專利名稱：編碼早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)的基因及其在診斷和治療肝病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在肝發(fā)育早期分離的肽及蛋白質(zhì)，及編碼這些肽和蛋白質(zhì)的基因，及針對(duì)這些蛋白質(zhì)培養(yǎng)的抗體，和其在診斷和治療肝疾病和其他病變中的應(yīng)用方法。
本發(fā)明的背景在美國(guó)和其他國(guó)家，由于傳染、基因缺陷或酗酒造成的晚期肝病是廣泛發(fā)病和死亡的主要原因，給世界上眾多人們帶來很大的潛在痛苦和經(jīng)濟(jì)損失。此外，許多其他疾病，包括膽汁異常和血液病變，也與肝的許多功能，如鐵運(yùn)載，肝細(xì)胞形成，生血功能壞損有關(guān)。通常，與肝功能衰弱有關(guān)的嚴(yán)重疾病是幾乎不治的，唯一的治療方式是需要作肝移植。然而，從需要作肝移植患者的數(shù)量和捐獻(xiàn)者的數(shù)量的巨大差異來看，許許多多的人們是得不到這種治療的，這樣，目前移植不是這種疾病可實(shí)施的方法。
同時(shí)，肝發(fā)育的準(zhǔn)確性質(zhì)及發(fā)育早期的肝蛋白質(zhì)的作用還沒有得到很好的了解。至今，還沒有確定或分離出肝臟特異的生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞形成的明確的分子機(jī)理仍然沒有闡明。這樣，一直就認(rèn)為需要確定和了解在肝發(fā)育中的基因調(diào)節(jié)和表達(dá)的變化，包括確定哪些基因開啟或關(guān)閉肝細(xì)胞的形成和肝的發(fā)育。因此，分離和確定出在早期肝發(fā)育中起重要作用的基因和蛋白質(zhì)，對(duì)于了解在分化的肝臟中，基因調(diào)節(jié)和表達(dá)的作用是積極的，對(duì)于診斷和治療與肝和肝功能有關(guān)的許多疾病也是有益的。
本發(fā)明的概述由此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含編碼早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，包括elf1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白質(zhì)106、和praja-1肝蛋白質(zhì)的核酸序列的基因。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供分離和提純的、由上述基因編碼的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供為早期肝發(fā)育特有的蛋白質(zhì)，和從所說的蛋白質(zhì)和肽中獲得的肽，和從所說的蛋白質(zhì)和肽中培養(yǎng)用作標(biāo)記的抗體，用在確定這種蛋白質(zhì)和肽，探測(cè)肝細(xì)胞組，及治療肝臟疾病的方法中。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是使用本發(fā)明的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，提供應(yīng)用在診斷和治療肝臟病變中的肝特異生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供使用本發(fā)明的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，診斷和治療晚期肝疾病的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供使用本發(fā)明的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，診斷和治療其他肝臟病變和疾病的方法，包括癌癥，衰退性神經(jīng)學(xué)上的病變，貧血，和共濟(jì)失調(diào)。
這些和其他目的是借助本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明提供了編碼涉及發(fā)育胚胎肝臟分化的各種蛋白質(zhì)的基因，包括稱作elf1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白質(zhì)106、和praja-1的蛋白質(zhì)，和一些編碼早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的其他階段特異基因，以及它們?cè)谠\斷和治療多種肝疾病和其他病變中的應(yīng)用方法。
附圖簡(jiǎn)要說明本發(fā)明將以較好的具體實(shí)施作詳細(xì)說明，具體實(shí)施與附圖相配合，其中

圖1表示依據(jù)本發(fā)明的編碼liyor-1(145)蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖2a表示依據(jù)本發(fā)明的編碼elf-1蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖2b表示依據(jù)本發(fā)明的編碼elf-2蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖2c表示依據(jù)本發(fā)明的編碼elf-3蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖3表示依據(jù)本發(fā)明的編碼praja-1蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖4表示依據(jù)本發(fā)明的編碼pk蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖5表示依據(jù)本發(fā)明的編碼106蛋白質(zhì)的核酸序列。
圖6表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因20的核酸序列。
圖7表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因36的核酸序列。
圖8表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因41的核酸序列。
圖9表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因112的核酸序列。
圖10表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因114的核酸序列。
圖11表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因118的核酸序列。
圖12表示依據(jù)本發(fā)明的編碼基因129的核酸序列。
圖13表示本發(fā)明的從praja-1蛋白質(zhì)獲得的RING-H2基元與其他幾種蛋白質(zhì)的對(duì)比。
圖14表示praja-1基因和其他基因在鼠染色體X上的位置。
圖15表示praja-1和鼠Neurodap1蛋白質(zhì)的PILEUP對(duì)比。
圖16a表示依據(jù)本發(fā)明的elf蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列。
圖16b表示elf3’端序列與鼠β-fordin片段和兩個(gè)典型EST序列的核苷酸多種對(duì)比。
圖17表示在中期妊娠發(fā)育期間，elf蛋白質(zhì)mRNA的Northern印跡分析自顯影圖。
圖18是包含用標(biāo)記elf蛋白質(zhì)作探針，從不同樣品獲取基因組DNA的9條泳道的zoo印跡分析說明。
圖19-20表示半量RT-PCR，演示了elf、ss3、145在bloc和肝臟移植培養(yǎng)物中的表達(dá)，與HNF3β，C/FBP，α-胎兒球蛋白質(zhì)和GAPDH的對(duì)比。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述依據(jù)本發(fā)明，早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)和編碼它們的基因已被分離及測(cè)序，這些基因和蛋白質(zhì)可用來診斷和/或治療多種肝臟病變和其他疾病。通常，本發(fā)明是在肝臟和其他器官處于從未分化狀態(tài)到分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變時(shí)的胚胎發(fā)生階段，從對(duì)肝形成的研究中獲得的。這種方式捕獲了開始于普通內(nèi)胚層細(xì)胞組的肝形成階段。此外，組織分化的早期階段與腫瘤形成和組織修復(fù)的過程密切相關(guān)，這樣，依據(jù)本發(fā)明獲得的分離的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)應(yīng)與晚期硬化和肝細(xì)胞癌的一些疾病，和許多其他疾病狀況的診斷和治療有關(guān)。
在對(duì)本發(fā)明的用于早期肝細(xì)胞形成的肝蛋白質(zhì)進(jìn)行確定和分離時(shí)，采取的第一步是“捕獲”和分析早期肝形成不同階段的基因表達(dá)，尤其是約9天到14.5天階段在鼠中呈現(xiàn)的基因表達(dá)。在這方面，建立了四個(gè)胚胎肝臟cDNA文庫(kù)，如在交配后10.0，11.5，12.5，14.5天的文庫(kù)，以及，在一組階段特異的相減雜交、分離后，分離肝臟限制性克隆體。正如下面更詳細(xì)的說明的那樣，序列分析顯示這些克隆體編碼一系列早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常是“階段特異”的，如，它們僅僅在發(fā)育的特異階段出現(xiàn)，而不在其他階段出現(xiàn)，早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)包括，elf蛋白質(zhì)1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白質(zhì)106、和由基因20、36、41、112、114、118和129編碼的蛋白質(zhì)，這些本文將作進(jìn)一步說明。
確定和分離發(fā)育肝蛋白質(zhì)的初始方案有四個(gè)主要目的(1)建立早期胚胎肝文庫(kù)；(2)用含有已知的生長(zhǎng)因子(IGF-I，IGF-II，IGFBP2)和已知在發(fā)育肝中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活劑(C/EBP和LFB1)的一組探針，篩查和表征這些胚胎肝文庫(kù)；(3)使用這些cDNA文庫(kù)進(jìn)行相減雜交，通過Southern印跡雜交、測(cè)序、轉(zhuǎn)錄尺寸、豐富度、和組織分布等來分析隨后的相減克隆體的階段特異性；(4)使用胚胎肝移植培養(yǎng)物對(duì)這些相減基因進(jìn)行功能鑒定。
至于本發(fā)明的主要目的，所決定的是將其集中在肝發(fā)育的四個(gè)階段，特別集中在發(fā)育鼠的約e10天，e11天，e12天，和e14天(交配后胚胎天數(shù))。確定的這四個(gè)階段發(fā)育時(shí)間點(diǎn)，代表從未分化的中胚層/內(nèi)胚層細(xì)胞，到發(fā)育完好分化的胚胎肝的肝發(fā)育階段。這些階段一般分為如(1)在約e9-10，在細(xì)胞極中發(fā)生變化；(2)在約e10.5-11，發(fā)生內(nèi)胚層細(xì)胞向環(huán)境間質(zhì)侵入和移入；(3)在約e11.5-12，假性裂片形成，肝細(xì)胞棒狀體和早期竇狀體一起形成；(4)在約e12.5-14.5，肝臟由生血位點(diǎn)和完全分化的胚胎肝細(xì)胞標(biāo)記。因此，表示這些階段的cDNA文庫(kù)代表在肝細(xì)胞形成的關(guān)鍵時(shí)期，“捕獲的”更充分表達(dá)的mRNA種類，使它們能夠分離，并提供了分析肝在發(fā)育期間基因表達(dá)的變化模式的方法。
本發(fā)明的另一方面是，通過確定和分離本發(fā)明的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)基因，和這些基因的表達(dá)，發(fā)展診斷和治療肝病變和其他疾病的有用方法。依據(jù)對(duì)這些早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究，很清楚地是，確定了的不同的基因和蛋白質(zhì)對(duì)于肝發(fā)育的不同方面是很重要的，并可應(yīng)用在適當(dāng)疾病的治療中。在胚胎形成期間，肝一般是從前腸憩室發(fā)育的，包括四種主要細(xì)胞類型第一種是肝細(xì)胞，或內(nèi)胚層組；第二種是膽樹狀小管細(xì)胞或膽管細(xì)胞，第三種是生血細(xì)胞；第四種是Kupffer細(xì)胞/Ito細(xì)胞。這些將在下面闡述，對(duì)于依據(jù)本發(fā)明獲得及分離的早期發(fā)育蛋白質(zhì)，可以認(rèn)為elf蛋白質(zhì)是形成膽樹的重要蛋白質(zhì)，如反義試驗(yàn)所示；praja-1蛋白質(zhì)顯示出對(duì)鐵運(yùn)載的重要性，及對(duì)肝細(xì)胞形成和生血功能的重要性；liyor-1(145)和pk在Ito細(xì)胞的形成和纖維化方面表現(xiàn)出重要性。
由此，依據(jù)本發(fā)明，可以考慮認(rèn)為elf蛋白質(zhì)1-3在對(duì)疾病如，膽汁郁積，膽結(jié)石，肝堵塞，肝狹窄，原發(fā)性膽硬化，和原發(fā)性硬化膽管炎的治療方面是很有用的。此外，蛋白質(zhì)praja-1、liyor-1(145)和pk在對(duì)晚期肝疾病，缺水外胚層發(fā)育異常，肝細(xì)胞癌，和貧血，如鐵粒細(xì)胞性貧血，共濟(jì)失調(diào)，如脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，和衰退性神經(jīng)學(xué)上的病變，缺水外胚層發(fā)育異常，和血色沉著病的治療方面是有用的。
進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞組織中確定出了蛋白質(zhì)praja-1，正常組織是不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)及診斷結(jié)腸癌的方法，其中，從被測(cè)試患者獲取結(jié)腸細(xì)胞或組織，對(duì)這些細(xì)胞或組織進(jìn)行篩查確定praja-1蛋白質(zhì)存在或不存在。在結(jié)腸細(xì)胞或組織中確定praja-1可以決定細(xì)胞是否是癌細(xì)胞，因?yàn)橥ǔＴ诜前┙Y(jié)腸細(xì)胞中檢測(cè)不到praja-1。
