專(zhuān)利名稱(chēng)：腫瘤熱休克蛋白－多肽復(fù)合物抗原的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)的蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)，腫瘤抗原的分離純化方法。
目前研究表明很多惡性腫瘤細(xì)胞有熱休克蛋白-多肽復(fù)合物(Heat ShockProteins-peptide complexes，HSPs)表達(dá)。由于HSPs上結(jié)合有腫瘤抗原肽，因此，分離得到腫瘤細(xì)胞的HSPs就可得到腫瘤抗原，用于制備抗腫瘤的生物制劑，所以研究HSPs的分離提取方法并不斷進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)，探索大批量生產(chǎn)的工藝，對(duì)實(shí)現(xiàn)提供大量的成品HSPs抗原供臨床使用有重大的實(shí)用價(jià)值。
現(xiàn)在普遍采用的分離HSPs技術(shù)一是用ATP-agarose，但分離后HSPs無(wú)生物活性(免疫原性)，沒(méi)有臨床使用價(jià)值。二是過(guò)Con A-sephrose后再過(guò)Mono Q柱。這種方法提純量小，只能用于試驗(yàn)室，并且因柱子價(jià)格昂貴、易損，一旦操作不慎造成柱子損壞，浪費(fèi)很大，又影響進(jìn)度，柱子是進(jìn)口的，不能自行組裝，所以該方法的最大缺點(diǎn)是成本高。
本發(fā)明的目的是提供一種降低成本、適于制備大量樣品的腫瘤HSP-多肽復(fù)合物抗原的分離純化方法。
腫瘤熱休克蛋白-多肽復(fù)合物(HSP)抗原的分離純化方法，包括取瘤組織破碎，使細(xì)胞核與膜分離，然后離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測(cè)定，其特征是破碎時(shí)將低滲裂解液與超聲粉碎機(jī)并用；在層析時(shí)用DEAE-52行第二次分離。
本發(fā)明分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)是1、在裂解步驟中低滲裂解液及超聲粉碎機(jī)并用，這樣既減少了裂解液的用量，是原有用量的1/18，又能使細(xì)胞在行超聲粉碎前膨脹或部分破裂，易于粉碎。因此該法操作簡(jiǎn)便、適于處理量大的樣品，使規(guī)?；a(chǎn)成為可能。單純使用低滲裂解液，在處理大量組織細(xì)胞時(shí)裂解液量大，離心及過(guò)柱費(fèi)時(shí)，效率低，且不必要，但單純應(yīng)用超聲粉碎機(jī)恐難將細(xì)胞器徹底粉碎，而影響HSPs的產(chǎn)率。
2、在第二次層析中改用DEAE-52有如下優(yōu)點(diǎn)(1)傳統(tǒng)的ATP-agarose方法分離得到的HSPs無(wú)抗原性，因HSPs具有ATP酶的活性，HSPs與ATP接觸后HSP與多肽分離，喪失抗原性，使得HSPs無(wú)臨床使用
(2)目前國(guó)外用的Mono Q柱分離方法，純度高，分離效果好。但Mono Q柱容積小(10×0.5cm)，價(jià)格昂貴，8900元/支。該柱對(duì)樣品要求高，且易損壞。一旦損壞使提純成本倍增。而且Mono Q柱主要用于處理少量的實(shí)驗(yàn)用品，不適于大批量生產(chǎn)成品。而本發(fā)明改用DEAE-52層析柱進(jìn)行第二次分離，效果與用Mono Q相同。DEAE-52價(jià)格低廉，且可自行裝柱，多次使用。其成本較MonoQ柱層析顯著下降，比用現(xiàn)有技術(shù)下降2/3-3/4，適合于大批量生產(chǎn)用。
(3)本發(fā)明中層析時(shí)還可省去ConA-Sepharose層析步驟，而只用DEAE-52進(jìn)行兩次層析，此法比方案1更進(jìn)一步地降低成本。
實(shí)施例1腫瘤HSP-多肽復(fù)合物抗原的分離純化方法，包括取瘤組織或培養(yǎng)的瘤細(xì)胞株(若取組織則需將組織研碎后，過(guò)200目網(wǎng))，細(xì)胞清洗干凈、離心后，破碎，其特征是破碎時(shí)用低滲裂解液與超聲粉碎機(jī)并用；按固體物體積比1/10加入低滲裂解液，10分鐘(4℃)后再用超聲粉碎機(jī)破碎，實(shí)驗(yàn)室用的超聲粉碎機(jī)，在10ml試管內(nèi)加入樣品5-8ml，反復(fù)三次，每次3秒，于冰水中進(jìn)行。使細(xì)胞核與膜分離，然后用超高速離心機(jī)離心，105g/分鐘，離心1小時(shí)，取上清液，層析先過(guò)ConA-Sepharose層析柱行第一次層析，收集洗脫液，透析、濃縮后再用快速液相蛋白系統(tǒng)(FPLC)，過(guò)DEAE-52層析柱行第二次層析，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集250-350mmol/L濃度的洗脫液透析、濃縮后可得HSPs。分離得到的HSPs經(jīng)定性(聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE、免疫印跡雜交Western-Blot法)、定量后，純度達(dá)到電脈純，(電脈后為一條帶)。每次上樣品量與所用的DEAE-52要相匹配，將前步驟的濃縮樣品按1∶5比例配DEAE-52。純度測(cè)定后，可作為抗原使用。主要用于惡性腫瘤及傳染病的免疫治療。
實(shí)施例2本方法還可在此基礎(chǔ)上試行改進(jìn)層析時(shí)省去Con A-Sepharose層析柱，而只用DEAE-52層析柱行兩次分離。這樣可使成本比方案1進(jìn)一步大幅度下降。細(xì)胞破碎后，直接于FPLC系統(tǒng)上過(guò)DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然后尋找HSPs的蛋白峰純化，再測(cè)純度及產(chǎn)率，直至HSPs達(dá)到電脈純。
