAS4啟動子)的細胞(或其祖先)。
所述“植物細胞”是指由半透膜定界的并含有質(zhì)體的任何自身繁殖細胞。如果需要進一步的增殖，這個細胞也需要細胞壁。本文所用的植物細胞包括但不限于藻類、藍細菌、種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
所述“轉(zhuǎn)基因的”是指包含DNA序列的任何細胞，所述DNA序列由人工插入細胞并成為由該細胞發(fā)育的生物基因組的一部分。本文所用的轉(zhuǎn)基因生物一般是轉(zhuǎn)基因植物，并且所述DNA由人工插入到所述生物的基因組中。
所述“分離的DNA”是指無下述序列的DNA，所述序列在衍生本發(fā)明DNA的生物天然存在的基因組中位于所述DNA的側(cè)翼。因此所述術(shù)語包括諸如摻入到載體、自主復制型質(zhì)粒或病毒、或者原核或真核生物基因組DNA中的重組DNA沉默調(diào)節(jié)元件；或作為獨立于其它序列的分離分子(例如在啟動子區(qū)內(nèi))存在的重組DNA沉默調(diào)節(jié)元件。它也包括作為編碼多肽序列的雜種基因部分的重組DNA調(diào)節(jié)元件。
從下述的其最佳實施方案的描述及權(quán)利要求書中可明顯地看出本發(fā)明其它的特點和優(yōu)點。
詳細描述首先解釋附圖。附1A是一示意圖，顯示了所述EAS4啟動子區(qū)圖譜。用小箭頭和具有A-E字母符號的線段表示用于克隆和產(chǎn)生不同探針和競爭者的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物的位置。在圖右側(cè)的大箭頭代表所述EAS4的開放讀框。帶有+1符號的彎曲箭頭表示所述EAS4轉(zhuǎn)錄起始位點(如SEQ ID NO:5中描述的位置1299(5′GTA+1G3′))；及在C片段內(nèi)包圍的實心垂直的矩形表示所述TAC框的位置。


圖1B是一組照片，顯示在由對照細胞和誘出劑(elicitor)處理細胞制備的細胞核和全細胞提取物存在的情況下，使用A、E和B片段的電泳遷移率變動分析(EMSA)的結(jié)果。結(jié)合試樣包括1微克dI-dC、1毫微克放射性標記的DNA探針和2毫微克蛋白提取物。由對照細胞(標明C)或用纖維素酶誘導3小時的細胞(標明E)制備細胞核(標明nuc)和全細胞(標明wce)提取物。
圖1C是一張照片，顯示在由對照細胞和誘出劑處理細胞制備的細胞核(標明nuc)和全細胞(標明wce)提取物存在的情況下溫育的D片段的電泳遷移率變動分析的結(jié)果。接圖1B所述進行測定，除了在這些測定中包括超出50倍摩爾濃度的野生型D片段或包含突變M2(見圖2B中圖解說明)的D片段作為特異競爭者的片段。
圖2A是一組照片，說明了在所述EAS4啟動子中主要蛋白結(jié)合位點的鑒定。用在編碼或非編碼鏈的5′末端標記的C片段進行甲基化干擾(M.I.)和DNaseⅠ(DNase)足跡法分析。星號表示干擾蛋白提取物結(jié)合的鳥嘌呤堿基甲基化的位置。實線確定了免受DNaseⅠ切割的局部受保護的區(qū)域。泳道標記符號說明如下G指鳥嘌呤特異性切割反應(yīng)；F指電泳遷移率變動分析(EMSA)后游離的(未結(jié)合的)DNA；C指與對照細胞核提取物結(jié)合的DNA；和E指與來自誘出劑處理細胞的細胞核提取物中的蛋白結(jié)合的DNA。
圖2B說明了WT-TAC框和M2-TAC框的核苷酸序列。在WT-TAC框中有下劃線的序列表示重復TAC框，而星號表示干擾蛋白結(jié)合的鳥嘌呤甲基化的位置，在M2-TAC框中的方框內(nèi)的核苷酸表示用定點誘變突變的核苷酸。
圖3A是EMSA的照片，所述EMSA是用由對照細胞(泳道2、6和7)或用誘出劑處理1.5小時(泳道3、8和9)、3小時(泳道4、10和11)或12小時(泳道5、12和13)的細胞制備的提取物進行的。用堿性磷酸酶測定緩沖液稀釋蛋白至1微克/微升，然后立即加入到結(jié)合反應(yīng)復合物中(泳道2-6)；或在沒有(泳道6、8、10和12)或有(泳道7、9、11和13)堿性磷酸酶的情況下，于37℃溫育45分鐘后加入。在總體積為10微升的EMSA結(jié)合反應(yīng)物中含有0.5皮摩爾TAC框雙鏈寡核苷酸探針、2皮克聚dI-dC和2微克蛋白提取物。在圖3A-3C中只顯示了包含所述蛋白質(zhì)-DNA復合物的部分凝膠。
圖3B是一組照片，顯示了使用由對照全細胞提取物制備的蛋白提取物的EMSA，用補加了MgCl2或EDTA的結(jié)合緩沖液將所述對照全細胞提取物稀釋至1微克/微升，并立即加入到結(jié)合試樣中(泳道1-4)；或于37℃溫育45分鐘后加入到所述結(jié)合試樣中(泳道5-8)。
圖3C是一張照片，顯示了使用全細胞提取物的EMSA，制備所述全細胞提取物的細胞是在加入(泳道8)或不加入MgCl2(泳道1-7、9-11)或EDTA(泳道10、11)的情況下誘出劑處理3小時，并在加入結(jié)合反應(yīng)之前于37℃溫育不同的時間。用于泳道9的提取物首先不加入MgCl2溫育30分鐘。
圖4A是一張照片，說明了從DNA親和層析組分獲得的不同組分的EMSA。在每一泳道上加入10微升結(jié)合試樣，所述10微升結(jié)合試樣包括1毫微克C片段探針(圖1A)和2微克蛋白樣品。標記“E-3 hr”的泳道指由誘出劑處理3小時的細胞制備的上柱蛋白樣品；第1批和第2批指順序加工的兩個相同的樣品；而第3批指流通液(flow through)(FT1和FT2)和低鹽(0.1M KCl)流洗液合并并再次上柱，以提取另外的結(jié)合活性的組合物。在所述最后3條泳道中，將蛋白樣品稀釋10倍(0.1X)或蛋白樣品中有加入到結(jié)合試樣中的0.5微克dI-dC。星號指混合并透析產(chǎn)生E-DAC標記的制品的組分，然后超濾所述E-DAC標記的制品產(chǎn)生標記E-DAC-UF的制品。