在依據(jù)本發(fā)明的cDNA文庫(kù)的制備中，為了分離影響肝細(xì)胞及肝臟形成的關(guān)鍵的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，采用上述的四個(gè)發(fā)育階段是必要的。盡管這些研究是在鼠體上進(jìn)行的，但這些肝形成的各階段對(duì)人類發(fā)育的相關(guān)性，將在下面這些研究的總結(jié)中指出(1)交配后10天(e10，34-39個(gè)體節(jié))(人27天)在鼠體內(nèi)，初級(jí)肝盲囊在妊娠第十天中出現(xiàn)。它是在心臟原基發(fā)育之前，在胚胎和胚胎外區(qū)域間的邊界上，從在外胚層中第七天形成的前腸凹痕發(fā)育而來。在這個(gè)階段，盡管細(xì)胞要進(jìn)行胚胎肝細(xì)胞的形成，但它們性質(zhì)上仍然是上皮細(xì)胞，并且在沒有心臟環(huán)境間質(zhì)存在的情況下，肝盲囊是不能生存的。這可能是肝細(xì)胞在未分化狀態(tài)可能的最早階段，所以，被認(rèn)為是非常重要的；一些細(xì)胞分化成生血細(xì)胞，而其他細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。因此，在λ-Unizap中建立第10.0天的文庫(kù)，并且以前沒有在這個(gè)階段建立過cDNA肝文庫(kù)。(2)交配后11.5天(e11.5，40-44個(gè)體節(jié))(人32天)這個(gè)階段的特點(diǎn)是肝臟的生長(zhǎng)很快。肝胚芽形成后不久，內(nèi)胚層細(xì)胞繁殖，破壞將橫膈與上皮細(xì)胞分開的膈膜，使上皮細(xì)胞移入間質(zhì)。e11.5的肝臟由含有成核紅血球的，由大型竇狀體分離的寬型肝棒狀體構(gòu)成。生血位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與肝棒狀體相混合。在此階段獲得的胚胎肝在λ-gt10和λ-Zap中建立cDNA文庫(kù)，其原因是，雖然這些細(xì)胞的繁殖很快，但它們?nèi)匀粵]有達(dá)到完全區(qū)分的胚胎階段。(3)交配后12.5-13.0天(e12.5，人35-45天)(胚胎尺寸7-9mm)這個(gè)階段可通過早期指發(fā)育痕跡和足板前期凹痕輕松確認(rèn)。在這個(gè)階段，肝臟發(fā)育良好，所有肝葉都清晰可見；它含有許多巨核細(xì)胞和具有紅血球生成活性的細(xì)胞。在λ-gt10和λ-Zap中建立e12.5的cDNA文庫(kù)，這是可以看到完全分化的胚胎肝細(xì)胞的最早階段。(4)交配后14.5天(e14.5，人51-57天)(胚胎尺寸20-32mm)在這個(gè)階段，單個(gè)、獨(dú)立前足趾可以看到；皮膚上的毛囊也可以確認(rèn)出，臍帶疝非常明顯。這個(gè)階段代表了含有分散生血位點(diǎn)的充分分化的胚胎肝。為了與建立在λ-Unizap(stratagene)中的第十天的文庫(kù)便于相減，在λ-Unizap中建立這個(gè)階段的cDNA文庫(kù)。
其中p是1-100；
其中R5、R6和R7是在鏈中具有至多大約100個(gè)原子的直鏈或支鏈烷基、烷氧基、烷基胺、烷基硫、亞烷基、亞烷基氧基、亞烷基胺、亞烷基硫、芳基、芳氧基或芳基硫，其鏈可含有為側(cè)鏈的或作為鏈中骨架一部分的飽和或未飽和環(huán)或雜環(huán)取代基，并且，其中的任何雜原子可以或不可以直接與芳香環(huán)連接；或R5、R6和R7是具有結(jié)構(gòu)-(CR12)e-[SiR42-O]f-SiR42-(CH3)g-的硅氧烷，其中R1取代基是H或具有1-5個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，和各位置中的R4取代基獨(dú)立地是具有1-5個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)，e是1-10和f是1-50；
<p>表2 早期胚胎肝cDNA文庫(kù)和成年鼠肝文庫(kù)
交配后e10.5、e11.5、e12.5、e14.5階段的鼠的cDNA插入及成年鼠肝，在Biogel A150柱(＞500 bp)上在與載體連接前進(jìn)行尺寸篩選。文庫(kù)中膜動(dòng)蛋白頻率在表3中列出。
使用已知的發(fā)育調(diào)節(jié)cDNA對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行性質(zhì)分析，是為了建立在發(fā)育中有意義的重要早期基因的發(fā)育結(jié)構(gòu)，然后用特定數(shù)目的探針對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行篩查。下面是用作篩查這些文庫(kù)的探針，包括類胰島素生長(zhǎng)因子I(IGFI)，得自于Dr.DerekleRoith(NIH)；類胰島素生長(zhǎng)因子II(IGFII)和IGFII結(jié)合蛋白質(zhì)-2(BP-2)，均從Dr.Matt Rechler of NIH獲得；LFB1是從EMBLin Heidelberg的Drs.Monaci，Nicosia和Cortese獲得的；C/EBP探針是從New York N.Y.的Rockefeller University的Dr.Darnekk獲得的。
表3 10.0、11.5和12.5天的文庫(kù)的克隆頻率(按雙份進(jìn)行)陽性cDNA克隆體/100,000 PloyA+含有cDNA的克隆體。
N.D.＝?jīng)]有作數(shù)據(jù)顯示在任何胚胎文庫(kù)中都沒有檢測(cè)到IGFI，然而，從e6.5到e8.5檢測(cè)到IGFII的克隆頻率是增長(zhǎng)的(在e6.5是8，在e7.5是8，在e8.5是38，數(shù)據(jù)沒有給出)，在e10.0和e12.5文庫(kù)中也檢測(cè)到了IGFII(在e10.0是3，在e12.5是4-見表3)。IGFII在成年肝文庫(kù)中沒有檢測(cè)到。有趣地是，在早期e6.5、e7.5、e8.5文庫(kù)中，BP2的克隆頻率與IGFII的克隆頻率是相同的(數(shù)據(jù)沒有給出)，但在肝臟cDNA文庫(kù)中克隆頻率是不同，在e10.0、e11.5中每100,000被檢測(cè)的BP2只有一個(gè)克隆，在成年肝文庫(kù)中檢測(cè)到的是7，相比之下，IGFII的數(shù)據(jù)較大。這表示在胚胎和胎兒中，它的時(shí)序和空間的表達(dá)與IGFII是不同的，這一點(diǎn)由隨后的原位研究證實(shí)。在e12.5文庫(kù)中檢測(cè)到了LFBI，但每100,000篩查L(zhǎng)FBI只有一個(gè)克隆，這表示它在有絲分裂細(xì)胞中是不存在的，但從出生以后它的含量是調(diào)節(jié)并增加的。在e6.5、e7.5、e8.5和e10.0文庫(kù)中沒有檢測(cè)到C/EBP(數(shù)據(jù)未給出)，但在e11.5和e12.5文庫(kù)中突然測(cè)得低含量的C/EBP(在e11.5中約2克隆/100,000，在e12.5中約為5)，表示在胚胎階段，雖然它被表達(dá)出來，但它的含量也是可以調(diào)節(jié)的，雖然是向下的。最后，β-膜動(dòng)蛋白用作參照物所有七個(gè)文庫(kù)具有相同β-膜動(dòng)蛋白頻率，從120克隆到300克隆/100,000，這被認(rèn)為是這種胚胎文庫(kù)的代表性。
接著，實(shí)施用相減法確定階段特異克隆體，建立兩個(gè)相減的文庫(kù)。進(jìn)行兩次相減處理，產(chǎn)物相減文庫(kù)含有64個(gè)克隆體(e11.5-e12.5)，和174個(gè)克隆體(e10.5-e14.5)。進(jìn)一步對(duì)這些克隆體進(jìn)行如下特性測(cè)試(1)Southern雜交；(2)測(cè)序；(3)Northern分析；(4)Zoo印跡分析；(5)蛋白質(zhì)的體外翻譯。
在對(duì)這些克隆體進(jìn)行Southern印跡測(cè)試中，三十四個(gè)克隆體顯示階段特異性，不含線粒體的、核糖體的和球蛋白的序列。對(duì)這三十四個(gè)階段特異性克隆體進(jìn)行DNA測(cè)序，是為了確認(rèn)帶有與已知發(fā)育基因同源基因的克隆體(如細(xì)胞極性基因，同源框基因等)，測(cè)出對(duì)每個(gè)克隆體的前400個(gè)堿基對(duì)序列。對(duì)構(gòu)成本發(fā)明的一部分的一些基因進(jìn)行詳細(xì)分析，包括liyor-1(145)、蛋白質(zhì)106、pk、和praja-1，因?yàn)檫@些克隆體表現(xiàn)出真實(shí)的階段特異性，并顯示是屬于編碼信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的一組基因，由于研究顯示它們?cè)诩?xì)胞譜系中的重要性，所以它們?cè)诎l(fā)育中是有很大影響的。依據(jù)本發(fā)明中的基因編碼的其他階段特異性蛋白質(zhì)在下面作進(jìn)一步闡述。對(duì)蛋白質(zhì)如praja-1和elf，以及其他早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究已闡述了這些蛋白質(zhì)的序列，下面將作更詳細(xì)的說明。
作為用來闡述這些肝蛋白質(zhì)的發(fā)育表達(dá)的一個(gè)測(cè)試實(shí)例，測(cè)試liyor-1(145)蛋白質(zhì)，用以確定在發(fā)育期間這些轉(zhuǎn)錄是否分化地表達(dá)，是否對(duì)中胚層或內(nèi)胚層衍生來的組織特異，或在成年鼠和人的器官中表達(dá)。因此，對(duì)妊娠中期胚胎的組織進(jìn)行分析，來確定在肝發(fā)育中145的作用。在這些試驗(yàn)中，解剖第十一天以后的組織，在這個(gè)階段，獨(dú)立的肝、心臟和其他組織可容易地解剖出來，并且隨后分離的RNA質(zhì)量也很好。
對(duì)使用32P標(biāo)記的1.1Kb插入代表蛋白質(zhì)145，使用從不同發(fā)育階段獲取的polyA RNA，在不同鼠組織內(nèi)進(jìn)行的與liyor-1(145)DNA的RNA雜交試驗(yàn)進(jìn)行研究。在145含量穩(wěn)定的情況下，通過測(cè)量膜動(dòng)蛋白的相對(duì)量，來測(cè)定發(fā)育改變的特異性。在高度嚴(yán)謹(jǐn)沖洗下顯示了2.2kb轉(zhuǎn)錄。對(duì)每條帶的光密度掃描顯示，145的最大表達(dá)出現(xiàn)在肝和心臟中，在其他組織中的表達(dá)要少些，但在第十一天特異性地表達(dá)，在第12.5和第14.5天量減少(1-2月后Northerns顯影)。
對(duì)在成年組織中的蛋白質(zhì)145RNA的分布，和在進(jìn)展中它的保留狀況作進(jìn)一步特征檢測(cè)，涉及成年鼠和人類組織的RNA分析。蛋白質(zhì)145與成年肝、腎和睪丸雜交，在肝和腎中為2.4Kb轉(zhuǎn)錄體，在睪丸中為2.6Kb轉(zhuǎn)錄體，其豐富度很低這兩個(gè)印跡在膠片上于-70℃曝光一個(gè)月后顯影。對(duì)elf蛋白質(zhì)和編碼它的核酸作同樣的試驗(yàn)，顯示elfDNA通常保留在許多不同的物種中，包括人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，雞，和酵母，在所有研究的物種中，除了兔子，都表現(xiàn)出了elf DNA。
最后，依據(jù)本發(fā)明，為了在實(shí)驗(yàn)室中建立鼠胚胎肝移植培養(yǎng)物，對(duì)相減基因建立了功能性測(cè)定，這個(gè)試驗(yàn)通常被認(rèn)為是反義試驗(yàn)的主要障礙，原因是由于在第9.5天當(dāng)肝臟胚芽為0.2mm時(shí)，需要解剖很小的組織。在這個(gè)方面，對(duì)相鄰的心臟中胚層和前腸內(nèi)胚層的相互作用進(jìn)行研究，確定在細(xì)胞類特異基因表達(dá)中隨后的變化，特別是有關(guān)α-胎兒球蛋白和清蛋白的表達(dá)的變化，和部分有關(guān)上皮基膜組成的變化。依據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)肝移植體的方法在下面闡述。在這些試驗(yàn)中得到的結(jié)果顯示，在完全沒有中胚層衍生物存在的培養(yǎng)中，肝內(nèi)胚層會(huì)很快惡化。15個(gè)這樣的肝移植體只有2個(gè)存活。蘇木精和曙紅染色顯示，壞死的內(nèi)胚層沒有明顯的肝分化跡象。當(dāng)與周圍的中胚層尤其是心臟中胚層(整體解剖)相連合時(shí)，內(nèi)胚層細(xì)胞繁殖并侵入中胚層部分。可以看到肝細(xì)胞被組成棒狀體，被竇狀體分離，伴隨著假性裂片形成。從整體解剖獲取的全部15個(gè)培養(yǎng)物都完全存活了。這項(xiàng)研究證實(shí)了闡述肝形成需要周圍中胚層的先前移植體研究。
因此，為鼠肝發(fā)育四個(gè)主要階段e10、e11.5、e12.5、和e14.5以及成年肝建立了cDNA文庫(kù)。通過采用仔細(xì)地初始RNA印跡分析，尺寸分級(jí)，定量，和定性分析，顯示出它們各自mRNA種類的真正代表性。Northern分析肯定了階段特異性，和它們轉(zhuǎn)錄體的限制性表達(dá)對(duì)于145，含有對(duì)妊娠中期腦和肝組織具有限制性的1.35和2.37Kb轉(zhuǎn)錄體，對(duì)成年鼠和人的Northern印跡分析顯示出，在肝、腎、睪丸中145轉(zhuǎn)錄體含量極低。有關(guān)145蛋白質(zhì)的進(jìn)一步試驗(yàn)顯示，對(duì)于田鼠磷脂酶C-γ(PLC-γ)其序列一致性為53％(20S.D.’s)，145保留部分的氨基酸與PLC-γ的對(duì)比確定了分裂的血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源(PH)區(qū)域。蛋白質(zhì)145(liyor-1)氨基酸的含量與PLC-γ的氨基端PH區(qū)域有99％的一致性。PH區(qū)域是有100個(gè)氨基酸的區(qū)域，已在很多中蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶，GTP酶激活蛋白質(zhì)，磷脂酶和細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)，這個(gè)PH區(qū)域被認(rèn)為與信號(hào)傳導(dǎo)是有關(guān)的。核磁共振光譜顯示P-胞襯蛋白(fodrin)的PH區(qū)域是靜電極性分子，帶有可能結(jié)合配位體的囊。具有重要意義的事實(shí)是，這個(gè)囊與肽酰-脯氨酰-順-反-異構(gòu)酶FKBP有關(guān)，其中，這個(gè)囊涉及對(duì)大環(huán)化合物FK506的結(jié)合。因此，已經(jīng)考慮了的是，蛋白質(zhì)145的確帶有對(duì)與FK506類似的“自然”配位體結(jié)合的囊，并因此表現(xiàn)為肝細(xì)胞分化的潛在因子。
