專利名稱：新的人谷胱苷肽過氧化酶、其編碼序列及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為谷胱苷肽過氧化酶家族的一個新成員。
谷胱苷肽過氧化酶家族成員廣泛存在于生物體的各個組織、器官中，以谷胱苷肽為還原劑催化有機過氧化物和過氧化氫的還原，保護細胞在正常的氧代謝中不受到損傷(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。
早在1957年，就在生物體內(nèi)檢測到谷胱苷肽過氧化酶(glutathioneperoxidase，簡稱為“GPx”，又名“GSHPx”)，并發(fā)現(xiàn)它有重要的生理活性(J.Biol.Chem.，1957(229)，189-197)。
1973年由Rotruck小組和Flohe小組同時發(fā)現(xiàn)谷胱苷肽過氧化酶的每一個單體都有一個硒(Science，1973(179)，588-590)，后來發(fā)現(xiàn)該蛋白的第二十一個氨基酸是硒代半胱氨酸，這是第一個被發(fā)現(xiàn)的含硒的蛋白酶。
之后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)磷脂過氧化物谷胱苷肽過氧化酶(phospholipid hydroperoxideGPx，簡稱為“PHGPx”)、血漿谷胱苷肽過氧化酶(glycosylated plasma GPx，簡稱為“pGPx”)、腸胃谷胱苷肽過氧化酶(gastrointestinal GPx，簡稱為“GI-GPx”)(Biochim Biophys Acta，1982(710)，197-211，J.Biol.Chem，1987(262)，17398-17403，Arch.Biochem.Biophys.，1987(254)，9-17)等含硒的過氧化酶。
目前，谷胱苷肽過氧化酶家族主要由上述四種硒蛋白酶組成，編碼GPx、GI-GPx、pGPx和PHGPx的四個基因分別命名為GPx1、GPx2、GPx3和GPx4(Arch.Biochem.Biophys.，1997，Vol340(1)，59-63)。除磷脂過氧化物谷胱苷肽過氧化酶是分子量為19kD的單體外，其余三種酶均為四聚體，每個單體分子量約為22kD。三種四聚體酶之間的同源性較高，而它們與單聚體的磷脂過氧化物谷胱苷肽過氧化酶之間同源性只有30％。但該單聚體酶的7個外顯子中的兩個與四聚體酶的兩個外顯子具有極高的同源性，足以證明它們屬于同一基因家族(Methods in Enzymol，1995(252)，38-53)。
該家族成員中，(1)谷胱苷肽過氧化酶存在于所有細胞中，(2)磷脂過氧化物谷胱苷肽過氧化酶特異性地還原磷脂的過氧化物衍生物以及膜和低密度脂蛋白(LDL)中的膽甾醇和膽甾醇酯(J.Biol.Chem.，1990(265)，454-461)，(3)腸胃谷胱苷肽過氧化酶則主要存在于胃腸道中(J.Biol.Chem，1993(268)，2571-2576)，上述三種酶均為細胞內(nèi)酶。而血漿谷胱苷肽過氧化酶為細胞外酶，主要存在于血漿中(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。作為該家族中唯一的細胞外酶，血漿谷胱苷肽過氧化酶與其它三種酶有著顯著的差別它與其它三種酶在蛋白質(zhì)水平上僅有44％的同一性，因此抗血漿谷胱苷肽過氧化酶的抗體不會與其它三種酶有交叉反應(yīng)(Blood，1986(68)，640-645)；而且，血漿谷胱苷肽過氧化酶有糖基化修飾，其它三種酶沒有(Blood，1989(73)，318-320)。四種酶在一級結(jié)構(gòu)中雖有差異，但它們的活性位點尤其是催化位點的硒代半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺，是非常保守的，這三處殘基與酶和底物谷胱苷肽(glutathione，GSH)結(jié)合的特異性有關(guān)(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，327-332)。該家族的結(jié)構(gòu)特征是，都具有由通常作為終止密碼子TGA所編碼的硒代半胱氨酸(EMBO J.，1986，Vol5(6)，1221-1227)。
谷胱苷肽過氧化酶家族成員均可將SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2轉(zhuǎn)變成H2O而清除之，從而防止了羥自由基(·OH)、·O2的產(chǎn)生，進而防止脂質(zhì)過氧化物的生成(中國地方病學(xué)雜志，1991(6)，337)。研究表明，自由基和脂質(zhì)過氧化物的形成，會導(dǎo)致細胞膜損害，被認為是許多疾病的主要病因，如動脈粥樣硬化、冠心病和糖尿病等心血管疾病。由于該家族成員能有效的降低過氧化物的毒性，因此與多種疾病的機制有關(guān)，在病理研究和臨床應(yīng)用上都具有重要的意義。其中，血漿谷胱苷肽過氧化酶是血漿中最主要的過氧化酶，由腎臟合成后分泌到血漿中，負責(zé)血漿中所有過氧化物的還原反應(yīng)(J.Biol.Chem，1994，Vol269(43)，27066-27073)。
人體中這四種谷胱苷肽過氧化酶都已發(fā)現(xiàn)。其中，人的血漿谷胱苷肽過氧化酶基因(pGPx)已經(jīng)于1993年被Shinichi Y等人克隆(Gene，1994(145)，293-297)。
然而，在本申請之前，沒有公開過本發(fā)明所涉及的人谷胱甘肽過氧化酶或其序列。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼谷胱苷肽過氧化酶基因家族的一個新成員，本發(fā)明新的人谷胱苷肽過氧化酶基因被命名為pGPxH。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的谷胱苷肽過氧化酶蛋白家族成員，該酶被命名為pGPxH。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人谷胱苷肽過氧化酶的方法。
本發(fā)明還涉及這種人谷胱苷肽過氧化酶編碼序列和多肽的應(yīng)用。