圖4B是一張照片，說明了在Mono-S快速蛋白液相層析(FPLC)過程中獲得的不同組分的EMSA分析。除了使用兩微升每一組分的10倍稀釋液，如上所述進行結(jié)合測定。E-DAC-UF指上凝膠的樣品，而數(shù)字對應(yīng)于從所述柱子獲得1毫升組分。星號指混合并透析產(chǎn)生標記E-FPLC的制品的組分，然后超濾標記E-FPLC的制品產(chǎn)生E-FPLC-UF制品。
圖5是一張不同TBBF制品的SDS-PAGE分析照片。泳道1，對照全細胞提取物；泳道2,C-DAC-UF；泳道3,C-FPLC-UF；泳道4,C-核酸酶；泳道5,E-全細胞提取物；泳道6,E-DAC-US；泳道7,E-FPLC-UF；及泳道8,E-nuc。
圖6A是一張使用純化的TBBF制品的DNaseⅠ足跡法分析照片。
圖6B是一幅圖，表示在不同非特異性DNA存在的情況下，與TAC框探針結(jié)合的TBBF的量。
圖7A是一示意圖，顯示了在EAS4啟動子GUS基因融合物中野生型TAC框元件(WT-TAC框)和突變TAC框元件(M2-TAC框)的位置。
圖7B是一幅圖，顯示了轉(zhuǎn)基因植物中的GUS活性的對比，所述轉(zhuǎn)基因植物包含用誘導物處理的所述野生型TAC框元件(WT-TAC框)和所述突變TAC框元件(M2-TAC框)。用包含或者所述野生型或者突變TAC框的EAS4-266至+73區(qū)控制下的GUS基因轉(zhuǎn)化煙草植物。用水或所述誘出劑隱配基(cryptogein)(1μg/ml)浸潤F1子代葉，從所述浸潤區(qū)域提取蛋白質(zhì)，并測定GUS活性。每對條塊(對照和誘出劑)代表獨立轉(zhuǎn)基因系。每一條塊的高度代表至少3株植株的平均體積。
現(xiàn)有下述分析的描述，所述分析分析識別標記EAS4的5-表-馬兜鈴烯合酶基因啟動子區(qū)特定序列的DNA結(jié)合活性。通過足跡法鑒定一個活性結(jié)合位點，然后突變以證明其對蛋白結(jié)合和啟動子活性的影響。所述DNA結(jié)合活性在生物化學上進行特征鑒定，且負責這種活性的蛋白質(zhì)是純化的。另外，通過將一系列啟動子構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入煙草中，證實在所述EAS4啟動子區(qū)中的這種順式元件的功能鑒定，所述啟動子構(gòu)建物包含融合GUS報道基因的所述沉默元件。
提供這些實施例的目的是為了說明本發(fā)明，不應(yīng)解釋為是限制性的。鑒定EAS4啟動子區(qū)結(jié)合活性為了解調(diào)節(jié)EAS4基因的機制，將EAS4啟動子區(qū)(SEQ ID NO:5)劃分為5個重疊的核苷酸片段，用片段A-E代表(圖1A)，且檢驗了每一個片段結(jié)合蛋白的能力，所述蛋白由煙草細胞懸浮培養(yǎng)物的細胞核或全細胞提取物制備。用電泳遷移率變動分析(EMSA)(未列出數(shù)據(jù))檢測時，這些實驗顯示未在細胞核提取物中檢測出對A或E片段特異性的DNA結(jié)合活性。因為在制備分離的細胞核時蛋白質(zhì)可能會丟失，所以也檢測了全細胞提取物結(jié)合A-E片段的活性。
這些實驗的結(jié)果表明，在全細胞提取物中存在一些與A-E片段弱結(jié)合的活性(圖1B，泳道1-6)，而在細胞核和全細胞提取物中發(fā)現(xiàn)結(jié)合B片段(圖1B，泳道7-11)和D片段(圖1C，泳道1-5)的主要DNA結(jié)合活性。限制酶分析表明，所述主要DNA結(jié)合活性識別這兩個片段重疊的區(qū)內(nèi)的序列(未列出數(shù)據(jù))。如圖1C所示，在使用D片段和不同的提取物制備的結(jié)合反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)三種遷移復合物(用F、I和S代表，分別指快速、中速和慢速遷移復合物)。來自對照細胞(C-nuc)和誘出劑處理(E-nuc)的細胞的細胞核提取物均形成所述快速遷移復合物，并且由誘出劑處理細胞制備的細胞核提取物中的這種DNA結(jié)合活性較少。
對照全細胞提取物形成所有三種復合物，其中復合物I(中速)是最多的。誘出劑處理3小時后制備的全細胞提取物主要形成復合物S(慢速)。加入超出50倍的未標記的D片段(圖1C，泳道6-9)減少了標記D片段的結(jié)合量，因此證明了序列專一性。鑒定蛋白結(jié)合位點為鑒定包含上述鑒定活性的結(jié)合位點的特定核苷酸堿基，進行了甲基化干擾(M.I.)和DNaseⅠ足跡實驗(圖2A)。將EAS4啟動子區(qū)的C片段在鳥嘌呤上部分甲基化，同來自對照細胞或誘出劑處理細胞的核蛋白混合，并用EMSA分析以分離結(jié)合和未結(jié)合的DNA。凝膠純化后，在所述甲基化位點切割所述DNA，并將得到的片段在6％變性聚丙烯酰胺測序凝膠上分離(圖2A)。在結(jié)合DNA組分中(圖2A，泳道C和E)在非編碼鏈-239和-234(圖2A-星號標記)位置鳥嘌呤甲基化的DNA片段的代表性不足，這表明在這些位置的甲基化作用干擾了蛋白結(jié)合。在編碼鏈-237位置的鳥嘌呤甲基化不影響DNA結(jié)合。