對(duì)PLC-γ的調(diào)節(jié)，是通過SH2-區(qū)域決定的復(fù)合物，酪氨酸磷酸化受體的酪氨酸激酶，和在酪氨酸殘基上的磷酸化作用聯(lián)合進(jìn)行的。PLC-γ和蛋白質(zhì)145的獨(dú)特性質(zhì)是兩個(gè)都含分裂的PH區(qū)域，PLC的分裂PH區(qū)域填充了SH2-SH2-SH3區(qū)域和周圍X和Y催化反應(yīng)區(qū)域之間的間隙。SH2區(qū)域調(diào)節(jié)了PLC-γ與活性生長(zhǎng)因子受體如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，或血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)受體的高親和相互作用。PH區(qū)域同樣可用來在肝發(fā)育期間，在蛋白質(zhì)激酶和其假定目標(biāo)之間作引導(dǎo)復(fù)合物形成的特定非催化反應(yīng)區(qū)域。此外，在145和PLC-γ中的完全同一的區(qū)域和分裂的PH區(qū)域，也保留在一些其他蛋白質(zhì)中，如TOR2，重要的酵母PI3活化酶，和v-ab1中?？山oSH2區(qū)域劃上平行線與活性生長(zhǎng)因子受體相聯(lián)系的蛋白質(zhì)具有特別的酶屬性，在結(jié)構(gòu)上不屬于它們的催化區(qū)域，并且蛋白質(zhì)也含有約100個(gè)氨基酸的相同的非催化區(qū)域，稱src同源性(SH)區(qū)域2。通過SH區(qū)域與活化酶區(qū)域和磷酸化底物相互作用的明顯性質(zhì)，它首先在無受體蛋白質(zhì)酪氨酸活化酶如Src和Fps中被確認(rèn)出?？梢哉J(rèn)為在細(xì)胞信號(hào)機(jī)制的演化期間，獲取SH2區(qū)域給PLC-γ和GAP提供了與跨膜酪氨酸激酶相互作用的能力，并因此而將生長(zhǎng)因子刺激與PI轉(zhuǎn)換和激酶途徑相偶合。PH區(qū)域可與SH2區(qū)域同樣保留，并能以與SH2區(qū)域同樣的方法加以使用。
如上所述，蛋白質(zhì)liyor-1(145)顯示出在Ito細(xì)胞的形成和纖維化中的重要性，這樣，就可用于治療晚期肝疾病和其他病況包括肝細(xì)胞癌，貧血，共濟(jì)失調(diào)，血色沉著病等?，F(xiàn)在認(rèn)識(shí)到的是，蛋白質(zhì)liyor-1的使用可以是，給適合的患者服用對(duì)治療該患者具體病況為有效量的這種肝蛋白質(zhì)，具體采用的是傳統(tǒng)方式和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用藥方式來實(shí)施。使用本發(fā)明cDNA文庫(kù)確定的liyor-1序列在圖1中列出，適當(dāng)量的liyor-1(145)蛋白質(zhì)可用傳統(tǒng)的方式制備，對(duì)重組的或其它形式的編碼145蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行表達(dá)，之后，蛋白質(zhì)可被分離和/或制成所需的足夠純的形式。另外，145蛋白質(zhì)也可與任何其他適當(dāng)?shù)?，通常用來給患者服用的化合物一起服用，如適當(dāng)?shù)乃幱每山邮艿妮d體。
如本文下面的實(shí)例所述，依據(jù)本發(fā)明，早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的其他基因已被分離和測(cè)序，包括編碼elf蛋白質(zhì)、praja-1蛋白質(zhì)、pk蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)106的基因，和基因20，36，41，112，114，118和129。對(duì)于elf蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是通過分析從妊娠中期胚胎中獲取的組織的mRNA來研究的。解剖第11天以后的組織，在這個(gè)階段，獨(dú)立的肝、心臟和其他組織可容易地解剖出來，隨后分離的RNA質(zhì)量也很好。對(duì)使用32P標(biāo)記的1.1Kb插入代表蛋白質(zhì)elf，使用從不同發(fā)育階段獲取的polyA RNA，與elf DNA在不同鼠組織內(nèi)進(jìn)行的RNA雜交進(jìn)行研究。在elf含量穩(wěn)定的情況下，通過測(cè)量膜動(dòng)蛋白的相對(duì)量，來測(cè)定發(fā)育改變的特異性。在高度嚴(yán)謹(jǐn)沖洗下顯示了2.4kb轉(zhuǎn)錄體。對(duì)每條帶的光密度掃描顯示，elf的最大表達(dá)出現(xiàn)在肝和心臟中，在其他組織中的表達(dá)要少些，在第十一天特異表達(dá)，在第12.5和第14.5天量減少(1-2月后Northerns顯影)。
然后，使用原位雜交確定在e11.5心臟和肝中elf的表達(dá)，連同確定在早期肝發(fā)育期間它的表達(dá)模式，這些在下面的實(shí)例中將作說明。從前腸內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生的肝胚芽，在妊娠第九天長(zhǎng)成為橫膈(13-20個(gè)體節(jié)階段)。在交配后10.5到11.0天期間，相當(dāng)程度的分化出現(xiàn)肝臟在這段時(shí)間充分增大，這種體積的增大是由于，橫膈的間質(zhì)被肝棒狀體侵入和肝臟中生血活性的產(chǎn)生。在第9.5天，elf的明顯標(biāo)記在心臟中變得顯著，模式是小梁式的，包括心原基的壁。部分竇房心室壁也顯示高強(qiáng)度的elf表達(dá)。周圍組織，特別是尾部肝胚芽區(qū)域沒有顯示存在銀色顆粒。
在下一個(gè)階段，第10.5天，銀色顆粒清晰地突出了發(fā)育的肝臟，在這個(gè)部分顯示為水平結(jié)構(gòu)(L)。在這個(gè)階段，在發(fā)育的心臟組織中的信號(hào)減弱。周圍組織顯著缺少銀色顆粒。在第11.5天，elf明顯標(biāo)記在肝臟中變得顯著，其尺寸變大。在這個(gè)階段，心臟僅在后部顯示微弱信號(hào)。作為對(duì)照，除了有義探針，α-胎兒球蛋白的核糖探針概括出了11-12天發(fā)育的胚胎肝。
比較第9.5天和10.5天的胚胎顯示，elf時(shí)序和空間的表達(dá)在心臟中elf表達(dá)升和降的時(shí)序梯度，可從第9天的發(fā)育心臟中的明顯染色，和在下一階段較弱染色中(第10.5天)推斷出來。同時(shí)，肝的表達(dá)增加了?？臻g梯度明顯，銀色顆粒從發(fā)育的心臟向肝臟移動(dòng)的密度增加在第10.5天，由elf cDNA制備的反義RNA探針與第9.5天心臟間質(zhì)組織特異雜交；第10.5天的表達(dá)對(duì)心臟和肝臟是限制性的，elf表達(dá)最終對(duì)在后面第11.5天的胚胎的肝臟是限制性的。值得注意的是，在后面的階段(第12.5，14.5天p.c.)，在胚胎肝中可以看到elf的表達(dá)，但是，豐富度減少相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間后的Northerns和原位顯影結(jié)果出來時(shí)，才測(cè)試出這些后面階段的信息。elf的有義探針不與任何組織雜交。這說明elf的表達(dá)不是突然“開”“關(guān)”的現(xiàn)象，更為具有梯度模式與腦β-膜收縮蛋白的表達(dá)模式相一致。
α-胎兒球蛋白反義RNA探針與11.5、12.5、13.5、14.5胚胎鼠肝組織特異雜交，這與以前對(duì)從胚胎肝樣品中分離的mRNA的研究是相符的。我們通過原位雜交可以檢測(cè)到的α-胎兒球蛋白mRNA的最早階段，是在妊娠第10.5-11.0天。對(duì)清蛋白mRNA的同樣試驗(yàn)顯示，清蛋白在第9.5天在從前腸上皮的細(xì)胞簇中和見到的侵入橫膈中的清蛋白細(xì)胞簇中被表達(dá)。在α-胎兒球蛋白試驗(yàn)中，將肝在隨后的所有階段中作上標(biāo)記(第11天以后)，經(jīng)過組織學(xué)檢驗(yàn)，確定主要發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞中。生血細(xì)胞出現(xiàn)收縮，但不含在α-胎兒球蛋白陽性細(xì)胞中可見的雜交顆粒。這些試驗(yàn)顯示elfmRNA出現(xiàn)在早期胚胎心臟中，然后移動(dòng)到e11的肝臟中。
接著，確定了elf是肝形成中胚層組成的標(biāo)記。因?yàn)镹orthern分析顯示elf表達(dá)出現(xiàn)在第11.5天的心臟和肝組織中，所以實(shí)施原位定位是為了研究elf表達(dá)對(duì)心臟和肝中胚層組織是否是特異限制性的，然后與α-胎兒球蛋白的內(nèi)皮表達(dá)比較。在發(fā)育胚胎中的中胚層的主要區(qū)域是背部(體節(jié))，中部，和側(cè)部。具體地，側(cè)板中胚層包括軀體組織(胸膜，心包膜，腹膜，肢體胚芽)，內(nèi)臟組織[心臟，心外膜，心肌，結(jié)締組織和內(nèi)臟的平滑肌及血管，血管胚(hemangioblastic)組織，腎上腺皮層及脾]。在第9天(13-20個(gè)體節(jié))時(shí)，發(fā)育的心臟顯示是在胚胎內(nèi)，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞被管壁包圍的唯一區(qū)域。普通心室和心房的壁表現(xiàn)出程度增加的橫紋(trabeculation)。在內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的空間里充滿了稱為心臟膠質(zhì)的疏松間質(zhì)。使用elf反義核糖探針進(jìn)行的第9天和第10天胚胎心臟的原位雜交顯示出，心室和心房區(qū)域高含量的標(biāo)記和顯著的橫紋(trabeculation)。
肝間質(zhì)也是從側(cè)板中胚層產(chǎn)生的。肝間質(zhì)的橫膈部分是從心前區(qū)域的內(nèi)臟中胚層產(chǎn)生的，這一點(diǎn)被認(rèn)為是造成后來肝細(xì)胞分化的原因。然而，組織移植試驗(yàn)顯示，所有側(cè)板衍生物可在后面替換肝間質(zhì)。初始試驗(yàn)顯示，內(nèi)皮層的遷移必須與前者的間質(zhì)相互作用，以分化成肝細(xì)胞，最近對(duì)清蛋白mRNA(肝細(xì)胞分化的指示劑)表達(dá)的研究已證實(shí)這些性質(zhì)；最初清蛋白mRNA的表達(dá)出現(xiàn)在橫膈侵入期間，在當(dāng)前腸內(nèi)皮層細(xì)胞明顯接觸心臟間質(zhì)組織時(shí)。同樣地，清蛋白轉(zhuǎn)錄的引物延伸分析顯示，發(fā)生在10.5天的起始轉(zhuǎn)錄位置，在第12.5天肝器官形成時(shí)有15-20倍的清蛋白mRNA的升高。在我們使用α-胎兒球蛋白作為分化肝細(xì)胞的標(biāo)記的試驗(yàn)中，很顯然的一點(diǎn)是，α-胎兒球蛋白表達(dá)對(duì)于肝發(fā)育后期的內(nèi)胚層組成是限制性的，elf表達(dá)似乎在疏松組織的輕度染色的間質(zhì)細(xì)胞中，初始在心臟間質(zhì)中(在第9.5天)出現(xiàn)，然后在心臟和肝臟組織中出現(xiàn)(在第10.5天)，隨后又限制在肝組織(在第11.5天以后)；然后，當(dāng)整個(gè)胚胎肝形成時(shí)，elf表達(dá)的豐富度降低。組織學(xué)檢驗(yàn)后期(第11.5天以后的)部分顯示出了顆粒的分散分布，以及與elf的雜交信號(hào)局限在外竇狀細(xì)胞中，而不在肝細(xì)胞中。
由于elf在早期心臟中胚層中的表達(dá)，及后來的表達(dá)被限制在肝中胚層，這就說明，對(duì)于肝發(fā)育的中胚層組成，這是一種新標(biāo)記。分子標(biāo)記在胚胎學(xué)研究中的誘導(dǎo)事件解剖中的價(jià)值是無法衡量的。例如，在非洲爪蟾(Xenopus)的vg-1中，TGF-β家族的一個(gè)成員被認(rèn)為是當(dāng)前背中胚層誘導(dǎo)的最好候選，而事實(shí)上最初的分離是通過對(duì)位于發(fā)育非洲爪蟾卵的植物性半球中的mRNA的分化篩查完成的。活化素和屬于TGF-β家族的其他基因如vg-1，以及wnt和BFGF家族，代表了導(dǎo)致實(shí)施特定中胚層演化的級(jí)聯(lián)的組成，并且所有都是作為中胚層誘導(dǎo)因子的好的候選。然而，這些基因中，只有vg-1顯示出位于植物性細(xì)胞中，即對(duì)造成體內(nèi)中胚層誘導(dǎo)負(fù)責(zé)的分裂球。vg-1的特異位置是很重要的，其負(fù)責(zé)對(duì)vg-1在中胚層形成中作誘導(dǎo)劑的作用的研究中所要求的一致性。同樣地，對(duì)于分離肝形成所需的假定誘導(dǎo)劑，關(guān)鍵的步驟是定位從胚胎肝分離出的新mRNA。因此，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的是，elf和與其有關(guān)的調(diào)節(jié)基因作為肝生長(zhǎng)因子是具有巨大的潛在好處的。
對(duì)elf的進(jìn)一步特征化涉及對(duì)成年鼠和人類組織的RNA分析，已經(jīng)確定的是，elf與成年肝、腎、和睪丸雜交，在肝和腎中為2.4Kb轉(zhuǎn)錄體，在成年睪丸中為2.6Kb轉(zhuǎn)錄體，其豐富度很低兩個(gè)印跡在膠片上于-70℃曝光一個(gè)月后顯影。對(duì)從人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，雞，和酵母中獲取的DNA(基因組)的elf表達(dá)進(jìn)行的基因組DNA分析顯示，elf保留在許多不同的物種中，在所有研究的物種中，除了兔子，都表現(xiàn)出了elf DNA。
在elf的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯中，使用核酸酶處理的兔子網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞體(promega)的后者顯示了34Kb的蛋白質(zhì)，如elf插入尺寸所預(yù)計(jì)的，說明這種插入對(duì)于特異蛋白質(zhì)編碼序列是框內(nèi)的。這些研究建立的理論是，特異中胚層mRNA是以保證它們后來的與特異中胚層組織相隔離的方式定位的，這樣，則假設(shè)的肝臟中胚層組成就如胚胎移植理論中所示。
對(duì)elf蛋白質(zhì)已經(jīng)測(cè)序，并且確定的是，在早期肝發(fā)育期間可確認(rèn)出至少三種特異elf蛋白質(zhì)基因，這些基因的序列被稱為elf-1，elf-2，elf-3，分別在圖2a、2b、2c中給出。如上所述，在早期肝發(fā)育期間，elf蛋白質(zhì)1-3對(duì)膽樹的形成可能是重要的。因此，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的是，依據(jù)本發(fā)明，elf蛋白質(zhì)在治療多種與肝功能有關(guān)的疾病中是有用的，包括膽汁郁積，膽結(jié)石，膽阻塞，膽?yīng)M窄，原發(fā)性膽硬化，原發(fā)性硬化膽管炎。使用elf蛋白質(zhì)的治療方式，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的，包括服用對(duì)治療上述具體病況為有效量的分離的elf蛋白質(zhì)。同樣顯而易見的是，elf蛋白質(zhì)本身可用一些適當(dāng)?shù)姆绞?，通過表達(dá)圖2a-2c中所示的核酸序列來制備，包括制備這些蛋白質(zhì)的重組方法，然后分離，離析和/或充分提純elf蛋白質(zhì)。一旦用這種方式獲得了elf蛋白質(zhì)，就可以將其制成患者可接受的任何適當(dāng)形式。此外，這三種elf蛋白質(zhì)任何一種可與任何其他適當(dāng)?shù)?，通常用來給患者服用的化合物一起服用，如適當(dāng)?shù)乃幱每山邮艿妮d體。
