專利名稱：糖尿病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作用于糖代謝的藥物以及糖代謝異常引起的疾病的癥狀改善用或疾病預(yù)防用食品或飲料。
現(xiàn)有技術(shù)糖尿病是高血糖引起的綜合性疾病，大致分為由于缺乏胰島素必須補(bǔ)充其的胰島素依賴性糖尿病以及雖然胰島素的產(chǎn)量充足但由于受體或糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的異常等原因而不能表現(xiàn)出其作用的非胰島素依賴性糖尿病。
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于開(kāi)發(fā)一種可以使血漿成分正?；⒂行е委熁蝾A(yù)防糖尿病等疾病的化合物，提供以該化合物為有效成分的藥物、食品和飲料。課題的解決手段本發(fā)明者為了達(dá)到上述目的進(jìn)行了悉心的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)式1表示的化合物，4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(以下簡(jiǎn)稱為環(huán)戊烯酮)或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的能力、抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的能力，對(duì)于治療或預(yù)防糖尿病是很有用的，從而完成了本發(fā)明。
如果概要的說(shuō)明本發(fā)明的話，本發(fā)明的第1項(xiàng)發(fā)明涉及糖尿病的治療劑或預(yù)防劑，其特征在于含有的有效成分為選自下述式1表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物。
本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明涉及糖尿病改善用食品飲料或糖尿病預(yù)防用食品飲料，其特征在于含有選自上述式1表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物。
圖面說(shuō)明

圖1表示環(huán)戊烯酮的給藥量與血糖值的關(guān)系。
圖2表示環(huán)戊烯酮的給藥量與血清胰島素值的關(guān)系。
圖3表示環(huán)戊烯酮的給藥量與血清甘油三酯值的關(guān)系。
圖4表示環(huán)戊烯酮的給藥量與血清游離脂肪酸值的關(guān)系。
圖5表示環(huán)戊烯酮濃度與腫瘤壞死因子產(chǎn)生的量的關(guān)系。
圖6表示(-)體環(huán)戊烯酮的對(duì)二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(-)體環(huán)戊烯的立體結(jié)構(gòu)。
圖7表示(+)體環(huán)戊烯酮的對(duì)二甲基氨基苯甲酰基衍生物的CD以及(+)體環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)。
發(fā)明的實(shí)施方式以下，具體地說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明所使用的式1表示的環(huán)戊烯酮包括4位和5位羥基的立體構(gòu)型為順式的異構(gòu)體和反式的異構(gòu)體兩者。在本發(fā)明中可以使用順式環(huán)戊烯酮，也可以使用反式環(huán)戊烯酮，還可以使用順式環(huán)戊烯酮和反式環(huán)戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它們的光學(xué)活性體。
順式環(huán)戊烯酮可以采用化學(xué)合成法制得(《瑞士化學(xué)學(xué)報(bào)》Helvetica Chimica Acta，第55卷，第2838～2844頁(yè)(1972))。反式環(huán)戊烯酮也可以采用化學(xué)合成法制得(《碳水化合物研究》Carbohydrate Res.，第247卷，第217～222頁(yè)(1993))，另外也可以通過(guò)加熱處理糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛酸內(nèi)酯)或含有它們的物質(zhì)(參考PCT/JP97/03052號(hào)說(shuō)明書(shū))。在本發(fā)明中可以使用含有環(huán)戊烯酮的這些加熱處理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡萄糖醛酸，通過(guò)將其1％的溶液在121℃條件下加熱處理4小時(shí)，在加熱處理物中可以生成環(huán)戊烯酮。用溶劑提取該加熱處理物中的環(huán)戊烯酮，濃縮提取物。然后用硅膠柱層析法分離該濃縮物，將洗脫出的環(huán)戊烯酮部分濃縮，用氯仿從濃縮物中提取環(huán)戊烯酮，提取濃縮物通過(guò)正相柱層析法分離得到加熱處理物中的環(huán)戊烯酮。