DNaseⅠ足跡分析也暗示了在C片段內(nèi)的所述同一區(qū)為所述蛋白結(jié)合位點。在由或者對照細胞或者誘出劑處理細胞制備的細胞核提取物存在的情況下，編碼鏈的-237至-242區(qū)域和非編碼鏈的-236至-242區(qū)域受到局部保護，免遭DNaseⅠ酶解(圖2A，實線)。這些發(fā)現(xiàn)提供了另外的證據(jù)，證明在B和D片段存在的情況下形成所述DNA-蛋白質(zhì)復合物是由于結(jié)合在這兩個片段重疊的位置(即在C片段內(nèi))造成的。綜合從甲基化干擾和DNaseⅠ足跡法得到的結(jié)果，表明實際上是在細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合活性識別這種核苷酸序列，所述細胞核提取物是由對照細胞和誘出劑處理細胞制備的。如標明TAC框的序列5′CTACAGTAC3′(SEQ ID NO:6)，是由于存在重復的“TAC”基元造成的。
為了確認所述TAC框負責通過EMSA觀察到的所述結(jié)合活性，通過寡核苷酸介導的定點誘變(圖2B,M2-TAC框)改變所述TAC框中的兩個核苷酸。來自對照細胞和誘出劑處理細胞(未列出數(shù)據(jù))的細胞核和全細胞提取物與包含所述突變TAC框的DNA片段的結(jié)合最小，且不競爭結(jié)合野生型D片段探針(圖1C，泳道10-13)。這個結(jié)果提供了進一步的證據(jù)，表明蛋白結(jié)合需要所述TAC框元件。TAC框結(jié)合活性的特征鑒定來自對照細胞和誘出劑處理細胞的全細胞提取物之間在所述TAC框-蛋白復合物遷移上的不同表明，在由誘出劑處理引起的細胞應(yīng)答過程中所述TAC框結(jié)合因子可能受到修飾。為檢查這種可能性，由誘出劑處理不同時間的細胞制備全細胞提取物(圖3A，泳道1-5)。先前的研究表明誘出劑處理后2-6小時EAS mRNA的累積是最快的。過了這個時間mRNA水平開始下降并回到24小時前的對照水平。而由對照細胞制備的全細胞提取物主要產(chǎn)生復合物I；雖然由形成復合物S的EAS轉(zhuǎn)錄高峰期(即誘出劑處理后3小時)的細胞制備的全細胞提取物中也鑒定出復合物I，但是誘出劑處理30分鐘的細胞制備的全細胞提取物導致復合物S的形成；并且由誘出劑處理后12小時的細胞制備的全細胞提取物形成復合物I。這些結(jié)果顯示，所述TAC框-蛋白質(zhì)復合物的改變和EAS基因轉(zhuǎn)錄的誘導模式有關(guān)。
為了檢查復合物遷移差異的性質(zhì)，檢測了脫磷酸作用對結(jié)合活性的影響(圖3A，泳道6-13)。在堿性磷酸酶緩沖液(20mMTris-HCl,pH8.5)中將全細胞提取物大約稀釋10倍，并在EMSA分析之前于37℃將所述提取物溫育45分鐘。令人驚訝的是，在沒有堿性磷酸酶的情況下(對比圖3A的泳道2和6；3和8；4和10；及5和12)于37℃溫育所述提取物時，發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)-DNA復合物從較慢速向較快速遷移形式變動。所以用堿性磷酸酶溫育減少了結(jié)合活性的總量，并且也部分抑制了復合物遷移變動。在單獨的實驗中，用或不用堿性磷酸酶于37℃溫育30分鐘不影響所述細胞核提取物的結(jié)合活性(未列出數(shù)據(jù))。
為了確定在這些條件下復合物遷移沒有變動，將對照細胞制備的全細胞提取物稀釋并補加MgCl2或EDTA，然后立即把這個復合物加入到結(jié)合試樣中，或用另一種方法，在加入MgCl2±EDTA之前于37℃溫育45分鐘(圖3B)。EMSA顯示，MgCl2或EDTA的存在不影響所述TAC框-蛋白復合物的遷移(圖3B，泳道1-4)。45分鐘后，僅含有4mM Mg2+的樣品主要產(chǎn)生復合物F；用9mM Mg2+溫育產(chǎn)生等量的復合物F和I；而24mM Mg2+不影響復合物的遷移率。另外，同EDTA溫育的樣品的EMSA(圖3B，泳道8)表明抑制了結(jié)合活性，這說明TAC框蛋白結(jié)合需要二價陽離子。我們的結(jié)果也顯示，用不含有Mg2+的緩沖液制備的細胞提取物不含有TAC框結(jié)合活性(未列出數(shù)據(jù))。
在低濃度Mg2+存在的情況下，于37℃溫育由誘出劑處理細胞制備的全細胞提取物，在其后的60分鐘溫育過程中(圖3C，泳道1-7)也監(jiān)測了復合物遷移率的變動。在這個階段，觀察到復合物S減少的同時，復合物I增加。另外，觀察到TAC框結(jié)合活性的總量減少。當此提取物同高濃度Mg2+溫育時，觀察到復合物遷移沒有變化。在總共60分鐘溫育過程中的30分鐘后加入Mg2+，防止所述結(jié)合活性的改變超出在前30分鐘內(nèi)發(fā)生的結(jié)合活性。再者，在EDTA存在的情況下于這些條件下溫育，發(fā)現(xiàn)抑制TAC框結(jié)合活性。純化TAC框結(jié)合因子用蛋白粗提物，如Miskimins等(Proc.Natl.Acad Sci.82:6741-6744,1985)所述，通過DNA-蛋白質(zhì)印跡法鑒定TAC框結(jié)合因子(TBBF)的幾次嘗試是不成功的。為進一步鑒定此結(jié)合活性的特征，我們用DNA親和層析純化TBBF。由誘出劑處理3小時的細胞制備的全細胞粗提物同ZNG緩中液中的魚精DNA混合，以結(jié)合非特異性DNA結(jié)合蛋白。將該復合物分為兩批并分別通過床體積為5ml的TAC框瓊脂糖凝膠柱。然后用含有0.1M KCl的ZNG緩中液流洗所述柱，以洗脫弱結(jié)合蛋白，并用含有0.5M KCl的ZNG緩沖液從所述固定化DNA親和柱上洗脫TBBF。將最初兩次流通液(稱之為FT1和FT2)和低鹽流洗液混合，并再次通過該柱以提取剩余的結(jié)合活性(圖4A)。使用(FT1)的EMSA表現(xiàn)出的TAC框結(jié)合活性比上該柱的粗樣品(E-3小時)少，這表明大百分率的所述DNA結(jié)合活性保留在柱上。在低鹽流洗過程中從該柱洗脫下的TBBF最少；然而，在0.5M KCl存在的情況下洗脫下了蛋白質(zhì)結(jié)合活性(圖5,1-3、7-8、12組分)。請注意，除了在層析前加入到所述提取物中的結(jié)合試樣，這些結(jié)合試樣不包含非特異性DNA。因此，魚精DNA存在于原始樣品、流通洗脫液(FT1和FT2)和低鹽流洗液中，但不存在于高鹽組分中。