依據(jù)本發(fā)明確定及分離出的，認(rèn)為也能用于多種治療方法中的另一種蛋白質(zhì)是praja-1。目前，已對(duì)praja-1與早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的試驗(yàn)一起進(jìn)行了研究，對(duì)氨基酸翻譯的分析顯示出COOH-終端RING-H2基元序列的存在，它是一種鋅指變異體。此外，對(duì)成年鼠RNA的Northern印跡分析顯示出在肝、腦、和腎中對(duì)3.1kb、2.6kb、和2.1kb轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)，和在睪丸中對(duì)2.3kb轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)。praja-1的表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中也是明顯的，下面將作闡述，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的是，praja-1蛋白質(zhì)對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞的早期發(fā)現(xiàn)是一種有用的標(biāo)記。
還了解到的是，praja-1位于X染色體，在約36cM的地方。位于該區(qū)域的其他基因包括膜突蛋白[moesin](Msn)，雄性荷爾蒙受體(Ar)，白細(xì)胞間介素-2受體γ(IL-2rg)，X-連接的鋅指蛋白質(zhì)(Zfx)，以及tabby(Ta)。鼠和人類X染色體之間的同義和保留基因順序可與這個(gè)區(qū)域中的人類疾病基因相比較。在這個(gè)區(qū)域中與中胚層有關(guān)的人類疾病包括缺水外胚層發(fā)育異常(eda)，鐵粒細(xì)胞性貧血和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(asa)，因此，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的是，依據(jù)本發(fā)明，praja-1在治療這些疾病狀況，及衰退性神經(jīng)病學(xué)上的病變中將是有用的。
對(duì)praja-1的體外表達(dá)顯示，翻譯的產(chǎn)物走出兩個(gè)相鄰的間隔帶，為Mr＝55.6和56.9kD，比預(yù)測(cè)的ORF尺寸47.4kD要大。一種可能的解釋是，表達(dá)產(chǎn)物是強(qiáng)酸性的，已知的酸性蛋白質(zhì)如granin會(huì)給SDS-PAGE帶來異常高的Mr值。存在兩種產(chǎn)物說明翻譯開始于第二個(gè)中間的ATG密碼子，如在Met-19。
此外，對(duì)praja-1的反義研究顯示，praja-1對(duì)于肝臟機(jī)構(gòu)體系形成是很重要的。在1.25、2.5、和5mfn濃度，使用對(duì)praja-1的兩種不同ODN，進(jìn)行初步反義研究。在這些試驗(yàn)中，肝和塊移植體用這些反義ODN處理，與對(duì)照物對(duì)比(混雜的，有義的或無ODN的)。結(jié)果顯示，對(duì)照物肝臟一般比反義處理的肝臟大，對(duì)照物塊顯示出早期肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，軟骨的生長(zhǎng)，和保存很好的膽管。用任何一種對(duì)praja-1的反義ODN處理過的肝和塊，都顯示出最小程度的肝細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞壞疽，及仍保存著軟骨組織，并且是劑量依賴性的。
在praja-1中，除了RING-H2指外，剛超過這個(gè)基元序列的三十四個(gè)COOH-終端氨基酸的部分富含脯氨酸殘基(17.6％)；并如所述的，蛋白質(zhì)通常是強(qiáng)酸性的。在幾種哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了富含脯氨酸的區(qū)域，如在轉(zhuǎn)錄因子CTF的COOH-終端。富含脯氨酸區(qū)域和酸性區(qū)域可能會(huì)發(fā)揮與其他蛋白質(zhì)相接觸的作用。當(dāng)將praja-1序列整體考慮時(shí)，鼠Neurodap1基因具有最大的相似性。Neurodap1在鼠腦中大量表達(dá)，在心臟和骨骼肌中的量要少的多。同樣地，盡管praja-1顯示在腦中表達(dá)，但不象Neurodap1(較大4.8kb轉(zhuǎn)錄體)，它也在肝和腎中表達(dá)。Neurodap1的亞細(xì)胞定位，顯示集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀細(xì)胞(ER)和大腦皮層和面部核子的高爾基體周圍，尤其是在軸突胞體神經(jīng)鍵的后神經(jīng)鍵密度區(qū)域中。根據(jù)其亞細(xì)胞定位，加上RING-H2指的存在，Neurodap1可能與分泌或蛋白質(zhì)分類相關(guān)聯(lián)。與Neurodap1的這種相似性表明praja-1很可能與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，可能與涉及肝細(xì)胞形成的蛋白質(zhì)分類或分泌路徑有關(guān)。
對(duì)編碼praja-1蛋白質(zhì)的基因測(cè)序，該核酸序列在圖3中給出。如上所述，praja-1蛋白質(zhì)對(duì)于鐵的運(yùn)載可能是很重要的，對(duì)肝細(xì)胞形成及生血作用也是很重要的。因此，依據(jù)本發(fā)明，praja-1可用于診斷和治療一些疾病如晚期肝疾病，鐵存貯病變，肝細(xì)胞癌，及貧血如鐵粒細(xì)胞性貧血，共濟(jì)失調(diào)如脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)，和血色沉著病。正如本此領(lǐng)域的技術(shù)人員可明了那樣，這些治療方式涉及給遭受上述一種病況的患者服用有效量的praja-1蛋白質(zhì)。此外，praja-1蛋白質(zhì)的分離可通過表達(dá)圖3中所示的編碼praja-1蛋白質(zhì)的核酸序列來獲得，使用任何此領(lǐng)域熟知的適當(dāng)方法如重組方式。一旦用這種方式分離，可獲得所需形式的praja-1蛋白質(zhì)，如充分提純的狀態(tài)，并且可加入到對(duì)需要這種治療的患者為適應(yīng)的任何適當(dāng)治療模式中。此外，praja-1蛋白質(zhì)可與任何其他適當(dāng)?shù)?、通常用來給患者服用的化合物一起服用，如適當(dāng)?shù)乃幱每山邮艿妮d體。
如上所述，進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，在癌性結(jié)腸組織中確定出來了蛋白質(zhì)praja-1，如在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中，其正常體是不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的。因此，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的是，依據(jù)本發(fā)明，提供了一種檢測(cè)診斷結(jié)腸癌的方法，其中從測(cè)試患者獲取結(jié)腸細(xì)胞或組織，用任何適當(dāng)?shù)姆绞胶Y查這些細(xì)胞或組織，確定在測(cè)試細(xì)胞或組織中存在或不存在praja-1蛋白質(zhì)。用這種方式，在從患者獲取的結(jié)腸細(xì)胞或組織中確定出praja-1，說明在結(jié)腸細(xì)胞或組織中出現(xiàn)癌病況，這樣本發(fā)明為在早期，當(dāng)疾病仍處于可治療的狀況下，確定患者是否感染了結(jié)腸癌提供了簡(jiǎn)單有效的方法。相反，不存在praja-1通常表示在測(cè)試的結(jié)腸細(xì)胞中無癌癥狀。
依據(jù)本發(fā)明，還有其他編碼早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的基因被確定和測(cè)序，這些蛋白質(zhì)對(duì)于診斷和治療與肝臟或肝功能有關(guān)疾病的多種方法中是有用的。包括在這些額外基因中的有，編碼被確認(rèn)為pk蛋白質(zhì)的核酸，如圖4中所示，編碼被確認(rèn)為蛋白質(zhì)106蛋白質(zhì)的核酸，如圖5中所示，以及基因20，36，41，112，114，118和129，如圖6-12所示。這些蛋白質(zhì)對(duì)于肝細(xì)胞形成也是有用的，對(duì)于使用與上述許多蛋白質(zhì)相似的方法，及使用與應(yīng)該用于治療各種病況的已知生長(zhǎng)因子相同的方法治療肝疾病也是有用的。例如，蛋白質(zhì)pk在Ito細(xì)胞形成和纖維化中是很重要的，這樣就可使用與蛋白質(zhì)liyor-1(145)相同的方法加以利用。因此，蛋白質(zhì)pk，如從圖4所示的核酸序列制備的，在治療晚期肝疾病，肝細(xì)胞癌，以及其他疾病狀況包括貧血，共濟(jì)失調(diào)，和血色沉著病中也很可能是有用的。如同上面的情況，這些早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)可與用來給患者服用的任何其他合適的化合物一起服用，如適當(dāng)?shù)乃幱每山邮艿妮d體。
本發(fā)明的另一方面包括培養(yǎng)上面提到的早期發(fā)育蛋白質(zhì)的抗體，或培養(yǎng)從這些蛋白質(zhì)衍生的肽或融合蛋白質(zhì)如pk蛋白質(zhì)(也稱作itih-4)的抗體。如同被本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的，這些蛋白質(zhì)的抗體，或從這些蛋白質(zhì)衍生選擇的肽或融合蛋白質(zhì)的抗體，可用目前已知的任何適當(dāng)?shù)膫鹘y(tǒng)方法制備，包括在這樣一些動(dòng)物如，兔子，綿羊，山羊，或豚鼠中培養(yǎng)抗體。在一個(gè)較好的實(shí)施例中，下列抗體是在兔子中培養(yǎng)的(1)在鼠elf基因N-終端aa2-14上的肽(13-mer)，序列為5-ELQRTSSVSGPLS-3；(2)在鼠elf基因C-終端aa2140-2154上的肽(14-mer)，序列為5-FNSRRTASDHSWSG-3；(3)在鼠praja-1基因中部aa144-156上的肽(13-mer)，序列為5-LRRKYRSREQPQS-3。
此外，本發(fā)明還包括下列肽的抗體(1)從基因145(Cded)C-終端設(shè)計(jì)的145肽-A(18-mer)，序列為5-SAQSLVVTLGRVEGGIRV-3或5-CSAQSLVVTLGRVEGGIRV-3；
(2)從基因145(Cded)中部設(shè)計(jì)的145肽-B(17-mer)，序列為5-KIEGSSKCAPLRPASRL-3或5-CAPLRPASRLRASQTLG-3；(3)從基因G59(Praja1)N-終端設(shè)計(jì)的g59肽-A(16-mer)，序列為5-PPREYRASGSRRGMAY-3或5-PPREVYASGSRRGMAYC-3；(4)從基因G59(Praja1)中部設(shè)計(jì)的g59肽-B(15-mer)，序列為5-CKVPRRRRTMADPDFW-3；本發(fā)明也包括融合蛋白質(zhì)的抗體，如40kD pk/itih-4融合蛋白質(zhì)，其包括itih-4d兩個(gè)EF-手性基元序列(約400-bp14kD)。
前述的具體實(shí)施僅僅是對(duì)權(quán)利要求的發(fā)明的演示，在上面沒有具體說明的、對(duì)此領(lǐng)域中的技術(shù)人員顯然的或熟知的變通具體實(shí)施也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，下面給出的實(shí)例是對(duì)權(quán)利要求的發(fā)明的演示，不能以任何方式認(rèn)為是對(duì)所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)例1依據(jù)本發(fā)明確定涉及早期鼠肝發(fā)育的基因的克隆策略，我們分離了Praja-1，此基因與果蠅melanogaster goliath(gl)基因具有相似的序列，它涉及最終形成腸肌肉組織、脂肪及心肌的中胚層細(xì)胞的形成。Praja-1是一個(gè)2.1kb基因，編碼一個(gè)假定的423個(gè)氨基酸的ORF，并包含一個(gè)羧基終端RING-H2區(qū)域。使用Jackson Laboratory BSS測(cè)試組，我們定位出Praja-1在染色體X的36cM處，鄰近X的非活性中心基因Xist。Northern印跡分析顯示，在從成年鼠組織腦、肝、腎獲取的mRNA中，及從發(fā)育鼠胚胎(交配后第7，11，15和17天)中獲取的mRNA中，有3個(gè)轉(zhuǎn)錄體(3.1kb、2.6kb、和2.1kb)。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯得到Mr為55.6KD和56.9KD的兩種產(chǎn)物。RING-H2區(qū)域、在羧基-終端的一個(gè)富含脯氨酸區(qū)域、及富含酸性氨基酸區(qū)域的存在，可得到這樣一個(gè)假說Praja-1產(chǎn)物涉及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，可能作為蛋白質(zhì)分類或轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的一部分。鼠Neurodap1與Praja-1的相似性強(qiáng)化了這一假說，鼠Neurodap1的產(chǎn)物顯示位于腦中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體上。
進(jìn)行肝細(xì)胞分化的分子機(jī)制還沒有被很好的了解，因此，確定控制肝發(fā)育的基因可以為明確肝的功能及發(fā)育提供有力工具，并可以將誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化用于治療目的。作為克隆這樣基因的策略的一部分，我們分離了一種新的RING-H2指基因，Parja-1。RING-H2是一種鋅指，除Cys4被His取代，它與RING指是相同的[參閱Freemont，Ann.N.Y.Acad.Sci.684174-192，1993；Lovering et al.，P.N.A.S.902112-2116，(1993)]。現(xiàn)在我們可以看到Praja-1在鄰近羧基終端有一個(gè)RING-H2基元序列。這個(gè)RING-H2基元序列與果蠅melangogaster gl基因(Bouchard et al.，Gene 125205-209，1993)及鼠Neurodap1(Nakayama et al，.J.Neurosci.155238-5248，1995)基因相類似。Praja-1位于X染色體上，在鼠的腦、肝及腎臟中表達(dá)。所以RING-H2基元序列的存在，加上翻譯產(chǎn)物的酸性及親水性特征，可推出這樣一個(gè)假設(shè)Praja-1在蛋白質(zhì)運(yùn)載中起到作用。材料及方法cDNA的制備及3′-RACE PCR.