環(huán)戊烯酮的物理性質(zhì)如下所示。另外，環(huán)戊烯酮的質(zhì)量分析是采用DX302質(zhì)量分析儀(日本電子社生產(chǎn))進(jìn)行的。另外，使用重氫氯仿溶劑的NMR波譜測(cè)定使用JNM-A500(日本電子社生產(chǎn))。比旋光度使用DIP-370型旋光計(jì)(日本分光社生產(chǎn))測(cè)定、UV吸收光譜使用UV-2500分光光度計(jì)(島津制作所生產(chǎn))測(cè)定、紅外吸收光譜(IR)使用FTIR-8000紅外分光光度計(jì)(島津制作所生產(chǎn))測(cè)定。MS m/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化學(xué)位移值以CHCl3的化學(xué)位移值7.26ppm為準(zhǔn)。
旋光度〔α〕D200°(c1.3，水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1處有吸收。
分離得到的環(huán)戊烯酮通過(guò)光學(xué)拆分，可以得到(-)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。當(dāng)然，通過(guò)合成方法得到的環(huán)戊烯酮也可以進(jìn)行光學(xué)拆分。
例如，將環(huán)戊烯酮溶解于乙醇。在該乙醇溶液中再加入己烷/乙醇(94/6)，調(diào)制環(huán)戊烯酮溶液。可以將該試樣溶液，例如使用Chiral PackAS(Daicel化學(xué)工業(yè))柱，在柱溫40℃、流動(dòng)相己烷/乙醇(94/6)的條件下進(jìn)行HPLC，從而光學(xué)拆分環(huán)戊烯酮。
拆分得到的(-)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮〔以下稱為(-)體環(huán)戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20-105°(c0.30，乙醇)，(+)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮〔以下稱為(+)體環(huán)戊烯酮〕的旋光度為〔α〕D20+104°(c0.53，乙醇)。另外，旋光度是使用上述DIP-370型旋光計(jì)(日本分光社生產(chǎn))來(lái)測(cè)定的。
以下，按照上述記載的方法對(duì)(-)體環(huán)戊烯酮和(+)體環(huán)戊烯酮分別進(jìn)行質(zhì)量分析、通過(guò)核磁共振法(NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析、測(cè)定UV吸收光譜、測(cè)定紅外吸收光譜。其結(jié)果表明，兩種光學(xué)活性體具有與光學(xué)拆分前的環(huán)戊烯酮相同的結(jié)果。
將光學(xué)拆分得到的(-)體環(huán)戊烯酮與(+)體環(huán)戊烯酮分別制成對(duì)二甲基氨基苯甲?；苌?，使用J-720型圓二色性分散計(jì)(日本分光社生產(chǎn))測(cè)定圓二色譜(CD)，將其結(jié)果應(yīng)用于二苯甲酸鹽偏光力規(guī)則(《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》J.Am.Chem.Soc.，第91卷，第3989～3991頁(yè)(1996))，確定其立體構(gòu)型。
(-)體環(huán)戊烯酮的對(duì)二甲基氨基苯甲?；苌锏腃D及(-)體環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)如圖6所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(zhǎng)(nm)。另外，上述立體結(jié)構(gòu)如下式II所示
(+)體環(huán)戊烯酮的對(duì)二甲基氨基苯甲?；苌锏腃D及(+)體環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)如圖7所示。圖中縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(zhǎng)(nm)。另外，上述立體結(jié)構(gòu)如下式III所示
如圖6、7及式II、式III所示，(-)體環(huán)戊烯酮為(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，(+)體環(huán)戊烯酮為(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
以上本發(fā)明所使用環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體可以采用任何方法制備，可以采用說(shuō)明書(shū)中描述的方法制備，也可以采用化學(xué)合成方法合成，本發(fā)明也可以使用環(huán)戊烯酮的反式體、順式體及其混合物。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體的鹽為可藥用鹽，可以按照公知的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