本發(fā)明中新的蛋白與人的pGPx具有較高的同源性，它們在蛋白水平上有91％同一性。鑒于兩者之間存在著一定的差別，因此將其命名為pGPxH。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從16-696位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的pGPxH蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人pGPxH蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人pGPxH蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人pGPxH蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人pGPxH蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人pGPxH蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為707個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于16-696位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、 純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“pGPxH蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中16-696位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框16-696位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中16-696位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，較佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人pGPxH相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“pGPxH蛋白多肽”指具有人pGPxH蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人谷胱苷肽過氧化酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括pGPxH蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與pGPxH DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗pGPxH多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含pGPxH多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了pGPxH多肽的可溶性片段。通常，該片段具有pGPxH多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供pGPxH蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然pGPxH多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人pGPxH保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表 1
本發(fā)明還包括pGPxH多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)pGPxH的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有pGPxH核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼pGPxH的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測pGPxH核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于pGPxH多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對pGPxH DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于pGPxH基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與pGPxH基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制pGPxH蛋白的分子，也包括那些并不影響pGPxH蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的pGPxH基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的pGPxH基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達pGPxH或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷pGPxH功能的抗體以及不影響pGPxH功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用pGPxH基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與pGPxH基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人pGPxH核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆人載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為707個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于16-696立核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的以人腎λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A5′-GCGCCCCAGCCCGCCATGGC-3′和反向引物B5′-ACGGCAATCAGTTACTTCCTC TTC-3′進行PCR，獲得707bp的目的片段，測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