用上述方法提取Hcaf細(xì)胞(小鼠的肝癌細(xì)胞株)HSP-多肽腫瘤抗原實(shí)例1、Hcaf細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增、一共9個(gè)克氏瓶(每個(gè)容積100ml)盛培養(yǎng)液10ml，內(nèi)有約107細(xì)胞)總計(jì)用Hcaf細(xì)胞9×107個(gè)，量約90-100ml，將上述細(xì)胞用PBS洗三次，用低滲裂解液60毫升，作用10分鐘后用超聲粉碎機(jī)破碎三次，每次3秒，于冰水中，用超高速離心機(jī)在4℃環(huán)境下離心(105g/分)一小時(shí)，取上清液。
2、層析將上清液過(guò)Con A-Sepharose柱，6ml/分，收集洗脫液透析濃縮至5ml。再將該樣品于FPLC系統(tǒng)上用DEAE-52分離劑分離，柱子規(guī)格40×1.5，20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各洗脫峰蛋白，然后每個(gè)峰均行SDS-PAGE，測(cè)分子量，在E峰發(fā)現(xiàn)-70KD蛋白質(zhì)，再行電泳；用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸素纖維膜上，以抗HSP-70抗體為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體為二抗，行Western-blot定性，顯色后證實(shí)該蛋白為HSP70。測(cè)定該蛋白純度為97.3％。
以此蛋白為抗原注射給健康的615系近交系小鼠10μg/次，連續(xù)二次，每周一次，最后一次注射一周后，再向?qū)嶒?yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注射活的HCaf細(xì)胞107個(gè)/次/只，則注射HSP70的小鼠長(zhǎng)期存活，無(wú)一死于腫瘤，而對(duì)照組于10日內(nèi)全部死亡，荷瘤組鼠的生存期比對(duì)照組延長(zhǎng)了2-3倍。
用HSP70為抗原成功地誘導(dǎo)出了腫瘤特異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)，效靶比例為50∶1時(shí)，體外殺瘤效應(yīng)為84.8％，注射給荷瘤鼠后，小鼠腫瘤于注射三次后全部消退，該組小鼠全部存活，無(wú)一死于腫瘤。進(jìn)一步說(shuō)明該方法提取的腫瘤HSP70具有強(qiáng)大的免疫原性，證明該分離方法實(shí)用、有效、純化效果好。
權(quán)利要求
1.一種腫瘤HSP-多肽復(fù)合物抗原的分離純化方法，包括取瘤組織破碎，使細(xì)胞核與膜分離，然后離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測(cè)定，其特征是破碎時(shí)用低滲裂解液與超聲粉碎機(jī)并用；在層析時(shí)用DEAE-52行第二次層析分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征是破碎步驟a將組織研碎后，過(guò)濾一次，用200目網(wǎng)篩；b按固體物體積比1/10，加入低滲裂解液，4℃浸10分鐘后再粉碎；c將低滲裂解液浸泡物放入超聲粉碎機(jī)，破碎三次，每次3秒，于冰水中進(jìn)行，再離心，105g/分鐘，1小時(shí)、取上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征是層析時(shí)提取液經(jīng)ConA-Sepharose層析柱，透析、濃縮后，再用快速液相蛋白系統(tǒng)(FPLC)、過(guò)DEAE-52層析柱行第二次分離，用20-500m mol/L NaCl洗脫液，濃縮樣品按1∶5比例配DEAE-52，經(jīng)上述步驟得到的HSPs可達(dá)電脈純。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的分離純化方法，其特征是層析時(shí)省去ConA-Sepharose層析柱步驟，而只用DEAE-52進(jìn)行兩次層析分離；細(xì)胞破碎后，直接于FPLC系統(tǒng)上過(guò)DEAE-52柱，用20-500mmol/L NaCl洗脫，收集各峰蛋白，行SDS-PAGE，再行Western-Blot，然后尋找HSPs的相應(yīng)蛋白峰，再行一次DEAE-52，以純化，再測(cè)純度及產(chǎn)率，直到HSPs達(dá)到電脈純。
全文摘要
腫瘤熱休克蛋白－多肽復(fù)合物抗原的分離純化方法,包括取瘤組織破碎,使細(xì)胞核與膜分離,然后離心、第一次層析、透析、濃縮、第二次層析、定性定量、純度測(cè)定,其特征是破碎時(shí)低滲裂解液與超聲粉碎機(jī)并用;用EDAE－52行第二次層析分離。這種破碎方法既減少了裂解液的用量,是原有用量的1/18,又能使細(xì)胞易于粉碎;該分離純化方法使成本比現(xiàn)有技術(shù)下降2/3—3/4,適合于大批量生產(chǎn),從而使該抗原能夠用于臨床。本發(fā)明中層析時(shí)還可省去ConA－Sepharose層析步驟,而只用DEAE－52進(jìn)行兩次層析,此法比方案1更進(jìn)一步降低成本。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1257870SQ9812109
公開(kāi)日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日
發(fā)明者傅慶國(guó), 郭仁宣 申請(qǐng)人:傅慶國(guó), 郭仁宣