環(huán)戊烯酮在生物體內(nèi)與含有SH基的化合物(例如半胱氨酸、谷胱甘肽等)反應(yīng)，生成作為藥物很有用的代謝衍生物。因此，在投給環(huán)戊烯酮后也可以得到該代謝衍生物所顯示出的藥效。在生物體內(nèi)環(huán)戊烯酮與含有SH基的化合物的反應(yīng)產(chǎn)物可以推測(cè)為代謝有效物質(zhì)的一種。
也就是說(shuō)，對(duì)于含有SH基的化合物(R-SH)舉例來(lái)說(shuō)，環(huán)戊烯酮與含有SH基的化合物反應(yīng)，生成例如下述通式IV或下述通式V所表示的化合物。另外，通式V表示的化合物可以轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?b>IV表示的化合物。
這樣，環(huán)戊烯酮在含有SH基的化合物的存在條件下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞔x衍生物，在生物體內(nèi)生成的這些代謝衍生物也可以發(fā)揮藥效。
(其中，R為從含有SH基的化合物中除去SH基得到的殘基)。
(其中，R為從含有SH基的化合物中除去SH基得到的殘基)。
因此，這些在生物體內(nèi)形成的反應(yīng)產(chǎn)物，即以在生物體內(nèi)形成代謝衍生物為目的的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽的使用也包含在本發(fā)明內(nèi)。
近年來(lái)，根據(jù)糖尿病的病理研究結(jié)果可知，正常的脂肪細(xì)胞承擔(dān)著使全身的胰島素正常發(fā)揮作用的重要作用，為了使糖代謝順利地進(jìn)行，正常的脂肪細(xì)胞是必不可少的〔《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)》，第14卷，第61～68頁(yè)(1996)〕。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞，例如成纖維前體細(xì)胞分化的能力，誘導(dǎo)該細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。因此，可以推測(cè)通過(guò)攝取選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽的化合物，能增加正常的脂肪細(xì)胞，改善糖尿病的癥狀。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有降低血糖的作用，可以制造以選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物作為有效成分的糖尿病治療劑或預(yù)防劑。
也就是說(shuō)，如果以選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物為有效成分，將其與公知的藥用載體組合使之制劑化，可以制造糖尿病治療劑或預(yù)防劑。該制劑的制造一般可以將選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽與可藥用的液體或固體載體配合，并在必要時(shí)加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體制劑；溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體制劑。另外，可以將其制成干燥品，在使用前加入適當(dāng)?shù)妮d體使之成為液體。
藥用載體可以根據(jù)上述給藥方式及劑型進(jìn)行選擇，口服制劑的場(chǎng)合可以使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無(wú)機(jī)鹽等。另外，制造口服制劑時(shí)還可以加入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，非口服制劑的場(chǎng)合，可以按照常規(guī)方法將本發(fā)明的有效成分環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽溶解乃至懸濁于注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等稀釋劑中，必要時(shí)加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、無(wú)痛化劑等而制得。
本發(fā)明的糖尿病治療劑或預(yù)防劑可以相應(yīng)于制劑形態(tài)采用適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給藥。給藥方法也沒(méi)有特別的限定，可以內(nèi)用、外用和注射。注射劑可以靜脈、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)給藥，外用劑也包括栓劑等。