根據(jù)同源比較的結(jié)果，本發(fā)明的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列與不同來源的谷胱苷肽過氧化酶顯示了顯著的同源性，因此，這表明它是谷胱苷肽過氧化酶家族的一個新成員，并且具有谷胱苷肽過氧化酶家族蛋白的一些重要功能。
谷胱苷肽過氧化酶家族成員都以谷胱苷肽為還原劑，催化有機過氧化物和過氧化氫的還原，保護細胞在正常的氧代謝中不受到損傷(Nutri.Rev.，1980(38)，265-273)。具體機制是該家族成員均可將SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2轉(zhuǎn)變成H2O而清除之，從而防止了羥自由基(·OH)、·O2產(chǎn)生，進而防止脂質(zhì)過氧化物的生成(中國地方病學(xué)雜志，1991(6)，337)。本發(fā)明的pGPxH能降低過氧化物的毒性，因而可能與多種疾病的機制有關(guān)，在病理研究和臨床應(yīng)用上都具有重要的意義。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人pGPxH與鼠pGPx(MpGPx)的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標出。
圖2為本發(fā)明的人pGPxH與鼠pGPx(MpGPx)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖3為本發(fā)明的人pGPxH與人pGPx(pGPx)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1pGPxH的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腎λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A5′-GCGCCCCAGCCCGCCATGGC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B5′-ACGGCAATCAGTTACTTCCTCTTC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷為約700bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共707bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于16-696位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出pGPxH的氨基酸序列，共226個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較用本發(fā)明的pGPxH的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST軟件進行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它與谷胱苷肽過氧化酶家族的成員具有很高的同源性。其中與人的血漿谷胱苷肽過氧化酶基因pGPx在蛋白水平上達到91％同一性，95％相似性(圖3)，與鼠的血漿谷胱苷肽過氧化酶基因pGPx在核酸水平上達到98.4％同一性(圖1)，在蛋白水平上達到97.8％同一性，98.2％相似性(圖2)。因此，這表明本發(fā)明的新蛋白是一種新的血漿谷胱苷肽過氧化酶。
特別是在本發(fā)明的pGPxH的氨基酸序列中存在由通常意義上的終止密碼子TGA所編碼的硒代半胱氨酸(簡稱為“SeCys”)(SEQ ID NO.4中第73位氨基酸)。該TGA密碼子在翻譯時連讀，從而使硒代半胱氨酸在蛋白翻譯時就進入蛋白多肽鏈，而非后來的修飾形成的。
為了實現(xiàn)正確的解讀TGA(在mRNA中為UGA)終止密碼子，將硒代半胱氨酸插入硒蛋白，需要一套復(fù)雜的翻譯機制。該機制在原核生物中已基本闡明(TIBS，1991(16)，463-467)，但真核生物中的機制還有待繼續(xù)研究。已知，在原核生物中涉及四個基因，分別為SelA、B、C和D(TIBS，1991(16)，463-467)。由SelC編碼一種特殊的tRNASer，這種tRNASer較通常的tRNA大，反密碼子為與終止密碼子UGA互補的UCA，攜帶的氨基酸為絲氨酸(Nature，1988(331)，723-725)。在由SelA編碼的tRNASeCys(攜帶硒代半胱氨酸的tRNA)合成酶和硒磷酸酶的催化下，tRNASer轉(zhuǎn)化為tRNASeCys(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990(87)，543-547)。由SelB編碼的輔助因子既可以識別特定的UGA，又能與tRNASeCys特異性地結(jié)合(Nature，1989(342)，453-456)。在輔助因子的幫助下，tRNASeCys在UGA對應(yīng)的位置上插入了硒代半胱氨酸。上述過程中，硒磷酸酶是由SelD編碼的酶利用ATP和硒合成的(J.Bacteriol，1988(170)，540-546)。SelD被認為是表達硒蛋白的決定因子(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，163-176)。上述四種基因最初均在E.coli中發(fā)現(xiàn)，目前，除SelB外，其余三種基因均已在真核生物中找到同源基因，功能與原核生物中相似。
將終止密碼子TGA翻譯為硒代半胱氨酸是谷胱苷肽過氧化酶家族共同的結(jié)構(gòu)特征(EMBO J，1986，Vol5(6)，1221-1227)，因此，這更確定了本發(fā)明的血漿谷胱苷肽過氧化酶屬于該家族，并具有該谷胱甘肽過氧化酶家族蛋白的相關(guān)功能。