從交配11天后的胚胎鼠(ICR，Harlan Sprague-Dawley)的肝中用胍硫酸氰鹽(Chomczynski et al.，Ann.Biochem 162156-159，1987)分離出RNA。按制造商說明用Dynabeads從總量RNA中分離出Poly(A)+mRNA。用Promega反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)和3′-RACE引物5′-GACTCGAGTCGACATCGA-T17[Frohman，InM.A.Innis et al.，(eds.)，PCR protocolsa guide to methods andapplications，Academic press，San Diego，pp.28-38，1990]從Poly(A)+mRNA中制備第一條cDNA鏈。3′-RACE引物在PCR中也可用作反引物。正向PCR引物，最初設(shè)計(jì)用來擴(kuò)增克隆145/PH(血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源性)區(qū)域的保留區(qū)域，是5′-CTCAAGCAGGTCCTGGCACA。PCR反應(yīng)混合物包括cDNA(約10ng的Poly(A)+mRNA)，25pmol各種引物，ImMdNPT混合物和2.5單位的AmpliTaq DNA聚和酶(Perkin-Elmer)，加入10mM Tris，1.5mM MgCl2，和75mM KCl，pH9.2，最后的體積為50ml。溫度程序包括35個(gè)周期的變性(94℃，1分鐘)，退火(55℃，1分鐘)，延伸(72℃，3分鐘)，之后再加8分鐘的延伸。PCR反應(yīng)產(chǎn)物之一(CH7)包括725bp片段，它被克隆成運(yùn)載體PCRII，使用的是Invitrogen TA克隆試劑盒測(cè)序，通過序列分析顯示含有RING-H2指。最終cDNA克隆的與CH7相當(dāng)?shù)牟糠煮w在圖3中列出?；蛭膸?kù)篩查通過使用反向PCR引物加AmpliTaq聚合酶，在72℃的PCR緩沖液中的引物延伸，將PCR產(chǎn)物CH7用[a-32P]-dCTP(3000Ci/mmol，Amersham)標(biāo)記[Konat et al.，in PCRTechnologyCurrent Innovations(H.G.Griffin and A.M.Griffin，Eds.)，CRC Press.Boca Raton，PP.37-42，1994]。產(chǎn)物反義探針用來篩查在載體Zap中的整個(gè)胚胎鼠(交配第11天后)cDNA文庫(kù)的噬菌斑。將陽性噬菌斑選出并提純，并用標(biāo)準(zhǔn)工藝將DNA從溶胞體中分離(Silhavy et al.，Experiment with gene fusions，Coldspring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1984)。用EcorI將插入體從Zap DNA中切除。為了測(cè)序和隨后的操作，將其亞克隆到PGEM3Zf(-)(Promega)。DNA序列分析采用Genband中BLAST搜索法，進(jìn)行DNA序列與已經(jīng)存在序列的對(duì)比，使用GCG程序PILEUP實(shí)施排序。染色體制圖使用[32P]-標(biāo)記的CH7作探針，對(duì)從C57BL/6J(B6)和Musspretus(SPRET/Ei)中獲取的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析，顯示對(duì)TaqI酶的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。使用從JacksonLaboratory Backcross DNA Panel Map Service獲取的(B6XSPRET/Ei)XSPRET/Ei反交測(cè)試組(BBS)，使用這種多態(tài)性跟蹤Praja-1基因的遺傳(Rowe et al.，Mammalian Genome 5253-274，1994)。通過最小化在每一個(gè)單型體內(nèi)多級(jí)重組的數(shù)量，確定相對(duì)于其它標(biāo)記的順序和連鎖。Praja-1表達(dá)的Northern印跡分析將含有2毫克從鼠組織獲取的Poly(A)+mRNA(Clontech)的Northern印跡，用[32P]標(biāo)記過的CH7反義鏈和Express Hyb雜交溶液在68℃進(jìn)行探測(cè)。依據(jù)制造商的說明沖洗，并進(jìn)行放射自顯影。與Northern印跡一起提供的[32P]標(biāo)記的b-肌動(dòng)蛋白探針用作對(duì)照物，以標(biāo)準(zhǔn)化每條鏈中的RNA含量。體外轉(zhuǎn)錄/翻譯使用轉(zhuǎn)錄/翻譯一體的兔子網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞體系，依照制造商的說明進(jìn)行(35S)蛋氨酸標(biāo)記。在PGEM32F(-)中Praja-1的克隆加一個(gè)熒光素酶對(duì)照體克隆與T7-RNA聚合酶一起使用(正向)。每個(gè)反應(yīng)包括兔子網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞體12.5ml，反應(yīng)緩沖液1ml，1mM氨基酸混合液(除蛋氨酸外)0.5ml，0.5ml T7-RNA聚合酶，20單位的RNasin，最后體積為25ml。在300℃90分鐘溫育后，按照Laemmli，Nature227680-685(1970)，產(chǎn)物在SDS/疏基乙醇處理緩沖液中溶胞，在10％的SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離。蛋白質(zhì)用BioRad Trans-Blot儀器，依據(jù)制造商的說明電轉(zhuǎn)染到BAS-NC膜上，通過放射自顯影使標(biāo)記產(chǎn)物可見。結(jié)果新基因praja-1的分離和序列分析作為對(duì)涉及肝發(fā)育及肝功能的基因的分析的一部分，我們擴(kuò)增了前面未被描述的基因CH7的3’未端。使用CH7探針對(duì)鼠胚胎cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩查，分離了兩個(gè)重疊克隆體，Praja-1-5和Praja-1-6。對(duì)共有的重疊區(qū)域進(jìn)行的序列分析顯示出有424個(gè)氨基酸的開放讀框(ORF)，預(yù)計(jì)尺寸為47.4KD。水療法分析(Kyteet al.，J.Mol.Biol.157105-132，1981；未給出)顯示，翻譯產(chǎn)物具有強(qiáng)親水性，不帶有疏水前導(dǎo)區(qū)或膜跨越區(qū)域。翻譯也有很強(qiáng)的酸性，pI為4.6，含有17.7％的酸性殘基(Asp加Glu)。圖3中所示的推測(cè)的ATG啟始密碼子被選出，是因?yàn)樗欠祥_放讀框內(nèi)的最上游的ATG，TAG終止密碼位于推測(cè)的ATG啟始密碼子上游的21對(duì)堿基對(duì)之前。然而，這個(gè)ATG的前后與共有Kozak識(shí)別序列GCCAGGatgG，僅是勉強(qiáng)匹配，其中在-3上沒有嘌呤且在+4上沒有G(由Kozak評(píng)論，Genome7563-574，1996)。氨基酸翻譯的序列分析顯示存在羧基終端RING-H2基元序列，它是一個(gè)鋅指變異體(Freemont，同上)。圖13顯示了Praja-1的RING-H2基元序列與含RING-H2的其它幾種蛋白質(zhì)的對(duì)比。鼠染色體X上Praja-1位置的連鎖分析Praja-1的限制性片段長(zhǎng)度多樣性的確定是，使用CH7作探針，在含有從幾種限制性酶(TaqI，BglII，EcoRI，HindIII，HincII，KpnI，PstI)酶解過的親本中獲取的DNA的Southern印跡上測(cè)得的。對(duì)于每種使用的酶，C57B61/J僅有一個(gè)限制性片段，而在SPRET/Ti帶內(nèi)總是可觀察到兩個(gè)片段。使用TaqI獲得的多樣性，在BBS測(cè)試組中用來對(duì)C57B1/6J等位基因的遺傳分類。這里有兩個(gè)Spretus帶S1和S2和一個(gè)C57B1/6J帶B1。在對(duì)praja-1基因型與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)分類的其他基因比較后，可以確定praja-1位于鼠染色體約36cM的位置上(圖14)。S1帶是在SPRET/Ei染色體X上的praja-1等位基因。S2TaqI片段出現(xiàn)在每種反交動(dòng)物中，因?yàn)樗蟹唇坏玫降男坌詣?dòng)物含有這種等位基因，所以它不是位于X染色體上的。因?yàn)榇菩詣?dòng)物也含有S2帶，所以它不是Y-連鎖的。這樣，S2是常染色體位點(diǎn)，含有praja-1探針序列的同源序列。位于這個(gè)區(qū)域的其他基因包括膜突蛋白(Msn)，雄性荷爾蒙受體(Ar)，白細(xì)胞間介素-2受體γ(Il2rg)，X-連鎖鋅指蛋白質(zhì)(zfx)，和tabby(Ta)。這個(gè)區(qū)域距Xist位點(diǎn)也是1.1±1.1cM。進(jìn)一步的研究是需要確定praja-1是否在無活性X-染色體上沒有表達(dá)，及在X-無活性區(qū)是否起作用。在鼠和人類X染色體之間同義和保留的基因順序(Herman et al.，Genome 6S317-S330，1996)，可與此區(qū)域的人類疾病基因比較。此區(qū)域中涉及中胚層的人類疾病包括缺水性外胚層發(fā)育異常(eda)和鐵粒細(xì)胞性貧血以及脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(asat)。
體外表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物比預(yù)計(jì)的尺寸大。Praja-1-5和praja-1-6克隆體的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)物的放射自顯影顯示，只有Praja-1-5產(chǎn)生了有意義的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物跨越兩個(gè)鄰近間隔的帶，Mr＝55.6和56.9kD，比預(yù)計(jì)的ORF尺寸47.4kD要大。一個(gè)可能的解釋是表達(dá)產(chǎn)物是強(qiáng)酸性的，已知的酸性蛋白質(zhì)如granin給SDS-PAGE帶來異常高的Mr值(Huttner et al.，TrendsBiol.Sci.1627-30，1991)。存在兩種產(chǎn)物說明翻譯開始于第二個(gè)中間的ATG密碼子，如Met-19(圖3)。
在胚胎和鼠組織中存在著praja-1的轉(zhuǎn)錄體。從成年鼠獲取的RNA的Northern印跡分析顯示，在肝、腦和腎中有3.1kb、2.6kb和2.1kb的轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)，另外在睪丸中有2.3kb轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)。Praja-1蛋白質(zhì)不象是膜受體，因?yàn)樗鄙偈杷缒^(qū)域。一致的親水性建議該蛋白質(zhì)是可溶性的。在圖13中，Praja-1RING-H2基元序列與從幾種其他蛋白質(zhì)中獲取的基元序列一起列出。RING指通常被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起作用(Borden et al.，Curr.Opinion.Struct.Biol.6395-401，1996；Saurin et al.，Trends Biochem.Sci.96208-214，1996)。引用一個(gè)具體實(shí)例，如果兩個(gè)組成急性前髓細(xì)胞白血病原致癌蛋白PML的RING指的Zn++鍵合點(diǎn)的半胱氨酸的任一個(gè)突變，那么核子多蛋白復(fù)合物，或稱為核體，就不會(huì)出現(xiàn)(Borden et al.，EMBO.J141532-1541，1995)。作者總結(jié)認(rèn)為PNM RING區(qū)域，和可能的其他RING指區(qū)域與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)。
在praja-1中，除了RING-H2指外，剛超過這種基元序列的三十四個(gè)COOH-終端氨基酸的片段(圖3)富含脯氨酸殘基(17.6％)；并如所述的，蛋白質(zhì)通常是強(qiáng)酸性的。在幾種哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了富含脯氨酸的區(qū)域，如在轉(zhuǎn)錄因子CTF的COOH-終端，富含脯氨酸區(qū)域和酸性區(qū)域可能會(huì)起到與其他蛋白質(zhì)相接觸的作用(Mitchell et al.，Science 245371-378，1989)。對(duì)富含脯氨酸COOH-終端的BLAST的搜索顯示，在可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有與任何蛋白質(zhì)有意義的匹配。然而，當(dāng)將praja-1序列整體考慮時(shí)，鼠Neurodap1基因具有最大的相似性。對(duì)比序列在圖15中列出。
Neurodap1在鼠的腦中大量表達(dá)，在心臟和骨骼肌中的量要少的多。同樣地，盡管praja-1顯示在腦中最大的表達(dá)，但不象Neurodap1，它也在肝和腎中表達(dá)。Neurodap1的亞細(xì)胞定位，顯示集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀細(xì)胞(ER)和大腦皮層和面部核子的高爾基體周圍，尤其是在軸突胞體神經(jīng)鍵的后神經(jīng)鍵密度區(qū)域中(Nakayama et al.，同上)。根據(jù)其亞細(xì)胞定位，加上RING-H2指的存在，Neurodap1可能與分泌器官或蛋白質(zhì)分類相關(guān)連。然而，Praja-1確實(shí)與Neurodap1在一些方面相區(qū)別。除了與Neurodap1相比在一些不同的器官中表達(dá)之外，Praja-1編碼的產(chǎn)物比(47.4kD，依據(jù)圖3中克隆體的組成)Neurodap1編碼的產(chǎn)物77.9kD要小。尺寸的不同是在蛋白質(zhì)的N-終端(圖15)。我們觀察到的Praja-1最大的轉(zhuǎn)錄體為3.1kb，而Neurodap1在田鼠腦mRNA的Northern印跡上存在單一的4.8kD轉(zhuǎn)錄體。
依據(jù)BRCA1的事實(shí)，其含有RING指，具有酸性pI，是一種分泌蛋白質(zhì)，也具有蛋白質(zhì)granin家族的性質(zhì)(Jensen et al.，Nature Genet.12303-308，1996)，我們檢驗(yàn)了praja-1的granin特征。我們發(fā)現(xiàn)在praja-1翻譯產(chǎn)物中沒有區(qū)域與共有序列E[N/S]LX[A/D]X[D/E]XEL完美匹配，盡管兩個(gè)區(qū)域七分之五的保留殘基相互匹配。我們也不能證明存在明顯的螺旋式盤繞，這種結(jié)構(gòu)存在于BRCA1和以前提及的帶有三重結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中。在這些方面，與其他蛋白質(zhì)如BRCA1相比，praja-1與Neurodap1更為相似。同樣，盡管在praja-1中RING-H2顯示出與melanogaster goliath(gl)中的RING-H2有更多的相似性(圖13)，但Goliath蛋白質(zhì)呈堿性pI(8.9)，并且沒有與RING-H2指外部的praja-1相似的序列。RING-H2基元序列加酸性和富含脯氨酸區(qū)域，以及與Neurodap1的相似性，可得出這樣的結(jié)論，praja-1與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，可能與蛋白質(zhì)分類或分泌路徑有關(guān)。