糖尿病治療劑或預(yù)防劑的給藥量可以根據(jù)其制劑形態(tài)、給藥方式、使用目的及其所適用的患者的年齡、體重、癥狀適當(dāng)設(shè)定，雖然并不是一定的，但是一般來(lái)說(shuō)，制劑中含有的選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物的量為成人每天10pg～200mg/kg。當(dāng)然，給藥量根據(jù)各種條件而有所變動(dòng)，既有少于上述給藥量就足夠的場(chǎng)合，也有必須超范圍的場(chǎng)合。本發(fā)明的藥劑除可以直接口服之外，還可以添加到任意的飲食品中使之進(jìn)行日常的攝取。
另外，環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽也可以用作糖尿病改善或預(yù)防用飲食品的原料。通過(guò)攝取含有環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽的物質(zhì)，可以改善糖尿病，使尿糖量迅速減少。另外，性機(jī)能減退等并發(fā)癥也可以得到顯著的改善。而且也可以改善高脂血癥。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有改善高脂血癥的作用，即降低血清總膽固醇的作用、降低血清甘油三酯的作用、降低血清游離脂肪酸的作用，如果以選自具有這些作用的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上化合物作為有效成分，將其與公知的藥用載體組合使之制劑化，則可以制得高脂血癥治療劑或高血脂預(yù)防劑。該制劑的制造可以按照糖尿病治療劑或預(yù)防劑進(jìn)行，另外可以按照糖尿病治療劑或預(yù)防劑的方法給藥。另外，也能以環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽作為高血脂改善或預(yù)防用飲食品的原料。通過(guò)攝取含有環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽的物質(zhì)，可以改善高血脂，迅速減少血液中類脂的量。
另外，以具有誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞能力的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽為有效成分，將其與公知的藥用載體組合另外，以具有誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞能力的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽為有效成分，將其與公知的藥用載體組合使之制劑化，可以制得使前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)劑。該制劑可以按照糖尿病治療劑或預(yù)防劑進(jìn)行制造，另外可以按照糖尿病治療劑或預(yù)防劑的方法給藥。
另外，環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用，對(duì)于由腫瘤壞死因子引起的非胰島素依賴性糖尿病〔《自然》Nature，第389卷，第610～614頁(yè)(1997)〕的治療、預(yù)防是很有用的。
以選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上的化合物為有效成分的藥劑作為使前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)劑、腫瘤壞死因子產(chǎn)生的抑制劑是有用的。確認(rèn)通過(guò)投給環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽，可以改善血糖值，使胰島素值正常化，本發(fā)明的藥劑可以用作糖尿病的治療劑或預(yù)防劑。而且通過(guò)投給本發(fā)明的藥劑還可以使血漿中的甘油三酯、游離脂肪酸值正?；?，本發(fā)明的藥劑可以用作高脂血癥治療用或預(yù)防用藥劑。
而且，以環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽為有效成分的使前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)劑是對(duì)于生物化學(xué)研究有用的分化誘導(dǎo)劑，通過(guò)使用該分化誘導(dǎo)劑可以提供對(duì)于生物化學(xué)研究有用的誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的方法，通過(guò)使用該方法可以篩選分化誘導(dǎo)抑制劑或分化誘導(dǎo)劑。
在本發(fā)明中，能以選自環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽、含有環(huán)戊烯酮的加熱處理物以及由該加熱處理物得到的部分精制環(huán)戊烯酮作為原料使用，提供糖尿病改善用或預(yù)防用食品或飲料、高血脂改善用或預(yù)防用食品或飲料、誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞用的食品或飲料。