研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的pGPxH的5’端編碼了一段信號肽(SEQ ID NO.4第24、25位氨基酸之間為切割位點)，與血漿谷胱苷肽過氧化酶在細胞內(nèi)合成后分泌到血漿中這一特點符合。
研究表明，脂質(zhì)過氧化物是不飽和脂肪酸酶解反應(yīng)和非酶解反應(yīng)的主要產(chǎn)物。它們是前列腺素、白三烯等生物活性分子合成過程中的中間物。脂質(zhì)過氧化物可以與過渡金屬復(fù)合物和金屬蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒性很高的自由基(Cytochrome，1986，29-76，Plenum Press)。除自由基的毒性外，過氧化物的毒性還表現(xiàn)在它們在花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng)中有調(diào)節(jié)酶活性的作用(N.Engl.J.Med.，1979(300)，1142-1147)。自由基和脂質(zhì)過氧化物的形成，導(dǎo)致細胞膜損害，被認為是許多疾病的主要病因，如動脈粥樣硬化、冠心病和糖尿病等心血管疾病。近年來研究已發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣病變伴隨有脂質(zhì)過氧化物水平的升高(微量元素與健康研究，1996，13卷1期，61-63)。在正常的代謝中，主要由過氧化酶將脂質(zhì)過氧化物還原為相應(yīng)的醇。谷胱苷肽過氧化酶家族成員均可將SOD歧化超氧自由基(·O2)而生成的H2O2轉(zhuǎn)變成H2O而清除之，從而防止了羥自由基(·OH)、·O2的產(chǎn)生，進而防止脂質(zhì)過氧化物的生成(中國地方病學(xué)雜志，1991(6)，337)。下列多種疾病的發(fā)生與該家族成員有關(guān)。如(1)在心臟中，該家族成員是消除H2O2的重要酶類。酶活性降低時，未被及時消除的活性氧使得細胞膜上不飽和脂肪酸活性氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，使心臟中脂質(zhì)過氧化物的濃度增高，損害膜結(jié)構(gòu)和功能，使膜的流動性與通透性異常，心肌對過氧化物的解毒能力明顯減少，最終導(dǎo)致心肌細胞不可逆損傷，及主細胞壞死(中國地方病學(xué)雜志，1992，11(2)，81)。
(2)動脈粥樣硬化以脂質(zhì)代謝紊亂為特征，是冠心病等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。動脈粥樣硬化患者體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物濃度升高，易形成血栓，以及血管壁損傷區(qū)膽固醇沉積和血管平滑肌增生。體內(nèi)含硒谷胱苷肽過氧化酶的活性增高能大量破壞在血管壁損傷處集聚的膽固醇，調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂代謝，防止或逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化過程的發(fā)生(老年學(xué)雜志，1991，11(1)，49)。冠心病患者體內(nèi)谷胱苷肽過氧化酶活性增加，可以減輕脂質(zhì)過氧化作用，加速心肌梗塞細胞的修復(fù)過程，增加冠狀血管的血流量，降低心肌耗氧量，有利于心肌細胞功能的改善。
谷胱甘肽過氧化酶家族成員的活性與微量元素硒有關(guān)，因為在所有谷胱苷肽過氧化酶的活性中心，硒以硒代半胱氨酸的形式連接在酶的肽鏈上。在臨床應(yīng)用上，可以在急需提高抗氧化能力的病患(如慢性腎衰、冠心病患者)體內(nèi)增加硒的含量，調(diào)節(jié)過氧化酶活性。但在某些組織中，谷胱苷肽過氧化酶還原脂質(zhì)過氧化物生成白三烯的前體，該前體參與如哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥反應(yīng)。因此在設(shè)計關(guān)節(jié)炎的藥物中，可以考慮將谷胱苷肽過氧化酶的拮抗物作為減輕炎癥的藥物(J.Biol.Chem.，1984(259)，1043-1050)。
血漿谷胱苷肽過氧化酶是血漿中最主要的過氧化酶，血漿中幾乎所有過氧化物的還原反應(yīng)均由其負責(zé)(J.Biol.Chem.，1987，Vol262(36)，17398-17403)。由于血漿谷胱苷肽過氧化酶在血漿中的特殊位置，因此除上述該家族成員的共同功能外，血漿谷胱苷肽過氧化酶還特異性地與多種疾病的機制有關(guān)。如由于血漿谷胱苷肽過氧化酶的主要產(chǎn)生與分泌均在腎臟，因此與動脈硬化和尿毒癥在腎衰病中的病理有關(guān)。慢性腎衰病人的腎內(nèi)存在大量活性氧簇，抗氧化能力卻下降，因而無法及時清除活性氧簇，使得活性氧簇對腎功能惡化的作用更為突出，具體的毒性表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化、膜通透性增加、蛋白質(zhì)生物活性受損、細胞受到廣泛的損傷，功能減退或喪失，失去恢復(fù)與增殖能力。提高過氧化酶活性，可以改善慢性腎衰或者體內(nèi)清除活性氧簇的能力延緩慢性腎衰的發(fā)展。(J.Lab Clin Med.，1994(124)，468-469)本發(fā)明新的血漿谷胱甘肽過氧化酶對于血漿谷胱苷肽過氧化酶的結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，以及病理研究和臨床應(yīng)用都具有重要的意義。
本發(fā)明的人pGPxH除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人pGPxH還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人pGPxH的C端與鼠的pGPx的C端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人pGPxH的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員，比如鼠pGPx蛋白)。
