專利名稱：一種從天麻中提取的抗真菌蛋白及其制備方法
一種從天麻中提取的抗真菌蛋白及其制備方法屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)1．天麻(Gastrodia elata)是蘭科名貴的中草藥，已有兩千年的使用歷史，主要用于治療麻痹、精神病、風(fēng)濕、癱瘓、高血壓和腦神經(jīng)疼痛，是鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜藥，無副作用。
2．從天麻塊莖之中，云南植物研究所胡忠等人于1988年分離出的一種分子量為14kD蛋白(天麻抗真菌蛋白Gastrodia antifungal protein,GAFP或天麻素Gastrodianin)，除抗真菌活性之外，并未證明有其它生物活性。
3．在比利時(shí)Katholieke University Leuven的Peumans W.J.和Van DammeE.J.M等人在蘭科的許多種植物中分離出一系列生物活性各異的凝集素，其中有的對(duì)真菌菌絲生長有抑制作用，有的對(duì)同翅目昆蟲具殺傷作用，還有的能對(duì)人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV)等的侵染有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩?br> 發(fā)明的目的1、分離和純化植物體內(nèi)特異的抗真菌類蛋白質(zhì)，對(duì)它們進(jìn)行生理生化特性以及結(jié)構(gòu)和功能的研究分析，主要是拮抗機(jī)理的闡明，這在植物基因工程和植物病理學(xué)領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
2、闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能在很大程度上要依賴于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，通過與已知蛋白質(zhì)序列的比較可直接推斷出未知蛋白的結(jié)構(gòu)功能域，從而得知它的生物學(xué)特性；通過遺傳密碼反推出編碼該蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列，從而為克隆出該蛋白的基因、研究基因的表達(dá)與調(diào)控提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為獲得轉(zhuǎn)基因抗真菌農(nóng)作物打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
實(shí)施例1．抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之一取100g保存在-70℃冰箱中的天麻次生塊莖，清水洗凈后取表皮及皮層部組織50g，切成約為1cm的小塊，加入4℃ 100ml磷酸緩沖液50mMpH6.5，含0.2MNaCl，在組織勻漿機(jī)中勻漿，每次勻漿30sec，停30sec，共20次。
用四層紗布將勻漿物濾過后，于40℃ 6000×g離心20分鐘。上清液用45％飽和度的硫酸銨沉淀8小時(shí)，4℃。10000×g離心20分鐘后取上清液，加入硫酸銨到80％飽和度，4℃過夜沉淀。沉淀被收集后，溶解于50mM,pH5.0的醋酸鈉緩沖液之中。離心去除不溶物后，上清液上Sephadex G-25凝膠過濾柱(C26/40)，有活性的部分被收集后上DEAE-纖維素柱(36mm×20cm)，未被吸附的樣品收集起來，用70ml超濾罐(Sigma)在PTGC膜(分子量截流值為10.0KD)上，于4℃進(jìn)行超濾。
蛋白質(zhì)濃縮液用Sephadex G-50凝膠過濾柱(C16/70)進(jìn)行分離后，收集活性部分，上CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱，洗脫方式為用含0～0.3M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫。收集有活性部分，用4M硫酸銨溶液與它等體積混合，用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上以含2～0M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫，有活性組分用PD-10 Sephadex G-25M柱進(jìn)行脫鹽。此法可得14mg GAFP-1。
2．抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之二按方法一，向經(jīng)45％硫酸銨沉淀后的上清液加入1M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)使?jié)舛葹?0mM，流經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow(C10/20)后，直接上Mannose-Sepharose 6B(甘露糖偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠6B)(C10/20)，經(jīng)過含2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫和含1.5M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫，含有GAFP-1組分可用含0.2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫下來。此組分用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)進(jìn)一步純化，同方法一。
3．抗真菌蛋白GAFP-1的分子特征經(jīng)SDS-PAGE電泳分析及Superose12凝膠過濾分析GAFP-1的分子量為10kD。經(jīng)聚丙烯凝膠等電聚焦電泳分析，GAFP-1是一個(gè)等電點(diǎn)pI=8.45的堿性蛋白。