也就是說(shuō)，通過(guò)稀釋和/或添加選自含有環(huán)戊烯酮的加熱處理物、由該加熱處理物得到的部分精包括在明的食品或飲料中。
本發(fā)明的食品或抗病毒用飲料的制造方法沒(méi)有特別的限定，例如可以采用烹調(diào)、加工以及通常所使用的食品或飲料的制造方法來(lái)制造，制得的食品或飲料中優(yōu)選以選自具有糖尿病改善或預(yù)防作用的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少一種以上化合物為有效成分。
作為本發(fā)明的食品或飲料，只要含有、添加和/或稀釋了選自具有糖尿病改善或預(yù)防作用的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中1種以上的化合物，其形狀并無(wú)特別的限定，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀、凝膠狀、溶膠狀等可以經(jīng)口攝取的形狀。
另外，本發(fā)明所使用的化合物即使按其生理活性的有效量給藥也沒(méi)有毒性，例如經(jīng)口給藥時(shí)，即使將環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中任意一種按照100mg/kg一次投給大白鼠，確認(rèn)也沒(méi)有死亡例。
實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例更具體的說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。另外，實(shí)施例中的％是指重量％。參考例1將D-葡萄糖醛酸(Sigma公司生產(chǎn)G 5269)10g溶解于1升水中，在121℃加熱4小時(shí)后，在減壓條件下濃縮至約10ml。將醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上層40ml加入到其中混合后，將離心分離得到的上清液在減壓條件下濃縮至約10ml。
將上述提取液于采用柱層析法的硅膠BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化學(xué)社生產(chǎn))中上樣，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上層為洗脫液，用壓縮機(jī)加壓至0.2kg/cm2，以每分鐘5ml的流速進(jìn)行分離。分出流分使每1種流分為10ml，取各流分的一部分采用薄層色譜法進(jìn)行分析，第61-80號(hào)流分中含有高純度的環(huán)戊烯酮。集中這些流份，在減壓條件下濃縮后用40ml氯仿提取，將提取液在減壓條件下濃縮，從而得到100mg環(huán)戊烯酮。
通過(guò)使用Palpack型S柱(寶酒造社生產(chǎn))的正相HPLC分離該餾份，用215nm紫外線吸收檢測(cè)，純度為98％。
將上述環(huán)戊烯酮113.9mg溶于乙醇2.85ml中。再在該乙醇溶液中加入己烷/乙醇(94/6)3.85ml，調(diào)制成17mg/ml的環(huán)戊烯酮溶液。用0.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾該溶液，得到光學(xué)拆分HPLC的試樣溶液。
在以下條件下，對(duì)該試樣溶液進(jìn)行光學(xué)拆分HPLC，分別收集前峰的(-)體環(huán)戊烯酮和后峰的(+)體環(huán)戊烯酮，減壓干燥，分別得到(-)體環(huán)戊烯酮43.2mg，(+)體環(huán)戊烯酮43.0mg。
光學(xué)拆分HPLC條件柱Chiral Pack AS(Daicel化學(xué)工業(yè)生產(chǎn))2.0cm×25.0cm柱溫40℃流動(dòng)相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/min檢測(cè)UV210nm進(jìn)樣量150μl(2.55mg)由于得到的(-)體環(huán)戊烯酮與(+)體環(huán)戊烯酮兩者均含有約1％的對(duì)映體，在上述條件下再度進(jìn)行光學(xué)拆分。其結(jié)果分別從前峰的(-)體環(huán)戊烯酮30.0mg得到不含有對(duì)映體的(-)體環(huán)戊烯酮19.7mg，從后峰的(+)體環(huán)戊烯酮37.4mg得到不含有對(duì)映體的(+)體環(huán)戊烯酮27.7mg。另外，(-)體環(huán)戊烯酮、(+)環(huán)戊烯酮的光學(xué)拆分HPLC的洗脫時(shí)間分別為33分、40分。實(shí)施例1在含有胎牛血清(FCS)5％的Dulbecco改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)來(lái)自胎小鼠的成纖維前體細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞(ATCC CL-173)使之達(dá)到90％鋪滿。