此外，本發(fā)明人pGPxH核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人pGPxH的表達水平或者抑制人pGPxH的過度表達。本發(fā)明的人pGPxH蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人pGPxH缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實施例3pGPxH在大腸桿菌中的表達編碼pGPxH的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中的PCR擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGGATCCATGCAAGAGAAGTCTAAGA-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是起始密碼子和從SEQ IDNO.3中第88位核苷酸開始的pGPxH編碼序列的16個核苷酸(在SEQ ID NO.3中從第16位核苷酸(A)至第87位核苷酸(A)編碼的是一段信號肽序列，在大腸桿菌中表達時將這段序列去除)；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTTACTTCCTCTTGACCCCC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和pGPxH的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體，隨后將同樣消化過的插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E-coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒，用ApaI酶切鑒定插人片段大小及方向，測序驗證結(jié)果表明pGPxH的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中(在培養(yǎng)基中添加有10％胎牛血清和5ng/ml的亞硒酸鈉)，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的pGPxH。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫pGPxH?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為23kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4pGPxH在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼pGPxH的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中的PCR擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCAAGCTTATGGCCCGGATCCTCCGGG-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的pGPxH編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’GTTCGGATCCTTACTTCCTCTTGACCCCC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和pGPxH的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3載體，隨后將同樣消化過的插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證結(jié)果表明pGPxH的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆(并在培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清和7.5ng/ml的亞硒酸鈉。雖然在真核生物中硒代半胱氨酸摻入蛋白的表達機制尚未完全闡明，但研究表明，在培養(yǎng)基中提高硒的含量，就可顯著地促進硒蛋白的表達(Biomed.Environ.Sci.，1997(10)，163-176))。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為25kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將如上獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀pGPxH基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱新的人谷胱苷肽過氧化酶、其編碼序列及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GCGCCCCAGC CCGCCATGGC 20(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2ACGGCAATCA GTTACTTCCT CTTC24(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)長度707bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3GCGCCCCAGC CCGCCATGGC CCGGATCCTC CGGGATTCCT GCCTTCTGTC CCTGCTCCTG 60GCCGGGTTTG TTCCGCCGGG CCGGGGACAA GAGAAGTCTA AGACAGACTG CCATGGCGGT 120ATGAGTGGTA CCATCTACGA GTATGGAGCC CTCACCATCG ATGGGGAGGA ATACATTCCT 180TTTAAGCAGT ATGCAGGCAA ATATATCCTC TTTGTCAACG TAGCCAGCTA CTGAGGTCTG 240ACAGACCAAT ACCTTGAACT GAATGCACTA CAAGAAGAAC TTGGGCCATT TGGCTTGGTC 300ATTCTGGGCT TCCCTTCCAA