專利名稱：脫水河豚毒素的提取方法
技術領域：
本發(fā)明是一種海洋生物活性物質(zhì)的分離提取方法，屬于天然生物產(chǎn)品提取技術領域。
脫水河豚毒素(Anhydrotetrodotoxin，Anh-TTX)是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，其分子式和結構式如下分子式C11H15O7N3，分子量301．27．結構式
河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是存在于河豚魚體內(nèi)的一種有毒物質(zhì)，脫水河豚毒素是河豚毒素的衍生物，一般情況Anh-TTX與TTX存在于同一生物體中，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟、皮膚和腸胃中，在蝦虎魚、螺類、章魚、蟹類、和海星等，海生陸產(chǎn)的兩棲類、軟體動物、節(jié)肢動物等都已檢測到Anh-TTX，并發(fā)現(xiàn)Anh-TTX可能來源于一些細菌如弧菌、假單胞菌等。
Anh-TTX是生物細胞Na+通道的阻斷劑，其毒力僅為TTX的1％，其LD50為986ug／kg(ⅳ．小鼠)，其生理作用是快速可逆地阻斷Na+通道，所以，可廣泛用于神經(jīng)生物學和生理學及其他科學研究。
Anh-TTX雖然分布于多種生物中，但在生物體內(nèi)含量極小，約為百萬分之一至千萬分之一。由于Anh-TTX與TTX分子結構、分子量及理化性質(zhì)非常接近，提取TTX時總是含混有Anh-TTX，所以，要單一提取Anh-TTX非常困難，目前尚未見有單一提取Anh-TTX的報道。
本發(fā)明的目的是利用純化TTX后，富集有Anh-TTX的廢棄母液為原料，從而建立一種分離精制Anh-TTX的有效方法，使制備出Anh-TTX中不含有TTX，從而為科學研究提供一種新的制劑，并做到廢物利用，降低成本。
本發(fā)明的主要內(nèi)容一種脫水河豚毒素的提取方法，使Anh-TTX等富集于母液中，以此廢棄的母液為原料，用高壓液相色譜分離提取Anh-TTX，再用陽離子交換樹脂、生物凝膠脫鹽，回收Anh-TTX，使得到Anh-TTX的純度達到97％以上，且不含TTX。
一種分離精制脫水河豚毒素的方法，按下列步驟提取(1)純化河豚毒素母液制備先將粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加無水乙醇1-10倍，離心除去不溶物，然后將上清液移到小燒杯、貯藏在密閉的容器中，并另放一杯乙醚，控制溫度5-35℃、12-72小時，最后將醇醚溶液經(jīng)離心分離出河豚毒素母液，母液經(jīng)濃縮，加氨水調(diào)節(jié)PH7-10，收集其沉淀物(2)高壓液相色譜分離提取脫水河豚毒素將上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流動相組成含有0．1-10％甲醇的0．01-0．2M磷酸鹽緩沖液，調(diào)PH為5．7，流動相流速1-20ml／min，用示差檢測器進行檢測，分離過程按記錄儀上出峰圖，收集脫水河豚毒素餾份；(3)脫水河豚毒素餾份的脫鹽、回收選用填料為酸性陽離子交換樹脂和生物凝膠，洗脫劑用1-20％的醋酸，收集PH4-7餾份，加氨水調(diào)節(jié)PH7．5-10，可沉淀出脫水河豚毒素，經(jīng)反復脫鹽，可得到純品脫水河豚毒素結晶。
脫水河豚毒素的具體分離提取方法為一、Anh-TTX的富集取粗品TTX10-2000mg，溶于0．5-40ml1-20％HAC中，在此溶液中邊攪拌，邊加入1-80ml無水乙醇，離心除去不溶物，把溶液移到燒杯中，貯藏在密閉的容器中，并放上一瓶乙醚溶液。當乙醚向TTX-HAC-ETOH-H2O溶液擴散時，導致TTX結晶出來，離心收集上清液，濃縮后加入NH4OH調(diào)節(jié)PH7-10，即可得到沉淀物。
二、脫水河豚毒素(Anhydrotetrodotoxin，Anh-TTX)的HPLC分離提取。
①制備柱150-400×10-40mm②固定相反相硅膠C18③洗脫液為含0．1-10％甲醇的磷酸鹽緩沖液，PH5．7④示差檢測器檢測⑤泵壓力100-2500PSi⑥分離過程按記錄儀上Anh-TTX峰圖收集鎦份。
三、Anh-TTX的脫鹽、回收①交換柱200-600×10-400mm②固定相為酸性陽離子交換樹脂和P2生物膠。
③洗脫劑為1-20％HAC④洗脫餾份按每份0．5-5ml收集⑤以PH試紙對收集餾份進行PH測定⑥對PH4-7餾份加NH4OH調(diào)節(jié)PH至7．5-10，可得到沉淀物。
⑦沉淀物水洗、真空干燥。
上述樣品經(jīng)反復進行HPLC-離子交換、凝膠工藝即可得到Anh-TTX結晶，且不含TTX。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果。
生物體內(nèi)Anh-TTX含量極微，提取難度大，選用醇醚擴散法純化TTX，不僅可以提高TTX純度，同時可使Anh-TTX等(TTX的衍生物)富集于母液中，以此母液為原料，不但提高Anh-TTX提取率，并做到廢物利用，降低成本。