經(jīng)BECKMAN 121MB Amino Acid Analyzer(氨基酸分析儀)測(cè)定GAFP-1的氨基酸組成為<
<p>*色氨酸殘基數(shù)通過與酪氨酸比較消光值(A288,A280)而測(cè)得。
**經(jīng)巰基保護(hù)后測(cè)得半胱氨酸的殘基數(shù)為4。
經(jīng)Protein Sequencer(ABI491,USA)蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定GAFP-1的N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI通過國際計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)系統(tǒng)，與美國的國家生物信息中心(NCBI)中的多肽序列庫比較結(jié)果，GAFP-1與蘭科的二葉蘭(Listera ovata)中的一種甘露糖結(jié)合蛋白有75％的相同性，可以推測(cè)它們生理功能有很大的相似或相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種天麻抗真菌蛋白質(zhì)GAFP-1及其制備方法，其特征在于氨基酸的組成為
*色氨酸殘基數(shù)通過與酪氨酸比較消光值(A288,A280)而測(cè)得。**經(jīng)巰基保護(hù)后測(cè)得半胱氨酸的殘基數(shù)為4。其分子量為10kD；等電點(diǎn)pI=8.45的堿性蛋白；在含2M硫酸銨的溶液中能結(jié)合甘露糖，幾丁質(zhì)，N乙酰葡萄糖胺；其N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI
2.一種從天麻中提取的抗真菌蛋白質(zhì)GAFP-1及其制備方法，其特征在于所述方法包括(1)抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之一取100g保存在-70℃冰箱中的天麻次生塊莖，清水洗凈后取表皮及皮層部組織50g，切成約為1cm的小塊，加入4℃ 100ml磷酸緩沖液50mM pH6.5，含0.2M NaCl，在組織勻漿機(jī)中勻漿，每次勻漿30sec，停30sec，共20次；用四層紗布將勻漿物濾過后，于4℃ 6000×g離心20分鐘。上清液用45％飽和度的硫酸銨沉淀8小時(shí)，4℃；10000×g離心20分鐘后取上清液，加入硫酸銨到80％飽和度，4℃過夜沉淀；沉淀被收集后，溶解于50mM,pH5.0的醋酸鈉緩沖液之中。離心去除不溶物后，上清液上Sephadex G-25凝膠過濾柱(C26/40)，有活性的部分被收集后上DEAE-纖維素柱(36mm×20cm)，未被吸附的樣品收集起來，用70ml超濾罐(Sigma)在PTGC膜(分子量截流值為10.0KD)上，于4℃進(jìn)行超濾；蛋白質(zhì)濃縮液用Sephadex G-50凝膠過濾柱(C16/70)進(jìn)行分離后，收集活性部分，上CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱，洗脫方式為用含0～0.3M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫；收集有活性部分，用4M硫酸銨溶液與它等體積混合，用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上以含2～0M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫，有活性組分用PD-10 Sephadex G-25M柱進(jìn)行脫鹽。此法可得14mg GAFP-1；(2)抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之二按方法一，向經(jīng)45％硫酸銨沉淀后的上清液加入1M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)使?jié)舛葹?0mM，流經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow(C10/20)后，直接上Mannose-Sepharose 6B(甘露糖偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠6B)(C10/20)，經(jīng)過含2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫和含1.5M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫，含有GAFP-1組分可用含0.2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫下來；此組分用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)進(jìn)一步純化，同方法一。
全文摘要
利用生物技術(shù)的方法,主要是液相色譜技術(shù)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù),天麻中分離純化出一種抗真菌的蛋白質(zhì)名為GAFP－1,其分子量為10kD,等電點(diǎn)為8.45。從氨基酸組成上看,它富含天門冬氨酸(酰胺)Asx(22.1%)、甘氨酸Gly(10.0%)、亮氨酸Leu(9.4%),只含一個(gè)Met，不含Pro。GAFP－1的N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI。根據(jù)這個(gè)序列可以合成DNA探針或引物,可克隆出GAFP－1基因,為獲得轉(zhuǎn)基因抗真菌農(nóng)作物打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1217340SQ98120239
公開日1999年5月26日 申請(qǐng)日期1998年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月6日
發(fā)明者陳章良, 徐慶 申請(qǐng)人:北京大學(xué)