專利名稱：一種新的人蛋白質及其編碼序列,以及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人Rab4b的cDNA序列，該蛋白是大鼠Rab4的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
在真核細胞內(nèi)，膜泡運輸是胞內(nèi)物質運輸?shù)闹匾绞?。細胞的?nèi)吞作用，胞吐作用，內(nèi)質網(wǎng)與高爾基體之間、高爾基體各囊膜之間的物質運輸過程，以及高爾基體形成溶酶體的過程都是由各類運輸小泡所介導的。運輸小泡以出芽的方式從供體膜上產(chǎn)生，然后通過與特定受體膜的融合，將小泡中包含的物質轉運到另一細胞器中或者實現(xiàn)細胞內(nèi)外物質的交流。
研究表明，一類低分子量的GTP/GDP結合蛋白Ypt/Rab蛋白，在調節(jié)膜泡運輸過程中起著重要的作用。Ypt/Rab蛋白和Ras蛋白同屬于GTP/GDP結合蛋白超家族。它們在蛋白結構上存在四個與GTP/GDP結合作用相關的保守區(qū)域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989，341(6239)209-214)。除此之外，在Ypt/Rab蛋白家族中，保守的位點還有DTAGQE區(qū)前的色氨酸，DTAGQE區(qū)后相距約10個氨基酸的精氨酸以及SAK/L區(qū)后的苯丙氨酸等。
在釀酒酵母(S.cerevisiae)中的Ypt/Rab家族成員共有11個(Ypt1，Sec4，Ypt31，Ypt32，Ypt51，Ypt52，Ypt53，Ypt6，Ypt7，Ypt10，Ypt11)(TrendsBiochem Sci1997；22(12)468-472)；在哺乳動物中，已發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白約有40個，如Rab1，Rab3，Rab8，Rab10，Rab30等。1987年，Touchot，N.等首先報導從大鼠腦cDNA庫中分離了Rab4 cDNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，84(23)，8210-8214)。1989年，Zahraoui A等又從人的副神經(jīng)節(jié)瘤cDNA庫中也分離到了大鼠Rab4的同源基因。以后在小鼠、Dictyostelium discoideum(一種網(wǎng)柱菌屬生物)等中了也發(fā)現(xiàn)了Rab4的同系物。
Ypt/Rab蛋白家族成員的多樣性提示，不同的蛋白可能在不同的膜泡運輸途徑的不同步驟中發(fā)揮作用。例如，Sec4蛋白參與了高爾基體分泌小泡向質膜的運輸過程(Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被證明介導了極化的MDCK細胞中由TGN區(qū)向基底外側區(qū)的膜泡運輸(J Cell Biol 1993；123(1)35-45)。Rab1與從內(nèi)質網(wǎng)到高爾基體順式面及隨后的從高爾基體順式面到中間高爾基體的囊泡運輸有關(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)；Rab3A可能在神經(jīng)遞質的釋放有關(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。Rab4和Rab5則參與了核內(nèi)體的融合過程，并被認為控制了內(nèi)吞過程的限制性步驟(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
Rab蛋白在介導膜泡運輸過程中還涉及到其它因子如GDP解離抑制因子(GDP-dissociation inhibitor，GDI)，GTP/GDP交換因子(GTP/GDP-exchangefactor，GEF)，GTP酶活化因子(GTPase-activating protein，GAP)，GDI置換因子(GDI-displacement factor，GDF)的共同作用。
在介導膜泡運輸中Rab蛋白的循環(huán)過程如下(a)在細胞質中，GDI與Rab-GDP結合，抑制了Rab蛋白非選擇性地與膜結合。(b)Rab-GDP在牻牛兒基牻牛兒基轉移酶(geranylgeranyltransferase，簡稱為“GGTase”)的作用下，使Rab蛋白C末端兩個半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化是Rab與質膜結合所必需的。GGTase包含兩個組分組分A又稱Rab護衛(wèi)蛋白(Rab escort protein，REP)，此蛋白與未異戊二烯化的Rab蛋白結合并將其呈遞給催化組分B，催化組分B負責催化半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化的Rab蛋白在GIP作用下定位于特定的供體膜上(Cell 1993；73(6)1091-1099)。當Rab-GDP結合于供體膜上時，GDI在GDF作用下從Rab上解離下來。(c)在GEF催化作用下，GTP替換下了Rab上的GDP從而活化了Rab。(d)運輸小泡以出芽方式從供體膜上產(chǎn)生。(e)在GTP-Rab的介導下(或者還有受體膜上的效應分子的共同作用下)，運輸小泡與受體膜結合，GTP在GAP催化下發(fā)生水解。(f)GDI與受體膜上的Rab結合，將Rab重新釋放到細胞質中(Curr Opin Cell Biol，1997，9(4)496-504)。
此外，Rab蛋白與某些疾病存在一定的相關性。例如，1993年Culine S.等報道，在Sezary綜合征病人的外周血單核細胞中，Rab2表現(xiàn)為過度表達，這提示Rab2可能在腫瘤發(fā)生的免疫反應中發(fā)生作用(Leuk Lymphoma 1998；28(5-6)515-522)。
然而，在本申請之前，還沒有公開或發(fā)表過本發(fā)明所涉及的這種Rab蛋白或其編碼序列。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Rab/Ypt家族的一個新成員，本發(fā)明的Rab/Ypt家族成員被命名為人Rab4b。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人的Rab/Ypt家族成員，該蛋白被命名為人Rab4b蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產(chǎn)所述的新的人的Rab4b多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的Rab4b核酸序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人Rab4b蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人Rab4b蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Rab4b蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Rab4b蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Rab4b蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Rab4b蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為988個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于89-730位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發(fā)明中，術語“人Rab4b蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人RAB4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中89-730位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框89-730位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中89-730位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人Rab4b相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“人Rab4b蛋白多肽”指具有人Rab4b蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人高效淋巴細胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人Rab4b蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人Rab4b DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Rab4b多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Rab4b多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人Rab4b多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Rab4b多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Rab4b蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Rab4b多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Rab4b保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人Rab4b多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)人Rab4b的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針和引物的核酸分子，該分子通常具有人Rab4b多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人Rab4b的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人Rab4b核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于人Rab4b多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用各種市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人Rab4b DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人Rab4b基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Rab4b基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人Rab4b蛋白的分子，也包括那些并不影響人Rab4b蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Rab4b基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人Rab4b基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人Rab4b或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)6511，1976；Kohler等人，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Rab4b功能的抗體以及不影響人Rab4b功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人Rab4b基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Rab4b基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人Rab4b核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，人Rab4b的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15’-AGATTACTATGGAGATCTGGCTG -3′為正向引物，寡核苷酸A25′-GGAGCTCTTGGGATATGGTTAGG-3’為反向引物，進行PCR。測序后得到SEQID NO.3的全長cDNA序列。
Rab/Ypt家族調控了真核細胞內(nèi)的膜泡運輸。Rab/Ypt家族成員的多樣性提示不同成員在膜泡運輸?shù)牟煌緩讲煌襟E中發(fā)揮作用。對已發(fā)現(xiàn)的一些Rab4基因/蛋白的研究顯示，Rab4與早期內(nèi)吞體相聯(lián)系(Proc.Nat.Acad.Sci.USA1991，88，6313-6317；J.Cell.Biol.1993，121，997-1010)并且被認為可能參與了細胞表面受體(如轉鐵蛋白受體)從內(nèi)吞體到細胞膜表面的循環(huán)過程(Cell，1992，70，729-740)。這樣，Rab4向胞質的分配可能既影響了胞吐過程，也影響了胞吐過程。特別是有關實驗說明，Rab4與攜帶葡萄糖轉運復合物GLUT4的囊泡緊密聯(lián)系，可能與胰島素誘導的GLUT4的轉移有關，從而與胰島素的作用機制相關。另外，實驗還暗示Rab4還可能參與了有絲分裂期膜運輸?shù)囊种茩C制。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人Rab4b(hRab4b)與狗Rab4蛋白(dRab4)和大鼠Rab4b蛋白(rRab4b)之間的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人Rab4b的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15’-AGATTACTATGGAGATCTGGCTG-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25’-GGAGCTCTTG GGATATGGTTAGG-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1000bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序將上述PCR擴增產(chǎn)物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共988bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于89-730位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導出人Rab4b的氨基酸序列，共213個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較用本發(fā)明的人Rab4b的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發(fā)現(xiàn)，它們與Rab/Ypt家族基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，例如，它與狗Rab4、大鼠Rab4b、小鼠Rab4a、人Rab4a等在蛋白水平上的同一性(又稱為“相同性”)分別達到98％(圖1)、98％(圖1)、84％和84％。另外，與Rab/Ypt家族的其他成員如Rab2，Sec4，Ypt1等也具有很高同源性(數(shù)據(jù)未給出)。