初步實驗表明，甚至在所述高親和性結(jié)合位點被占用以后，所述親和純化的TBBF也能夠非特異性地結(jié)合DNA。所以，當存在的TBBF超過探針的量時，觀察到多種蛋白結(jié)合單一DNA片段。這導致形成階梯，每一梯級都比其低一梯級多含有一個結(jié)合蛋白。另外，通過對比不同量的高活性蛋白組分或通過加入非特異性DNA可目測該結(jié)果。因此，發(fā)現(xiàn)過量500倍的非特異性DNA(組分2+dI-dC)的存在減少了較高梯級(higher-order)復合物的數(shù)目，以致僅一個或兩個TAC框結(jié)合因子結(jié)合所述大部分探針。將加入所述結(jié)合試樣的TBBF的量減少90％(0.1X組分2)，與加入非特異性DNA有同樣的作用。最后，當用雙鏈寡核苷酸做探針時，發(fā)現(xiàn)甚至當存在過量的結(jié)合活性時也形成一個復合物(未列出數(shù)據(jù))。
混合含有所述結(jié)合活性的高鹽組分(～30ml)，并對沒有KCl的ZNG緩沖液透析，再超濾至大約5ml。通過SDS-PAGE和銀染這些加工的DNA親和層析組分和來自對照細胞的相似制品進行分析，顯示了5至7個多肽主帶(圖5，泳道2和6)。因為DNA-蛋白質(zhì)印跡分析不能鑒定作為TAC框結(jié)合蛋白的特定條帶，所以通過快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)進一步分級分離了所述部分純化的蛋白制品。
為確定用于此純化步驟的合適的離子交換柱，將等份的所述部分純化的TBBF與陽離子交換樹脂Q-瓊脂糖或陽離子交換樹脂S-瓊脂糖混合。離心并除去含有未結(jié)合蛋白的上清液后，用ZNG緩中液和含有1.0M KCl的ZNG緩沖液連續(xù)洗滌所述瓊脂糖。通過EMSA分析每一部分的所述結(jié)合活性，顯示TBBF結(jié)合S-瓊脂糖，而不結(jié)合Q-瓊脂糖(未列出數(shù)據(jù))。
然后將DNA親和層析純化的TBBF制品上Mono-S柱，并用線性KCl梯度的Z緩中液洗脫所述結(jié)合蛋白。如圖4B所示，同上該柱的(E-DAC-UF)樣品相比，相當于所述柱最初流通液的1至8組分僅含有少量的TAC框結(jié)合活性。雖然在低濃度KCl存在的情況下洗脫下的結(jié)合活性幾乎沒有，但當KCl水平達到大約150mM時，蛋白質(zhì)結(jié)合活性被快速洗脫下來(圖4B,22至24組分)?；旌线@些組分，脫鹽并通過超濾濃縮。然后將所述組分用甘油穩(wěn)定化并保存在-80℃。
用SDS-PAGE定性估價TBBF的純化，然后用銀染法目測所述分離的蛋白質(zhì)(圖5A)。來自對照細胞的FPLC純化樣品在17和19kD顯示了兩個大約等量的主帶。在16和20kD檢測出小多肽條帶(圖5A，泳道3)。來自誘出劑處理細胞的相似制品含有污染蛋白，但可以看見所述17和19kD多肽，這表明這些多肽是所述TBBF的主要組分。在使用由對照細胞和誘出劑處理細胞(圖5，對比泳道2和6)制備的提取物的DNA親和層析過程中，均發(fā)現(xiàn)23、31和37kD的多肽與TBBF共純化。在對照細胞制品中所述37kD條帶的減少量同誘出劑處理細胞的相比可能不重要，因為來自對照細胞的不同制品顯示存在較高量的這個條帶。來自對照細胞和誘出劑處理細胞的細胞核提取物也含有和純化TBBF的17kD條帶共遷移的強條帶，而和所述19kD多肽共遷移的細胞核提取物條帶相對較弱。
為了確定每步純化步驟之后回收的DNA結(jié)合活性的量，在過量濃度的含有所述TAC框DNA元件的雙鏈寡核苷酸存在下進行EMSA。盡管在純化過程中用來監(jiān)測結(jié)合活性的較大C片段探針對目測鑒定具有高水平結(jié)合活性的組分很有價值，但定量分析需要利用結(jié)合一種因子的探針。在這些定量分析中不存在非特異性競爭者DNA。因此，形成相似遷移復合物的非特異性DNA結(jié)合蛋白可能會引起粗提取物活性檢測稍微過高，但對所述純化制品則不會?？紤]到這些，分別將對照細胞和誘出劑處理3小時細胞中的TBBF至少純化750倍和461倍(表Ⅰ)。
所述純化蛋白的特征鑒定在定量足跡分析中也用FPLC純化的誘出劑處理3小時細胞的TBBF制品，以檢測所述結(jié)合活性的相對特異性，或所述TAC框?qū)τ诜翘禺愋訢NA的優(yōu)先性。在每個實驗中，在編碼鏈上標記C片段(8.8費摩爾)，并與增加量的TBBF溫育標記片段，而在實驗之間改變聚dI-dC和魚精DNA的量。DNaseⅠ處理并沉淀后，在測序凝膠上分離所述DNA并分析。
在圖6A中顯示了一系列增加TBBF量的代表性實驗，并通過實心方括號代表原足跡。我們觀察到由全細胞提取物純化的所述蛋白的足跡比細胞核粗提物的足跡大(圖2A)。此足跡清晰地從-232強條帶向下延伸到相當于-245的條帶，細胞核粗提物沒有保護二者中的任何一個。這個延伸的足跡包括恰好間隔10bp并因此位于螺旋同一面的兩個ACTC基元。我們也觀察到在很大量TBBF(短劃方括號)存在的情況下，在大約-275處的DNaes Ⅰ敏感模式有輕微的變化。這個區(qū)域有核苷酸序列TAaAGTAaT(小寫字母指非配對核苷酸)，該序列在9個位置中的7個配對所述核心TAC框序列。
