專利名稱：一種清潔純化紫杉醇的方法
技術領域：
本發(fā)明是一種清潔純化紫杉醇的方法。
紫杉醇是一種具有廣譜抗癌活性的天然有機化合物。1971年Wani(JAmer.Chem.Soc.,1971,93,2325)等首次報道從印度短葉紅豆杉(Taxuobrevifolia)中分離得到了紫杉醇，并且確認紫杉醇對肺癌、肝癌、乳房癌細胞及其它腫瘤細胞具有廣泛的強殺傷作用，副作用非常小。它的分子式為C47H51NO14，分子結構如下
1979年Schiff等(Nature,1979,277,665)確認紫杉醇藥理作用機理獨特，既能促進微管蛋白的聚合，又能穩(wěn)定微管不致解聚。1983年美國食品和藥品署(FDA)批準進入Ⅰ期臨床，目前已進入第Ⅲ期臨床試驗，被認為是近20年來發(fā)現(xiàn)的最有希望的抗癌藥。
紫杉醇的來源極為有限。它是從紫杉科樹木的樹皮中提取和純化來的，樹皮中含量約40～160mg/kg。該樹種生長極為緩慢，通常一棵百年老樹的樹干直徑約6英寸，每棵樹上一般只能剝取2.5kg的樹皮。提取25kg的純紫杉醇提供1萬2千例癌癥患者臨床試驗，相當于需要3萬棵紫杉樹的樹皮。美國、加拿大、印度等國家有紫杉樹自然資源，我國東北紅豆杉(T.cuspidata)、云南紅豆杉(T.yunnanensis)和美麗紅豆杉(T.chinensis var.mairei)的樹皮、樹干和杉葉中均含有紫杉醇，但含量較低。為了獲取紫杉醇的來源，保護稀少樹種，國外開展了紅豆杉樹的矮壯化及組織培養(yǎng)法，還有半合成及全合成紫杉醇的工作。然而，由于培養(yǎng)法每天僅獲得納克級的量，全合成得率較低，成本巨大，難以商業(yè)化。因此，從樹中提取紫杉醇，特別是盡可能全部提取出紫杉醇，是目前唯一的、商業(yè)化的方法。
常用的分離和純化步驟為使用甲醇或95％乙醇浸提樹皮，除去溶劑，得浸膏用水溶解，脫脂后用二氯甲烷或三氯甲烷萃??；萃取組分濃縮后，經色譜層析得到紫杉烷類化合物的單體或混合物。使用浸提法從樹皮中提取紫杉醇粗產物較為容易，但是將10～48％的粗產品直接純化得到99.5～99.9％的精產品技術難度較大。另外，溶劑或淋洗劑不經回收直接排放，造成嚴重的環(huán)境污染。
Senilh(J.Natural Products,1984,47,131)等從歐洲杉(Taxul bacata)提取紫杉醇使用如下步驟(1)用乙醇萃取樹皮，濃縮；(2)在水和二氯甲烷中分配；(3)“過濾”色譜法分離；(4)硅膠柱色譜分離；(5)氧化鋁色譜分離；(6)中壓硅膠柱色譜分離；(7)制備HPLC分離。
Polysciences Inc.從T.brevifolis樹皮中分離紫杉醇(1)甲醇或乙醇萃取樹皮，混合萃取后濃縮除去大部分醇；(2)濃縮液用二氯甲烷萃取，萃取質濃縮干燥至粉末；(3)粉末用丙醇和里格羅因(1∶1)溶解，不溶組分過濾除去；(4)含有紫杉醇的濾液濃縮，溶于30％丙醇里格羅因溶液，經Florisil柱過濾；(5)從柱中流出的紫杉醇組分結晶純化二次；(6)結晶的紫杉醇進一步在硅膠柱中分離，該步中，最相似的產物cephalomannine從紫杉醇中分離出來；(7)從柱中流出的紫杉醇再結晶二次；(8)未分離的混合物和其它溶質，循環(huán)處理得到純紫杉醇。Miller(J.Org.Chem,1981,46,1469)采用下列步驟(1)用甲醇萃取Taxus wallichiana樹根、樹干、樹葉，濃縮萃取液至固體；(2)在水和己烷中分配；(3)用氯仿萃取，然后濃縮；
(4)硅膠柱色譜法；(5)二次硅膠柱色譜法；(6)逆流分配法；(7)二次逆流分配法；(8)制備HPLC分離純化。
