專利名稱：核酸快速抽提方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，是采用較為簡便可靠的方法抽取臨床標(biāo)本DNA、RNA，再采用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法對其進行檢測。
一般情況下DNA、RNA的提取主要是采用強力變性劑如鹽酸胍或異硫氰胍或尿素-氯化鋰等來溶解蛋白質(zhì)，從而破壞細胞、病毒，并使核蛋白從核酸上解離下來，并滅活可能存在的RNA酶。在此基礎(chǔ)上可采用硅藻、玻璃粉吸附和解吸附或有機溶劑抽提、乙醇(異丙醇)沉淀法提取核酸。這一方法是目前從事RT-PCR的臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用的方法。
有機溶劑法的原理是強力變性劑與硫基乙醇聯(lián)合作用溶解蛋白滅活RNA酶，再加入乙酸鈉、飽和酚、氯仿-異戊醇抽取以變性蛋白，經(jīng)高速離心后得到上清，再以乙醇或異丙醇沉淀濃縮核酸再以75％乙醇洗滌沉淀和容器去除殘余鹽份，再經(jīng)烘干去除殘余乙醇，從而得到純凈的核酸。從以上實驗過程我們可以看到其優(yōu)點在與能有效去除蛋白，排除一些溶于有機溶劑的干擾反應(yīng)的物質(zhì)，而且可以有效地濃縮核酸，但是其缺點也非常明顯，首先是操作非常繁瑣，有機溶劑抽提后取上清的過程必須小心謹慎，通常的小體積操作時很容易吸到或碰到導(dǎo)致實驗失敗的界面處的蛋白及有機溶劑；為了濃縮核酸，往往要加入一定量的助沉淀劑，有時會造成或大或小的影響；乙醇的洗滌過程仍屬小心操作，以免沉淀的丟失；整個過程中至少需要三次較長時間的離心。
硅藻、玻璃粉吸附的原理是高鹽的強力變性劑作用下溶解蛋白、滅活RNA酶，核酸與同步加入的硅藻或玻璃粉吸附，經(jīng)離心后小心吸盡上清，再以高鹽的強力變性劑溶液洗滌，經(jīng)離心后小心吸盡上清，再以乙醇、丙酮等有機溶劑洗滌，經(jīng)離心后小心吸盡上清，烘干后即得吸附的核酸樣品，加入低鹽的反應(yīng)體系即可使核酸解吸附進入反應(yīng)液。這一方法的優(yōu)點在于所有的離心步驟都是一分鐘以內(nèi)的短時間，從而大大提高了實驗速度；不用酚氯仿的有機溶劑處理，從而避免了導(dǎo)致實驗失敗的一個重要影響因素。但這一方法仍有較大的缺點；其仍然需要離心步驟；上清的吸取必須徹底，否則可能導(dǎo)致實驗失敗，所以對操作的要求較高；由于吸附物質(zhì)性質(zhì)較為疏松，吸盡上清時很容易吸走吸附物質(zhì)而導(dǎo)致實驗失敗，因此有時需要反復(fù)操作；核酸濃度太低時，解吸附的比率較低，所以有時仍需加入tRNA等輔助核酸，以提高目標(biāo)核酸的得率，有時會造成或大或小的影響。
上述兩種方法最大的缺點在于其需要多次離心，它極大地限制了單位時間內(nèi)可處理的樣品數(shù)，而某些步驟需要的精心操作，不僅限制了單位時間內(nèi)可處理的樣品數(shù)，增大了操作人員的勞動強度，而且使得實驗的穩(wěn)定性受到威脅。
RNA抽提的方法還有采用去污劑與蛋白酶聯(lián)合作用標(biāo)本后，經(jīng)有機溶劑抽提，乙醇或異丙醇沉淀，75％乙醇洗滌最后得到純凈的核酸。該方法不僅有與強力變性劑方法同樣的缺點，比如多次離心，操作精度要求較高；有時需加助沉淀劑；操作失敗而導(dǎo)致假陰性的可能性較高等等；而且該方法RNA的得率較低，因為有可能標(biāo)本中的RNA酶在被蛋白酶消化或抑制前有時間發(fā)揮作用。
RNA抽提的簡便方法還有去污劑與蛋白酶聯(lián)合作用標(biāo)本或僅用去污劑作用標(biāo)本，然后直接經(jīng)100℃水浴煮沸后離心取上清作為核酸制備物。但這一簡便方法實際使用中發(fā)現(xiàn)其RNA酶不完全失活而穩(wěn)定性不高。
本發(fā)明的目的是研制一種試劑，用于核酸的抽提，從而取得提高檢測穩(wěn)定性和提高檢測效率的良好效果。
本發(fā)明研制出一種混合試劑，它們是50-90％濃度的乙醇和1-10％(V/V)焦碳酸二乙酯(DEPC)的混合液。該混合液以(0.8-1.2)∶(8-12)比例與血清或血漿或其它標(biāo)本混合均勻，再經(jīng)25-40℃水浴1-12分鐘后，在沸水浴中置放5-20分鐘，再打開試管蓋置于55-70℃水浴10-30分鐘即可發(fā)揮掉乙醇與DEPC及水份，目的是適當(dāng)濃縮樣品，最后經(jīng)12000-16000轉(zhuǎn)/分高速離心，一般5-15分鐘即可，所得上清即可用于PCR或RT-PCR的核酸溶液。
上述混合液中，乙醇更為合適的濃度是70-85％(V/V)，DEPC更為合適的濃度是5-9％(V/V)。
