專(zhuān)利名稱(chēng)：錨定于細(xì)胞膜的抗凝血融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于對(duì)血液凝結(jié)作用的抑制，特別是在器官排異作用過(guò)程中。
背景技術(shù)：
器官移植外科技術(shù)到現(xiàn)在已被成功地實(shí)施了幾十年，并且由于它的成功，這種做法己普遍了，并可論證地成了常規(guī)程序。但是，適當(dāng)移植器官的供應(yīng)不能滿足日益增長(zhǎng)的需要。
由于缺乏適當(dāng)?shù)娜梭w(即同種異體)器官，近年來(lái)，對(duì)于在人體移植手術(shù)中使用動(dòng)物(即異種的)器官(異種移植)的可能性已日益受到重視(例如自然1997；385285)。認(rèn)為豬供體器官是適合的選擇，因?yàn)樨i在解剖學(xué)和生理學(xué)方面都類(lèi)似于人類(lèi)，并且供應(yīng)充足。
但是在目前，嚴(yán)重充分確證的排異作用問(wèn)題阻止了異種移植。這種排異過(guò)程可分為明顯不同的階段，其中第一步發(fā)生在移植后數(shù)分鐘時(shí)間內(nèi)。這一步驟被稱(chēng)為超急性反應(yīng)，是由于接受者存在抗體而引起，這種抗體能識(shí)別異種移植物內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)上的外來(lái)抗原并與之反應(yīng)。此識(shí)另過(guò)程可激發(fā)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)過(guò)程(Complement Cascade)，并進(jìn)而導(dǎo)致移植物ECs的溶胞和死亡。
然后，這種初始的超急性排異作用，將被遲發(fā)性血管反應(yīng)(也被稱(chēng)為急性血管排異作用或異種移植遲發(fā)性排異作用)進(jìn)一步強(qiáng)化。在超急性反應(yīng)過(guò)程中，EC細(xì)胞裂解、死亡，同時(shí)伴隨有水腫和外膜細(xì)胞的暴露，這些細(xì)胞在其表面組成型表達(dá)組織因子(TF)。據(jù)認(rèn)為，組織因子對(duì)引發(fā)體內(nèi)凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程具有決定性作用，它暴露于血漿可能引發(fā)凝血反應(yīng)。凝血酶和TNF-α集中在受損組織的周?chē)?，這可進(jìn)一步誘發(fā)ESs合成和表達(dá)TF。
靜止ECs周?chē)h(huán)境不利于凝結(jié)作用。幾種天然的凝血抑制劑可與EC細(xì)胞外蛋白多糖相結(jié)合，例如組織因子途徑抑制劑，抗凝血酶III和凝血調(diào)節(jié)蛋白。但是，天然的異種反應(yīng)性抗體(XNAs)對(duì)外來(lái)組織的識(shí)別，可導(dǎo)致這些分子喪失。組織因子的暴露和誘導(dǎo)合在一起，使EC周?chē)目鼓h(huán)境變成為前凝血環(huán)境。
異種移植物的血管形成區(qū)因此將成為血液凝結(jié)的部位，這是受損害組織的特征。血流減少，移植的器官將發(fā)生局部缺血?？稍贐ach等(1996)的文獻(xiàn)中找到對(duì)遲發(fā)性血管排異作用的可詳細(xì)的敘述。
因此，在移植中使用異種器官受到如下排異作用的阻礙開(kāi)始是超急性排異作用，隨后是長(zhǎng)時(shí)間的血管排異作用，可能隨后還有T-細(xì)胞介導(dǎo)的排異作用。抑制引起這些排異作用的機(jī)制可能有助于異種移植的使用。
但是，單純地給予適當(dāng)?shù)囊种苿┎皇翘貏e適合的措施。對(duì)受體動(dòng)物完全抑制補(bǔ)體相當(dāng)于免疫抑制，將使受試動(dòng)物增加被感染的機(jī)會(huì)。類(lèi)似地，對(duì)受體動(dòng)物抑制其凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程，將導(dǎo)致該動(dòng)物對(duì)手術(shù)后失控性出血敏感。因此，抑制劑按需要應(yīng)該局限于受試者的異種移植物部位。
防止超急性排異作用是歐洲專(zhuān)利0495852(Imutran)的研究主題。此專(zhuān)利揭示，為了使組織更適合于異種移植，應(yīng)該使它們與同源的補(bǔ)體限制因子結(jié)合，此種限制因子可防止對(duì)異種器官的接受者補(bǔ)體的完全激活。
已經(jīng)發(fā)展和應(yīng)用了這種方法，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，設(shè)計(jì)使此動(dòng)物具有能在超急性排異作用下生存的器官。已產(chǎn)生了可在心臟ECs上表達(dá)人的一種補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑CD59的轉(zhuǎn)基因小鼠(Diamond，1995)。當(dāng)以人血漿灌注此轉(zhuǎn)基因心臟時(shí)，人CD59可保持生物活性，而補(bǔ)體被抑制了。
還報(bào)導(dǎo)了表達(dá)人DAF和/或CD59的轉(zhuǎn)基因豬(McCurry，1996)。與對(duì)照相比較，用轉(zhuǎn)基因移植物時(shí)，經(jīng)歷了二倍長(zhǎng)的時(shí)間才出現(xiàn)心臟排異作用。
對(duì)于抑制遲發(fā)性血管排異作用沒(méi)有受到同樣的關(guān)注。盡管本領(lǐng)域已熟知一些凝結(jié)級(jí)聯(lián)過(guò)程的抑制劑，并對(duì)其中很多已進(jìn)行了充分地鑒定。
例如已知組織因子途徑抑制劑(TEPI)可抑制通常是組織因子，因子VIIa，以及因子X(jué)a之間形成的活性復(fù)合物的功能。TFPI是一種276個(gè)殘基的可溶性多肽，它帶正電荷的C-端連接了EC蛋白多糖層中的肝素硫酸鹽。理論上已將它分為三個(gè)“Kunitz”功能區(qū)Kunitz功能區(qū)I負(fù)責(zé)結(jié)合組織因子和因子VIIa；功能區(qū)II結(jié)合因子X(jué)a；但對(duì)區(qū)域III的功能尚不了解(Hamamotom 1993)。
蜱抗凝血肽(TAP)是因子X(jué)a的特異性有效抑制劑。已從軟蜱Ornithodoros moubata純化得到了這種60個(gè)氨基酸的多肽。
許多蛇毒液也含有抗凝血多肽。例如已從蛇Agkistrodon contoetrixcontortrix的毒液中純化得到一種231個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)C激活物(McMullen，1989；Kisiel，1987)。
水蛭素是水蛭Hirudo medicinelis在從受害者吸血時(shí)使用的抗凝血蛋白。它非常有效，可按1∶1的比例與凝血酶結(jié)合，具有飛摩爾數(shù)量級(jí)的離解常數(shù)。凝血酶的活性位點(diǎn)被掩蓋在此穩(wěn)定的復(fù)合物中，因此水蛭素可阻止血纖維蛋白原分解而抑制血凝結(jié)塊形成。
用于使抗凝血?jiǎng)┚窒抻谂女愖饔貌课坏囊环N可能的方法是，將水蛭素連接于抗E-選擇素抗體，在細(xì)胞激活過(guò)程中，其表達(dá)在ECs表面。在體外試驗(yàn)中已表明這種方法對(duì)抑制血凝塊形成是有效的(Kiely，1995)。最近Bach等(1996)對(duì)另一些可能的方案進(jìn)行了評(píng)述。
P-選擇素(也稱(chēng)為CD62)也是在細(xì)胞激活過(guò)程中表達(dá)在ECs表面。在合成過(guò)程中，由存在于胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)的序列使它定向進(jìn)入血小板和內(nèi)皮細(xì)胞中的分泌性貯存顆粒(Disdier，1992)。在對(duì)細(xì)胞激活物如凝血酶反應(yīng)時(shí)，這些顆粒迅速地重新分布，P-選擇素表達(dá)于細(xì)胞表面(Green，1994)。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供膜結(jié)合的抗凝血蛋白。這些蛋白質(zhì)適合于在ECs表面抑制血凝結(jié)級(jí)聯(lián)過(guò)程，因此適合于在體內(nèi)抑制引起器官排異作用的機(jī)制。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是，提供在ECs表面對(duì)這些分子的調(diào)節(jié)性表達(dá)，因此使凝血抑制過(guò)程局部地在器官排異狀態(tài)下發(fā)生。這種排異作用可能是異種的或同種異體的。
本發(fā)明還有另一個(gè)目標(biāo)是，提供適合于移植的，特別是適合于異種移植的生物組織。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面是提供一種蛋白質(zhì)，它包含一個(gè)具有抗凝血?jiǎng)┗钚缘膮^(qū)域和一個(gè)可使此蛋白質(zhì)錨定于細(xì)胞膜的區(qū)域。優(yōu)選地這是一種嵌合蛋白質(zhì)，也就是說(shuō)，其錨定區(qū)和抗凝區(qū)是來(lái)自不同的蛋白質(zhì)。
此抗凝血區(qū)可以包括任何一種抗凝血多肽的序列。這種抗凝血多肽的例子包括肝素，TAPs，抗凝血酶，水蛭素和TFPIs，以及它們的功能衍生物，如保持有抗凝血?jiǎng)┗钚缘钠瑪嗪脱苌铩＿€報(bào)導(dǎo)了一些凝血酶的抗凝血?jiǎng)┭苌?，通常是前凝血?jiǎng)?Dang，1997)。
優(yōu)選地此抗凝血區(qū)含有水蛭素序列。水蛭素類(lèi)包括水蛭素，水蛭素衍生物，類(lèi)似物(“hirulogs”)和變異體(如hirudisins)。例如，己報(bào)導(dǎo)在Tyr-64硫酸化可增加水蛭素的抗凝血?jiǎng)┗钚?，以及hirudisin-2比水蛭素本身，是凝血酶活性的更有效的抑制劑(如Knapp，1992；Skern 1990)。
另一種選擇是，此抗凝血區(qū)可含有組織因子途徑抑制劑(TFPI)序列。TFPI類(lèi)包括TFPI本身及其保持有抑制活性的衍生物或類(lèi)似物。優(yōu)選的TFPI序列包含TFPI本身的Kunitz功能區(qū)I和功能區(qū)II。