另一方面，用分級(jí)分子量為3萬(wàn)的超濾膜超濾FCS，將得到的高分子量成分用蛋白酶K、鏈霉蛋白酶及亮氨酸氨肽酶處理，在含有5％上述處理物(稱為酶處理FCS)的DMEM中加入濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8或10-9μg/ml的按照參考例1所述的方法制得的環(huán)戊烯酮或濃度為100、50、10、5、1或0.2μg/ml的胰島素(寶酒造社售)，培養(yǎng)9天。另外，在培養(yǎng)3天后和6天后分別換成含有其濃度的環(huán)戊烯酮或胰島素的新鮮培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基細(xì)胞中含有的脂肪用油紅O(Sigma公司生產(chǎn))染色，用顯微鏡進(jìn)行觀察。如果細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞并有脂肪蓄積，則被染成紅色。
其結(jié)果如表1所示。另外，在表1中，-表示未見(jiàn)脂肪蓄積，±表示細(xì)胞中脂肪蓄積少于25％，+表示細(xì)胞中脂肪蓄積在25％以上但少于50％，++表示細(xì)胞中脂肪蓄積在50％以上但少于75％，+++表示細(xì)胞中脂肪蓄積在75％以上。表1
如表1所示，與添加10～50μg/ml胰島素后脂肪蓄積程度成為+++相對(duì)應(yīng)，添加10-5～10-6μg/ml環(huán)戊烯酮后脂肪蓄積程度成為+++。環(huán)戊烯酮在低濃度即顯示向脂肪細(xì)胞分化的誘導(dǎo)活性。
另外，(-)體環(huán)戊烯酮、(+)體環(huán)戊烯酮也得到了同樣的結(jié)果。實(shí)施例2(1)由日本Clea公司購(gòu)入非胰島素依賴性糖尿病自然發(fā)病小鼠的KK-Ay小鼠(雄性，10周齡，體重約40g)。給予飼料CE-2(日本Clea公司)，單獨(dú)預(yù)備飼養(yǎng)約1周后，使用11周齡的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于1組8～9只的小鼠，分別按照每kg體重0.1mg、1mg、10mg比例，強(qiáng)制經(jīng)口投給采用參考例1所述方法制得的環(huán)戊烯酮，1日1次，直到第4天，共計(jì)5次。第4天由眼底靜脈取血。對(duì)照組用水代替環(huán)戊烯酮給藥，從小鼠同樣的取血，血漿分離后用葡萄糖測(cè)定試劑(GLU NeoShinotest；Shinotest公司)測(cè)定血漿中的葡萄糖量。
其結(jié)果如表2所示。環(huán)戊烯酮給藥組與對(duì)照組相比，確認(rèn)有濃度依賴的降低血漿中血糖量的作用，特別是10mg/kg/日、5次給藥組的血漿中的血糖值與對(duì)照組相比，確認(rèn)有降低血糖量的作用。另外，確認(rèn)對(duì)于環(huán)戊烯酮給藥組與對(duì)照組都沒(méi)有體重增減差別。表2
(2)由日本Clea公司購(gòu)入KK-Ay小鼠(雄性，4周齡)，飼養(yǎng)到10周齡后，將按照參考例1所述的方法制得的環(huán)戊烯酮經(jīng)口給藥14天，研究對(duì)血糖、血漿中胰島素和脂類的影響。環(huán)戊烯酮的用量為13mg/kg。在13mg/kg的環(huán)戊烯酮給藥組中血糖值降低(圖1)。在13mg/kg的環(huán)戊烯酮給藥組中，血清胰島素值降低(圖2)。對(duì)于血清脂類，在13mg/kg的環(huán)戊烯酮給藥組中甘油三酯值降低(圖3)，在13mg/kg的環(huán)戊烯酮給藥組中游離脂肪酸值降低(圖4)。
也就是說(shuō)，圖1表示環(huán)戊烯酮給藥量與血糖值的關(guān)系，圖中縱軸表示血清葡萄糖值(mg/dl)，橫軸表示環(huán)戊烯酮給藥量(mg/kg)。圖2表示環(huán)戊烯酮給藥量與血清胰島素值的關(guān)系，圖中縱軸表示血清胰島素值(μU/ml)，橫軸表示環(huán)戊烯酮給藥量(mg/kg)。圖3表示環(huán)戊烯酮給藥量與血清甘油三酯值的關(guān)系，圖中縱軸表示血清甘油三酯值(mg/dl)，橫軸表示環(huán)戊烯酮給藥量(mg/kg)。圖4表示環(huán)戊烯酮給藥量與血清游離脂肪酸值的關(guān)系，圖中縱軸表示血清游離脂肪酸值(μEq/升)，橫軸表示環(huán)戊烯酮給藥量(mg/kg)。圖中*和**表示由多項(xiàng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，與環(huán)戊烯酮無(wú)給藥組具有顯著性差異，*為p＜0.05，**為p＜0.01。
另外，動(dòng)物分為給予生理鹽水(5ml/kg)、給予環(huán)戊烯酮13mg/5ml/kg的2組，每組10只。各試驗(yàn)物質(zhì)1日1次經(jīng)口給藥，給藥14天，在最后1次給藥的那天，投給試驗(yàn)物質(zhì)4小時(shí)后用乙醚麻醉，由下腹部大靜脈取血。
采用酶-免疫法(市售試劑盒Glazym Insulin-EIATEST，和光純藥社生產(chǎn))測(cè)定血清胰島素。血清中的糖、甘油三酯和游離脂肪酸分別通過(guò)己糖激酶-G6PDH法、GPO·DAOS法和ACS·ACOD法使用自動(dòng)分析裝置(7070型，日立制作所生產(chǎn))測(cè)定。