CCAATTTGGC AAACAGGAGC CAGGCGAGAA CTCGGAGATA 360CTCCCCAGTC TCAAGTATGT TCGACCAGGT GGGGGCTTTG TGCCTAATTT CCAGCTCTTT 420GAGAAAGGAG ATGTGAACGG GGAGAAAGAG CAGAAATTCT ACACTTTCCT GAAGAACTCC 480TGTCCTCCCA CTGCAGAGCT CCTGGGCTCA CCTGGCCGCC TCTTTTGGGA ACCCATGAAG 540ATCCATGACA TCCGCTGGAA CTTTGAGAAG TTCCTGGTGG GGCCAGATGG TATACCGGTT 600ATGCGCTGGT ACCACCGGAC CACAGTCAGC AACGTCAAGA TGGACATCCT GTCCTACATG 660AGGCGGCAGG CAGCCCTGGG GGTCAAGAGG AAGTAACTGA TTGCCGT 707(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度226個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(A)描述/desc＝＂第73位的Xaa是由TGA編碼的硒代半胱氨酸＂(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Arg Ile Leu Arg Asp Ser Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu 15Ala Gly Phe Val Pro Pro Gly Arg Gly Gln Glu Lys Ser Lys Thr 30Asp Cys His Gly Gly Met Ser Gly Thr Ile Tyr Glu Tyr Gly Ala 45Leu Thr Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Ile Pro Phe Lys Gln Tyr Ala 60Gly Lys Tyr Ile Leu Phe Val Asn Val Ala Ser Tyr Xaa Gly Leu 75Thr Asp Gln Tyr Leu Glu Leu Asn Ala Leu Gln Glu Glu Leu Gly 90Pro Phe Gly Leu Val Ile Leu Gly Phe Pro Ser Asn Gln Phe Gly 105Lys Gln Glu Pro Gly Glu Asn Ser Glu Ile Leu Pro Ser Leu Lys 120Tyr Val Arg Pro Gly Gly Gly Phe Val Pro Asn Phe Gln Leu Phe 135Glu Lys Gly Asp Val Asn Gly Glu Lys Glu Gln Lys Phe Tyr Thr 150Phe Leu Lys Asn Ser Cys Pro Pro Thr Ala Glu Leu Leu Gly Ser 165Pro Gly Arg Leu Phe Trp Glu Pro Met Lys Ile His Asp Ile Arg 180Trp Asn Phe Glu Lys Phe Leu Val Gly Pro Asp Gly Ile Pro Val 195Met Arg Trp Tyr His Arg Thr Thr Val Ser Asn Val Lys Met Asp 210Ile Leu Ser Tyr Met Arg Arg Gln Ala Ala Leu Gly Val Lys Arg 225Lys 226(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGCAAGAGA AGTCTAAGA 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TTACTTCCTC TTGACCCCC29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGGCCCGGA TCCTCCGGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TTACTTCCTC TTGACCCCC29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列。
4.一種分離的pGPxH蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產(chǎn)生具有pGPxH蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有pGPxH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成pGPxH蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成pGPxH蛋白的重組細胞；(c)在適合表達pGPxH蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有pGPxH蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸16-696位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的pGPxH蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新的谷胱苷肽過氧化酶基因家族的成員pGPxH。本發(fā)明提供了該新谷胱苷肽過氧化酶的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人谷胱苷肽過氧化酶的方法。本發(fā)明還提供了這種新的人谷胱苷肽過氧化酶的應(yīng)用。
文檔編號C07H21/04GK1256312SQ9812197
公開日2000年6月14日 申請日期1998年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月29日
發(fā)明者余龍, 屠強, 傅強, 趙勇, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)