還有另一種選擇是，此抗凝血區(qū)可含有蜱抗凝血肽(TAP)序列。TAP類(lèi)包括TAP本身及其保持有抑制活性的衍生物或類(lèi)似物。例如通過(guò)位點(diǎn)定向誘變，提高了TAP對(duì)FXa的抑制效果(如Mao.1995)。
還有一些選擇是，抗凝血區(qū)可含有例如從蛇毒液中分離出的蛋白C激活物序列(例如McMullen，1989；Kisiel，1987)，或者從不是通過(guò)蛋白C激活而起作用的蛇毒液中分離出的抗凝血序列，或者是它們的保持有抗凝血活性的衍生物或類(lèi)似物。
錨定區(qū)可以是能使該蛋白質(zhì)附著于細(xì)胞膜的任何一種序列。適合的例子包括來(lái)自膜蛋白的跨膜序列和GPI錨定體。優(yōu)選的錨定區(qū)是能夠使該蛋白質(zhì)附著于脂質(zhì)雙層的序列，如HLA I類(lèi)蛋白或CD4蛋白的跨膜區(qū)。還可以要求該蛋白質(zhì)包含通常是與所述跨膜區(qū)結(jié)合的細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)，如CD4細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)，以及/或者包含與細(xì)胞膜緊鄰接的細(xì)胞外功能區(qū)，如CD4功能區(qū)3和4。另一種選擇是，此錨定區(qū)可以是一個(gè)使該蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞外與膜蛋白結(jié)合，而不需要該蛋白質(zhì)本身插入細(xì)胞膜的序列。
本發(fā)明的第二方面是提供一種根據(jù)第一方面的蛋白質(zhì)，并且另外還包含一個(gè)使該蛋白質(zhì)不致在細(xì)胞表面組成型表達(dá)的定向序列。
優(yōu)選地此向定序列是一種可以使新生的多肽定向進(jìn)入分泌顆粒的多肽序列，更優(yōu)選地是，此分泌顆粒是一種直至細(xì)胞受到適合的刺激才能與細(xì)胞質(zhì)膜融合的分泌顆粒。例如，Weibel-Palade小體只有在內(nèi)皮細(xì)胞表面受促分泌素如凝血酶或血纖維蛋白刺激時(shí)才能與質(zhì)膜融合(Wagner，1993)。優(yōu)選的情況是，在器官排異過(guò)程中發(fā)生EC激活時(shí)，此分泌顆粒與質(zhì)膜融合。
因此，此定向序列優(yōu)選地是一個(gè)可使新生的多肽定向進(jìn)入Weibel-Palade小體的序列，例如來(lái)自P-選擇素的相關(guān)序列。更優(yōu)選地是，根據(jù)本發(fā)明第二方面的蛋白質(zhì)包含抗凝血序列，以及P-選擇素的跨膜功能區(qū)和細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)。因此，來(lái)自P-選擇素的這些功能區(qū)既提供錨定序列，又提供定向序列。
本發(fā)明的第三方面是提供了一種編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸。優(yōu)選地此多核苷酸是DNA。
此多核苷酸優(yōu)選地含有適合于調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)的序列。這種表達(dá)優(yōu)選地可被控制，如細(xì)胞特異性控制，可誘導(dǎo)性控制，或時(shí)序控制。例如，表達(dá)可能對(duì)EC是特異性的，或者可能是在對(duì)細(xì)胞激活反應(yīng)時(shí)受到調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的第四方面是提供一種包含根據(jù)第三方面的多核苷酸的載體。
此名詞“載體”意指一種能夠?qū)⒍嗪塑账徂D(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的分子。優(yōu)選地此載體是DNA載體，而更優(yōu)選地是它能夠表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA。本領(lǐng)域已知許多適合的載體。
此載體優(yōu)選地是適合于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的。例如，在Heckl-Ostreicher(1995)，McMurry(1996)，White(1995)，Yannoutsos(1995)，和Langford(1996)的文獻(xiàn)中論述了適合用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬的載體。Diamond(1995)論述了適合用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的小基因載體。
本發(fā)明的第五方面，提供了一個(gè)包括本發(fā)明第一，第二，第三或第四方面分子的傳遞系統(tǒng)，以及傳遞這些分子至靶細(xì)胞的方法。
本發(fā)明第四方面的某些載體還可能作為適合的傳遞系統(tǒng)而起作用。同樣，本發(fā)明第五方面的某些傳遞系統(tǒng)也可能本來(lái)就是載體，但這不是經(jīng)常的情況。例如，病毒載體也可以起傳遞系統(tǒng)的作用，而脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)不是載體。
該傳遞系統(tǒng)可以是病毒或非病毒系統(tǒng)。非病毒系統(tǒng)如脂質(zhì)體，可避免一些與病毒為基礎(chǔ)系統(tǒng)有關(guān)的困難，如批量生產(chǎn)的費(fèi)用，表達(dá)穩(wěn)定性差和對(duì)安全的擔(dān)心。優(yōu)選地此傳遞系統(tǒng)是適合用于基因治療的。本領(lǐng)域已知道許多適合的傳遞系統(tǒng)。
優(yōu)選地此傳遞系統(tǒng)將被定向，以致使適合于移植的細(xì)胞，或已被移植的細(xì)胞可吸收本發(fā)明的分子。更優(yōu)選地，此傳遞系統(tǒng)是對(duì)這些細(xì)胞特異的。例如，可使此傳遞系統(tǒng)定向?qū)?zhǔn)特定的器官如心臟或腎臟，或者對(duì)準(zhǔn)特定的細(xì)胞類(lèi)型如上皮細(xì)胞。
為達(dá)到這個(gè)目的，例如，此傳遞系統(tǒng)可能是一個(gè)受體介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)，已被定向?qū)?zhǔn)了靶細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的受體。例如，可使此傳遞系統(tǒng)定向?qū)?zhǔn)心臟細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的受體，優(yōu)選地是對(duì)準(zhǔn)僅在心臟細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體，或者可使之定向?qū)?zhǔn)內(nèi)皮細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的受體，優(yōu)選地是對(duì)準(zhǔn)僅見(jiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞上的變體，或者對(duì)準(zhǔn)被激活內(nèi)皮細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的受體，如E-選擇素或P-選擇素。
此傳遞系統(tǒng)優(yōu)選地是適合于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的。例如，可使此傳遞系統(tǒng)定向?qū)?zhǔn)配子，受精卵，或胚胎干細(xì)胞。
本發(fā)明的第六方面是提供了一種用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。在此可能包括使用本發(fā)明的傳遞系統(tǒng)。
細(xì)胞類(lèi)型不受限制，可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過(guò)程可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。
當(dāng)細(xì)胞是用于移植時(shí)，此細(xì)胞優(yōu)選地是真核細(xì)胞，更優(yōu)選地是內(nèi)皮細(xì)胞。例如Heckl-Ostreicher(1995)描述了對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)程。
優(yōu)選地此細(xì)胞是適合于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的。更優(yōu)選地，此細(xì)胞是配子細(xì)胞，受精卵或胚胎干細(xì)胞。例如，Diamond(1995)描述通過(guò)微注射法轉(zhuǎn)染鼠卵細(xì)胞產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠，而Yannoutsos(1995)，Langford(1996)，和White(1995)描述通過(guò)微注射豬受精卵產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因豬。
本發(fā)明的第七方面是提供一種按照本發(fā)明第六方面轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
為了增加對(duì)凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程的抑制效果，此細(xì)胞優(yōu)選地能夠表達(dá)本發(fā)明的二種或兩種以上不同的蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)在不同的階段抑制凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程。例如，在一個(gè)蛋白質(zhì)中的抗凝血區(qū)可能含有TFPI，而在另一個(gè)蛋白質(zhì)中，它可能含有水蛭素序列。