從以上結(jié)果可以確認(rèn)環(huán)戊烯酮具有降低血糖、胰島素和脂類的效果。
另外，(-)體環(huán)戊烯酮、(+)體環(huán)戊烯酮也得到了同樣的結(jié)果。實(shí)施例3(1)將來(lái)源于馬流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonella abortus equi)的LPS(脂聚糖，Sigma公司生產(chǎn))溶解于生理鹽水，對(duì)20周齡的雌性CDF1種小鼠腹腔內(nèi)給藥(0.1mg/kg)，制成內(nèi)毒素休克模型。
在LPS給藥30分鐘前，將環(huán)戊烯酮以30mg/kg的用量腹腔內(nèi)給藥或經(jīng)口給藥。另一方面，對(duì)照組不進(jìn)行處理。LPS給藥90分鐘后，由小鼠取血分離血清。然后，采用TNF-α·ELISA試劑盒(Genzyme公司生產(chǎn))測(cè)定血清中的腫瘤壞死因子量，測(cè)定通過(guò)投給環(huán)戊烯酮引起的抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的效果。
其結(jié)果如表3所示。也就是說(shuō)，相對(duì)于對(duì)照組在環(huán)戊烯酮給藥組中，無(wú)論是腹腔內(nèi)給藥組還是經(jīng)口給藥組，血清中腫瘤壞死因子的濃度都較低，通過(guò)投給環(huán)戊烯酮可以顯著抑制腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。
表3<
p＜0.001，相對(duì)于對(duì)照組有顯著差異*p＜0.01，相對(duì)于對(duì)照組有顯著差異(2)使用8周齡的雌性CDF1系小鼠，將LPS腹腔內(nèi)給藥(10μg/小鼠)，制成內(nèi)毒素休克模型。在LPS給藥15分鐘前，將環(huán)戊烯酮以0.03、0.3、3、30mg/kg的用量皮下給藥(一組4只)。LPS給藥1小時(shí)后，由小鼠取血，分離血清，采用市售的ELISA試劑盒(Endogen公司生產(chǎn))測(cè)定血清中腫瘤壞死因子-α量。其結(jié)果如表4所示。也就是說(shuō)，環(huán)戊烯酮可以用量依賴的抑制由LPS引起的血清中腫瘤壞死因子-α濃度上升。表4<
3)在8周齡的雌性CDF1系小鼠的腹腔內(nèi)投給石蠟油(Cosmo Bio公司)2ml，誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞(Mφ)。石蠟油給藥1周后，在小鼠的腹腔內(nèi)注入RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)4ml，充分按摩后回收得到腹腔細(xì)胞。
將腹腔細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次后，懸濁于含有10％胎牛血清(FCS，High-Clone公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106細(xì)胞/ml。將調(diào)整得到的細(xì)胞液1ml置于24孔板中，在37℃ CO2保溫箱中培養(yǎng)2小時(shí)。除去培養(yǎng)后的上清液中含有的非粘連細(xì)胞，以粘連細(xì)胞作為腹腔Mφ使用。
在板的各孔中加入含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基800μl，然后加入溶解于生理鹽水的1、10、100、1000μM的環(huán)戊烯酮100μl，在37℃ CO2恒溫槽中培養(yǎng)1小時(shí)。
培養(yǎng)后加入100ng/ml的脂聚糖(Sigma公司生產(chǎn))100μl，再培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，回收培養(yǎng)上清液，采用市售的ELISA試劑盒(Endogen公司生產(chǎn))測(cè)定血清中腫瘤壞死因子-α量。
其結(jié)果如圖5所示。也就是說(shuō)，圖5表示環(huán)戊烯酮濃度與腫瘤壞死因子產(chǎn)生量的關(guān)系，縱軸表示腫瘤壞死因子量(pg/ml)，橫軸表示各試樣的環(huán)戊烯酮濃度(μM)。
環(huán)戊烯酮在10μM以上的濃度可以顯著抑制脂聚糖誘發(fā)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子。
以上，環(huán)戊烯酮顯示了抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用。另外，(-)體環(huán)戊烯酮、(+)體環(huán)戊烯酮也得到了同樣的結(jié)果。實(shí)施例4五年前在診斷為非胰島素依賴性糖尿病后開(kāi)始接受1日1次服用作為治療藥的格列本脲(Euglucon)片劑(山之內(nèi)制藥公司出售)糖尿病的治療，但使用Miles-三共公司生產(chǎn)的尿糖試紙測(cè)定時(shí)，尿糖在空腹時(shí)為(+++)糖尿病未見(jiàn)改善的男性(55歲)每日飲用下述實(shí)施例7-(2)得到的飲料50ml(含環(huán)戊烯酮2mg)，飲用3個(gè)月后測(cè)定空腹時(shí)的尿糖為(-)，顯著治愈了非胰島素依賴性糖尿病。另外，在治愈非胰島素依賴性糖尿病的同時(shí)，確認(rèn)性機(jī)能顯著恢復(fù)。實(shí)施例5注射劑(1)生理鹽水(日本藥典收載品)中以1％的濃度加入環(huán)戊烯酮，制得注射劑。