使用正相硅膠柱色譜法從Ornamental yew(Taxus Xmedia Hicksii)中提取(usp.5,279,949)(1)用70％乙醇萃取鮮葉；(2)萃取物中活性炭脫色后過濾；(3)萃取質濃縮除去大部分有機溶劑；(4)水溶性組分離心與含紫杉醇的沉淀固體分離；(5)固體進入正相硅膠柱色譜分離；(6)二次柱色譜分離，低壓硅膠柱色譜分離粗紫杉醇組分；(7)反相色譜最后純化。
Caster等(usp.5,440,055)用超臨界法，同時使用N2O、CO2、C3H8、Freon-22或CHClF2等作為超臨界氣體，提取紫杉醇。
Rao等(usp.5,380,916,1992)使用臭氧處理分離后的紫杉醇得純紫杉醇(同時參見WO92/07842)。
1998年3月Durand等(usp.5,723,635)發(fā)明了利用離心分配色譜法分離純化紫杉醇的方法。該方法使用一個色譜柱可以良好地從粗物質中分離純化紫杉醇，一次處理量大(1)在制備柱規(guī)模下，用反相色譜法處理紫杉醇粗處理物；(2)從吸附劑上洗脫紫杉醇和其它產物；(3)在洗脫的柱子中回收紫杉醇和相似物；(4)使用臭氧純化最終產物。
上述諸多分離純化方法，包括結晶法，高壓正相色譜法，高壓反相色譜法，離心分配色譜法和超臨界萃取法等均需要高壓、真空或超臨界狀態(tài)下進行，產品純度僅在99％，主要雜質是cephalomannine，很難分離；制備高純度的紫杉醇，還需要用臭氧或四氯化銫等處理；溶劑、淋洗液未回收，造成環(huán)境污染。
本發(fā)明的目的是建立一種工藝方法簡單、純化過程中無污染、淋洗液或溶劑可回收再使用、便于工業(yè)化且能得到高純度紫杉醇的方法。
本發(fā)明使用市售10～48％紫杉醇產品為原料，正構烷烴、乙酸酯、分析用乙醇、乙腈等試劑均為分析純，經蒸餾后使用。分析用甲醇為高效液相色譜純，水為二次重蒸水，硅膠、活性炭纖維為分析純。原料及產品分析使用的高效液相色譜儀為美國Beckman公司生產，110B雙泵進樣。128二極管振列檢測器或126紫外檢測器，4.6×250mmC18色譜柱，流速為1.0ml/min，進樣量為3μl。奔騰ⅡMMX266計算機控制高效液相色譜分析操作。Sbsz-Ⅰ型旋轉蒸發(fā)儀，KLG-Ⅱ型冷凍干燥機，CS501-SP超級數(shù)顯校溫器，WZZ-2A自動旋光儀，WKS-1A數(shù)字熔點儀。質譜分析在美國CE&A公司生產的TOF-2000MIP飛行時間二次離子質譜儀上進行，電子能量15kev，荷質比m/e在0～1000范圍內掃描。液-質連譜分析在美國惠普HP1100-MS上進行，Zorbax2.1×100mmC18色譜柱，5μm，流速為0.3ml/min，進樣量為5μl,APES源，傳輸電壓為70伏，掃描范圍為m/z在200～1200之間。
本發(fā)明在純化紫杉醇之前，需自裝色譜柱。人工裝柱加入硅膠填料時敲打柱子使其均勻裝入，裝好后的柱子柱內填料應無明顯的斷層或裂紋。紫杉醇粗產物溶于乙酸酯后，倒入色譜柱，加入正構烷烴、乙酸酯及其混合物梯度洗脫，各梯度溶劑和混合溶劑比例是正構烷烴(100％)、正構烷烴∶乙酸酯(4∶1～2)、正構烷烴∶乙酸酯(1∶1～4)、乙酸酯(100％)。
市售紫杉醇粗產品純度是10～48％，將其配制成紫杉醇濃度是2.5～10％(wt％)的乙酸酯溶液待純化用，濃度太稀純化效率不高，濃度太大純化效果不好。