本發(fā)明建立HPLC-離子交換、凝膠工藝，使Anh-TTX與TTX得到徹底分離和有效的回收是Anh-TTX提取的一大突破。
下面敘述
具體實施例方式實施例一1、Anh-TTX原料液的富集a．粗TTX0．1克，加5％HAC5ml溶解。
b．TTX溶解液邊攪邊加無水乙醇25ml離心(4000轉(zhuǎn)／min)30分鐘，去除不溶物。
c．醇溶液移到燒杯，放在密閉的容器中，并另放盛有50ml乙醚的燒杯一只，控制溫度在10℃，時間18小時。
d．醇醚溶液經(jīng)離心，收集其上清液。
e．上清液濃縮后，加氨水調(diào)PH8．0，產(chǎn)生沉淀，并吸出清液。
f．沉淀物水洗三次。
g．沉淀物冷凍干燥，得沉淀物15mg。
2、Anh-TTX分離提取a．制備型高壓液相色譜儀1臺，制備柱200×10mm，內(nèi)裝C18，流動相為5％甲醇的0．08M磷酸鹽緩沖液PH5．7，示差檢測，壓力600PSi、流速3ml／min。
b．取含Anh-TTX的沉淀物15mg，加30％磷酸0．5mg溶解，進樣分離。
c．Anh-TTX出峰圖收集餾份30ml。
3、Anh-TTX脫鹽回收。
a．離子交換柱400×30mm，內(nèi)裝弱酸性陽離子交換樹脂50g。
b．含Anh-TTX餾份30ml，加入交換柱，流速1ml／min。
c．用12％HAC洗脫、收集PH4-7餾份25ml。
d．加氨水調(diào)節(jié)PH8．5，收集沉淀物。
e．沉淀物經(jīng)水洗、冷凍真空干燥，得Anh-TTX5mg。實施例二1、Anh-TTX原料液的富集a．取粗品TTX2克，加20％HAC50ml溶解b．a(chǎn)溶液邊攪拌邊加入無水乙醇400ml以4000轉(zhuǎn)／分離心分離上述溶液60分鐘，得上清液。
c．b溶液，連同另盛有400ml乙醚的燒杯，一同置于密閉容器中，恒溫30℃，經(jīng)72小時，溶液再經(jīng)4000轉(zhuǎn)／分離心分離不溶物，得溶液C。
d．溶液C經(jīng)濃縮后，加入氨水調(diào)節(jié)PH9靜置，得沉淀物。
e．d沉淀物水洗三次。
f．e沉淀物冷凍真空干燥得Anh-TTX粗品400mg2、Anh-TTX分離提取a．色譜條件如下制備型高壓液相色譜儀一臺，制備柱400×40mm，填料C18，流動相10％甲醇的0．2M磷酸鹽緩沖液PH5．7，示差檢測器，柱壓力800Psi，流速20ml／分。
b．取400mg粗品Anh-TTX溶于2ml30％磷酸c．取b溶液進樣分離，根據(jù)色譜圖收集Anh-TTX餾份500ml3、Anh-TTX脫鹽回收a．分離柱600×40mm，填料P2生物凝膠。
b．加入含Anh-TTX溶液500ml，流速3ml／分。
c．以20％HAC洗脫，收集4-7溶液300ml。
d．c溶液加氨水調(diào)節(jié)PH9．5，收集沉淀物。
e．沉淀物水洗三次。
f．沉淀物冷凍真空干燥，得Anh-TTX半成品100mg。
4、Anh-TTX精制取Anh-TTX半成品100mg，按上述HPLC-凝膠脫鹽工藝，可得純度97％以上的Anh-TTX60mg，且不含有TTX。
權利要求
1.一種提取脫水河豚毒素的方法，其特征在于按下列步驟提取(1)純化河豚毒素母液制備先將粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加無水乙醇1-10倍，離心除去不溶物，然后將上清液移到小燒杯，貯藏在密閉的容器中，并另放一杯乙醚，控制溫度5-35℃、12-72小時，最后將醇醚溶液經(jīng)離心分離出河豚毒素母液，母液經(jīng)濃縮，加氨水調(diào)節(jié)PH7-10，收集其沉淀物；(2)高壓液相色譜分離提取脫水河豚毒素將上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流動相組成含有0．1-10％甲醇的0．01-0．2M磷酸鹽緩沖液，調(diào)PH為5．7，流動相流速1-20ml／min，用示差檢測器進行檢測，分離過程按記錄儀上出峰圖，收集脫水河豚毒素餾份；(3)脫水河豚毒素餾份的脫鹽、回收選用填料為酸性陽離子交換樹脂和生物凝膠，洗脫劑用1-20％的醋酸，收集PH4-7餾份，加氨水調(diào)節(jié)PH7．5-10，可沉淀出脫水河豚毒素，經(jīng)反復分離提取和脫鹽，可得到純品脫水河豚毒素結晶。
全文摘要
本發(fā)明是一種提取脫水河豚毒素的方法,所用原料為純化河豚毒素的母液,經(jīng)高壓液相色譜分離,再經(jīng)離子交換樹脂、生物凝膠脫鹽回收得到的脫水河豚毒素結晶。用此方法精制的脫水河豚毒素中,不含有河豚毒素。脫水河豚毒素是快速可逆的鈉離子通道阻斷劑,可廣泛應用于神經(jīng)生物學和生理學及其他科學研究。目前國際上無此產(chǎn)品。
文檔編號C07D491/22GK1206009SQ9810259
公開日1999年1月27日 申請日期1998年7月9日 優(yōu)先權日1998年7月9日
發(fā)明者黃致強, 王寶君, 黃海楓 申請人:河北省水產(chǎn)研究所