定量分析顯示，隨著所述蛋白濃度的增加，結(jié)合探針的百分率增至100％(圖6B)。魚精DNA(fs DNA)抑制所述探針結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)其分解常數(shù)(Kd)的增加程度超過dI-dC，可推測是由于魚精子DNA中隨機出現(xiàn)的所述TAC框元件。在所有檢測條件下，所述Kd范圍從1.5×10-10M至1.5×10-9M。TAC框元件作為沉默子起作用構(gòu)建含有啟動子融合物的轉(zhuǎn)基因煙草植物，所述啟動子與β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)編碼區(qū)融合，以評價所述TAC框的功能(圖7A)。所述嵌入基因融合物由EAS4 5′-非翻譯區(qū)和EAS4轉(zhuǎn)錄起始位點的上游266核苷酸構(gòu)成，并包括或者野生型或者突變的TAC框。將F1植物培養(yǎng)至10至12片葉的階段，用水(對照)和1μg/ml隱配基溶液浸潤兩片完全伸展的葉片的中脈的背面，所述隱配基為煙草中防御反應(yīng)誘出劑。12小時后，從浸潤區(qū)切下直徑為2.5厘米的葉圓盤，用研缽和研杵將其在GUS分析緩中液中勻漿，并測定蛋白提取物的GUS活性。
如表Ⅱ和圖7B所示，當用水浸潤時，用野生型啟動子轉(zhuǎn)化的植物品系的葉含有的GUS活性最小，而誘出劑處理后水平大約高出11倍。除了比包含野生型啟動子的轉(zhuǎn)基因植物中的絕對活性水平高出2到3倍外，包含GUS基因上游突變啟動子的植物品系表現(xiàn)出相似的表達模式。在對對照和誘出劑處理的應(yīng)答中都注意到這種GUS活性的增加。這些結(jié)果表明，在所述截短的啟動子的前后序列內(nèi)，所述TAC框元件起抑制基因表達的作用。
表Ⅱ
上述實驗是用下述技術(shù)進行的。寡核苷酸和探針按照標準方法合成寡核苷酸，并用在所述EAS4啟動子中的位置(數(shù)字)和編碼鏈(c)或非編碼鏈(n)代表(參見以下和圖1A)。小寫字母表示的堿基相應(yīng)于用來加入限制位點或加入的突變的非同源堿基(n是A、T、G或C)。-740c gggctgcAGGCGTAAAGATACATTATACC(SEQ ID NO:7)-571c gggctgcAGGTGAATGTCAGGGCTTATGC(SEQ ID NO:8)-526n CTGGCAGGGCATAAGTATCG(SEQ ID NO:9)-349c GggcTgcAGTTCATCAAAGTGGACTCTGC(SEQ ID NO:10)-266c GggcTgcagATTTGATAGTTCCAGGAAAC(SEQ ID NO:11)-233n AGTAGTGTAGAnTTGTTTCC(SEQ ID NO:12)-160c GgnnnnnnGATCAATAGACC(SEQ ID NO:13)-147n gGGCtgCaGGGGTCTATTGATCCAGTTTCC(SEQ ID NO:14)+76n GgGGatccTGCTAATTAAAGATGAGTG(SEQ ID NO:15)TAC-M2n CAAAATAAGGGAGTACacTAGAGTTGTTTCC(SEQ ID NO:16)dsTACcagctACTCTACAGTACTC(SEQ ID NO:17)dsTACnagctGAGTACTGTAGAGT(SEQ ID NO:18)
用γ-32p-ATP末端標記寡核苷酸引物，并用下述末端標記引物通過標準聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)流程合成放射性標記DNA片段。總體積為10微升的標記引物反應(yīng)包含25皮摩爾寡核苷酸、1μl 10×T4激酶緩沖液(0.5M Tris-HCl pH7.60、1M MgCl2、50mM DTT、1mM亞精胺HCl、1mM EDTA)、25μCiγ-32P-ATP(3000Ci/毫摩爾)和10單位T4激酶。于37℃溫育30分鐘后，在所述PCR反應(yīng)中加入下述組分至最終體積為50微升5μl dNTPs(2.5mM)、5μl 10x激酶-PCR過渡緩中液(transition buffer)(20mM Tris pH9.5、0.5M KCl、0.1％吐溫-20、0.1％明膠、0.1％乙基苯基聚乙二醇)、1至10毫微克模板DNA(克隆于pBluescript的EAS4啟動子)，1單位Taq聚合酶(Gibco-BRL)、50皮摩爾第二寡核苷酸(未標記)和水。于50℃退火溫度進行32個熱循環(huán)。在非變性12％(80∶1)聚丙烯酰胺凝膠中分離PCR產(chǎn)物，然后將其在Kodak X-Omat AR膠片上曝光30秒至2分鐘，檢查所述探針在所述凝膠中的位置。從所述凝膠上切下放射性標記片段，包埋在1％瓊脂中，然后將所述放射性標記片段電泳到DE-81紙(Whatman)或NA-45濾膜(Schleicher和Schuell)上。下一步，在洗脫液(20mM TrispH8.0、2mM EDTA、1.5M NaCl)中于60℃從所述紙或膜上洗脫所述放射性標記探針2小時，并用2體積95％乙醇沉淀。制備提取物如Vogeli和Chappell(Plant physiol.94:1860-1866,1990)所述，用誘出劑(0.1μg/ml纖維素酶)處理煙草細胞懸浮培養(yǎng)物，并如Watson和Thompson(Meth.Enzymol.118:57-75,1986)所述從這些培養(yǎng)物中分離細胞核，并按照Dignam等(Nucl.AcidsRes.11:1475,1983)提取。按照Arias等(Plant cell 5:485-496,1994)所述用玻珠打漿機(bead beater)制備純化TBBF的提取物。用Bio-Rad蛋白分析染料(Bio-Rad)通過Bradford方法檢測蛋白。