實(shí)例2依據(jù)本發(fā)明，為了分離和確認(rèn)用于涉及肝臟和肝功能治療的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，對(duì)肝組織中分化誘導(dǎo)進(jìn)行研究。在發(fā)育胚胎中，誘導(dǎo)的相互作用，細(xì)胞間的聯(lián)絡(luò)，及細(xì)胞極性的建立對(duì)于發(fā)育期間的生長(zhǎng)和成型是很重要的。然而，影響肝細(xì)胞分化或肝發(fā)育的精確機(jī)理以前沒有被闡明。對(duì)哺乳動(dòng)物肝發(fā)育的首先認(rèn)識(shí)，是通過胚胎組織的間質(zhì)和內(nèi)胚層之間的相互作用的特異序列而建立的。在鼠妊娠的第9.5天，根據(jù)從心臟間質(zhì)傳出的信號(hào)，肝臟憩室的內(nèi)胚層細(xì)胞繁殖并移入周圍橫膈中。疏松間質(zhì)的這個(gè)特異區(qū)域接著分化成肝間質(zhì)，在妊娠約10.5天肝胚芽最終可在顯微鏡下看到。這種肝間質(zhì)繼續(xù)使肝細(xì)胞繁殖擴(kuò)增，然后持續(xù)整個(gè)胚胎生命(Le Dorarin，Med.Biol.53425-455，1997)。清蛋白轉(zhuǎn)錄最早可在第9.5天檢測(cè)到(Cascio et al.，Development 113217-225，1991)，說明當(dāng)肝內(nèi)胚層開始與心臟間質(zhì)接觸時(shí)，肝細(xì)胞分化就開始了。作為對(duì)基因表達(dá)的這樣限制性模式的調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分析的第一步，就要求分子標(biāo)記以及調(diào)節(jié)基因來確定肝發(fā)育所需的相互作用。
肝臟基因調(diào)節(jié)途徑的解剖使得轉(zhuǎn)錄活性劑，C/EBP，DBP，LFB1/HNF 1，3和4(Johnson，Cell Growth Differ.147-52，1990；Kuo et al.，Development 109473-481，1990；Frain et al.，Cell59145-157，1989)，肝特異基因，如α-胎兒球蛋白和清蛋白(Tilghman，Oxford Survevs on Rukaryotic Genes，OxfordUniversity Press，1985)得到確定和特征化。然而，除了HNF4、3α和β(Ang et al.，Development 1191301-1315，1991和Cell78561-574，1994)之外，在確定發(fā)育肝的細(xì)胞組和區(qū)域特異中，沒有發(fā)現(xiàn)上述一種起到確定性作用。肝胚芽的體積小(約4×10-2mm3)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，DNA和信使RNA的量更小。這樣使對(duì)肝發(fā)育的分子分析很困難。因此，建立早期胚胎肝cDNA文庫(kù)，實(shí)施相減雜交仍然是獲得早期鼠肝發(fā)育期間所需的基因的無偏差目錄的最似可信和廣泛的方法(參閱Harrison et al.，Development 1212479-2489，1995)。
標(biāo)記的分離提供了與基因表達(dá)這樣的限制性模式有關(guān)的轉(zhuǎn)錄活化劑和生長(zhǎng)因子的更進(jìn)一步信息，并且最終提供了確定與肝細(xì)胞分化有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方法。在一些情況中，這些途徑已成為脊椎動(dòng)物頭和軀干的模式及軸形成的特征(Oliver et al.，Development 121693-705，1995；Kessel et al.，Science 249374-379，1990)。例如，在非洲爪蟾(Xenopus)中，涉及brachyury，活化素和wnt有關(guān)的基因的網(wǎng)絡(luò)，負(fù)責(zé)中胚層誘導(dǎo)、somitogenesis、肌性和成骨的分化(參閱如，Wilkinson et al.，Nature 343657-659，1990；Herrmann et al.，Development 113913-917，1991；Green et al.，Trends Genet.7245-250，1990；Sokol et al.，Cell 67741-752，1991；Smith et al.，67753-767，1991)，并且背腹軸的形成是由于Xgsk-3(果蠅zw3/shaggy的非洲爪蟾同源物)磷酸化它的armadillo的非洲爪蟾同源物，β-連環(huán)蛋白(catenin)，從而調(diào)節(jié)可供背軸形成用的β-連環(huán)蛋白的含量。然而，對(duì)早期肝發(fā)育或它的重要的中胚層組成進(jìn)行特征化而言，沒有現(xiàn)成可用的分子標(biāo)記或途徑。
正是由于本發(fā)明，使對(duì)于肝發(fā)育而言，確定和特征化這樣的分子標(biāo)記和可能的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄體成為可能。如下所述，描述了elf蛋白質(zhì)的特征，并且，這種蛋白質(zhì)的表達(dá)可能標(biāo)記肝發(fā)育的分別的組成。關(guān)于這種特征的“顛倒”方法通常會(huì)確定出完全意料不到的基因組，特別是，這里描述的是elf蛋白質(zhì)，它通過在表膜上的相互作用，可能在建立細(xì)胞極性中起到作用。時(shí)cDNA文庫(kù)的特征描述在肝發(fā)育中的四個(gè)階段(e10、e11、e12、和e14，其中e是指胚胎)確定了從未分化中胚層/內(nèi)胚層細(xì)胞到發(fā)育良好和分化的胚胎肝的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)。在e9-10天時(shí)，細(xì)胞極性中出現(xiàn)變化。在e10.5-11天，發(fā)生內(nèi)胚層細(xì)胞侵入和移入到周圍間質(zhì)；在e11.5-12天，假性裂片形成，肝細(xì)胞棒狀體與早期竇狀體一起形成。因此，代表這些基因的cDNA文庫(kù)，表示在肝細(xì)胞形成的關(guān)鍵時(shí)間段“捕獲的”大量表達(dá)的mRNA種類，并能使它們分離，提供一種分析肝發(fā)育期間基因表達(dá)變化模式的方法。
含有5.0×106-4.1×107個(gè)獨(dú)立克隆體的文庫(kù)是用最大的cDNA片段制成的。目前估計(jì)顯示，含有5.0×105個(gè)獨(dú)立克隆體的文庫(kù)(Smabrook et al.，Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)是具有99％可能性的存在少見轉(zhuǎn)錄體(每個(gè)細(xì)胞少于10個(gè)復(fù)制體)的典型文庫(kù)。因此，我們的文庫(kù)很可能是代表這些階段mRNA種類的真正典型文庫(kù)。文庫(kù)的質(zhì)量和發(fā)育分布使用基因，如已知會(huì)在發(fā)育肝不同時(shí)間段中表達(dá)的IGF-II、IGFBP-2、IGF-I、C/EBP、HNF/LFBI，獲得了文庫(kù)有關(guān)的數(shù)據(jù)。下面表2中的數(shù)據(jù)顯示，IGF-I在任何胚胎文庫(kù)中都沒有檢測(cè)到，而IGF-H在e10.0和e12.5文庫(kù)中檢測(cè)到(在e10.0是3，在e12.5是4)。IGF-II在成年肝文庫(kù)中沒有被檢測(cè)到。有趣地是，在早期e6.5、e7.5和e8.5的文庫(kù)中，BP-2與IGF-II的克隆頻率相似(數(shù)據(jù)沒有列出)，但在肝cDNA文庫(kù)中克隆頻率不同，因?yàn)?，與IGF-II的較大的數(shù)目相比，BP-2在e10.0和e11.5中每100,00檢測(cè)基因只有一個(gè)克隆，在成年肝cDNA文庫(kù)中檢測(cè)到7個(gè)。這表示它在胚胎和胎兒中的時(shí)序和空間的表達(dá)與IGF-II不同，并且這一點(diǎn)在隨后的原位研究中被證實(shí)。在e12.5文庫(kù)中檢測(cè)到的HNF/LFBI突然在第11.5和12.5天中以低含量檢測(cè)到(在e11.5天2個(gè)克隆/100,000，在e12.5天5個(gè)克隆/100,000)，證實(shí)盡管它是表達(dá)的，但在胚胎階段它的含量也是可調(diào)節(jié)的，雖然是向下的。最后，將鼠β-肌動(dòng)蛋白用作參考所有七個(gè)文庫(kù)具有相同的β-肌動(dòng)蛋白頻率，從120-300個(gè)/100,00克隆，這被認(rèn)為是這樣的胚胎文庫(kù)的特點(diǎn)。通過相減方式確定階段特異性克隆如前面所提及的，建立兩個(gè)相減的文庫(kù)，包含64個(gè)克隆體(e11.5-12.5)，和174個(gè)克隆體(e10.5-11.5)。通過Southern雜交，測(cè)序，Northern印跡分析，Zoo印跡分析，和蛋白質(zhì)體外授精對(duì)這些克隆體進(jìn)行進(jìn)一步性質(zhì)測(cè)試。使用Southern印跡，三十四個(gè)克隆體顯示階段特異性，不含有線粒體RNA，核糖體，及球蛋白序列，進(jìn)一步的分析是對(duì)elf進(jìn)行的。Elf轉(zhuǎn)錄體的確定和發(fā)育調(diào)節(jié)分析從妊娠胚胎中期獲取的組織中的elf mRNA。解剖第11天以后的組織，因?yàn)樵谶@個(gè)階段可容易地解剖到獨(dú)立的肝、心臟和其他組織，并且后來分離的RNA質(zhì)量也很好。使用32P-標(biāo)記的1.1kb插入體代表elf，在穩(wěn)定含量elf中發(fā)育變化的特異性也可用測(cè)試3-肌動(dòng)蛋白相對(duì)含量來評(píng)定。在高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臎_洗下顯示2.1kb的轉(zhuǎn)錄體。對(duì)每條帶的光密度掃描顯示elf最大的表達(dá)出現(xiàn)在肝和心臟中，在其他組織中要小些，在第11天特異性表達(dá)，在12.5和14.5天以減少的量表達(dá)(Northerns1-2月后顯影)。Elf的序列分析相減雜交后，對(duì)一個(gè)階段特異克隆詳細(xì)分析sc32。然后在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件(0.2×SSC，60℃)下對(duì)初始文庫(kù)進(jìn)行篩查，以獲得sc32的重疊克隆體。將陽性的挑出，體內(nèi)切除(Stratagene)到Bluescript中，使用雙脫氧鏈終止法，使用預(yù)先確定序列的相應(yīng)的寡聚核苷酸對(duì)這些克隆體測(cè)序。在挑出的七個(gè)克隆體中，發(fā)現(xiàn)三個(gè)與sc32重疊，并包含編碼elf的序列(圖16a和圖16b)。通過對(duì)鼠胚胎組織進(jìn)行Northern印跡分析，證實(shí)了克隆體與elf的身份。對(duì)于elf而言，用sc32作探針，得到同樣的初始2.1kb轉(zhuǎn)錄體。不存在起始密碼子說明我們沒有克隆cDNA的5’端。然而，Northern印跡顯示了2.1kb轉(zhuǎn)錄體，這表明我們克隆了全部的elf，這可能代表β-胞襯蛋白的拼接形式。通過比較elf序列與表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)文庫(kù)，證實(shí)了elf序列3’端的真實(shí)性。盡管，沒有發(fā)現(xiàn)elf序列的鼠ESTs，但發(fā)現(xiàn)了三個(gè)不同的人類EST克隆體，跨越了獨(dú)特的最后100nt和5’鄰近序列的區(qū)域。說明在人類細(xì)胞中存在elf的同源體(參閱圖16a和圖16b)。
先前的序列分析顯示elf對(duì)β-胞襯蛋白(一種非紅細(xì)胞血影蛋白)有80％的一致性。我們的elf序列位于β-血影蛋白的區(qū)域II和III之間。區(qū)域II含有17個(gè)重復(fù)的106個(gè)氨基酸的基元序列，和一個(gè)錨蛋白鍵合區(qū)域(圖16a)。錨蛋白鍵合區(qū)域?qū)?nèi)收蛋白、錨蛋白、和Na+、K+ATPase正確的亞細(xì)胞定位是必需的，沒有它細(xì)胞形態(tài)就會(huì)混亂。區(qū)域II包括C終端區(qū)域，其含有不同數(shù)量的殘基(52-256)并以各種不同的拼接形式造成組織的特異表達(dá)(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992)，以及PH區(qū)域。Elf的原位定位使用elf有義探針和α-胎兒球蛋白反義探針作對(duì)照物，原位雜交證實(shí)在11.5心臟和肝中的elf表達(dá)，并確定了在肝發(fā)育期間它的表達(dá)模式。肝盲囊，其在前腸-中腸的連接處產(chǎn)生，在妊娠的第9天開始長(zhǎng)成橫膈(13-20個(gè)體節(jié)階段)。在交配后10.5天到11.0天之間，在這種初始肝中可以看到相當(dāng)大程度的分化。經(jīng)這段時(shí)間，肝充分增大總體積的增大是由于肝棒狀體侵入橫膈間質(zhì)，和這個(gè)器官中生血活性的開始。在9.5天，在心臟輪廓中elf明顯標(biāo)記變得顯著模式是小梁式的，包括心臟原基的壁。部分頭向室(sino-atrial chamber)的壁也帶有高強(qiáng)度的elf表達(dá)。周圍組織，尤其是尾部肝胚芽區(qū)域沒有顯示存在銀色顆粒。在下一階段，第10.5天，銀色顆粒清晰地突出了發(fā)育的肝臟，在這個(gè)部分顯示為水平結(jié)構(gòu)(L)。在這個(gè)階段，在發(fā)育的心臟組織中的信號(hào)微弱。周圍組織明顯缺少銀色顆粒。在第11.5天，elf明顯標(biāo)記在肝臟中變得顯著，其尺寸變大。心臟顯示非常微弱的信號(hào)僅在后部單一條紋中可見銀色顆粒。在這個(gè)階段，elf表達(dá)也在臍帶中顯示。作為對(duì)照，除了有義探針之外，對(duì)α-胎兒球蛋白的核糖探針概括出11-12天的發(fā)育胚胎肝。
比較第9.5天和10.5天的胚胎顯示了，用表示elf核糖探針的銀色顆粒染色的最大組織的清晰的時(shí)序和空間的梯度在心臟中elf表達(dá)升和降的時(shí)序梯度，可從第9天的發(fā)育心臟中的明顯染色，和在下一階段較弱染色中(第10.5天)推斷出來。同時(shí)，肝的表達(dá)增加了。thesde組織的發(fā)育的模式空間變梯度是明顯的，這說明銀色顆粒密度增加，因?yàn)轭w粒從發(fā)育的心臟向肝臟移動(dòng)在第10.5天，由elfcDNA制備的反義RNA探針與第9.5天心臟間質(zhì)組織特異雜交；第10.5天的表達(dá)對(duì)心臟和肝臟組織是限制性的；elf表達(dá)最終對(duì)第11.5天以后的胚胎中的肝臟是限制性的。值得注意的是，在后面的階段(第12.5，14.5天p.c.)，elf表達(dá)在胚胎肝中可以看到，但其豐富度減當(dāng)Northerns和原位檢驗(yàn)在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間后被顯影時(shí)，可測(cè)試出這些后面階段的信息。elf的有義探針不與任何組織雜交。
α-胎兒球蛋白反義RNA探針與11.5、12.5、14.5天的胚胎鼠肝組織特異雜交，這與以前對(duì)從胚胎肝樣品中分離的mRNA的研究是相符的(Tilghman et al.，P.N.A.S.79-5254-5257，1982)。通過原位雜交檢測(cè)到α-胎兒球蛋白mRNA的最早階段，是在妊娠第10.5-11.0天。對(duì)清蛋白mRNA(Cascio et al.，Development113217-225，1991)的同樣試驗(yàn)顯示，清蛋白在第9.5天在從前腸上皮細(xì)胞中培養(yǎng)的細(xì)胞簇中表達(dá)，和在開始侵入橫膈的細(xì)胞簇中表達(dá)。在用α-胎兒球蛋白的試驗(yàn)中，將肝在隨后所有階段作上標(biāo)記(第11天以后)，經(jīng)過組織學(xué)檢驗(yàn)，其顯示主要在上皮細(xì)胞中出現(xiàn)。生血細(xì)胞出現(xiàn)收縮，但不含在α-胎兒球蛋白陽性細(xì)胞中可見的雜交顆粒。在中胚層組織中ElfmRNA分布與在內(nèi)胚層中的α-胎兒球蛋白mRNA的比較因?yàn)镹orthern分析顯示elf表達(dá)出現(xiàn)在第11.5天的心臟和肝組織中，所以我們研究elf表達(dá)是否對(duì)心臟和肝中胚層組織是特異限制性的，并將它與α-胎兒球蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相比較。在發(fā)育的胚胎中，可以區(qū)分出中胚層的三個(gè)主要區(qū)域，即背部(體節(jié))，中部，和側(cè)部。具體地，側(cè)板中胚層包括軀體組織(胸膜，心包膜，腹膜，肢體胚芽)，內(nèi)臟組織(心臟，心外膜，心肌，結(jié)締組織和內(nèi)臟的平滑肌及血管，hemangioblastic組織，腎上腺皮層及脾)。發(fā)育的心臟在第9天(13-20個(gè)體節(jié))時(shí)顯示，跳動(dòng)規(guī)律且有力。在這個(gè)階段，在胚胎內(nèi)，心臟是循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞被管壁包圍的唯一區(qū)域。普通心室和心房的壁表現(xiàn)出程度增加的橫紋。值得注意的是，在內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間的空間里充滿了稱為心臟膠質(zhì)的疏松間質(zhì)。使用elf反義核糖探針進(jìn)行的第9天和第10天胚胎心臟組織的原位雜交顯示出了，心室和心房區(qū)域高含量的標(biāo)記。
