專利名稱：一種從混合物中分離胸苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，涉及一種從混合物中分離胸苷的方法。
胸苷，(代號dT)是一種重要的生化試劑，在生物化工領域的研究和生產中有著十分廣泛的應用。近年來，由于愛滋病在全球蔓延，嚴重威脅著人類的生命，因此抗愛滋病毒藥物的開發(fā)研究得到了人們的關注，胸苷是制備抗愛滋病藥——疊氮胸苷(AZT)的重要原料，無論作為生化試劑還是作為制備疊氮胸苷(AZT)的原料，其含量必須在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超過0.3％。目前胸苷的制備主要有化學合成和DNA酶解兩種方法，所得到的胸苷粗品中含有大量的雜質由化學合成法所得到的胸苷粗品中含有油狀物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，酶解法所得到的胸苷粗品中則含有脫氧腺苷(dA)，脫氧胞苷(dC)，脫氧烏苷(dG)，脫氧肌苷(dI)等雜質，如何從胸苷的混合物中分離出高純度的胸苷，則成為許多科技人員所關注的課題。
目前，化學合成法所得胸苷粗品的常用分離方法是這樣的先蒸發(fā)除去溶劑，然后加甲醇或乙醇溶解，滴加乙酸乙酯，加熱回流，冷卻結晶，從而獲得胸苷產品，該方法由于反復結晶，收率低，色澤差，5-甲基尿苷的含量高，且結晶母液不能回收；文獻(E.查加夫，J.N.達達伏生《核酸》第1卷，19，279頁)公開了一種在硼酸鹽系統(tǒng)中利用強堿陰離子交換層析法分離胸苷的方法，但是，該方法不能去除雜質和色素，不適宜于工業(yè)化生產。因此，必須盡快研究開發(fā)一種高收率、適宜于工業(yè)化生產的分離胸苷的方法，以滿足工業(yè)生產的需要。
本發(fā)明的目的在于公開一種采用大孔弱酸性陽離子交換樹脂和大孔弱堿性陰離子交換樹脂吸附和加入硼酸鹽以去除胸苷溶液中的雜質，從而獲得高純度胸苷的方法，以期克服現(xiàn)有技術所存在的缺點，滿足工業(yè)生產的需要，本發(fā)明所得胸苷的含量可達98％以上，且能適宜于工業(yè)化生產。
由于胸苷混合物的來源不同，因而混合物中胸苷的含量也不同，雜質的種類也不同，根據(jù)不同的胸苷混合物和產品要求，發(fā)明人依據(jù)大量的試驗，提出如下去除雜質的構思(1)對于采用化學法合成的胸苷混合物，先用大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂吸附混合溶液中大部分色素和少量雜質，然后再用大孔弱堿性離子交換樹脂吸附混合溶液中剩余少量的色素和大量的雜質，如5-甲基尿苷等胸苷衍生物，同時在溶液中或結晶時加入少量的硼酸鹽，使其與殘留于溶液中的少量5-甲基尿苷形成絡合物，增加其溶解度，通過常規(guī)的結晶方法即可獲得高純度的胸苷產品；(2)對于采用DNA酶解法獲得的胸苷混合物，則先用強酸性陽離子交換樹脂除去大部分dG，dC，dI，dA等雜質，然后再用(1)的方法獲得高純度的胸苷。
(3)對于僅含少量5-甲基尿苷的胸苷混合物，可直接加入少量硼酸鹽，降低產品中5-甲基尿苷的含量，然后通過常規(guī)的結晶方法而獲得高純度的胸苷產品。
本發(fā)明亦是這樣實現(xiàn)的由5-甲基尿苷為原料合成的胸苷粗品中含有胸苷50％、5-甲基尿苷10％和其它雜質，將含有雜質的胸苷粗品固體溶解于去離子水中，其水溶液呈深棕色，并有油狀物和懸浮物，將該水溶液以40～60ml/h的流速流過大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱，除去大部分的油狀物、懸浮物、色素及部分胸苷衍生物，常用的陽離子交換樹脂為市售的HD-1、122、125等，其用量為dT∶樹脂＝1∶6(W∶V)；然后再以40～60ml/h的流速流過大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱，除去剩余的色素及胸苷衍生物，常用的大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂為市售的D301、D309、D396、D351、709、710A、710B、Amberlite IRA-63、IRA-93、IRA-94、IRA-943、Amberlyst -A-21、XE-1003、Diaon WA-20、WA-21、Lewatit MP-60、Duolite A-305等，其用量為dT∶樹脂＝1∶12(W∶V)。上述弱酸陽離子交換樹脂柱和弱堿陰離子交換樹脂柱相互串聯(lián)，連成一體。串聯(lián)通過兩柱后流出的為無色或淡黃色胸苷水溶液，絕大部分的雜質已被吸附除去，該水溶液采用常規(guī)的濃縮、結晶、干燥方法，即可獲得含量高于98％的胸苷結晶體。為了有效地除去溶液中的5-甲基尿苷，可在胸苷粗品的水溶液中或在結晶時加入少量硼酸鹽，如四硼酸鈉等，使胸苷結晶體的純度達到99％以上。硼酸鹽加入量為5-甲基尿苷∶硼酸鹽＝1∶0.1～1，最佳為1∶0.3～0.5(質量比)。由于弱酸陽離子交換樹脂和弱堿陰離子交換樹脂不吸附胸苷，因此胸苷的回收率幾乎可達100％，而結晶母液可再次通過上述方法加以回收。