按Arias等(Plant cell 5:485-496,1994)所述方法修改方法如下制備全細胞提取物。用一大孔徑(～0.5mm)尼龍網(wǎng)過濾大約300毫升已培養(yǎng)2天的煙草細胞懸浮培養(yǎng)物，用200毫升冰冷的水洗滌所述細胞，稱重(大約75至100克)，并轉(zhuǎn)移到一冷凍的研缽中。將大約3克聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)噴到所述細胞上，然后用研杵將所述細胞磨碎。向所述細胞加入少量(～10毫升)冷勻漿緩沖液并繼續(xù)研磨。勻漿緩中液包含0.2M Tris、0.39M(NH4)2SO4、10mM MgSO4、20％甘油、2mM EDTA、5mM EGTA和2.5％葡聚糖硫酸酯，并用冰醋酸將pH值調(diào)至7.9。使用前立即將5mM DTT、1mM PMSF、2.5μg/ml抗蛋白酶、0.35μg/ml苯丁抑制素和0.4μg/ml胃蛋白酶抑制劑A加入到所述緩沖液中。將所述磨碎的細胞轉(zhuǎn)移到一大離心瓶中，隨后加入190毫升用來沖洗研缽和研杵的冷勻漿緩中液，并加入15滴辛醇以防止勻漿過程中起泡。用polytron以一分鐘8次的設(shè)定勻漿3次，在勻漿之間用冰冷卻。然后通過上述的大孔徑尼龍網(wǎng)過濾所述勻漿，并將濾液在10K(Sorvall SS34)離心7分鐘。在30至60分鐘內(nèi)，通過滴加4M(NH4)2SO4(pH7.0)使上清液成為0.9M(NH4)2SO4。攪拌30分鐘后，在(Sorvall SS34)中以15K將所述提取物離心30分鐘，并將上清液倒入一預(yù)冷燒杯中。在1小時內(nèi)，邊攪拌邊緩慢加入固體(NH4)2SO4(0.35g/ml勻漿液)和1M KOH(10μl/g(NH4)2SO4)，再攪拌所述勻漿液30分鐘，然后以15K(Sorvall SS34)離心45分鐘。在全細胞提取物透析緩沖液(50mm HEPES-KOH pH7.9、10mM EGTA、10mM MgSO4、20％甘油、5mM DTT、0.5mM PMSF)中再懸浮所述蛋白沉淀(以1克細胞45微升的比率)，所述透析緩中液包含4μg/ml胃蛋白酶抑制劑A、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、25μg/ml抗蛋白酶和35μg/ml苯丁抑制素，然后對透析緩中液過夜透析并更換兩次緩中液。電泳遷移率變動分析電泳遷移率變動分析(EMSA)包含總體積為10微升的10mM Tris(pH7.9)、80mm NaCl、1mM EDTA、1mm DTT、5％甘油、5至25費摩爾探針(10,000-50,000dpm)。在相應(yīng)圖示說明中顯示了蛋白和非特異性競爭者DNA的量。于室溫溫育樣品5至10分鐘，然后上12％丙烯酰胺∶bis(80∶1)非變性凝膠。所述凝膠于4℃在0.5X TBE緩沖液中電泳。足跡法如Baldwin所述(載于Ausubel等，分子生物學現(xiàn)行方案，JohnWiley & Sons，紐約，1994)用細胞核提取物進行甲基化干擾實驗。
用于DNaseⅠ足跡法的細胞核粗提物使用用于甲基化干擾的類似方法。向50微升結(jié)合樣品緩中液中加入MgCl2(至5mM)和2微克DNaseⅠ，于室溫溫育所述反應(yīng)物2分鐘，并通過加入2微升0.5M EDTA終止反應(yīng)。通過EMSA分離結(jié)合和游離的DNA，如上述分離，并在6％聚丙烯酰胺測序凝膠上電泳。用Brenowitz等(載于Short Protocols inBiology,Ausubel等，編輯，John Wiley & Sons，紐約，1992)所述步驟完成使用純化的TBBF的足跡定量分析。定點誘變依據(jù)Kunkel等(Meth.Enzymol.154:367,1987)所述方法進行定點誘變。設(shè)計誘變寡核苷酸，以使成功突變的質(zhì)粒失去TAC框內(nèi)的ScaⅠ限制性酶識別位點(5′AGTACT3′)。純化TAC框結(jié)合因子DNA親和層析基本按照Kadonaga和Tjian所述(Proc.Natl.Acad.Sci.83:5889-5893,1986)制備TAC框DNA-瓊脂糖。凝膠純化寡核苷酸(dsTAC和dsTACn)，退火，將其連接為多聚體，并偶聯(lián)至5毫升(床體積)溴化氰-活化瓊脂糖(Sigma)。得到的親和基質(zhì)包含大約400μg DNA/5ml瓊脂糖。
用冷ZNG緩沖液稀釋包含50至200毫克蛋白的全細胞粗提物，并以0.3-0.5毫克“魚精子”DNA(Amersham)/毫克蛋白在冰上培育30分鐘。除了省略甘油以加速所述層析和超濾步驟外，ZNG緩沖液(25mMHEPES-KOH pH7.8、12.5mM MgCl2、1mM DTT、0.1％乙基苯基聚乙二醇)同Kadonaga和Tjian所述(Proc.Natl.Acad.Sci.83:5889-5893,1986)Z緩沖液是一樣的。使蛋白-魚精子DNA復合物通過TAC框瓊脂糖柱，并且作為單一組分收集流通液(FT1和FT2代表)。然后用25ml補加0.1M KCl的ZNG緩沖液(低鹽洗液)，接著用25ml含有0.5M KCL的ZNG緩中液高鹽洗液流洗所述柱。收集所有組分并測定DNA結(jié)合活性。重復此步驟直至從全細胞粗提物中提取出所述大部分結(jié)合活性。將在EMSA中證實有DNA結(jié)合活性的組分混合，對ZNG緩中液透析，并通過超濾濃縮。