本發(fā)明的第八方面提供了包含本發(fā)明細(xì)胞的生物組織。在此所應(yīng)用的名詞生物組織包括細(xì)胞，組織和器官標(biāo)本。因此，該定義包括例如成纖維細(xì)胞，角膜，神經(jīng)組織，心臟，肝臟，或腎臟。
本發(fā)明的第九方面提供了一種包含有本發(fā)明的細(xì)胞和/或生物組織的動(dòng)物。優(yōu)選地此動(dòng)物適合于產(chǎn)生用于對(duì)人移植的器官。優(yōu)選地此動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地是轉(zhuǎn)基因豬或轉(zhuǎn)基因羊。
可在活著時(shí)對(duì)此動(dòng)物進(jìn)行處理，以使它包含轉(zhuǎn)基因生物組織(即作基因治療處理)。為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，優(yōu)選地是用本發(fā)明的載體對(duì)活動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，可特異性地將本發(fā)明的載體傳遞給豬的內(nèi)皮細(xì)胞，而產(chǎn)生適合用于異種移植的轉(zhuǎn)基因器官。
另一種選擇是，此動(dòng)物可作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被生蟲(chóng)，本領(lǐng)域已知道多種適合用于產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法(例如Bradley &Liu.1996；Clarke，1996；Wheeler，1994)。例如，已熟知通過(guò)微注射DNA直接操作受精卵或早期胚胎，通常是體外操作多能性細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞。已證明對(duì)早期胚胎的反轉(zhuǎn)病毒感染在種范圍內(nèi)是成功的，對(duì)無(wú)帶卵的腺病毒感染已有報(bào)導(dǎo)。通過(guò)核轉(zhuǎn)移對(duì)羊的轉(zhuǎn)基因和克隆也有論述(例如WO97/07668)。
本發(fā)明的第十方面是提供了一種使生物組織適合用于移植的方法，包括在此生物組織內(nèi)，優(yōu)選地是在其內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一種或幾種本發(fā)明的蛋白質(zhì)?？稍隗w內(nèi)或體外使此生物織織進(jìn)行這種過(guò)程。例如，可在體內(nèi)用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物的一種器官，或者可以移植前在體外或移植后在體內(nèi)轉(zhuǎn)染某一器官。
本發(fā)明的第十一方面是提供了一種移植方法，包括將本發(fā)明的生物組織從供體動(dòng)物移植進(jìn)入受體動(dòng)物。優(yōu)選地此方法是用于異種移植，相對(duì)于受體動(dòng)物，此供體生物組織是異種的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示本發(fā)明的水蛭素-CD4嵌合蛋白和構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)圖。(A)具有甘氨酸接頭的HLA-水蛭素-CD4構(gòu)建物。(B)具有人P-選擇素C-末端的HLA-水蛭素-CD4構(gòu)建物，特異性定向序列被加底線。標(biāo)明了CD4的跨膜區(qū)(TM)，轉(zhuǎn)移終止區(qū)(ST)，和細(xì)胞質(zhì)區(qū)(C)。
圖2顯示對(duì)于在DAP3成纖維細(xì)胞中表達(dá)的HLA-水蛭素-CD4構(gòu)建物的FACS分布圖。
圖3顯示對(duì)于在CHO-K1中表達(dá)的HLA-水蛭素-CD4-P-選擇素cDNA構(gòu)建物的FACS分布圖。
圖4顯示表達(dá)水蛭素-CD4的成纖維細(xì)胞對(duì)凝血酶的結(jié)合。
圖5顯示凝血酶對(duì)表達(dá)水蛭素-CD4的細(xì)胞結(jié)合的特異性。
圖6顯示凝血酶對(duì)以HLA-水蛭素構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞的結(jié)合。
圖7顯示使凝血酶失活可消除凝血酶在細(xì)胞表面對(duì)水蛭素-CD4的結(jié)合。將表達(dá)水蛭素-G2-CD4的細(xì)胞同凝血酶或失活的凝血酶共溫育，并用抗凝血酶原抗體或抗-凝血酶-水蛭素抗體染色顯示凝血酶的結(jié)合。
圖8顯示本發(fā)明的TFPI-CD4嵌合蛋白和構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)圖。
圖9顯示表達(dá)束縛于細(xì)胞表面的TFPI如DAP.3細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定分布圖。
圖10顯示FXa對(duì)結(jié)合了TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的細(xì)胞表面的特異性結(jié)合。
圖11顯示抗-TFPI多克隆免疫球蛋白組分對(duì)FXa結(jié)合的阻斷。
圖12顯示針對(duì)Kunitz功能區(qū)I和II的單克隆抗體對(duì)FXa結(jié)合的阻斷。
圖13顯示表達(dá)TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的細(xì)胞對(duì)FXa的抑制作用。顯示了對(duì)于同F(xiàn)Xa共溫育的已轉(zhuǎn)染DAP.3細(xì)胞，F(xiàn)Xa-特異性生色底物達(dá)到OD405＝1的平均時(shí)間?？鄢藢?duì)于對(duì)照細(xì)胞的數(shù)值，誤差標(biāo)志表示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖14顯示，為了最大地結(jié)合了TFPI-CD4嵌合蛋白需要活性的TF1-219/FVII復(fù)合物。
圖15顯示凝血酶對(duì)表達(dá)水蛭素-CD4的永生化豬上皮細(xì)胞(IPEC)結(jié)合的特異性，并且還顯示了細(xì)胞表面水蛭素-CD4的表達(dá)對(duì)凝血時(shí)間的作用。
圖16顯示D16/16細(xì)胞中ACTH和水蛭素的分布，是通過(guò)熒光顯示的。
圖17顯示PMA刺激之后水蛭素-CD4-P-選擇素在細(xì)胞內(nèi)分布的改變。
圖18顯示在IPEC上表達(dá)的TFPI-CD4保持有其結(jié)合特性。
圖19顯示豬組織因子和人組織因子的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。
圖20顯示當(dāng)在IPEC表面表達(dá)時(shí)，TFPI-CD4可延長(zhǎng)凝血時(shí)間。
圖21顯示共表達(dá)TFPI-CD4和水蛭素-CD4的抗凝血作用。
對(duì)實(shí)施方案的描述1.將與HLA I類(lèi)信號(hào)肽融合的并連接于人CD4功能區(qū)3和4的水蛭素束縛在細(xì)胞膜上為了在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)異種的水蛭素構(gòu)建物，應(yīng)用重疊延伸的PCR技術(shù)，使來(lái)自人HLA I類(lèi)A2.1，氨基酸-1至-24(Holmes.1987)的膜定向性信號(hào)肽前導(dǎo)序列與水蛭素變異體1(Dodr，1984)融合(圖1)。用如下引物擴(kuò)增了此HLA A2.1前導(dǎo)序列5′-cagtgtcgacggatccatggccgtcatggcgccccga-3′[hla-1]<SEQ ID 1>(導(dǎo)入SalI和BamHI限制性位點(diǎn))和5′-gtcagtgtaaacaaccgcccaggtctgggtcagg-3′ <SEQ ID 2>用如下引物擴(kuò)增hirudin序列5′-acccagacctgggcggttgtttacactgactgcacc-3′及 <SEQ ID 3>
5′-gacgctgcagaattcttgcaggtattcnccgggatt-3′[hir-3] <SEQ ID 4>(導(dǎo)入末端EcoRI和PstI位點(diǎn))。借助于瓊脂糖凝膠電泳純化所得到的PCR產(chǎn)物(108和228bp)，然后用于第三次PCR，使用側(cè)翼引物hla-1和hir-3。對(duì)形成的PCR產(chǎn)物(300 bp)用SaII和BamHI消化，并亞克隆進(jìn)入pBluescript SK(+)(Stratagene)。
將由編碼CD4功能區(qū)3和4(Maddon，1985)的cDNA組成的錨定體，連同轉(zhuǎn)移終止序列(ST)，CD4(CD4166-435)的跨膜功能區(qū)和細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)一起，加入到HLA-水蛭素盒中。
但是，為確保當(dāng)以其C-末端連接于此CD4錨定體時(shí)，水蛭素能保持可移動(dòng)性并有活性，制備了如下3段不同的甘氨酸接頭(稱(chēng)為G1、G2、G3-圖1A)-甘氨酸接頭1(G1GGSGG)，此寡核甘酸對(duì)是由5′-aattaggaggttctggaggctgca-3′<SEQ ID 5>(含有突變的EcoRI識(shí)別序列和PstI位點(diǎn))和5′-gcctccagaacctcct-3′<SEQ ID 6>組成；
-甘氨酸接頭2(G2)和接頭3(G3)是分別由重復(fù)2次或3次的核心序列(GGSGG)組成。將這3段接頭導(dǎo)入HLA-水蛭素片斷的3′末端。
在插入CD4錨定體之前將這些甘氨酸接頭寡核苷酸退火，并分別連接進(jìn)入包含HLA-水蛭素盒的質(zhì)粒EcoRI/PstI位點(diǎn)中。
用如下引物擴(kuò)增了CD4166-4355′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′ <SEQ ID 7>(導(dǎo)入PstI和EcoRI位點(diǎn))和5′-gtgggatccgcctggcctcgtgcctcaa-3′ <SEQ ID 8>(含有一個(gè)末端BamHI)。