對氨基酸保守區(qū)的研究分析表明，本發(fā)明的人Rab4b蛋白與其同系物在蛋白結構上存在四個與GTP/GDP結合作用相關的保守區(qū)域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989，341(6239)209-214)，因此，本發(fā)明的人Rab4b蛋白可歸入GTP/GDP結合蛋白超家族。除此之外，本發(fā)明的人Rab4b蛋白還具有Ypt/Rab蛋白家族特異保守位點如DTAGQE區(qū)前的色氨酸，DTAGQE區(qū)后約10個氨基酸距離的精氨酸以及SAK/L區(qū)后的苯丙氨酸等。這都進一步證實了本發(fā)明蛋白是Rab4b蛋白在人體中的同系蛋白。
Rab4已被證實與早期內(nèi)吞體相聯(lián)系(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；J.Cell.Biol.1993，121，997-1010)，并且被認為可能參與了細胞表面受體(如轉鐵蛋白受體)從內(nèi)吞體到細胞膜表面的循環(huán)過程(Cell，1992，70，729-740)。這樣，Rab4向胞質的分配可能即影響了胞吐過程，也影響了胞吐過程。
體外研究顯示，Rab4可以作為cdc2這一在有絲分裂期表現(xiàn)活力的激酶的底物，特別是在完整細胞及體外實驗中都證實了，Rab4羧基端cdc2識別位點的點突變會影響cdc2對Rab4的磷酸化(Nature，1991，350，715-718；EMBO J，1992，11，4379-4389)。1997年，Ayad，N等發(fā)現(xiàn)在有絲分裂細胞中，Rab4的磷酸化與它在胞質中的聚集過程相聯(lián)系(EMBO J，1997，16(15)，4497-4507)。以上事實都暗示，Rab4的磷酸化可能與細胞有絲分裂期間膜運輸?shù)囊种朴嘘P。
胰島素的一個主要作用是促進肌細胞和脂肪細胞對葡萄糖的攝取。這些細胞表達有對胰島素敏感的葡萄糖轉運復合物GLUT4。在胰島素刺激下，攜帶該復合物的囊泡由胞內(nèi)移至細胞表面，從而激發(fā)了細胞對葡萄糖的攝取(J.Biol.Chem.1980，255，4758-4762；Eur.J.Biochem.1994，219，713-725)，然而對其中胰島素誘導的GLUT4的轉動運程的機制仍不清楚，據(jù)認為應和胞吐作用相關。Rab4在大鼠脂肪細胞(J.Biol.Chem.1993，268，19491-19497)和3T3-L1脂肪細胞(FEBS Lett，1994，347，42-44)中都有表達，并且與攜帶GLUT4的囊泡緊密聯(lián)系(J.BIOL.Chem.1993，268；Biochem.Biochem.Res.Commun.1995，215，321-328；Endocrinology 1996，137，266-273)。胰島素的作用使得Rab4從囊泡轉移到了胞質中(J.Biol.Chem.1993，268)，當胰島素不再作用時，這一過程可以被逆轉，所以Rab4可能與胰島素誘導的GLUT4的轉移有關。上述猜測已被進一步的實驗所證實。Shibata，H.等人發(fā)現(xiàn)受胰島素誘導的Rab4上的鳥嘌呤核苷酸交換是以一種wortmannin敏感方式進行的，這證明了Rab4是受胰島素誘導的磷酯酰肌醇3激酶的底物(J.Biol.Chem.1997，272(23)，14542-14546)。另一個實驗中，對3T3-L1注射無論是Rab4的GTP結合缺陷型，還是Rab4的抗體都能使GLUT4的轉運明顯下降(Endocrinology，1997，138(11)，4941-4949)而對照組則無這些現(xiàn)象。由于胰島素同樣能誘導3T3-L1細胞的細胞骨架重排(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，93，8401-8406)；對于Rab4在這方面的作用同樣進行了上述實驗并初步證實了Rab4在其中的作用。
本發(fā)明的人Rab4b不僅可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人Rab4b還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人Rab4b的N端與小鼠的Rab4蛋白的N端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人Rab4b的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人Rab4b核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人Rab4b的表達水平或者抑制人Rab4b的過度表達。本發(fā)明的人Rab4b蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人Rab4b缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人Rab4b在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼人Rab4b的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人Rab4b cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGTCGACATGGCTGAAGACAGACACT-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人Rab4b編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGAAGCTTTCAGCAGCCACACGGCTGAG-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和人Rab4b的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人Rab4b的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Rab4b。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人Rab4b。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約24KDa。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人Rab4b在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人Rab4b的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人Rab4b cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGGCTGAAGACAGACACT-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人Rab4b編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGGAATTCTCAGCAGCCACACGGCTGAG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人Rab4b的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(f1 ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，測序驗證人Rab4b的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為24Da。