梯度淋洗用溶劑正構烷烴是正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷，乙酸酯是乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯。
為提高純化純化效率，純化用色譜柱長30-80cm，柱直徑2.0～8.0cm為好。為使純化后產品不帶雜色，本發(fā)明用色譜柱上端裝有25～35％硅膠體積的活性炭纖維，裝柱時硅膠從柱上端口加入，柱的下端有聚四氟乙烯活塞，活塞下端為墊一層纖維玻璃的4#砂芯層，將硅膠裝完后，最后裝活性炭纖維，硅膠和活性炭纖維尺寸大小分別是50～300目和100～200目。
硅膠和活性炭纖維裝柱前經90～120℃烘干活化1-3天，使其充分干燥，以去除吸附的過量水分。
紫杉醇粗產物經LC-MS的高效液相色譜分析(如

圖1)，在保留時間39.838、59.844、61.636、65.884min處分別檢測出主要產物，0.976min處為進樣峰。在位LC-MS的質譜分析表明(如圖2),61.636min的產物流入質譜儀后，在61.800min出得到質譜信號。使用API-ES正離子源，質譜數(shù)據(jù)為854.3，說明質量為853.3。使用Beckman生產的高效液相色譜儀及4.6×250mmC18色譜柱，分析紫杉醇粗產物(如圖3)，分別在18.00、29.10、34.39、36.05min處測出主要產物，2.24min處為進樣峰。與標準紫杉醇出峰時間相對照，表明36.05min處為紫杉醇。使用面積歸一法和內標法測得其含量為48.10％。
收集各段淋洗液，Ⅰ～Ⅳ經旋轉蒸發(fā)濃縮，餾出的溶劑或淋洗液精餾后可反復使用，避免直接排放造成污染。濃縮液經-40℃真空冷凍干燥，分離得到淋洗液Ⅰ～Ⅵ中各種化合物。高效液相色譜分析與粗產物各組分相對照，Ⅰ～Ⅱ中不含紫杉醇，Ⅲ中含約1％的紫杉醇，Ⅳ中含99.5～99.9％的紫杉醇(高效液相色譜分析結果如圖4所示)，對產物Ⅳ的質譜分析表明，其質量為853.4，見圖5。分離得到的紫杉醇為白色結晶狀粉末。熔點為215.4～215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
分離得產物后，從柱中取出的硅膠及活性炭纖維經250～350焙燒1至3天，可反復使用，降低了制備成本。
本發(fā)明的清潔純化紫杉醇粗產物的方法主要設備和試劑是填充色譜柱和淋洗液。常壓下經梯度淋洗含10～48％紫杉醇粗產品后，經回收淋洗液及溶劑，冷凍干燥可得到99.5～99.5％的紫杉醇。工藝簡單，淋洗液無毒易回收，與現(xiàn)有紫杉醇的純化方法相比，具有成本低，純化過程無污染，溶劑和淋洗液可以回收，便于工業(yè)化生產等諸多優(yōu)點。
圖1粗原料的LC-MS高效液相色譜2粗原料的LC-MS質譜3粗原料的Beckman儀的高效液相色譜4組分Ⅵ的Beckman儀的高效液相色譜5組分Ⅵ的TOF-SIMS質譜圖實施例1稱取100～200目硅膠225克和50～100目活性炭纖維10克，在馬福爐中110℃烘干活化48小時后，人工填充于60cm長、柱φ2cm的柱子。柱子下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端為墊一層0.5克玻璃纖維的4#砂芯層。稱取2克48％紫杉醇粗產物，溶于40ml乙酸甲酯，倒入層析色譜柱。依次加入300ml己烷(100％)、200ml己烷∶乙酸甲酯(4∶1)、600ml己烷∶乙酸甲酯(1∶1)、600ml乙酸甲酯(100％)，分別得到餾分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。77℃下分別旋轉蒸發(fā)組分Ⅰ-Ⅳ，得到的濃縮組分經-40℃、10-2τ下干燥40分鐘。經真空干燥處理后的組分Ⅳ為白色粉末，經高效液相色譜分析為99.9％紫杉醇，熔點為215.6℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