(2)在生理鹽水(與上述相同)中分別以0.5％和0.1％的濃度加入(-)體環(huán)戊烯酮和甘草酸，制得注射劑。實(shí)施例6片劑(1)調(diào)制含有環(huán)戊烯酮10mg和微晶纖維素適量的片劑，包上糖衣，制成片劑。
(2)調(diào)制含有(+)體環(huán)戊烯酮0.1mg、甘草酸二鉀10mg和微晶纖維素適量的片劑，包上糖衣，制成片劑。實(shí)施例7(1)將果膠(Pomosin Pectin LM-13CG，Hercules公司生產(chǎn))5kg添加到自來(lái)水100升中，通過(guò)通入水蒸氣使液體溫度由28℃經(jīng)35分鐘升高到液體溫度120℃，然后在攪拌條件下于120℃保溫5小時(shí)，然后冷卻，制得冷卻物135升。然后在冷卻物中加入過(guò)濾助劑硅藻土(Celite)#545(Celite公司生產(chǎn))1.35kg以及二氧化硅#600-S(中央二氧化硅公司生產(chǎn))1.35kg，然后使用預(yù)先涂有硅藻土(Celite)#5450.1kg以及二氧化硅#600-S 0.1kg的致密濾器(6英寸16級(jí)濾紙，ADVANTEC#327)進(jìn)行過(guò)濾。使用金屬板加熱器(日阪制作所生產(chǎn))將得到的濾液連續(xù)瞬間加熱處理(98℃，60秒)后冷卻，制得150升含有環(huán)戊烯酮的果膠加熱處理液。
含有環(huán)戊烯酮的果膠加熱處理液的pH為約3.5，酸度為6.2ml，糖度為5.8Brix％。另外，pH是用pH計(jì)測(cè)定的，酸度是用將試樣10ml中和到pH7.0所需要的0.1N NaOH的量(ml)表示的。而且糖度的從測(cè)定是用白利糖度計(jì)(Brix saccharomter)測(cè)定的。
(2)按照下述組成調(diào)制飲料果糖葡萄糖液糖 5.00％砂糖4.00％酸味成分1.20％香料0.30％含有環(huán)戊烯酮的物質(zhì) 0.5％精制水 余量合計(jì) 100.00％另外，含有環(huán)戊烯酮的物質(zhì)使用的是實(shí)施例7-(1)所述的含有環(huán)戊烯酮的果膠加熱處理物，添加其固體物質(zhì)換算量。該飲料100ml中含有4mg環(huán)戊烯酮。
發(fā)明的效果按照本發(fā)明可以提供一種具有誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的作用、抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用，具有治療、改善或預(yù)防糖尿病特別是非胰島素依賴性糖尿病作用的藥物。另外，還可以提供一種對(duì)于高脂血癥的治療、預(yù)防有用的藥物。
另外，按照本發(fā)明也可以使食品或飲料中適量的含有具有生理活性的環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽。通過(guò)這些化合物所具有的誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的作用、抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用，本發(fā)明的食品或飲料作為糖尿病特別是非胰島素依賴性糖尿病的改善用或預(yù)防用、高脂血癥的癥狀改善用或預(yù)防用食品或飲料是有用的，對(duì)于糖尿病并發(fā)癥、青光眼、性機(jī)能減退、高脂血癥等癥狀的改善或預(yù)防也是非常有用的。
權(quán)利要求
1.糖尿病治療劑或預(yù)防劑，其特征在于以選自下述式I表示的4，5-二羥基-2-戊烯-1-酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分。
2.糖尿病改善用食品或飲料，或糖尿病預(yù)防用食品或飲料，其特征在于含有選自下述式I表示的4，5-二羥基-2-戊烯-1-酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分。
全文摘要
糖尿病治療劑或預(yù)防劑,其特征在于以選自下述式Ⅰ表示的4,5－二羥基－2－戊烯－1－酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽中至少1種以上的化合物作為有效成分。
文檔編號(hào)C07C45/78GK1249680SQ98802986
公開(kāi)日2000年4月5日 申請(qǐng)日期1998年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月28日
發(fā)明者務(wù)華康, 小山信人, 西山英治, 富永隆生, 萩屋道雄, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社