專利名稱：新的人蛋白激酶c抑制蛋白編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的II型人蛋白激酶C抑制蛋白人PKCI-2的編碼序列，該序列編碼的蛋白是人體中天然存在的HIT家族的一個新成員，是人hPKCI的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
蛋白質(zhì)激酶C(protein kinase C，簡稱“PKC”)是一族在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中起重要作用的絲/蘇氨酸激酶。當(dāng)細(xì)胞外信號分子作用于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體或G蛋白耦連受體后，激活了胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酶，促使質(zhì)膜上的PIP2(4，5-二磷酸磷脂酰肌醇)水解為IP3(1，4，5-三磷酸肌醇)和DAG(二脂酰甘油)。IP3動員細(xì)胞內(nèi)源鈣到細(xì)胞溶質(zhì)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升，DAG激活蛋白激酶C?；罨牡鞍准っ窩通過對靶蛋白上絲/蘇氨酸殘基的磷酸化改變靶蛋白的生物活性，進(jìn)而引起細(xì)胞應(yīng)答。PKC活化和細(xì)胞應(yīng)答之間的中間步驟尚不清楚。已有的證據(jù)表明，PKC可通過抑制GAP(GTPase activatingprotein)來提高ras蛋白活性(Berry，Eur.J.Biochem(1990)189，205)。PKC途徑也可活化另一絲/蘇氨酸激酶Raf進(jìn)而影響蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)中的MAP激酶、RSK活性從而活化靶基因(Siegel，J.N.，J.Biol.Chem.(1990)265，18472)。PKC也可通過影響轉(zhuǎn)錄因子如c-Jun，NF-kB的活性來促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄(Boyle W.J.，Cell(1991)64，573；Silvia，S，Pharmac.Ther.(1991)51，71)。
蛋白激酶C抑制蛋白(protein kinase C inhibitor，簡稱PKCI)屬于HIT(histidine triad)蛋白家族。此家族的成員具有保守的由三個組氨酸構(gòu)成的基序(his-x-his-x-his)(Seraphin B.，DNA Sequence(1992)3，177；Robinson K，Biochem.J.(1994)662)。根據(jù)氨基酸序列比較，此蛋白家族又可分為兩個亞族。其中一個在C端相對較為保守，且其哺乳動物同源蛋白之間的氨基酸順序同一性大于94％。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的此亞族的成員包括人(Homo sapien)hPKCI(Brzoska PM，1996，登錄號U51004)，牛(Bos taurus)PKCI-1(Pearson JD，1990，登錄號U9405)，小鼠(Mus musculus)PKCI-1(Kelein MG，未發(fā)表序列，登錄號U60001)，玉米(Zea mays)ZBP14(Simpson GG，1994登錄號Z29643)等。另一亞族以人FHIT為代表(Ohta M，1996，登錄號U46922)，此外還包括裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)二核苷酸5′，5-P1，P4四磷酸(Ap4A)不對稱水解酶(Huang Y.Biochem.J.(1995)312，925)等。此亞族內(nèi)部的氨基酸序列同一性在50％左右，而在兩個亞族間的同一性只有20％左右。兩個亞族共有一個大約100個氨基酸的核心區(qū)，在靠近C端和N端的區(qū)域則有較大變異(Lima CD，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，5357)。
第一亞族的最初成員牛PKCI-1是作為一熱穩(wěn)定的鈣結(jié)合蛋白從牛腦中分離的，在體外有較強(qiáng)的PKC抑制活性，被認(rèn)為是最有可能的體內(nèi)PKC抑制因子(Mcdonald JR，Biochem.J(1985)232，559-567；Mcdonald JR，Biochem.J(1987)242，659-705)。Rane等將此蛋白導(dǎo)入雞胚感覺神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的鈣流被阻斷，為牛PKCI-1在體內(nèi)的PKC抑制作用提供了證據(jù)(Rane SG，Neuron(1989)3(2)，239)。然而在一項對內(nèi)源的熱穩(wěn)定和熱不穩(wěn)定蛋白在總PKC活性抑制中的作用相對大小的研究中，F(xiàn)raser推測牛PKCI-1可能并不是PKC在體內(nèi)的生理調(diào)節(jié)因子(Fraser ED，F(xiàn)EBS Lett(1991)294(3)，285)。Simpson等在1994年從玉米中分離了一個與牛PKCI同源的基因的cDNA(Simpson CG，Biochimica et Biophysica Acta 1222(1994)306)，對其表達(dá)的蛋白ZBP14的功能研究表明，此蛋白只有很弱的PKC抑制活性而且其抑制作用與另一PKC抑制蛋白14-3-3具有協(xié)同效應(yīng)(Robinson K，Biochem.J.(1995)307(ptl)267)。1996年，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，Brzoska等分離了一個人的PKCI-1 cDNA(Brzoska PM，Genomics(1996)36，151)，其表達(dá)的蛋白除了可以和PKC的調(diào)節(jié)區(qū)域發(fā)生作用外，還能與AT毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)互補(bǔ)蛋白ATDC(ataxia-telangictasia group D complementation)發(fā)生作用。這提示hPKCI-1可能在電離輻射誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起重要作用。(Brzoska PM，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92，7824)。
HIT家族的第二亞族的代表成員-人類FHIT是在1996年由Ohta等利用外顯子捕獲方法從覆蓋人染色體3P14.2缺失區(qū)的粘粒中分離得到的(Ohta M.，Cell(1996)84.587)。由于此基因在多種癌細(xì)胞株中的缺失，推測其可能是一個腫瘤抑制基因(SozziG.，Cell(1996)85，17；Virgilio L，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，9770)，然而確切的證明其腫瘤抑制功能的證據(jù)還不充分(Mao L.，Journal of the National Institute(1998)90(6)，412)。FHIT在體外具有二核苷酸5′，5-P1，P4三磷酸不對稱水解酶活性(Barnes LD，Biochemistry(1996)35，11529)，Lima等也報道了hPKI的ADP水解酶的活性(Lima CD，Science(1997a)278，286)。運(yùn)用晶體衍射和底物模擬方法，Lima等對FHIT和hPKCI進(jìn)行了催化機(jī)制和底物特性的研究，證明了HIT家族成員是核苷酸水解酶或核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Lima CD，1997a)。盡管如此，HIT家族在體內(nèi)的底物還是未知，其生物學(xué)功能還待進(jìn)一步研究。
但在本發(fā)明之前，尚沒有人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新的人hPKC編碼序列或多肽。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼HIT家族的一個新成員，本發(fā)明的人hPKCI同系物命名為人PKCI-2本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的HIT家族成員蛋白，該蛋白被命名為人PKCI-2。