將形成的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入pBluescript并測(cè)序。在CD4166-435中，發(fā)現(xiàn)V328突變成A328。將PstI/BamHI CD4片斷亞克隆進(jìn)入HLA-水蛭素-Gl，-G2，和-G3質(zhì)粒，并且通過(guò)DNA序列分析核實(shí)這些構(gòu)建物。
將此3個(gè)cDNA構(gòu)建物的每一個(gè)亞克隆進(jìn)入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pHβActpr-l gpt(Gunning，1987)的BamHI位點(diǎn)，此載體包含有人β-肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)，以及驅(qū)動(dòng)gpt抗性基因的SV40增強(qiáng)子成分，使之可在霉酚酸存在下對(duì)克隆進(jìn)行選擇(圖1C和1D)。通過(guò)限制性內(nèi)切酶基因定位測(cè)定核實(shí)了最終構(gòu)建物的取向。
按照標(biāo)準(zhǔn)的程序，以磷酸鈣將包含有單獨(dú)HLA-水蛭素-G1/2/3-CD4構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)移進(jìn)入小鼠成纖維細(xì)胞DAP.3品系(Merguelies.1983)。在以5％胎牛血清，氨芐青霉素，鏈霉素和谷氨酰胺補(bǔ)充的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)生長(zhǎng)18小時(shí)之后，用甘油處理細(xì)胞30分鐘。然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗細(xì)胞2次。再加入含有黃嘌呤，次黃嘌呤和霉酚酸達(dá)最后濃12μg/ml的新鮮培養(yǎng)基。
對(duì)于陰性對(duì)照，是使以表達(dá)HLA-DR的人II類(lèi)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的DAP.3細(xì)胞(細(xì)胞品系513)(Lechler，1988)，培養(yǎng)生長(zhǎng)在含有霉酚酸的相同培養(yǎng)基內(nèi)。
分別用鼠單克隆抗體4185-81-7(Schlaeppi，1991)和OKT-4(Reinherz，1979)，借助于FACS(熒光激活細(xì)胞分類(lèi)法)檢測(cè)了存活的克隆對(duì)水蛭素和CD4的表達(dá)。在冰浴上用鼠抗體對(duì)105個(gè)細(xì)胞染色30分鐘，并加入FITC-結(jié)合標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體作為第二抗體。
如在圖2中所顯示，在DAP.3細(xì)胞表面，這些水蛭素-CD4構(gòu)建物很好地被表達(dá)了。在具有3個(gè)不同長(zhǎng)度甘氨酸接頭的水蛭素-CD4之間，未檢測(cè)出表達(dá)水平有任何顯著性差異。
因此，抗凝血多肽可在細(xì)胞表面穩(wěn)定地被表達(dá)。2.在CHO-K1細(xì)胞表面表達(dá)具有來(lái)自P-選擇素C-末端的定向序列的水蛭素-CD4。
除HLA-水蛭素-G1/2/3-CD4構(gòu)建物之外，還構(gòu)建了具有來(lái)自人P-選擇素的定向序列的另外二個(gè)構(gòu)建物(圖1B)。來(lái)自CD4的跨膜區(qū)被用于這些構(gòu)建物，同時(shí)用來(lái)自P-選擇素的相應(yīng)序列(Johnston，1989)代替了轉(zhuǎn)移終止序列和C-末端。
為了將CD4功能區(qū)3和4加跨膜區(qū)(CD4166-395)融合于人P-選擇素(P-sel754-789)的轉(zhuǎn)移終止序列和細(xì)胞質(zhì)1區(qū)和2區(qū)(McEver，1989)，實(shí)施了重疊延伸的PCR反應(yīng)。為了擴(kuò)增此分子的CD4部分，使用了如下引物5′-tgtctgcaggaaccagaagaaggtggaattca-3′[CD4-5] <SEQ ID 7>(導(dǎo)入PstI和EcoRI限制性位點(diǎn))和5′-gtctgaaacgctttctgaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccg-3′<SEQ ID 9>平行地，為了擴(kuò)增P-選擇素的C-末端區(qū)，使用了如下引物(導(dǎo)入一個(gè)末端BamHI位點(diǎn))5′-tgggctaggcatcttcttcagaaagcgtttcagacaaaaaga-3′and<SEQ ID 10>
5′-gaccaggatccggacaggtctctta-3′[P-selN3] <SEQ ID 11>
以瓊脂糖凝膠純化所形成的PCR產(chǎn)物之后，用側(cè)翼引物CD4-5和P-selN3實(shí)施了第三次PCR。用PstI和BamHI消化所形成的PCR產(chǎn)物(832bp)，亞克隆進(jìn)入pBluescript并進(jìn)行測(cè)序。然后，用PstI/BamHI切割此CD4-P-sel片斷(CD4166-395-P-sel754-789)，并亞克隆進(jìn)入含有HLA-水蛭素G1或G2的質(zhì)粒。
將最后的HLA-水蛭素-G1/G2-CD4-P-選擇素構(gòu)建物亞克隆進(jìn)入pHβActpr-lgpt的BamHI位點(diǎn)，并被轉(zhuǎn)染進(jìn)入CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCL 61)，在以5％胎牛血清，氨芐青霉素，鏈霉素和谷氨酰胺補(bǔ)充的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)此細(xì)胞。
通過(guò)電穿孔法，按照標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將5×106個(gè)細(xì)胞再懸浮于350ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移至1ml的電穿孔小杯中，電極(Bio-Rad)間的距離為0.4cm。在150ml內(nèi)加入10μl質(zhì)粒DNA之后，將樣品緩慢地?cái)嚢璨⒈３衷诒≈?。在基因脈沖發(fā)生僅(Bio-Rad)中以無(wú)窮大電阻，960μF和350V使細(xì)胞經(jīng)受電穿孔作用。電穿孔后的次日，用PBS洗細(xì)胞，并加入包含有霉酚酸，黃嘌呤和次黃嘌呤的新鮮培養(yǎng)基。
最近發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用P-選擇素cDNA轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有聚積P-選擇素蛋白，而是被表達(dá)在細(xì)胞表面(Disdier，1992)。如通過(guò)用OKT-4和4158-81-7單克隆染色可斷定(圖3)，對(duì)于上述產(chǎn)生的CHO-K1轉(zhuǎn)染子，水蛭素-G1-CD4-P-選擇素和水蛭素-G2-CD4-P-選擇素都在其表面表達(dá)了，使用的陰性對(duì)照是CHO-K1細(xì)胞系，它表達(dá)融合CD4功能區(qū)3和4的TFPI(TFPI-CD4166-435)，培養(yǎng)在含有霉酚酸的相同培養(yǎng)基內(nèi)。
用完整長(zhǎng)度的人P-選擇素轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞(Johnston，1989)作為陽(yáng)性對(duì)照，此P-選擇素是作為3142bp的SalI片斷被亞克隆進(jìn)入包含有SV40-驅(qū)動(dòng)的新霉素(G418)抗性基因的pHβActpr-lneo中。用400μg/ml的G418處理這些細(xì)胞，2周后用棉拭子挑出單獨(dú)的克隆，轉(zhuǎn)移至12孔培養(yǎng)板內(nèi)。用10μg/ml的4158-81-7和未稀釋的OKT-4雜交瘤上清液，分析了存活克隆對(duì)水蛭素和CD4的表達(dá)。
用抗-CD62 mAb(Becton Dickinson)按照制造商的建議，對(duì)人P-選擇素進(jìn)行了檢測(cè)。對(duì)于這些CD62-標(biāo)記的細(xì)胞，觀察到與使用水蛭素-CD4-P-選擇素相類(lèi)似的FACS分布圖(圖3E)，證實(shí)CHO-K1細(xì)胞在質(zhì)膜可表達(dá)P-選擇素。
因此，當(dāng)在細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，含有P-選擇素定向序列的嵌合蛋白質(zhì)仍然具有功能作用。3.如以特異性抗體所檢測(cè)的，錨定在細(xì)胞表面的水蛭素可結(jié)合凝血酶為了測(cè)定以這種方式束縛于細(xì)胞表面的水蛭素是否仍保持其凝血酶結(jié)合活性，采用了如下的結(jié)合試驗(yàn)。
每次實(shí)驗(yàn)之前，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在T75培養(yǎng)搖瓶中培養(yǎng)36小時(shí)。用細(xì)胞剝離器脫離下DAP.3細(xì)胞，而通過(guò)用PBS，5mM EDTA在37℃處理10分鐘，使CHO-K1細(xì)胞與塑料瓶分離。細(xì)胞用含有0.1％BSA(w/v)的PBS洗4次之后，將150μl 2.5×105個(gè)細(xì)胞在37℃同遞增濃度的凝血酶共溫育1小時(shí)。用含有0.1％ BSA的PBS洗此細(xì)胞4次，并在冰浴上同兔抗-人凝血酶原免疫球蛋白(100μl中10μg/ml)(Dakopatts)再孵育30分鐘。再洗2次之后，將細(xì)胞同F(xiàn)ITC-標(biāo)記的豬抗-兔免疫球蛋白(Dakopatts)共溫育30分鐘。最后，將轉(zhuǎn)染子洗3次，并用流式細(xì)胞僅進(jìn)行分析。
如圖4所顯示，在細(xì)胞表面表達(dá)的水蛭素保持了結(jié)合凝血酶的能力，甘氨酸接頭長(zhǎng)度不影響對(duì)凝血酶的結(jié)合。