肝間質(zhì)也是從側(cè)板中胚層產(chǎn)生的。肝間質(zhì)的橫膈部分是從心前區(qū)域的內(nèi)臟中胚層產(chǎn)生的。這一點(diǎn)認(rèn)為是造成后來肝細(xì)胞分化的原因。然而，組織移植試驗(yàn)已顯示，所有側(cè)板衍生物可替換肝間質(zhì)。雖然初始試驗(yàn)顯示移植內(nèi)皮層必須與前者的間質(zhì)相互作用，以分化成肝細(xì)胞(Le Douarin，1975；Houssaint，Cell Differ.9269-279，1980)，但最近對(duì)清蛋白mRNA表達(dá)作為肝細(xì)胞分化的指示劑的研究已證實(shí)這些性質(zhì)清蛋白mRNA最初表達(dá)出現(xiàn)在橫膈侵入期間，在當(dāng)肝先驅(qū)細(xì)胞明顯接觸心臟間質(zhì)組織時(shí)。同樣地，清蛋白轉(zhuǎn)錄的引物擴(kuò)展分析顯示，起始轉(zhuǎn)錄位置在10.5天出現(xiàn)，并有在肝器官形成的第12.5天的清蛋白mRNA的15-20倍的增加。在我們使用α-胎兒球蛋白作為分化肝細(xì)胞的標(biāo)記的試驗(yàn)中，高度放大后很顯然的一點(diǎn)是，雖然α-胎兒球蛋白表達(dá)對(duì)于肝發(fā)育后期的內(nèi)胚層組成是限制性的，elf表達(dá)似乎在疏松組織的輕度染色間質(zhì)細(xì)胞中，和初始心臟間質(zhì)中(在第9.5天)出現(xiàn)，然后在心臟和肝臟組織中出現(xiàn)(在第10.5天)，隨后對(duì)肝組織是限制性的(在第11.5天以后)；然后，elf表達(dá)隨著肝形成而降低。對(duì)后來的組織學(xué)部分試驗(yàn)顯示出了顆粒的分散分布。盡管似乎與elf的雜交信號(hào)是位于外竇狀細(xì)胞中，而不在肝細(xì)胞中，但得到的結(jié)果讓人對(duì)雜交細(xì)胞的身份不能作出一個(gè)嚴(yán)格的結(jié)論。在成年組織中elf RNA的分布，在演變中的保留對(duì)elf進(jìn)一步的特征化涉及成年鼠組織的RNA分析。elf與成年肝、腎和睪丸雜交，在肝和腎中為2.1 kb轉(zhuǎn)錄體，在成年睪丸中為2.6kb轉(zhuǎn)錄體，豐富度很低。對(duì)從人，猴子，田鼠，鼠，狗，牛，雞，和酵母中獲取的elfDNA進(jìn)行基因組分析顯示，elf保留在許多不同的物種中，在所有研究的物種中，除了兔子，都表現(xiàn)出了elfDNA(圖18)。
在elf的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯中，后者使用了核酸酶處理的兔子網(wǎng)狀細(xì)胞溶菌體(promega)，顯示了34kb的蛋白質(zhì)，其正如elf插入體尺寸所預(yù)計(jì)的，說明這種插入體對(duì)于特異蛋白質(zhì)編碼序列是框內(nèi)的(圖17)。胚胎肝移植培養(yǎng)物與本發(fā)明相關(guān)的一個(gè)研究目的是建立確定在肝形成中elf和ss3的發(fā)育作用的功能檢測(cè)。當(dāng)?shù)?0-10.5天肝臟胚芽為0.2mm時(shí)，為了克服解剖和分析極小的組織塊，在我們的實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)鼠胚胎肝移植體。當(dāng)在完全沒有中胚層衍生物存在的情況培養(yǎng)時(shí)，肝內(nèi)胚層會(huì)很快惡化。15個(gè)這樣的肝移植體中只有2個(gè)存活。蘇木精和曙紅染色顯示，壞死的內(nèi)胚層沒有明顯的肝分化跡象。當(dāng)與周圍的中胚層，尤其是心臟中胚層(整體解剖)相聯(lián)合時(shí)，內(nèi)胚層細(xì)胞繁殖擴(kuò)增并侵入中胚層部分?？梢钥吹礁渭?xì)胞被組成棒狀體，被竇狀體分離，假性裂片形成。從整體解剖獲取的全部15個(gè)培養(yǎng)物都完全存活了。這項(xiàng)研究肯定了闡述肝形成需要周圍中胚層的先前移植體的研究。對(duì)elf、其他克隆體ss3、145、HNF3β，并用GAPDH和α-胎兒球蛋白作對(duì)照物的半量RT-PCR分析，證實(shí)了在中胚層-內(nèi)胚層相互作用期間增長(zhǎng)的表達(dá)。
在雞胚(Douarin，1975，同上)中的早期試驗(yàn)顯示，在初始條紋階段，預(yù)期的肝區(qū)域位于亨森氏節(jié)(Hensen′s node)前的中部和側(cè)部區(qū)域。在頭部的形成階段，預(yù)期的肝區(qū)域與心臟區(qū)域一致，集中在從頭部的頂端向初始凹痕稍后的區(qū)域延伸的雙邊區(qū)域內(nèi)。通過在絨膜尿囊膜上組織片的移植，檢測(cè)潛在的肝區(qū)域；在這樣的移植體中肝的分化取決于心臟組織的存在在附近沒有心臟細(xì)胞的地方?jīng)]有發(fā)現(xiàn)肝組織，但是一些移植體則含有心臟組織而又不含肝臟。在原腸胚階段完成后，在體節(jié)階段期間，肝臟和心臟部分分離-推測(cè)的心臟間質(zhì)向前并有益的移入心臟折疊中，預(yù)期的心肌細(xì)胞開始合并到心房中。使用碳粒標(biāo)記、放射性摧毀(radiodestruction)、和胎盤片的體腔移植的另一組試驗(yàn)顯示，在早期胚胎階段期間添加上的肝內(nèi)胚層和中胚層區(qū)域，以后的發(fā)展是不同的。
組織移植研究顯示在正常的肝發(fā)育中，肝細(xì)胞的分化和肝裂片的形成完全取決于逐漸被生長(zhǎng)的肝棒狀體內(nèi)胚層占據(jù)的中胚層組成(參閱Douarin，1975，同上)。已經(jīng)證實(shí)這些心臟和肝臟間質(zhì)的刺激性特性，在5個(gè)體節(jié)階段開始，并持續(xù)整個(gè)胚胎生命。這里所闡述的發(fā)現(xiàn)表明，elf在早期心臟中胚層中表達(dá)，后來的表達(dá)對(duì)肝中胚層是限制的，表明對(duì)于肝發(fā)育的中胚層組成，這是一個(gè)新標(biāo)記。值得注意的是，在正常發(fā)育中，純的肝間質(zhì)從未被觀察到。這些演示了elf表達(dá)的移植研究說明，elf蛋白質(zhì)在確定和研究中胚層和前腸內(nèi)胚層間相互作用是很有用的。在肝細(xì)胞形成期間事件的總結(jié)說明elf的作用胚胎Elf階段內(nèi)胚層細(xì)胞過度生長(zhǎng) 表達(dá)第9.5天 細(xì)胞極性出現(xiàn)變化第10.5天侵入和移入周圍間質(zhì)第11.5天假性裂片形成，肝細(xì)胞棒狀體，早期竇狀體形成第14.5天生血位點(diǎn)和完全分化的胎兒肝細(xì)胞序列分析顯示elf與β-胞襯蛋白(一種非紅細(xì)胞β-血影蛋白)有80％的一致性。β-血影蛋白有許多功能，包括維持細(xì)胞的細(xì)胞表面極性(Nelson et al.，J.Cell.Biol.108893-902，1989)；維持細(xì)胞-細(xì)胞的結(jié)合(Thomas et al.，Development 1202039-2050，1994，Luna et al.，Science 258955-964，1992)；β-血影蛋白含有與其他蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，如錨蛋白和肌動(dòng)蛋白(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992；Speicher et al.，Nature311177-180，1980)。較小的異構(gòu)β-血影蛋白也已充分地被描述過了。例如，4.0kb的肌肉組織轉(zhuǎn)錄體被認(rèn)為是從群集的乙酰膽堿受體中編碼一種以前報(bào)道的β-血影蛋白。同樣地，對(duì)elf而言，缺少的區(qū)域可通過使用其他的外顯子來替換，產(chǎn)生功能獨(dú)特的蛋白質(zhì)。這樣，Elf的一種功能是對(duì)在細(xì)胞表面的特異區(qū)域的裝配和維持，邁向肝細(xì)胞極性的建立，以及隨后的肝細(xì)胞分化。
血影蛋白還顯示保留在整個(gè)演化中，并隨發(fā)育被調(diào)節(jié)。這些結(jié)果說明，與腦的β-血影蛋白(β-G血影蛋白)一起，elf也以組織和階段特異方式表達(dá)并保留在整個(gè)演化中(Hu et al.，J.Biol.Chem.26718715-18722，1992；Zimmer et al.，Brain Res.594-75-88，1992；Leto et al.，Mol Cell Biol.81-9，1988)。Elf表達(dá)是以類梯度的方式進(jìn)行的，在對(duì)腦β-G血影蛋白的精密檢測(cè)顯示了類似的梯度模式，表明在特異時(shí)間點(diǎn)的突然開閉現(xiàn)象是過于簡(jiǎn)單化了。Elf最大的表達(dá)在第10-11天表明，它在這個(gè)時(shí)間起著重要的作用，在隨后的階段仍持續(xù)著，盡管程度較小。例如，可以認(rèn)為elf通過授予細(xì)胞極性，標(biāo)記肝細(xì)胞分化的最初的明顯跡象。因此，象果蠅β-H血影蛋白一樣，elf在促進(jìn)周邊細(xì)胞膜在它們延伸時(shí)的“尼龍拉鏈?zhǔn)健钡倪B接中可能起到作用(Thomas etal.，Development 1202039-2050，1994)。以這種方式，elf可標(biāo)記環(huán)境中胚層細(xì)胞的極化，使得前腸內(nèi)胚層細(xì)胞侵入這個(gè)區(qū)域并分化成肝細(xì)胞。在胚胎學(xué)研究中的誘導(dǎo)事件的解剖中，分子標(biāo)記具有不可估量的價(jià)值(New et al.，Curr.Opin，Genet，Dev.1196-203，1991;Sive，Genes Dev.71-12，1993)。例如，在Xenpous中，Epi1，對(duì)上皮特異的抗體，已用來闡明胚孔唇緣在神經(jīng)中樞誘導(dǎo)過程中的作用(Savage et al.，Dev.Biol.133157-168，1989)。同樣，活化素(調(diào)節(jié)角蛋白)(Asashima et al.，P.N.A.S.886511-6514，1991)，vg-1(Thomsen et al.，Cell 63485-493，1990)，和其他屬于TGF-β家族的基因，連同wnt和bFGF家族代表了導(dǎo)致特定中胚結(jié)局的各階臺(tái)的組成。例如，vg-1，最初是通過分化篩查而分離的，它是作用于細(xì)胞誘導(dǎo)的胚胎中胚層的，對(duì)胚胎未來一側(cè)的vg-I前體蛋白的翻譯后的處理是在非洲爪蟾的背中胚層和體軸的產(chǎn)生中的重要步驟(Thomsen et al.，Cell74433-441，1993)。同樣地，在分離肝發(fā)育所需的假定誘導(dǎo)劑中的關(guān)鍵步驟是，對(duì)位于心臟/肝間質(zhì)的mRNA的確定elf和它的調(diào)節(jié)基因?qū)﹃U明這個(gè)區(qū)域是很有幫助的。
最近，細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用已經(jīng)顯示是對(duì)幾種細(xì)胞的歸屬?zèng)Q定是很重要的。如在C.elegans中，lin-12和glp-1已經(jīng)顯示編碼了調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊的跨膜蛋白質(zhì)，并對(duì)幾種先前的結(jié)局的特異性為必需的。在果蠅中，作為間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換的結(jié)果的次級(jí)上皮細(xì)胞的產(chǎn)生，被認(rèn)為是取決于兩個(gè)獨(dú)立的粘著體系一方面是發(fā)育中腸內(nèi)胚層和內(nèi)臟中胚層之間的直接相互作用，另一方面是上皮細(xì)胞自身彼此的粘著相互作用。雖然后者的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用被認(rèn)為是通過鳥槍法控制的，頂基(apicobasal)極性的控制被認(rèn)為是由基因如cnambs和stardust實(shí)施的(Tepass etal.，Cell 61787-799，1990)。盡管已知在肝細(xì)胞形成中，細(xì)胞表面極性的生原是早期事件，暗示原生質(zhì)膜分子分類的機(jī)理在早期是功能性的，但在肝發(fā)育中涉及細(xì)胞信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)局的基因迄今還沒有確定。對(duì)這樣的基因的確定，將對(duì)深入了解涉及前腸內(nèi)胚層細(xì)胞遷移和隨后肝作為器官的形態(tài)形成的細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用給予極大的幫助。這些研究建立了一個(gè)理論特異中胚層mRNA是以確保它們隨后與特異中胚層組織分離的方式定位的，在這種情況下，指的是假設(shè)的肝臟中胚層組成，正如胚胎移植研究中所顯示的(Le Douarin，1975)。Elf的克隆和測(cè)序所有胚胎肝是從隨機(jī)喂養(yǎng)的ICR鼠(Harlan)的交配中獲得的。交配日定為第0天，收集交配后第10.0、11.5、12.5天的胚胎；用形態(tài)形成原則分階段(Theiler，The House Mouse，New YorkSpringer-Verlag，1989)。將肝臟進(jìn)行解剖，收集，和溶胞。為了制備cDNA文庫(kù)，將RNA分離(Chomczynski et al.，Analyt.Biochem.162156-159，1987)及用oligo(dt)-纖維素(CollaborativeResearch Type3)選取poly(A)+RNA。在制備oligo(dt)-灌注的cDNA文庫(kù)中使用1到5mg的poly(A)+RNA。第11.5和12.5天胚胎肝cDNA文庫(kù)的建立用傳統(tǒng)的技術(shù)實(shí)施(Gubler et al.，Gene25263-269，1983)，第10.0和成年鼠肝cDNA文庫(kù)的建立使用Stratagene Unizap cDNA文庫(kù)試劑盒。然后建立兩個(gè)相減文庫(kù)(Schweinfest et al.，Genet.Anal.Tech.Appl.764-70，1990)。得到的相減文庫(kù)含有64個(gè)克隆體(11.5-12.5)，和110個(gè)克隆體(10.5-11.5)。過程包括(a)生物素化(biotinylation)50毫克的從第12.5天的肝文庫(kù)獲取的cDNA，10mg/ml，在HE緩沖液(10mM Hepes，PH7.5，1mM EDTA，Clontech Labs.)中生物素化；(b)通過鏈霉抗生物素蛋白-苯酚提取來進(jìn)行相減過程鏈霉抗生物素蛋白-生物素雜交復(fù)合體表示，選擇性地分開進(jìn)入苯酚界面的共有基因產(chǎn)物，在水相中留下獨(dú)特的被相減的單鏈cDNA。第二條鏈DNA合成及過夜沉淀后，十分之一的DNA用來轉(zhuǎn)換感受態(tài)XL Blue細(xì)胞。使用所有相減DNA的轉(zhuǎn)換可以確定174個(gè)重組菌落。噬菌體提純、DNA的制備可通過Stratagene的體內(nèi)切除方案實(shí)施。使用77DNA聚合酶對(duì)DNA質(zhì)粒測(cè)序(Sanger et al.，J.Mol.Biol.143161-178，1980)。序列分析用blastp2和blastn2程序搜索NCGI無多余(nr)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)，這些程序允許有間斷的對(duì)比(Aleschul et al.