發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人PKCI-2蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及這種人PKCI-2核苷酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列含有SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人PKCI-2蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人PKCI-2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人PKCI-2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人PKCI-2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人PKCI-2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為532個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于106-492位核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人PKCI-2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中106-492位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框106-492位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中106-492位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人PKCI-2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人PKCI-2蛋白多肽”指具有人PKCI-2蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人高效淋巴細(xì)胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人PKCI-2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與人PKCI-2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人PKCI-2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人PKCI-2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了人PKCI-2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人PKCI-2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人PKCI-2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人PKCI-2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括人PKCI-2多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人PKCI-2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核酸分子。探針分子通常具有人PKCI-2多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人PKCI-2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人PKCI-2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人PKCI-2多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人PKCI-2DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人PKCI-2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人PKCI-2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人PKCI-2蛋白的分子，也包括那些并不影響人PKCI-2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人PKCI-2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人PKCI-2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人PKCI-2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人PKCI-2功能的抗體以及不影響人PKCI-2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人PKCI-2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PKCI-2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人PKCI-2核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。當(dāng)然，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為532個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于106-492位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，以寡核苷酸A15′-AAGATGGCGGCACGTGGTGCTG-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，A25′-AAGCATCCAGAGTCTGGTTGTCC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR，獲得532bp的目的片段。鑒定測序后得到SEQ ID NO3的全長cDNA序列。
本發(fā)明提供的多核苷酸與小鼠PKCI高度同源，并且本發(fā)明提供的多核苷酸編碼的蛋白與人hPKCI蛋白、牛PKCI-1蛋白、小鼠PKCI蛋白、玉米ZBP14蛋白的序列也分別有較高的同源度。又由于本發(fā)明多核苷酸編碼的蛋白與上述其同系物共有his-x-his-x-his的保守基序，因此本發(fā)明提供的多核苷酸人PKCI-2所編碼的蛋白可歸入HIT蛋白家族。鑒于此，本發(fā)明提供了一個HIT蛋白家族的新成員，并提供了對此家族研究的新途徑。
本發(fā)明的人PKCI-2蛋白在人體內(nèi)的同源蛋白人hPKCI蛋白具有與PKC調(diào)節(jié)區(qū)域相互作用的活性，因此可以推測本發(fā)明的人PKCI-2蛋白可能具有調(diào)節(jié)體內(nèi)PKC生理活性的作用。鑒于PKC在涉及到細(xì)胞生長，分化的細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起重要作用(Nishizuka Y，Science(1986)233，305；Nishizuka Y，Nature(1988)334，661)，PKC的不正常活化在多種疾病中都有涉及(Bradshaw D，Agents Actions(1993)38，135)。本發(fā)明除了提供一種對PKC在細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究方法之外，還提供了對多種PKC不正?；罨鸬募膊∵M(jìn)行研究的新途徑以及對此類疾病進(jìn)行治療的新方法。