為了測(cè)定飽和水蛭素-CD4表達(dá)細(xì)胞所需的凝血酶量，將2個(gè)克隆同最高達(dá)82U/ml的凝血酶共溫育。當(dāng)分析陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)時(shí)，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染子在41U/ml凝血酶含量下被飽和(圖4C)。但是，根據(jù)平均熒光強(qiáng)度(mfi)，即使在82U/ml細(xì)胞也未被飽和(圖4D)。在這些實(shí)驗(yàn)性高凝血酶濃度下，對(duì)表達(dá)HLA-DR的對(duì)照細(xì)胞的背景結(jié)合也顯著增加了。
為了進(jìn)一步闡明凝血酶對(duì)水蛭素-CD4結(jié)合的特異性，進(jìn)行了如下阻斷實(shí)驗(yàn)。將DAP.3 HLA-水蛭素-G3-CD4轉(zhuǎn)染子同10μg/ml的抗-水蛭素mAb或適當(dāng)?shù)膶?duì)照(小鼠IgG1和IgG2a，Dakopats)，在冰浴中共同預(yù)孵育30分鐘，在含有0.1％ BSA的PBS中洗2次后，如上述同凝血酶在37℃共溫育1小時(shí)。同上述對(duì)凝血酶的結(jié)合進(jìn)行了分析。
同4158-81-7的預(yù)溫育抑制了凝血酶對(duì)水蛭素-CD4的特異性結(jié)合(圖5A)。通過(guò)同凝血酶共溫育，以及以mAb 4107-76-1(Schlaeppi，1991)和抗-凝血酶原免疫球蛋白的標(biāo)記比較，證明了水蛭素-CD4對(duì)凝血酶的結(jié)合。4107-76-1定向針對(duì)水蛭素-凝血酶復(fù)合物，檢測(cè)到未結(jié)合凝血酶的水蛭素和凝血酶都不與內(nèi)源性凝血酶受體結(jié)合。如圖5B所示，以4107-76-1檢測(cè)的凝血酶結(jié)合類(lèi)似于以抗-凝血酶原免疫球蛋白組分所觀察到的結(jié)合。
因此，在DAP.3細(xì)胞表面表達(dá)的水蛭素保持了對(duì)凝血酶的特異性結(jié)合。
按同樣的方式以水蛭素-CD4轉(zhuǎn)染豬的永生化上皮細(xì)胞(IPEC)。如圖15A所示，只有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞結(jié)合凝血酶，并且這種結(jié)合可被4158-81-7以劑量依賴(lài)性方式所阻斷(圖15B)。應(yīng)用人血漿再鈣化試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)一步研究了在IPEC上表達(dá)，表面束縛的水蛭素的功能作用。如圖15C所示，與不存在細(xì)胞的對(duì)照血凝結(jié)時(shí)間370秒相比較，未轉(zhuǎn)染的IPEC使再鈣化血漿的凝結(jié)時(shí)間縮短至大約170秒。同誘導(dǎo)TF表達(dá)的IL-1預(yù)溫育進(jìn)一步使凝血時(shí)間減少至100秒以下。與之相反，轉(zhuǎn)染的IPEC使凝血時(shí)間延長(zhǎng)，即使是同誘導(dǎo)TF表達(dá)的IL-1預(yù)溫育之后也是如此。同4158-81-7共溫育則以劑量依賴(lài)性方式降低了這種抗凝血作用，表明此作用是由于存在細(xì)胞表面水蛭素(圖15D)。
因此，在IPEC表面表達(dá)的水蛭素可結(jié)合凝血酶，并且也能抑制人血漿凝結(jié)。4.CHO-K1細(xì)胞表達(dá)的水蛭素-CD4-P-選擇素對(duì)凝血酶的結(jié)合為了探查水蛭素-CD4-P-選擇素當(dāng)被表達(dá)在CHO-K1細(xì)胞表面時(shí)是否也能結(jié)合凝血酶，將這些細(xì)胞同凝血酶在37℃共溫育1小時(shí)。用抗-凝血酶原免疫球蛋白染色，并加上FiTC-標(biāo)記的第二抗體層之后，借助于流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。
檢測(cè)出完全不同的結(jié)合曲線，如圖6A所示。以抗-凝血酶原免疫球蛋白，在同相當(dāng)?shù)蜐舛鹊哪腹矞赜?，可檢測(cè)出凝血酶對(duì)表達(dá)與CD4連接的不相干蛋白質(zhì)的CHO-K1細(xì)胞的本底結(jié)合。但是，通過(guò)以特異性抗-水蛭素/凝血酶mAb 4107-76-1染色，證實(shí)了凝血酶對(duì)水蛭素的特異性結(jié)合(圖6B)。以這種抗體，未能測(cè)定出對(duì)照CHO-K1細(xì)胞的本底結(jié)合。圖6還表明，表達(dá)水蛭素的克隆顯示有對(duì)凝血酶不同程度的非特異性結(jié)合，意味著它們對(duì)內(nèi)源性凝血酶受體具有不同的表達(dá)水平。用其它幾個(gè)克隆證實(shí)了這種非特異性結(jié)合的變化。
為了比較，將來(lái)自表達(dá)水蛭素-G1-CD4和水蛭素-G2-CD4(即無(wú)P-選擇素序列)的二個(gè)CHO-K1轉(zhuǎn)染子的結(jié)果顯示在圖6C和6D中。與表達(dá)連接于CD4-P-選擇素錨定器的水蛭素的轉(zhuǎn)染子相比較，除了由于對(duì)嵌合蛋白質(zhì)較好的表達(dá)，凝血酶的結(jié)合稍有增加(較高的mfi)之外，未檢測(cè)出結(jié)合曲線有任何大的差異。5.水蛭素-CD4-P-選擇素被貯存在分泌顆粒中，激活時(shí)可被釋放出。
為了測(cè)定水蛭素在細(xì)胞內(nèi)的積蓄和它從分泌顆粒到細(xì)胞表面的路徑，以編碼水蛭素-CD4-P-選擇素或水蛭素-CD4的cDNA瞬時(shí)地轉(zhuǎn)染了分泌性鼠垂體細(xì)胞系(D16/16)。出于二個(gè)理由選擇了這個(gè)細(xì)胞系。第一，已知這些細(xì)胞在特殊的貯存顆粒內(nèi)表達(dá)ACTH，用佛波醇酯激活時(shí)，在細(xì)胞表面釋放出ACTH。第二，在體外培養(yǎng)過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞(這種細(xì)胞對(duì)于研究P-選擇素構(gòu)建物的細(xì)胞內(nèi)定向似乎是理想的細(xì)胞類(lèi)型)會(huì)迅速地喪失其Weibel-Palede貯存顆粒。
轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，以抗水蛭素和抗ACTH抗體對(duì)D16/16細(xì)胞染色。在以水蛭素-CD4-P-選擇素轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)水蛭素在顆粒內(nèi)均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖16A)。以ACTH-特異染色時(shí)，觀察到同樣的顆粒分布形式，表明了與水蛭素的共-定位(圖16B)。用二種抗體同時(shí)染色時(shí)證實(shí)了這點(diǎn)(圖16C)。
相比之下，以水蛭素-CD4轉(zhuǎn)染的D16/16細(xì)胞不將水蛭素積蓄在細(xì)胞內(nèi)的顆粒中，而是在細(xì)胞表面表達(dá)了高水平的水蛭素(圖16D)。雙重染色(圖16F)僅顯示有水蛭素和ACTH的少量共-定位。
用佛波醇酯PMA激活表達(dá)水蛭素-CD4-P-選擇素的細(xì)胞，并借助于流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了分析。對(duì)于未受刺激的細(xì)胞4158-81-7不能在細(xì)胞表面檢測(cè)出水蛭素(圖17A)。但是在PMA刺激30分鐘之后，在細(xì)胞表面檢測(cè)出了水蛭素(圖17B)。而且，激活的D16/16細(xì)胞可特異性地與凝血酶結(jié)合，不同于未激活細(xì)胞(圖17C-以4107-76-1染色的)。
因此，通過(guò)應(yīng)用含有顆粒的垂體細(xì)胞系D16/16，清楚地證明，水蛭素-CD4-P-選擇素可被定位于特定的細(xì)胞內(nèi)貯存顆粒中，并且激活時(shí)在細(xì)胞表面可釋放和暴露出功能性嵌合分子。6.當(dāng)使凝血酶催化位點(diǎn)失活時(shí)可消除凝血酶和水蛭素-CD4之間的相互作用。
已明了凝血酶對(duì)帶有和不帶有P-選擇素定向序列的水蛭素-CD4的特異性結(jié)合(圖4和6)。為了進(jìn)一步增強(qiáng)凝血酶-水蛭素相互作用的特異性，將凝血酶(210nmol，在50μl Tris-緩沖鹽水(TBS)中，含0.1％ BSA，pH7.4)同如下成分在37℃預(yù)溫育1小時(shí)-天然的全長(zhǎng)水蛭素(Biopharm)，以10倍摩爾過(guò)量-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮二鹽酸化物(“PPACK-HCl”)(Calbiochem)，以100倍摩爾過(guò)量；或者-合成的含有水蛭素殘基53-64的C-端水蛭素十二肽類(lèi)似物，帶有硫酸根合-Try64(Amertican Diagnostica)，以100倍摩爾過(guò)量。
用一個(gè)小的生色寡肽底物(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(“S-2238”)(Quadratech)分析凝血酶依賴(lài)性催化活性。
為了確定凝血酶是否已被PPACK-HCl和水蛭素失活，將5μl每種反應(yīng)混合物用95ml TBS，0.1％BSA稀釋?zhuān)?0μl 4mM S-2238在37℃共溫育10分鐘。
如所預(yù)料的，與不加抑制劑溫育的凝血酶相比較，對(duì)于同PPACK-HCl或水蛭素共溫育的凝血酶未觀察到任何顏色改變，另一方面，如通過(guò)S-2238的斷裂作用所測(cè)定的，此十二肽不影響凝血酶依賴(lài)性催化活性。
將這三種不同的制備物加到表達(dá)束縛于細(xì)胞表面的水蛭素的轉(zhuǎn)染子中。應(yīng)用上述的程序，用抗-凝血酶抗體或抗-水蛭素-凝血酶抗體，對(duì)凝血酶的結(jié)合進(jìn)行了檢測(cè)。如從圖7A可見(jiàn)，以水蛭素或PPACK-HCl失活的凝血酶，沒(méi)有被在DAP.3細(xì)胞表面所表達(dá)的水蛭素結(jié)合。此外，只觀察到凝血酶-十二肽復(fù)合物的部分結(jié)合。與DAP.3轉(zhuǎn)染子不同，CHO-K1細(xì)胞顯示了相對(duì)較高的凝血酶-PPACK-HCl結(jié)合(圖7B)。發(fā)現(xiàn)這種相互作用是非特異性的，如用抗-水蛭素-凝血酶mAb4107-76-1所顯示的。未檢測(cè)到凝血酶-PPACK-HCl-水蛭素的特異性結(jié)合。