對于由DNA酶解法所獲得的胸苷粗品，因其中含有dG，dC，dI，dA等雜質，故可使該胸苷粗品的水溶液先通過強酸性陽離子交換樹脂，以先除去其中的dG，dC，dI，dA等雜質，然后再以上述方法獲得高純度的胸苷結晶體，回收率亦可達到95％以上，常用的強酸性陽離子交換樹脂為市售的732、001×7、001×6、001×8、Amberlite IR-12等。
對于僅含有少量5-甲基尿苷的胸苷，則可直接加入少量硼酸鹽，如四硼酸鈉等，使胸苷結晶體的純度達到99％以上。硼酸鹽加入量為5-甲基尿苷∶硼酸鹽＝1∶0.1～1，最佳為1∶0.3～0.5(質量比)。
下面將結合附圖進一步闡明本發(fā)明的內容。


圖1為分離提純化學合成法得到的胸苷粗品的工藝流程簡圖。
其中1————大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱2————大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱3————濃縮釜4————結晶器5————過濾器將溶于水中的胸苷粗品或結晶母液按序流過大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱1、大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱2，其流速控制在40～60ml/h左右，流出陰離子交換樹脂柱的胸苷溶液進入濃縮釜3濃縮，在結晶器4中結晶，通過過濾器5可得到高純度的胸苷晶體；由于濃縮、結晶、過濾為現(xiàn)有技術，此處不再贅述。為了獲得高純度的胸苷晶體，可在溶液中或結晶時加入少量硼酸鹽，一般加入量為5-甲基尿苷∶硼酸鹽＝1∶0.1～1，最佳為1∶0.3～0.5。
圖2為分離提純酶解法得到的胸苷粗品的工藝流程簡圖。其中6————強酸性陽離子交換樹脂柱將溶于水中的胸苷粗品或結晶母液按序流過強酸性陽離子交換樹脂柱6、大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱1、大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱2，其流速控制在40～60ml/h左右，流出陰離子交換樹脂柱的胸苷溶液進入濃縮釜濃縮3，在結晶器4中結晶，通過過濾器5即可得到高純度的胸苷晶體。
下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，由于強酸性陽離子交換樹脂7、大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂1和大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂2的種類繁多，有關的工程技術人員可以按照本發(fā)明所公開的構思和技術方案，舉一返三地實現(xiàn)本發(fā)明，故實施例本身并不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1將15克含有50％胸苷、10％5-甲基尿苷和其它雜質的胸苷粗品溶于120ml去離子水中，將此胸苷溶液以40ml/h的流速流過HD-1陽離子交換樹脂柱1和D315陰離子交換樹脂柱2，HD-1的用量為45ml，柱的直徑為12mm，柱的長度為600mm，D315的用量為90ml，柱的直徑為20mm，柱的長度為600mm，上樣完畢，再加入200ml去離子水，將留在柱中的胸苷溶液排出。開始流出的為100ml的水，接著流出的為300ml的胸苷溶液，回收率為95％，濃縮后加入0.4克四硼酸鈉，結晶、過濾和干燥后可得胸苷4.5克，含量99.2％，結晶母液可按上述方法再次回收胸苷1.8克，二次總得率為84％。
實施例2稱取結晶母液54.7公斤，其中胸苷含量為19％，5-甲基尿苷含量為7％，在此溶液中加入1公斤硼酸鈉，用去離子水稀釋至200L。然后以60L/h的流速流過過HD-1陽離子交換樹脂柱和D315陰離子交換樹脂柱，HD-1的用量為90L，柱的直徑為400mm，柱的長度為2000mm，D315的用量為120L，柱的直徑為400mm，柱的長度為2000mm，然后再加入去離子水，將留在柱中的胸苷溶液排出，收集柱中排出的溶液，胸苷回收率為99％，濃縮后加入1公斤四硼酸鈉、結晶、干燥后可得胸苷5公斤，含量99.6％，結晶母液可按上述方法再次回收，二次總得率為70％。