特別地，最近的研究表明PKC在阿片受體的異源脫敏中發(fā)揮重要作用，而受體脫敏被認(rèn)為是阿片類藥物的耐受和成癮的具體分子機(jī)制。(Zhang L，J.Biol.Chem，(1996)271(19)，11449)因此本發(fā)明的蛋白的與PKC相互作用的活性提供了對阿片類藥物的耐受和成癮分子機(jī)制研究的新途徑。
由于本發(fā)明提供的多核苷酸編碼的蛋白與人PKCI蛋白有62％的序列同一性而人hPKCI具有與ATDC的相互作用的活性，本發(fā)明提供對遺傳病毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)AT及與之相關(guān)的電離輻射誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行研究的新途徑。
在附圖中，


圖1為本發(fā)明的人PKCI-2與人PKCI的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人PKCI-2與小鼠PKCI的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖3為本發(fā)明的人PKCI-2與人PKCI蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖4為本發(fā)明的人PKCI-2與小鼠PKCI蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人PKCI-2的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-AAGATGGCGGCACGTGGTGCTG-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25′-AAGCATCCAGAGTCTGGTTGTCC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃ 4分鐘，隨之以93℃ 1分鐘、68℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，A1/A2為532bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1/A2與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共532bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于106-492位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人PKCI-2的氨基酸序列，共128個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4實(shí)施例2.人PKCI-2同源比較利用blastn及blastp程序?qū)on-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+SPupdate+PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索。根據(jù)同源檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的多核苷酸與人PKCI基因和小鼠PKCI有50％左右的序列同一性(identity)(圖1和圖2)，并且本發(fā)明提供的多核苷酸編碼的蛋白與人hPKCI蛋白、牛PKCI-1蛋白、小鼠PKCI蛋白、玉米ZBP14蛋白的序列同一性分別61％(圖3)，62％，60％(圖4)，52％。此外，與hPKCI蛋白、小鼠PKCI蛋白的相似性達(dá)到了約75％(圖3和4)。
又由于本發(fā)明提供的多核苷酸編碼的蛋白與上述其同系物共有his-x-his-x-his的保守基序。在本發(fā)明蛋白中對應(yīng)于基序的是His Leu His Ile His(112-116位)，因此更確定了本發(fā)明提供的多核苷酸人PKCI-2所編碼的蛋白屬于HIT蛋白家族。鑒于此，本發(fā)明提供了一個HIT蛋白家族的新成員，并提供了對此家族研究的新途徑。
本發(fā)明的人PKCI-2蛋白在人體內(nèi)的同源蛋白人hPKCI蛋白具有與PKC調(diào)節(jié)區(qū)域相互作用的活性，因此可以推測本發(fā)明的人PKCI-2蛋白可能具有調(diào)節(jié)體內(nèi)PKC生理活性的作用。鑒于PKC在涉及到細(xì)胞生長，分化的細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起重要作用(Nishizuka，1985，1986)，PKC的不正?；罨诙喾N疾病中都有涉及(Bradshaw，1993)。本發(fā)明除了提供一種對PKC在細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究方法之外還提供了對多種PKC不正?；罨鸬募膊∵M(jìn)行研究的新途徑以及對此類疾病進(jìn)行治療的新方法。
特別地，最近的研究表明PKC在阿片受體的異源脫敏中發(fā)揮重要作用，而受體脫敏被認(rèn)為是阿片類藥物的耐受和成癮的具體分子機(jī)制(Li Zhang，1996)。因此，本發(fā)明的蛋白的與PKC相互作用的活性提供了對阿片類藥物的耐受和成癮分子機(jī)制研究的新途徑。
由于本發(fā)明提供的PKCI-2與人PKCI蛋白序列高度同源而人hPKCI具有與ATDC的相互作用的活性，本發(fā)明提供對遺傳病毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)AT及與之相關(guān)的電離輻射誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行研究的新途徑。
本發(fā)明的人PKCI-2除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人PKCI-2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，如將本發(fā)明人PKCI-2的N端與人PKCI的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
此外，針對本發(fā)明人PKCI-2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人PKCI-2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人PKCI-2的表達(dá)水平或者抑制人PKCI-2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人PKCI-2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人PKCI-2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人PKCI-2在大腸桿菌中的表達(dá)編碼人PKCI-2的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)或?qū)嵤├?中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-CCTAGTCGACATGG GAATTGAAGT GGCCA-3′(SEQ ID NO.5)。
該引物序列含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的人PKCI-2編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5′-ATCGAAGCTTTCAA CCTGGAGGCC ACTGG-3′(SEQ IDNO.6)。