，Methods inEnzymology 256460-480，1996)，用默認(rèn)參數(shù)和elf蛋白質(zhì)或核苷酸序列作為檢索命令。RNA制備和分析收集交配后第10.0、11.5和12.5天的胚胎。在Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(高含量葡萄糖)和20mM Hepes PH7.3中解剖胚胎肝。將特異階段的肝收集并分離全部的RNA(Chomcaynskiet al.，同上)。采用標(biāo)準(zhǔn)工藝(Smbrook et al.，1989，同上)將10毫克的RNA在1％甲醛凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到高結(jié)合(Hi-bond)尼龍膜上(Amersham)。用隨機(jī)引物法(Feinberg etal.，Analyat.Biochem.137；266-267，1984)合成32P-標(biāo)記的放射性的探針并與尼龍濾膜雜交。將濾膜高度嚴(yán)謹(jǐn)沖洗，最后在65℃的0.2×SSC(30mM NaCl，3mM檸檬酸鈉，PH7.4)0.5％十二烷基硫酸鈉中沖洗60分鐘。將每個(gè)探針的濾膜作成條并與其他探針再雜交，以證實(shí)在初始篩查情況下不獲得交叉雜交信號(hào)。然后，用加強(qiáng)篩在-70℃對(duì)這些濾膜進(jìn)行放射自顯影。原位分析對(duì)elf實(shí)施原位分析(Cox et al.，Dev.Bio.100197-206，1989)。合成RNA探針，并通過RNA聚合酶的T7或SP6啟動(dòng)子用35S-UTP標(biāo)記(100Ci/mmol)。將有義或反義探針加到適當(dāng)?shù)牟糠?，制作好，用橡膠粘合劑密封，在50℃溫育過夜。溫育后，將各部分用50％甲酰胺/5×SSC/10mM DTT(50℃；2×30分)沖洗，接著用4×SSC/TE沖洗，用RNase A(20mg/ml)和RNase TI(500U/ml；37℃30分鐘)溫育，再用4×SSC/TE(37℃30分鐘)，兩次用2×SSC(25℃15分鐘)，兩次用0.1×SSC(25℃15分鐘)沖洗，用乙醇系列(含0.3M醋酸銨)脫水，在空氣中干燥。作放射自顯影，將底片浸入到用2％甘油水溶液1∶1稀釋的NTB2乳液中，干燥。曝光時(shí)間為0周到四個(gè)月。依據(jù)制造商的說明使乳液顯影。Elf的體外翻譯使用體外Eukaryotic Translation Kit和MCAP mRNA CappingKit(Stratagene)，將含有elf的Bluescript用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。在〔35S〕蛋氨酸存在下，使用核酸酶處理的兔子網(wǎng)狀細(xì)胞溶胞體(Promega)中，將RNA轉(zhuǎn)錄體進(jìn)行90分鐘體外翻譯成為蛋白質(zhì)，并且在4％改性的聚丙烯酰胺凝膠上走膠。肝移植培養(yǎng)物從Harlan ICT鼠獲取鼠胚胎。通過出現(xiàn)陰道栓(plug)(0天)后的天數(shù)確定胚胎的年齡。胚胎可進(jìn)一步用體節(jié)數(shù)表征。分離鼠肝內(nèi)胚層、肝胚芽和中胚層(整體解剖)如下在妊娠第10天，肝胚芽開始變得明顯，是一厚層前腸的腹部壁，靠近卵黃蒂的起源。然后，這種腹部?jī)?nèi)胚層或者單獨(dú)取出培養(yǎng)，或者與周圍中胚層在聽泡和臍帶起源之間的胚胎部分一起取出培養(yǎng)。器官培養(yǎng)在如所述的濕潤(rùn)艙室內(nèi)(Houssaint，1980，同上)，將胚胎放進(jìn)核孔濾膜中，培養(yǎng)48小時(shí)或96小時(shí)。顯微鏡法將移植體如在原位方案中固定，并按如上所述分離RNA。用蘇木精，曙紅和高碘酸[periodic acid schiff(PAS)]對(duì)7mm切片的糖原進(jìn)行染色，指示分化的肝細(xì)胞。為作RNA分析，如在圖19和20中所述，實(shí)施半量RT-PCR。本發(fā)明已經(jīng)考慮到的是，使用這種肝移植培養(yǎng)物作為組織修復(fù)的合成物，作為肝修復(fù)療法的一種形式。免疫組織化學(xué)描述將對(duì)應(yīng)于praja1(COVANCE)的第145-157號(hào)的氨基酸(CLRRKYRSREQPQS)的肽的抗體，用作肝移植培養(yǎng)物中免疫組織化學(xué)定位。將胚胎固定并嵌入石蠟中，進(jìn)行切片后，依據(jù)常用方案使用間接免疫組織化學(xué)進(jìn)行免疫染色(Schevach，Currentprotocols in immunology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，1991)。在二甲苯中將8μm的切片脫去石蠟，將組織在酒精梯度中再水合，用PBS沖洗。首先用蛋白酶處理切片(0.1％Trypsin在0.5M的PBS中)，并在37℃溫育30分鐘。用3％過氧化氫去除內(nèi)生過氧化物。將切片在室溫下用含有5％山羊血清的PBS封閉30分鐘。然后，在4℃將切片在Humidor中，用針對(duì)PRAJA1肽的兔子抗鼠抗體的稀釋液溫育過夜。所有后面的步驟都在室溫下進(jìn)行。在每個(gè)后續(xù)的步驟之后，用PBS-S沖洗六次5分鐘。在初級(jí)抗血清中溫育后，將切片在室溫下用1×PBS沖洗6次5分鐘。將切片用二級(jí)抗體(在0.05M PBS1％血清中稀釋的)室溫下溫育30分鐘。
沖洗后，按如下加入底物不溶的過氧化酶底物DAB(SigmaFast)。加入100-150微升的底物溶液，覆蓋切片上的全部組織。在顯微鏡下監(jiān)測(cè)顯色。在用蒸餾水沖洗5分鐘后，用Harris蘇木精改性溶液(Sigma)染色1分鐘，接著用蒸餾水沖洗5分鐘。將切片經(jīng)過蒸餾水、然后是酒精濃度梯度、最后是二甲苯來脫水。在觀察前，用DPX(Fluka labs)或Permount(Fischersceientific)將蓋玻片安裝上。對(duì)于陰性對(duì)照物，僅加入初級(jí)抗體的稀釋溶液，沒有任何抗體?？贵w的產(chǎn)生針對(duì)elf3 C-終端和N-終端中的序列的肽特異性兔子抗鼠多克隆抗體的產(chǎn)生，按照Porter等人[Porter et al.，J.Cell.Biol.117997-1005(1992)]所述進(jìn)行。合成肽的序列，對(duì)于EL-1制備是ELQRT SSVSG PLS(在N-終端上的2-14個(gè)殘基)，對(duì)于EL-2制備是FNSRR TASDH SWSGM(在C-終端上的殘基2140-2154)。用蛋白質(zhì)A/G柱(Pharmacia)從抗血清中分離IgG，并加到親和柱上，蓋親和柱已經(jīng)用適當(dāng)?shù)暮铣呻呐c其共價(jià)結(jié)合了(Pharmacia)。將柱用幾個(gè)體積的緩沖的生理鹽水沖洗，然后用Elution緩沖液(Pharmacia pH2.8)洗脫。洗脫的各部分收集在含有足夠的1M Tris-HCl且pH8.0的試管中，調(diào)節(jié)pH到7.2。將親和提純的抗體和沒有與親和柱結(jié)合的抗體部分用含10mM NaN3的緩沖鹽液透析，保存在4℃。
抗體的特異性的檢測(cè)是，通過酶連免疫吸附測(cè)定法(ELISA)并隨后進(jìn)行Engvall法(Methods Enzymol.70419-439，1980)，或通過由SDA-PAGE分離的合成肽的免疫印跡法測(cè)定。從ELISA測(cè)得的結(jié)果證實(shí)了抗體對(duì)它們相應(yīng)抗源的特異性，與在免疫印跡所測(cè)的一樣。
權(quán)利要求
1.一種核酸序列，其編碼早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，選自包括基因20、36、41、112、114、118、129，和編碼elf蛋白質(zhì)1-3、liyor-1(145)、pk、蛋白質(zhì)106和praja-1的基因的組中。
2.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述的核酸編碼elf蛋白質(zhì)，并且其中的序列從含有圖2a、圖2b、和圖2c所示的序列中選取。
3.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述的核酸編碼liyor-1(145)，并且其中的序列如圖1所示。
4.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述的核酸編碼pk，并且其中的序列如圖4所示。
5.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述的核酸編碼蛋白質(zhì)106，并且其中的序列如圖5所示。
6.權(quán)利要求1的核酸序列，其中所述的核酸編碼praja-1，并且其中的序列如圖3所示。
7.一種被分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，選自包括elf、liyor-1(145)、pk、蛋白質(zhì)106和praja-1的組中。
8.權(quán)利要求7的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是elf蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是從含有圖2a、圖2b、圖2c所示的序列中選取的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求7的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是liyor-1(145)。
11.權(quán)利要求10的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是由如圖1所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求7的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是pk。
13.權(quán)利要求12的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是由如圖4所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求7的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)106。
15.權(quán)利要求14的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是由如圖5所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求7的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是praja-1。
17.權(quán)利要求16的分離的早期肝發(fā)育蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是由如圖3所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
18.一種治療肝疾病的方法，所述的肝疾病選自包括膽汁郁積，膽結(jié)石，肝阻塞，肝狹窄，原發(fā)性膽硬化，和原發(fā)性硬化性膽管炎的一組，所述的方法包括給患有一種這些病況的患者服用有效量的elf蛋白質(zhì)。
19.一種治療肝疾病的方法，所述的肝疾病選自包括晚期肝疾病，肝細(xì)胞癌，缺水性外胚層發(fā)育異常，衰退性神經(jīng)病學(xué)上的病變，貧血，共濟(jì)失調(diào)和血色沉著病的一組，所述的方法包括給患有一種這些病況的患者服用有效量的從praja-1、liyor-1(145)、和pk組中選取的肝細(xì)胞形成蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中治療的疾病是鐵粒細(xì)胞性貧血(Sideroblastic anemia)。
21.權(quán)利要求19的方法，其中治療的疾病是脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。
22.一種檢測(cè)結(jié)腸癌的方法，該方法包括從患者獲取結(jié)腸細(xì)胞，測(cè)試細(xì)胞中praja-1的存在，然后根據(jù)在測(cè)試細(xì)胞中對(duì)praja-1的檢測(cè)，確定細(xì)胞是否是癌化的。
23.一種分離編碼早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的基因的方法，該方法包括的步驟為建立交配后e9到e14.5各階段內(nèi)的發(fā)育鼠的cDNA文庫(kù)，分離編碼在至少一個(gè)這些階段期間表達(dá)的肝蛋白質(zhì)的cDNA。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的cDNA文庫(kù)建立的各階段包括(1)交配后約e9-e10天，(2)交配后約e10.5-e11天，(3)交配后約e11.5-e12天，(4)交配后約e13-e14.5天。
25.權(quán)利要求23的方法，其中分離的cDNA編碼階段特異性早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)。
26.一種編碼早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)的分離的基因，由權(quán)利要求23的方法制備。
27.一種分離的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)，由權(quán)利要求26的分離的基因表達(dá)制備。
28.一種針對(duì)權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)而培養(yǎng)的抗體。
29.一種培養(yǎng)的肽的抗體，所述的肽選自如下所述的一組在鼠elf基因N-終端aa2-14上的肽，其序列為5-ELQRTSSVSGPLS-3；在鼠elf基因C-終端aa2140-2154上的肽，其序列為5-FNSRRTASDHSWSG-3；在鼠praja-1基因中部aa144-156上的肽，其序列為5-LRRKYRSREQPQS-3；來自基因145(Cded)C-終端的145肽-A，其序列為5-SAQSLVVTLGRVEGGIRV-3或5-CSAQSLVVTLGRVEGGIRV-3；來自基因145(Cded)中部的145肽-B，其序列為5-KIEGSSKCAPLRPASRL-3或5-CAPLRPASRLRASQTLG-3；來自基因G59(Praja1)N-終端的g59肽-A，其序列為5-PPREYRASGSRRGMAY-3或5-PPREVYASGSRRGMAYC-3；來自基因G59(Praja1)中部的g59肽-B(15-mer)，其序列為5-CKVPRRRRTMADPDFW-3，和包括itih-4d兩個(gè)EF-手生基元序列的融合蛋白質(zhì)。
全文摘要
提供分離和測(cè)序的早期發(fā)育階段特異肝蛋白質(zhì)和其編碼基因。這些基因和蛋白質(zhì)可用來診斷和/或治療多種肝病變和其他疾病。本發(fā)明確定和分離的蛋白質(zhì)包括elf1－3、liyor－1(145)、pk、蛋白質(zhì)106、和praja－1,以及編碼這些和其他蛋白質(zhì)的核酸序列,并且可以培養(yǎng)從這些蛋白質(zhì)衍生的肽的抗體。因?yàn)楸景l(fā)明的早期發(fā)育肝蛋白質(zhì)是在當(dāng)肝和其他器官?gòu)臒o分化到分化轉(zhuǎn)變的胚胎期間產(chǎn)生的,所以這些蛋白質(zhì)與組織分化有關(guān),因此,它們可被用于診斷和治療多種肝疾病和其他病變,如那些涉及腫瘤生成和組織修復(fù)的疾病。因此,依據(jù)本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)應(yīng)與診斷和治療從晚期硬化到肝細(xì)胞癌及許多其他疾病狀況有關(guān)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1254290SQ98804664
公開日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1998年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月30日
發(fā)明者洛帕·米莎瑞 申請(qǐng)人:洛帕·米莎瑞