這證實(shí)水蛭素已特異性地束縛在細(xì)胞表面，并且在凝血酶的催化位點(diǎn)與它強(qiáng)烈地結(jié)合。7.在細(xì)胞表面表達(dá)錨定于CD4功能區(qū)的全長(zhǎng)和截短的TFPI。
為了使TFPI束縛在細(xì)胞膜上，將由人CD4166-435組成的融合蛋白連接于包含所有3個(gè)Kunitz功能區(qū)的全長(zhǎng)TFPI(TFPI1-276)，或者連接于缺少了Kunitz功能區(qū)III和C-末端的TFPI截短形式(TFPI1-183)(Wun，1988)(圖8)。按類(lèi)似于上述用于水蛭素的路徑，通過(guò)應(yīng)用盒式克隆方案將TFPI和CD4序列融合，進(jìn)行了這些合成，但是不同于水蛭素，TFPI是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，因此含有內(nèi)源性信號(hào)肽。
用如下引物擴(kuò)增了編碼TFPI的N-末端部分的DNA，此TFPI包含有Kunitz功能區(qū)I和II(675bp)5′-catcgtcgacggatcctagatgatttacacaatgaagaaagtacatgcactttgggc-3′<SEQ ID 12>(導(dǎo)入SalI和BamHI限制性位點(diǎn))；和5′-ggacctgcagaattcaaaaaggctgg-3′ <SEQ ID 13>(包含EcoRI和PstI位點(diǎn))用如下引物擴(kuò)增了編碼Kunitz第III功能區(qū)連同TFPI C-末端(315bp)的DNA5′-agcctttttgaattccacggtccctcat-3′ <SEQ ID 14>(具有EcoRI位點(diǎn))，和5′-cattgctataacaactgcagatatttttaac-3′ <SEQ ID 15>(含有PstI位點(diǎn))。
如上所述擴(kuò)增了CD4166-435。
通過(guò)將限制性位點(diǎn)導(dǎo)入TFPI183cDNA的3′末端和TFPI184-276cDNA的5′末端，在重組體融合蛋白中H184和G185被突變成C184和R185(圖8)。而且P186被突變成S186。通過(guò)導(dǎo)入PstI位點(diǎn)除去了TFPI的終止密碼子，因此使M276突變成I276，并加入了氨基酸C277。在將PstI位點(diǎn)導(dǎo)入CD4功能區(qū)3 N-末端的過(guò)程中，L164和Q165被分別突變成C164和R165。發(fā)現(xiàn)TFPI184-276cDNA中K265被突變成E265，CD4166-435中V328被突變成A328(如上所述)將所有的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入pBluescrpt SK(+)。
將全部TFPI-CD4 cDNA連接進(jìn)入pHβActpr-1gpt表達(dá)載體的BamHI位點(diǎn)。
如上面所述，借助于磷酸鈣對(duì)保持在補(bǔ)充DMEM中的DAP.3進(jìn)行了轉(zhuǎn)染。通過(guò)FACS法，用10μg/ml的鼠抗-人TFPI mAb 4903或4904(American Diagnostica)以及未稀釋的OKT-4雜交瘤上清液(Reinherz，1979)，分析了克隆對(duì)TFPI和CD4的表達(dá)。4903是針對(duì)Kunitz功能區(qū)I的，而4904針對(duì)Kunitz功能區(qū)II。如上所述，每個(gè)樣品用105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，用細(xì)胞系531作為對(duì)照。
如圖9所示，細(xì)胞表面既能表達(dá)TFPI1-276-CD4也能表達(dá)TFPI1- 183-CD4。8.束縛在細(xì)胞表面的TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4能與FXa結(jié)合為了測(cè)定以此方法束縛于細(xì)胞表面的TFPI是否保持其FXa結(jié)合活性，采用了如下的結(jié)合試驗(yàn)通過(guò)以PBS，5mM EDTA在37℃處理10分鐘，分離出被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DAP.3細(xì)胞。以過(guò)量PBS，0.1％ BSA(w/v)洗細(xì)胞之后，將100μl中的2.5×105個(gè)細(xì)胞同遞增濃度的FXa在37℃共溫育1小時(shí)。
然后洗細(xì)胞2次，在冰浴上用100μl 10μg/ml的兔抗-人FXa免疫球蛋白(RAFX-IG，Enzyme Research Laboratories)再共溫育30分鐘。再洗2次之后，將細(xì)胞同F(xiàn)ITC-標(biāo)記的豬抗兔多克隆免疫球蛋白共溫育30分鐘，并借助于流式細(xì)胞儀分析。
如圖10中所示，在細(xì)胞表面表達(dá)TFPI1-276-CD4和TFPI1-183-CD4的DAP.3細(xì)胞，以劑量-依賴(lài)性方式強(qiáng)烈地結(jié)合FXa(圖10)，在0.02nM就可檢測(cè)到顯著的結(jié)合。在全長(zhǎng)TFPI-CD4和截短的TFPI-CD4之間，未發(fā)現(xiàn)對(duì)FXa結(jié)合有任何差異。
還可能用多克隆抗-TFPI免疫球蛋白組分(4901)或者用單克隆4903和4904阻斷對(duì)FXa的結(jié)合。
在冰浴上將細(xì)胞同遞增濃度的4901，4903或4904共溫育30分鐘，用抗-血紅蛋白抗血清(Dakopatts)作陰性對(duì)照。然后在PBS，0.1％ BSA中洗細(xì)胞2次，同5nM FXa 37℃共溫育1小時(shí)。然后再洗細(xì)胞，如上述同RAFX-IG共溫育，并通過(guò)FACS法分析FXa的結(jié)合。
與同無(wú)關(guān)的抗-血紅蛋白多克隆對(duì)照共溫育的細(xì)胞相比較，在10μg/ml和80μg/ml多克隆4901下FXa對(duì)TFPI1-276-CD4的結(jié)合分別降低了27％和55％(圖11A)。還發(fā)現(xiàn)對(duì)于同4901預(yù)溫育的TFPI1- 183-CD4細(xì)胞FXa的結(jié)合降低了(圖11B)。
與同種型-匹配的小鼠免疫球蛋白相比較，當(dāng)用4903或4904阻斷TFPI1-276-CD4時(shí)，在40μg/ml mAb下觀察到FXa結(jié)合降低了33％(圖12)。在mAb4903和4904之間未發(fā)現(xiàn)其阻斷活性的的差異。
這首次證明，當(dāng)作為膜結(jié)合的融合蛋白被表達(dá)時(shí)，TFPI仍保持其Fxa結(jié)合活性。9.TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4都具有抗FXa功能活性為了測(cè)定束縛于細(xì)胞表面的TFPI是否保持了其抑制FXa功能作用的能力，應(yīng)用生色底物N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-PNA·2HCl(“S-2765”)(Quadratech)分析FXa的蛋白水解活性。
如前面所述分離出轉(zhuǎn)染的DAP.3細(xì)胞，用過(guò)量的TBS，pH7.4，0.1％BSA洗4次。每孔加入0.5×106個(gè)細(xì)胞(在100μl)，與不同濃度的Fxa在37℃共溫育1小時(shí)。加入50μl 4mM S-2765，在37℃再溫育2小時(shí)。每30秒測(cè)定一次OD405值，確定達(dá)到OD405＝0.1所需的時(shí)間，表明仍具有FXa活性。
所表達(dá)的TFPI-CD4以劑量依賴(lài)性方式抑制了FXa活性，發(fā)現(xiàn)加入低濃度FXa(0.16nM)時(shí)具有最大的抑制作用(圖13)。在一系列實(shí)驗(yàn)中，未觀察到在表達(dá)TFPI1-183-CD4或TFPI1-276-CD4的細(xì)胞之間，F(xiàn)Xa抑制作用的任何顯著的差異。
因此，當(dāng)束縛于細(xì)胞表面不論在TFPI1-183-CD4還是在TFPI1-276-CD4表達(dá)細(xì)胞表面，Kunitz功能區(qū)II仍保持有功能作用。10.TF1-129/FVIIa復(fù)合物的結(jié)合作用與Kunitz第III功能區(qū)的存在無(wú)關(guān)組織因子和因子VIIa的結(jié)合可用于證實(shí)Kunitz功能區(qū)I是否也保持有功能作用。
分別在E.Coli和CHO-K1中產(chǎn)生了重組人TF1-129和FVIIa(O′Brien，1994)。以等摩爾濃度將它們混合，并在25℃溫育15分鐘，獲得TF1-129/FVIIa復(fù)合物。
按標(biāo)準(zhǔn)方法制備了兔抗-人TF多克隆免疫球蛋白。
將表達(dá)TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4的DAP.3細(xì)胞同5nMFXa在37℃共溫育1小時(shí)。洗細(xì)胞2次，并將TF1-219/FVIIa復(fù)合物加入到100μl的2.5×105個(gè)細(xì)胞中。在37℃溫育1小時(shí)之后，洗轉(zhuǎn)染子2次，并在冰浴上同50μl兔抗-TF多克隆免疫球蛋白(2.5μg/ml)共溫育30分鐘，隨后洗2次，然后同F(xiàn)ITC標(biāo)記的豬抗兔免疫球蛋白共溫育。借助于流式細(xì)胞術(shù)僅對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。
TF1-219/FVIIa可同等有效地與TFPI1-276-CD4(圖14A)和TFPI1 -183-CD4(圖14B)結(jié)合，而完全沒(méi)有檢出有對(duì)對(duì)照細(xì)胞系531的結(jié)合。
為了證實(shí)TF1-219/FVIIa復(fù)合物對(duì)Kunitz功能區(qū)I的特異性結(jié)合，可通過(guò)用1.5-丹磺酰-Glu-Gly-Arg-氯甲基酮，二鹽酸化物(“1，5-DNS-GGACK·HCl”)預(yù)溫育使FVIIa失活。此抑制劑結(jié)合于FVIIa的活性位點(diǎn)，抑制它對(duì)TFPI的結(jié)合，而不影響形成TF1-219/FVIIa復(fù)合物(Bajaj，1992)。