該引物序列含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個翻譯終止子和人PKCI-2的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用HindIII和SalI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證人PKCI-2的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物陽性轉(zhuǎn)化子的克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6，隨后加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人PKCI-2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人PKCI-2?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定出表達(dá)蛋白的分子量為14KDa。
此外用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實(shí)施例4人PKCI-2在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)編碼人PKCI-2的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)或?qū)嵤├?中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-CGTAAAGCTTATGG GAATTGAAGT GGCCA-3′(SEQ ID NO.7)，該引物序列含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開始的人PKCI-2編碼序列的19個核苷酸；3′端寡核苷酸引物序列為5′-ATTCGAATTCTCAA CCTGGAGGCC ACTGG-3’(SEQ ID NO.8)該引物序列含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個翻譯終止子和人PKCI-2的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證人PKCI-2的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定出表達(dá)蛋白的分子量為14K Da。
此外用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將如上獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人PKCI-2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱新的人蛋白激酶C抑制蛋白編碼序列、其編碼的多肽及制備方法(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1AAGATGGCGG CACGTGGTGC TG22(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGCATCCAG AGTCTGGTTG TCC 23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度532bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 AAGATGGCGG CACGTGGTGC TGGCTGCTGG GTTGCGCGCG CGCAGAAGCC GTGGCGCCCA61 CGGGGGTGCG CGGGGGGCAG GTCCGAGGAG CTGCAGGTGT GACTGATGGG AATTGAAGTG121 GCCAAGGCCC AGCAGGCAAC TCCTGGGGGA GCAGCCCCAA CCATCTTCTC CCGGATCCTG181 GACAAGAGCC TCCCAGCTGA CATTCTCTAT GAGGACCAGC AGTGTCTTGT GTTCCGTGAT241 GTGGCCCCTC AGGCTCCTGT GCACTTCCTG GTCATTCCTA AGAAGCCCAT TCCTCGGATT301 AGCCAGGCTG AAGAAGAAGA CCAGCAGCTT CTAGGACACC TACTCCTTGT GGCCAAGCAG361 ACAGCAAAGG CTGAGGGCCT GGGAGATGGA TACCGACTTG TGATCAACGA TGGGAAGCTG421 GGTGCACAAT CTGTGTATCA TCTGCACATT CATGTACTTG GGGGCCGGCA GCTCCAGTGG481 CCTCCAGGTT GAACCTGCCA ACTGATTAAA GGACACCAGA CTCTGGATGC TT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度128氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Gly Ile Glu Val Ala Lys Ala Gln Gln Ala Thr Pro Gly Gly16 Ala Ala Pro Thr Ile Phe Ser Arg Ile Leu Asp Lys Ser Leu Pro31 Ala Asp Ile Leu Tyr Glu Asp Gln Gln Cys Leu Val Phe Arg Asp46 Val Ala Pro Gln Ala Pro Val His Phe Leu Val Ile Pro Lys Lys61 Pro Ile Pro Arg Ile Ser Gln Ala Glu Glu Glu Asp Gln Gln Leu76 Leu Gly His Leu Leu Leu Val Ala Lys Gln Thr Ala Lys Ala Glu91 Gly Leu Gly Asp Gly Tyr Arg Leu Val Ile Asn Asp Gly Lys Leu106 Gly Ala Gln Ser Val Tyr His Leu His Ile His Val Leu Gly Gly121 Arg Gln Leu Gln Trp Pro Pro Gly(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CCTAGTCGAC ATGGGAATTG AAGTGGCCA 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ATCGAAGCTT TCAACCTGGA GGCCACTGG 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTAAAGCTT ATGGGAATTG AAGTGGCCA 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ATTCGAATTC TCAACCTGGA GGCCACTGG 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3從核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的序列。
4.一種分離的人PKCI-2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人PKCI-2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人PKCI-2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人PKCI-2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人PKCI-2蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸106-492位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的人PKCI-2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Ⅱ型人蛋白激酶C抑制蛋白PKCI－2的編碼序列,該序列編碼的蛋白是人體中天然存在的HIT家族的一個新成員,是人h PKCI的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K16/18GK1249341SQ98119440
公開日2000年4月5日 申請日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月28日
發(fā)明者余龍, 趙勇, 張民, 胡培蓉, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)