快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)將從DNA親和層析(上文)獲得的具有DNA結(jié)合活性的組分混合，上Mono-S柱(Pharmacia)，并用離子強度增加梯度的緩中液洗脫。緩沖液A同ZNG緩中液是一樣的；B緩中液還含有0.75M KCl。用下列梯度以0.5毫升/分鐘的流速洗脫蛋白4分鐘0％B；40分鐘0-33％B；20分鐘33-100％B；4分鐘100％B。收集1ml組分，并在EMSA分析前將等份試樣稀釋10倍。將在EMSA中證實有DNA活性的組分混合，對ZNG緩中液透析，并通過超濾濃縮。通過SDS-PAGE(Laemmli,Nature 227:680-685,1970)用Duracryl高拉伸強度丙烯酰胺(Millipore)從這些組分中分離蛋白，并用SilverStain Plus(Bio-Rad)銀染。轉(zhuǎn)基因植物和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)分析按照標準方法生產(chǎn)包含嵌合基因融合物的轉(zhuǎn)基因植物，所述嵌合基因融合物由EAS4 5′-非翻譯區(qū)和EAS4轉(zhuǎn)錄起始部位上游266個核苷酸構(gòu)成，包括或者野生型(5′CAACTCTACAGTACTCCC3′；SEQ ID NO:19)或者突變TAC框(5′CAACTCTAGTGTACTCCC3′；SEQ ID NO:20)，所述標準方法例如為Chappell等(轉(zhuǎn)錄控制序列及其應(yīng)用，分別于1995年5月18日、1995年6月6日和1995年12月22日申請的USSN08/443,639、08/471,983和08/577,483)和Chappell等(WO97/012076)描述的方法。用途本文所述核苷酸沉默元件及其結(jié)合因子可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種農(nóng)業(yè)用途。本文所述元件和結(jié)合因子提供了一個負調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物基因表達水平的方法。例如，可以將類異戊二烯合酶基因沉默元件(例如所述TAC框元件)克隆到任何啟動子區(qū)，作為減少或抑制植物基因表達的工具。沉默元件也可以用來調(diào)節(jié)與其轉(zhuǎn)錄方向和距其起始部位的距離無關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。如果需要，這種沉默元件的重復拷貝也可用于一個給定基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明的沉默元件可以位于將要轉(zhuǎn)錄的基因的5′或3′轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(例如Chappell等USSN08/443,639、08/471,983、08/577,483和WO97/012076中的EAS4:ParAl構(gòu)建物)。可以按照常規(guī)方法(例如本文所述的那些方法)監(jiān)測沉默元件減少或消除基因表達的效率。如果需要，也可以將編碼TBBF的基因引入到合適的宿主植物中，以調(diào)節(jié)與本發(fā)明沉默元件操作性地連接的基因的表達。按照本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法進行用于本發(fā)明的TBBF的分離和克隆。
如同具體并單獨指明通過引用結(jié)合到本文中一樣，將本說明書中提及的所有出版物和專利通過引用結(jié)合到本文中。
其它實施方案根據(jù)前述，顯然可以對本文所述的這項發(fā)明進行改變和修改，以適于不同的用途和條件。這樣的實施方案也在下述的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Board of Trustees of the University of Kentucky(ⅱ)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)錄沉默元件及其結(jié)合因子(ⅲ)序列數(shù)20(ⅳ)通信地址(A)收信人Clark & Elbing LLP(B)街道176 Federal street(C)城市波士頓(D)州馬薩諸塞(E)國家美國(F)郵政編碼02110(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for windows，版本2.0(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(ⅶ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?0/020,087(B)提交日期1996年6月13日(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名Paul T.Clark,Esq.