首先將FVIIa用100倍摩爾過(guò)量的1，5-DNS-GGACK·HCl在20℃共溫育18小時(shí)，并借助于離子交換層析再次純化。將活性位點(diǎn)受抑制的FVIIa(FVIIai)同等摩爾濃度的TF1-219在25℃共溫育15分鐘，然后加到100μl的2.5×105個(gè)細(xì)胞中。隨后的步驟同上所述。
如從圖14可以看出，同具有結(jié)合“活性的”TF1-219/FVIIa相比較，TF1-219/FVIIai復(fù)合物對(duì)TFPI-CD4表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合顯著地減少了。在以TFPI1-276-CD4或TFPI1-183-CD4轉(zhuǎn)染的DAP.3之間未見(jiàn)有任何差異。
因此，當(dāng)在TFPI1-183-CD4和TFPI1-276-CD4中束縛于細(xì)胞表面時(shí)，Kunitz功能區(qū)I也保持其功能作用。所以顯然，束縛在細(xì)胞表面的TFPI是作為一個(gè)整體發(fā)揮其功能活性。11.在IPEC上表達(dá)的TFPI-CD4可結(jié)合相關(guān)的人凝血因子和豬TF如在圖18中所示，可在IPEC上表達(dá)TFPI-CD4融合蛋白并保持有結(jié)合FXa和FVIIa的能力。為了證明TFPI可同豬TF發(fā)生物理性相互作用，采取了應(yīng)用可溶性人TF的競(jìng)爭(zhēng)性抑制法。如圖19A中所示，與TF-陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染子(沒(méi)有用IL-1α激活的)的結(jié)合相比較，存在飽和濃度的FXa和FVIIa時(shí)，可溶性人TF對(duì)TFPI-轉(zhuǎn)染的IPEC(用IL-1α預(yù)處理的)的結(jié)合顯著地降低了。這表明豬TF在同可溶性人TF競(jìng)爭(zhēng)VIIa，并因此競(jìng)爭(zhēng)對(duì)TFPI的結(jié)合。圖19B顯示的結(jié)果支持了這點(diǎn)，如果將這些轉(zhuǎn)染子同遞增濃度的抗豬TF抗體共溫育，則可溶性人TF對(duì)TFPI-CD4轉(zhuǎn)染的IPEC(用IL-1α預(yù)激活的)的結(jié)合增加了。這種抗體的作用可反映出對(duì)豬TF和FVIIa之間或者豬TF-VIIa復(fù)合物和TFPI-CD4之間相互作用的抑制。二種方法的結(jié)果都提示，在IPEC表面表達(dá)的TFPI-CD4融合蛋白可同豬TF-FVIIa發(fā)生物理性相互作用。12.在IPEC上表達(dá)的TFPI-CD4可抑制TF-依賴(lài)性血纖維蛋白的形成圖20A顯示圖解說(shuō)明TFPI-CD4轉(zhuǎn)染的IPEC前凝血?jiǎng)┍硇偷膯蝹€(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。與對(duì)照的IPEC相比較，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上存在融合蛋白質(zhì)時(shí)，相應(yīng)延長(zhǎng)了凝血時(shí)間。但是，只有當(dāng)使用TF-陰性IPEC時(shí)，在IL-1α激活-RFPI-CD4表達(dá)對(duì)凝血時(shí)間沒(méi)有影響之后，才能觀察到這種作用。因此，如所預(yù)料的，TFPI-CD4抑制了TF-依賴(lài)性血纖維蛋白的形成，但不抑制TF-無(wú)關(guān)的血纖維蛋白形成。在預(yù)溫育步驟中以遞增濃度使用抗TFPI抗體，能夠使凝血時(shí)間正?；祷氐接梦崔D(zhuǎn)染的IL-1α激活的對(duì)照IPEC所看到的時(shí)間(圖20B)，表明存在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)凝血時(shí)間的延長(zhǎng)，完全是由于TFPI的特異性抑制作用。13.在細(xì)胞膜表達(dá)蛋白C激活物為了表達(dá)含有從Agkistrodon Contortrix Contortrix毒液中分離出的蛋白C激活物的異源性構(gòu)建物(McMullen，1989；Kisiel，1987)，合成了編碼此蛋白質(zhì)的cDNA。該蛋白質(zhì)的序列是如下<SEQID 16>V I G G D E C N I N E H R F L A L V Y A N G S L C GG T L I N Q E W V L T A R H C D R G N M R I Y L G MH N L K V L N K D A L R R F P K E K Y F C L N T R ND T I W D K D I M L I R L N R P V R N S A H I A P LS L P S N P P S V G S V C R I M G W G T I T S P N AT L P D V P H C A N I N I L D Y A V C Q A A Y K G LA A T T L C A G I L E G G K D T C K G D S G G P L IC N G Q F Q G I L S V G G N P C A Q P R K P G I Y TK V F D Y T D W I Q S I I S G N T D A T C P P根據(jù)豬密碼子的應(yīng)用傾向性(它至少適合于絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，合成了如下單健DNA<SEQ ID 17>GTG ATC GGC GGC GAC GAG TGC AAC ATC AAC GAG CAC CGCTTC CTG GCC CTG GTG TAC GCC AAC GGC AGC CTG TGC GGCGGC ACC CTG ATC AAC CAG GAG TGG GTG CTG ACC GCC CGCCAC TGC GAC CGC GGC AAC ATG CGC ATC TAC CTG GGC ATGCAC AAC CTG AAG GTG CTG AAC AAG GAC GCC CTG CGC CGCTTC CCC AAG GAG AAG TAC TTC TGC CTG AAC ACC CGC AACGAC ACC ATC TGG GAC AAG GAC ATC ATG CTG ATC CGC CTGAAC CGC CCC GTG CGC AAC AGC GCC CAC ATC GCC CCC CTGAGC CTG CCC AGC AAC CCC CCC AGC GTG GGC AGC GTG TGCCGC ATC ATG GGC TGG GGC ACC ATC ACC AGC CCC AAC GCCACC CTG CCC GAC GTG CCC CAC TGC GCC AAC ATC AAC ATCCTG GAC TAC GCC GTG TGC CAG GCC GCC TAC AAG GGC CTGGCC GCC ACC ACC CTG TGC GCC GGC ATC CTG GAG GGC GGCAAG GAC ACC TGC AAG GGC GAC AGC GGC GGC CCC CTG ATCTGC AAC GGC CAG TTC CAG GGC ATC CTG AGC GTG GGC GGCAAC CCC TGC GCC CAG CCC CGC AAG CCC GGC ATC TAC ACCAAG GTG TTC GAC TAC ACC GAC TGG ATC CAG AGC ATC ATCAGC GGC AAC ACC GAC GCC ACC TGC CCC CCC使此單鏈DNA對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸退火，得到雙鏈分子。在此雙鏈DNA的二端包括有限制性位點(diǎn)，CD4錨定器和P-選擇素信號(hào)序列以類(lèi)似于前面所述的方式與這些位點(diǎn)相連接。如前面所述，將所形成的分子連接進(jìn)入pHβActpr-1gpt載體。
作為DNA的另一種來(lái)源，可基于已知的蛋白質(zhì)序列，對(duì)蛇cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。14.TFPI-CD4和水蛭素-CD5的共表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)TF-依賴(lài)性凝血和TF-無(wú)關(guān)的凝血的抑制產(chǎn)生了表達(dá)TFPI-CD4和水蛭素-CD4的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。如圖21A中所示，此初級(jí)轉(zhuǎn)染子表達(dá)了不同水平的水蛭素和低水平的TFPI。但是，盡管大多數(shù)轉(zhuǎn)染子進(jìn)行這種適度的表達(dá)，與對(duì)照相比較，這些細(xì)胞的前凝血?jiǎng)┍硇惋@著地減少了(圖21B)。在IL-1α激活的IPEC的細(xì)胞表面存在二種抗凝血分子，明顯地延長(zhǎng)了血漿凝結(jié)的時(shí)間至大約300秒鐘，接近于被認(rèn)為是再鈣化人血漿自發(fā)凝結(jié)的時(shí)間。以抗-水蛭素和抗-TFPI抗體進(jìn)行的阻斷研究證實(shí)，這些雙轉(zhuǎn)染子的表型改變是由于所表達(dá)的水蛭素和TFPI對(duì)凝血的特異性抑制作用。
應(yīng)該理解的是，上面僅以實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，并且可能對(duì)其進(jìn)行修改，而仍屬于本發(fā)明的范圍。參考文獻(xiàn)(其內(nèi)容在此被引用了)Bach.FH等，遲發(fā)性異種移植排異作用。今日免疫學(xué)1996；17(8)；379-384Bajaj SP等，鈣結(jié)合和酶原激活時(shí)人因子IX蛋白酶功能區(qū)中抗體檢測(cè)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變推測(cè)在蛋白酶功能區(qū)中有高親和性Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。