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人Rab4b基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白特異性地發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發(fā)明名稱一種新的人蛋白質及其編碼序列，以及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1AGATTACTAT GGAGATCTGG CTG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GGAGCTCTTG GGATATGGTT AGG 23(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)長度988bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3AGATTACTAT GGAGATCTGG CTGCTCGCCT GGGCTATTTC CCCAGTAGCA TTGTCCGAGA 60GCACAGACCC TGAAACCTGG CAAAGTCGAT GGCTGAAGAC AGACACTTCC TCTTCAAATT 120CCTGGTGATT GGCAGTGCAG GAACTGGCAA ATCATGTCTC CTTCATCAGT TCATTGAGAA 180TAAGTTCAAA CAGGACTCCA ACCACACAAT CGGCGTGGAG TTTGGATCCC GGGTGGTCAA 240CGTGGGTGGG AAGACTGTGA AGCTACAGAT TTGGGACACG GCTGGCCAGG AGCGGTTTCG 300GTCAGTGACG CGGAGTTATT ACCGAGGGGC GGCTGGAGCC CTGCTGGTGT ACGACATCAC 360CAGCCGGGAG ACATACAACT CACTGGCTGC CTGGCTGACG GATGCCCGCA CCCTGGCCAG 420CCCCAACATC GTGGTCATCC TCTGTGGCAA CAAGAAGGAC CTGGACCCTG AGCGGGAGGT 480CACTTTCCTG GAGGCCTCCC GCTTTGCCCA GGAGAATGAG CTGATGTTCC TGGAGACCAG 540CGCTCTCACA GGCGAGAACG TGGAGGAGGC GTTCCTCAAG TGTGCCCGCA CTATCCTCAA 600CAAGATTGAC TCAGGCGAGC TAGACCCGGA GAGGATGGGC TCTGGCATTC AGTACGGGGA 660TGCGTCCCTC CGCCAGCTTC GGCAGCCTCG GAGTGCCCAG GCCGTGGCCC CTCAGCCGTG 720TGGCTGCTGA GCTCTGTGGA GCCAGCTCAC CTGTTCTCCA GGACCAGCCC TGCTGGGCCC 780AGGCCCAGGC TCTGAGAGGC CGTGTCCTAA CCTGCCCTGG CCCCGGAGAA GCTACGTTGC 840CACCTGTCCC CCTTCCCTGG CCTGGTGGGG CCTGGCTTTG GGGCAAGACT GAGCCACGGG 900GGAAGGGGGA ATCCCGTACC TGCTGCTGCT TCCTCTGTCT TGGCTAACGT CTGTCCCCCT 960GAACCCCTAA CCATATCCCA AGAGCTCC 988(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度213個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽
(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Ala Glu Asp Arg His Phe Leu Phe Lys Phe Leu Val Ile Gly 15Ser Ala Gly Thr Gly Lys Ser Cys Leu Leu His Gln Phe Ile Glu 30Asn Lys Phe Lys Gln Asp Ser Asn His Thr Ile Gly Val Glu Phe 45Gly Ser Arg Val Val Asn Val Gly Gly Lys Thr Val Lys Leu Gln 60Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Ser Val Thr Arg 75Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Tyr Asp Ile 90Thr Ser Arg Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Ala Ala Trp Leu Thr Asp 105Ala Arg Thr Leu Ala Ser Pro Asn Ile Val Val Ile Leu Cys Gly 120Asn Lys Lys Asp Leu Asp Pro Glu Arg Glu Val Thr Phe Leu Glu 135Ala Ser Arg Phe Ala Gln Glu Asn Glu Leu Met Phe Leu Glu Thr 150Ser Ala Leu Thr Gly Glu Asn Val Glu Glu Ala Phe Leu Lys Cys 165Ala Arg Thr Ile Leu Asn Lys Ile Asp Ser Gly Glu Leu Asp Pro 180Glu Arg Met Gly Ser Gly Ile Gln Tyr Gly Asp Ala Ser Leu Arg 195Gln Leu Arg Gln Pro Arg Ser Ala Gln Ala Val Ala Pro Gln Pro 210Cys Gly Cys 213(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGCTGAAG ACAGACACT 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCAGCAGCCA CACGGCTGAG 30(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGCTGAAG ACAGACACT 29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCAGCAGCCA CACGGCTGAG 30
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Rab4b蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產(chǎn)生具有人Rab4b蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Rab4b蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Rab4b蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Rab4b蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Rab4b蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Rab4b蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸89-730位。
12.一種能與權利要求4所述的人Rab4b蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人基因核苷酸序列,更具體地說,本發(fā)明提供了人Rab4b的cDNA序列,該序列編碼的蛋白是大鼠Rab4的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K14/435GK1257124SQ98125320
公開日2000年6月21日 申請日期1998年12月11日 優(yōu)先權日1998年12月11日
發(fā)明者余龍, 張宏來, 屠強, 趙勇, 傅強 申請人:復旦大學