實施例3稱取由DNA酶解法制備的胸苷溶液160ml，其中含有2克胸苷以及dA、dC、dG、dI等雜質，將此溶液先流過732強酸性陽離子交換樹脂30ml，然后再以60L/h的流速按序流過HD-1陽離子交換樹脂柱和D315陰離子交換樹脂柱，HD-1的用量為30ml，柱的直徑為12mm，柱的長度為600mm，D315的用量為120ml，柱的直徑為12mm，柱的長度為60mm，然后再加入去離子水，將留在柱中的胸苷溶液排出，收集柱中排出的溶液，經濃縮、結晶、干燥后可得胸苷14克，含量98.2％，得率為70％。
實施例4采用與實施例1相同的原料，工藝參數(shù)和交換柱，采用122陽離子交換樹脂和D301陰離子交換樹脂，可得胸苷6.1克，含量99.3％，得率81％。
實施例5采用與實施例1相同的原料，工藝參數(shù)和交換柱，采用125陽離子交換樹脂和D709陰離子交換樹脂，可得胸苷6.0克，含量99.7％，得率80％。
實施例6采用與實施例1相同的原料，工藝參數(shù)和交換柱，采用HD-1陽離子交換樹脂和Amberlite IRA-63陰離子交換樹脂，可得胸苷6.2克，含量99.5％，得率83％。
實施例7采用與實施例1相同的原料、工藝參數(shù)和交換柱，結晶時不加硼酸鹽，可得胸苷6.1克，含量98.6％，得率82.0％。
實施例8采用與實施例1相同的原料、工藝參數(shù)和交換柱，結晶時不加硼酸鹽，而在原料溶液中加入四硼酸鈉0.15克，可得胸苷6.2克，含量99.0％，得率82.5％。
實施例9采用與實施例1相同的原料、工藝參數(shù)和交換柱，結晶時加入四硼酸鈉1.5克，可得胸苷6.3克，含量99.2％，得率82.6％。
權利要求
1.一種從混合物中分離胸苷的方法，主要包括雜質的去除、濃縮(2)、結晶(3)、過濾(4)過程，其特征在于雜質的去除是這樣進行的將含有雜質的胸苷水溶液按序流過兩根串聯(lián)的離子交換樹脂柱，所說的離子交換樹脂柱為大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱(1)和大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱(2)。
2.據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于含有雜質的胸苷水溶液首先流過一強酸性陽離子交換樹脂柱(6)，然后再流過大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂柱(1)和大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂柱(2)，常用的強酸性陽離子交換樹脂為732陽離子交換樹脂。
3.據(jù)權利要求1、2所述的方法，其特征在于所說的大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂為HD-1、122、125中的一種；所說的大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂為D301、D309、D396、D315、709、710A、710B、Amberlite IRA-63、IRA-93、IRA-94、IRA-943、Amberlyst-A-21、XE-1003、Diaon WA-20、WA-21、Lewatit MP-60、Duolite A-305中的一種，常用的為D315、D301或Amberlite IRA-63中的一種。
4.據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于結晶時或在胸苷的水溶液中加入硼酸鹽，常用的硼酸鹽為四硼酸鈉，使四硼酸鈉與5-甲基尿苷形成絡合物，加入量為5-甲基尿苷∶硼酸鹽＝1∶0.1～1(質量比)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化工技術領域,涉及一種從混合物中分離胸苷的方法。所說的方法將含有雜質的由化學合成法獲得的胸苷溶液按序流過大孔酚醛系弱酸陽離子交換樹脂和大孔弱堿丙烯酸系陰離子交換樹脂,并在溶液中加入適量的硼酸鹽,以提高胸苷產品的純度;對于酶解法所獲得的胸苷溶液,則可添加一個強酸性陽離子交換樹脂,以便更好地除去溶液中的雜質。本發(fā)明所述的方法,工藝簡單,產品得率高,純度可達99%以上,能夠滿足工業(yè)生產的需要。
文檔編號C07H1/06GK1190656SQ9811060
公開日1998年8月19日 申請日期1998年1月5日 優(yōu)先權日1998年1月5日
發(fā)明者邱蔚然, 邵任森, 邵學鋒 申請人:華東理工大學, 上海力博生物化工廠