應(yīng)用該種溶液進行樣品處理，可有效抑制臨床標(biāo)本中所含RNA酶，其核酸溶液的質(zhì)量應(yīng)用于RT-PCR擴增的效果不差于強烈變性劑處理-有機溶劑抽提-乙醇沉淀法所得的核酸，甚至PCR檢測的靈敏度更高，從而使弱酸陽性的標(biāo)本檢出率穩(wěn)定更高。利用該方法進行樣品處理，操作的均一性較好，從而提高了實驗的穩(wěn)定性，使由于操作引起的假陰性率大大降低。該方法中離心只需一次，從而使單位時間內(nèi)樣品處理數(shù)得以提高，為大批標(biāo)本的處理提供了可能性，該方法中不引入tRNA等輔助核酸，從而避免了對實驗潛在的影響。該方法的操作時間比常規(guī)處理的方法大大縮短，使得實驗結(jié)果能更早得到，進一步體現(xiàn)出PCR的優(yōu)越性。該方法同樣適用DNA的抽提，從而僅進行一次處理，可同時進行DNA及RNA的檢測，為多種并發(fā)的病例的診斷提供了方便。
實施例1一、核酸制備配制90％乙醇、10％DEPC溶液，取5μl臨床標(biāo)本的50μl血清或血漿中，混合均勻，置37℃水浴10分鐘，然后轉(zhuǎn)入100℃沸水浴20分鐘，打開離心管蓋后置68℃水浴20分鐘后以15000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，上清液即為核酸溶液。二、反應(yīng)液配方10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液Tris.cl 250mM pH8.20(NH4)2SO4200mM明膠 1mg/ml10×逆轉(zhuǎn)錄底物HCV逆轉(zhuǎn)錄引物質(zhì)5μMdATP dTTP dGTP dCTP各2mM二硫蘇糖醇DTT 10mMMncl220mM耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶為復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己研制的FDTRT。5×PCR緩沖液Tris.cl 125mM pH8.20Kcl 250mM明膠 0.5mg/mlMgcl210mMFormamide 25％10×PCR底物HCV擴增引物P3、P4各5μMdATP dTTP dGTP dCTP各2mMEGTA 6mM耐熱DNA聚合酶為復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己研制的Taq DNAPolymerase。引物P2、P3、P4由Applied Biosgstems公司的381A型DNA合成儀合成PAGE純化，其核苷酸順序如下P2 5′-d(GGTGCACGGTCTACGAGACCT)-3′P3 5′-d(CTGTGAGGAACTACTGTCTTTC)-3′P4 5′-d(CCCTATCAGGCAGTACCACAA)-3′三、反應(yīng)過程1、按下列順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌的DEPC處理重蒸水14μl至離心管，再加入2μl10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μl10×逆轉(zhuǎn)錄底物，耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶4u，2μl制備的核酸溶液，混合均勻后離心片刻，加入液體石蠟30μl。2、置65℃～68℃水浴3～20分鐘后100℃沸水浴5分鐘備用。3、按下述順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌重蒸水12μl至離心管，再加入4μl 5×PCR緩沖液2μl 10×PCR底物，耐熱DNA聚合酶1u，2μl上述沸水浴后的下層水相中的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合均勻后離心片刻，加入液體石蠟30μl。4、置91～94℃ 30秒。5、按下述條件進行30～40次循環(huán)91℃～94℃ 20～30秒55℃ 20～30秒70℃～75℃ 20～30秒6、循環(huán)后置70～75℃ 0～5分鐘。四、產(chǎn)物檢測樣品取下層水相101μl加2μl 50％蔗糖、溴酚藍溶液，2％Agarose TAE電泳緩沖液電泳。五、結(jié)果及討論經(jīng)擴增后有257bpDNA片段為HCV陽性標(biāo)本，無257bpDNA片段者為HCV陰性標(biāo)本。
本實驗結(jié)果說明利用“快速核酸抽提液”獲得的核酸溶液。可以有效地應(yīng)用于RT-PCR檢測RNA樣品。實施例2一、核酸制備配制70％乙醇、5％DEPC溶液，取5μl加入臨床標(biāo)本的50μl血清或血漿中，混合均勻，置30℃水浴1分鐘，然后轉(zhuǎn)入100℃沸水浴5分鐘，打開離心管蓋后置60℃水浴10分鐘后13000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液即為核酸溶液。二、反應(yīng)配方10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液Tris.cl 250mM pH8.20(NH4)2SO4200mM明膠 1mg/ml10×逆轉(zhuǎn)錄底物HCV逆轉(zhuǎn)錄引物質(zhì)5μMdATP dTTP dGTP dCTP各2mMDTT 10mMMncl220mM耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶為復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己研制的FD TRT。