實施例2稱取100～200目硅膠280克和50～100目活性炭纖維10克，在馬福爐中110℃烘干活化48小時后，人工填充于80cm長、柱φ3cm的柱子。柱子下端有聚四氟乙烯活塞，活塞上端為填充0.5克玻璃纖維的4#砂芯層。稱取3.0克10％紫杉醇粗產物，溶于35ml乙酸乙酯，倒入層析色譜柱。依次加入600ml庚烷(100％)、400ml庚烷∶乙酸乙酯(2∶1)、400ml庚烷∶乙酸乙酯(1∶1)、300ml乙酸乙酯(100％)，分別得到餾分Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ。87℃下旋轉蒸發(fā)組分Ⅴ-Ⅷ，得到的濃縮組分經-40℃、10-2τ下干燥40分鐘。經真空干燥處理后的組分Ⅷ為白色粉末，經高效液相色譜分析為99.5％紫杉醇，熔點為215.4℃，旋光度為-49°(甲醇溶液中)。
實施例3實施例1和2中旋轉蒸發(fā)收集的溶劑及淋洗液經1萬塔板數(shù)精餾分別回收己烷、乙酸甲酯、庚烷、乙酸乙酯，該精餾后的溶劑可反復使用。使用后的硅膠及活性碳纖維從柱中取出分開收集，在馬福爐中110℃下烘干5小時，然后升溫至300℃焙燒48小時。該方法處理的硅膠及活性碳纖維，可反復使用。
權利要求
1．一種清潔純化紫杉醇的方法。其特征是在(1)純化是用填充硅膠的色譜柱；(2)淋洗液的加入順序是正構烷烴(100％)、正構烷烴∶乙酸酯(4∶1～2)、正構烷烴∶乙酸酯(1∶1～4)、乙酸酯(100％)，正構烷烴是正戊烷～正辛烷；(3)分段收集淋洗液，經蒸發(fā)、濃縮、干燥，即得純化后產品；(4)溶于乙酸酯配成溶液后的紫杉醇濃度是2.5～10％(wt％)待純化。
2．根據(jù)權利要求1所述的清潔純化紫杉醇的方法，其特征是色譜柱長30～80cm，柱直徑2.0～8.0cm，色譜柱中除了填充硅膠外，其上端填充有2～5％體積量的活性炭纖維，硅膠是50～300目，活性炭纖維是100～200目。
3．根據(jù)權利要求1所述的清潔純化紫杉醇的方法，其特征是色譜柱用填充硅膠和活性炭纖維在裝柱之前在90～120℃溫度下烘干活化1～3天。
4．根據(jù)權利要求1所述的清潔純化紫杉醇的方法，其特征是上述色譜柱中使用過的硅膠和活性炭纖維在250～350℃下加熱活化1～3天，可再生使用。
全文摘要
本發(fā)明是一種純化紫杉醇粗產物,清潔制備精產品的方法。該方法使用填充色譜柱,常壓下經梯度淋洗含10～48%紫杉醇的粗產品,以50～300目硅膠填充制備的色譜柱,用無毒性的正構烷烴(正戊烷～正辛烷)、乙酸酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯)為淋洗劑,常壓下分離純化紫杉醇。淋洗后的溶液經旋轉蒸發(fā)回收溶劑,溶液濃縮后的分段產物經真空冷凍干燥,獲得99.5%～99.9%的紫杉醇。該方法工藝簡單,成本低,純化過程無污染,溶劑、淋洗劑可以回收,便于工業(yè)化生產。
文檔編號C07D305/00GK1222518SQ9812194
公開日1999年7月14日 申請日期1998年10月10日 優(yōu)先權日1998年10月10日
發(fā)明者陳建民, 鄧名莉, 鄭志堅, 王康躍, 鮑余欽 申請人:復旦大學