(B)注冊號30,162(C)參考/檔案號07678/008W01
(ⅸ)電訊資料(A)電話617-428-0200(B)傳真617-428-7045(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:NTACNNTACN 10(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CTACAGTACT 10(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TCTACAGTAC T 11(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:ACTCTACAGT ACTC 14(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1368個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:AAGCTTTACG AATTAGATGT AAAAAGACAC AAACTACTTA TATATATTAC CAAAGTAACT 60TGAAAGTTTA AAATTTCAAT TAGAACTATA GTAGGGTAAA ACTGTCTATT TAAAATCAGT120ATTTAAAAAG GCATGAGCGA AAGATGAGGC GTTTTATCTA ACACGAAGCG AGGTGTAAGC180CCCATGGTGT TTTATTTTTA TATTTTATAA ATTTATAAAA TCATTATATA AATCAGAAAA240ATACACTAAA ATTGTGAAAA GTTAAAGAAA ATTATAGAAT TAATATATAT ATATATATAT300ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT360GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT420ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA ATATATATAT ATATATATAT ATATATATAT480ATATATATAA ATGTATGTGT GTGTGTGTGT GTATCGCATG CGCGCGACCA TGCAACTTTT540TTTTCTTGAA AAAATAAAAG GCGTAAAGAT ACATTATACC TATGTCATCA AAACAATATA600AAAACTAGAG CGATACCAAA GGAAATTTTA AATTCAAAAA CTAACTTGAA ATTAATATAT660TTAAAATTTC ATTTTTTTTT GTGTGGAGAA AACAAAGCAT AACACTTTGC TTTGTAACAC720TTTGCCTAGG TGAATGTCAG GGCTTATGCT CCACGATACT TATGCCCTGC CAGTACACCT780CGCAGTGGGA CTCGCTGAAA AAACGTCTTT GTTGTGAGAA ATTGCAATTT TGAACCTCTA840CAATTTCGAC AAAACCTTGG TTCGTGAAAA CTGTTTGATT AACTTTTAGA CCATCCAGTC900AATTTAACTC TAAACTGACC TAAATAAATA CTACGTACAC TAGTCTTTAA GTTCATCAAA960GTGGACTCTG CATTAATAAT TGAAATTTAT GCCGCAACAA TGACATTAGG TTTTATAAAT 1020AAAGTAATAG GAATTTGATA GTTCCAGGAA ACAACTCTAC AGTACTCCCT TATTTTGTGC 1080CTTTTTAAAT AATATTATTC AGTTGACGAA ACAAATAAAT AAAATATTTG GGAAACTGGA 1140TCAATAGACC CCAGACGCCA ACAATGAATC AAAAGGCTGC TAGCTAGTGT AAAGTCTAGT 1200AAGGCAACTG GGAAATTAAA TGATTAGGTG CTTTTGATCA ATTACATTAA CTAGTCTCTC 1260ACCACTATAT ATACTTGTCC CTTCTCTTCC ATTTAAGTAG AGTTCCTTTC TTTCTTCCTT 1320AAAACTTAAA AGAACAAGTA AAAATACACT CATCTTTAAT TAGCAATG1368(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型both(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CTACAGTAC9(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型both(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GGGCTGCAGG CGTAAAGATA CATTATACC29(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學兩者(both)(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GGGCTGCAGG TGAATGTCAG GGCTTATGC29(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:CTGGCAGGGC ATAAGTATCG 20(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GGGCTGCAGT TCATCAAAGT GGACTCTGC29(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:11:GGGCTGCAGA TTTGATAGTT CCAGGAAAC29(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:AGTACTGTAG ANTTGTTTCC 20(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GGNNNNNNGA TCAATAGACC 20(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GGGCTGCAGG GGTCTATTGA TCCAGTTTCC 30(2)SEQ ID NO:15的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GGGGATCCTG CTAATTAAAG ATGAGTG 27(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CAAAATAAGG GAGTACACTA GAGTTGTTTC C 31(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:AGCTACTCTA CAGTACTC18(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:AGCTGAGTAC TGTAGAGT18(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CAACTCTACA GTACTCCC18(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CAACTCTAGT GTACTCCC18
權(quán)利要求
1．包括類異戊二烯合酶基因沉默調(diào)節(jié)元件的分離核酸序列。
2．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述分離核酸序列包含序列5′NTACNNTACN3′(SEQ ID NO:1)。
3．權(quán)利要求2的分離核酸序列，其中所述核苷酸序列包含5′CTACAGTACT3′(SEQ ID NO:2)。
4．權(quán)利要求2的分離核酸序列，其中所述序列包含5′TCTACAGTACT3′(SEQ ID NO:3)。
5．權(quán)利要求2的分離核酸序列，其中所述序列包含5′ACTCTACAGTACTC3′(SEQ ID NO:4)。
6．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述類異戊二烯合酶是倍半帖合酶。
7．權(quán)利要求6的分離核酸序列，其中所述倍半萜合酶是表-5-馬兜鈴烯合酶。
8．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述核酸序列是來自雙子葉植物。
9．權(quán)利要求8的分離核酸序列，其中所述雙子葉植物是茄科植物的一種。
10．權(quán)利要求9的分離核酸序列，其中所述茄科植物是煙草屬的一種。
11．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述核酸序列是來自單子葉植物。
12．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述核酸序列是來自裸子植物。
13．權(quán)利要求1的分離核酸序列，其中所述核酸序列是來自松柏類植物。
14．包含權(quán)利要求1的核酸序列的載體。
15．權(quán)利要求15的載體，所述載體能夠在包含載體的細胞中使操作性地連接的核酸序列的表達沉默。
16．轉(zhuǎn)基因植物細胞，包含整合到所述植物基因組中權(quán)利要求1的分離核酸序列或權(quán)利要求14所述載體。
17．來自權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
18．來自權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因植物的細胞。
19．降低DNA序列在轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求14的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物細胞，所述核酸序列位于降低DNA序列轉(zhuǎn)錄的位置并整合到所述轉(zhuǎn)基因植物細胞的基因組中；和(b)由所述轉(zhuǎn)基因植物細胞培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及核苷酸調(diào)節(jié)序列及其結(jié)合因子。
文檔編號C07H21/00GK1227608SQ97197140
公開日1999年9月1日 申請日期1997年6月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月13日
發(fā)明者J·查普爾, J·D·紐曼, S·－H·殷 申請人:肯塔基州州立大學托管委員會