5×PCR緩沖液Tris.cl 125mM pH8.20Kcl 250mM明膠 0.5mg/mlMgcl210mMFormamide 25％10×PCR底物HCV擴增引物P3、P4各5μMHBV擴增引物P5、P6各5μMdATP dTTP dGTP dCTP各2mMEGTA 6mM耐熱DNA聚合酶為復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己研制的Taq DNAPolymerase。引物P5 P6由Applied Biosgstems公司的381A型DNA合成儀合成PAGE純化，其核苷酸順序如下P5 5′-d(CTCGGATCCTTGTGACTTCTTTCCTT)-3′P6 5′-d(CGGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCT)-3′三、反應(yīng)過程1、按下述順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌的DEPC處理重蒸水14μl至離心管，再加入2μl10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μl10×逆轉(zhuǎn)錄底物，耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶4u，2μl制備的核酸溶液，混合均勻后離心片刻，加入液體石蠟30μl。2、置65℃～68℃水浴3～20分鐘后100℃沸水浴5分鐘備用。3、按下述順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌重蒸水12μl至離心管，再加入4μl5×PCR緩沖液，2μl10×PCR底物，耐熱DNA聚合酶1u，2μl上述沸水浴后的下層水相中的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，混合均勻后離心片刻，加入液體石蠟30μl。4、置91℃～94℃ 30秒5、按下述條件進行30～40次循環(huán)91℃～94℃ 20～30秒55℃ 20～30秒70℃～75℃ 20～30秒6、循環(huán)后置70℃～75℃ 0～5分鐘四、產(chǎn)物檢測樣品取下層水相10μl加2μl 50％蔗糖溴酚藍溶液2％Agarose TAE電泳緩沖液電泳五、結(jié)果及討論經(jīng)擴增后有257bp 441bp兩條DNA片段者為HBV HCV皆陽性標(biāo)本，僅有257bp DNA片段者為HBV陰性，HCV陽性標(biāo)本，僅有441bp DNA片段者為HBV陽性HCV陰性標(biāo)本，無257bp 441bpDNA片段者為HBV、HCV皆陰性標(biāo)本。
本實驗說明利用“快速核酸抽提液”獲得的核酸溶液，可以有效地應(yīng)用于RT-PCR或PCR同時檢測DNA及RNA樣品。
權(quán)利要求
1.一種核酸快速抽提方法，其特性在于用乙醇和焦碳酸二乙酯混合溶液，以一定比例與待測標(biāo)本均勻混合，經(jīng)水浴反應(yīng)，濃縮樣品，離心后，抽提完畢，上述過程具體條件如下(1)混合溶液中乙醇濃度是50-90％(V/V)，焦碳酸二乙酯濃度是1-10％(V/V)；(2)上述混合液以(0.8-1.2)∶(8-12)比例與待測標(biāo)本均勻混合；(3)與待測標(biāo)本混合后的溶液在25-40℃水浴下反應(yīng)1-12分鐘，再在沸水浴中置5-20分鐘；(4)在55-70℃水浴中揮發(fā)乙醇、焦碳酸二乙酯和水份，用以濃縮樣品；(5)高速離心，得上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸快速抽提方法，其特性在于混合液中乙醇和焦碳酸二乙酯更為合適的濃度分別是70-85％(V/V)，5-9％(V/V)。
全文摘要
本發(fā)明是一種核酸快速抽提方法?，F(xiàn)有技術(shù)中用強力變性劑溶解蛋白質(zhì),再采用硅藻、玻璃粉吸附和解吸附等方法提取核酸,但是操作繁瑣,多次離心等不足,經(jīng)常易導(dǎo)致實驗失敗。本發(fā)明研制了一種乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液,與一定比例的待測標(biāo)本混合,經(jīng)反應(yīng)、濃縮、離心后,即可得到用于PCR或RT－PCR的核酸溶液,方法簡單、可靠,不僅提高了標(biāo)本的檢測穩(wěn)定性,也大大提高了檢測效率。
文檔編號C07H1/00GK1189501SQ9811065
公開日1998年8月5日 申請日期1998年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月12日
發(fā)明者唐榕, 李曉芳, 毛裕民 申請人:復(fù)旦大學(xué)