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NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3acccagacct gggcggttgt ttacactgac tgcacc 36(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.4gacgctgcag aattcttgca ggtattcttc cgggatt 37(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.5aattaggagg ttctggaggc tgca 24(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.6gcctccagaa cctcct16(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.7tgtctgcagg aaccagaaga aggtggaatt ca 32(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.8gtgggatccg cctggcctcg tgcctcaa28(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.9gtctgaaacg ctttctgaag aagatgccta gcccaatgaa aagcaggagg ccg53(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.10tgggctaggc atcttcttca gaaagcgttt cagacaaaaa ga42(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.11gaccaggatc cggacaggtc tctta 25(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度57個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.12catcgtcgac ggatcctaga tgatttacac aatgaagaaa gtacatgcac tttgggc57(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.13ggacctgcag aattcaaaaa ggctgg 26(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.14agcctttttg aattccacgg tccctcat 28(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.15cattgctata acaactgcag atatttttaa c 31(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度231個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型蛋白質(zhì)(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(vi)來(lái)源(A)生物體Agkistrodon contortrix contortrix(xi)SEQ ID NO16序列描述Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Ala1 5 10 15Leu Val Tyr Ala Asn Gly Ser Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Gln20 25 30Glu Trp Val Leu Thr Ala Arg His Cys Asp Arg Gly Asn Met Arg Ile35 40 45Tyr Leu Gly Met His Asn Leu Lys Val Leu Asn Lys Asp Ala Leu Arg50 55 60Arg Phe Pro Lys Glu Lys Tyr Phe Cys Leu Asn Thr Arg Asn Asp Thr65 70 75 80Ile Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asn Arg Pro Val Arg85 90 95Asn Ser Ala His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro Ser100 105 110Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Thr Ile Thr Ser Pro115 120 125Asn Ala Thr Leu Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Ile Leu130 135 140Asp Tyr Ala Val Cys Gln Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ala Thr Thr145 150 155 160Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Lys Gly Asp165 170 175Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu Ser180 185 190Val Gly Gly Asn Pro Cys Ala Gln Pro Arg Lys Pro Gly Ile Tyr Thr195 200 205Lys Val Phe Asp Tyr Thr Asp Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ser Gly Asn210 215 220Thr Asp Ala Thr Cys Pro Pro225 230(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度693個(gè)核苷酸(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.17gtgatcggcg gcgacgagtg caacatcaac gagcaccgct tcctggccct ggtgtacgcc 60aacggcagcc tgtgcggcgg caccctgatc aaccaggagt gggtgctgac cgcccgccac 120tgcgaccgcg gcaacatgcg catctacctg ggcatgcaca acctgaaggt gctgaacaag 180gacgccctgc gccgcttccc caaggagaag tacttctgcc tgaacacccg caacgacacc 240atctgggaca aggacatcat gctgatccgc ctgaaccgcc ccgtgcgcaa cagcgcccac 300atcgcccccc tgagcctgcc cagcaacccc cccagcgtgg gcagcgtgtg ccgcatcatg 360ggctggggca ccatcaccag ccccaacgcc accctgcccg acgtgcccca ctgcgccaac 420atcaacatcc tggactacgc cgtgtgccag gccgcctaca agggcctggc cgccaccacc 480ctgtgcgccg gcatcctgga gggcggcaag gacacctgca agggcgacag cggcggcccc 540ctgatctgca acggccagtt ccagggcatc ctgagcgtgg gcggcaaccc ctgcgcccag 600ccccgcaagc ccggcatcta caccaaggtg ttcgactaca ccgactggat ccagagcatc 660atcagcggca acaccgacgc cacctgcccc ccc 69權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，它包含一個(gè)具有抗凝血活性的區(qū)域，以及一個(gè)可以將此蛋白質(zhì)錨定于細(xì)胞膜的區(qū)域。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，另外還含有一個(gè)使此蛋白質(zhì)不致在細(xì)胞表面組成型表達(dá)的定向序列。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中的抗凝血區(qū)包括水蛭素序列，組織因子途徑的抑制劑序列，蜱抗凝血肽序列，或蛋白C激活物序列。
4.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中的錨定區(qū)是一個(gè)能將此蛋白質(zhì)附著于脂質(zhì)雙層的序列。
5.權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)，其中的錨定區(qū)包括來(lái)自膜蛋白的跨膜序列。
6.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其中的定向序列是一種可以使新生的多肽定向進(jìn)入分泌顆粒的序列。
7.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中所述的分泌顆粒直到細(xì)胞受到適合的刺激才能與細(xì)胞質(zhì)膜融合。
8.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其中的分泌顆粒是Weibel-Palade小體。
9.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，其中的定向序列是P-選擇素的細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)。
10.上述權(quán)利要求中任何之一的蛋白質(zhì)，其中的錨定序列是P-選擇素的序列。
11.一種多核苷酸，它編碼根據(jù)上述權(quán)利要求中任何之一的蛋白質(zhì)。
12.一種載體，包含有權(quán)利要求11的多核苷酸。
13.一種傳遞系統(tǒng)，包括權(quán)利要求1-10中任何之一的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求11的多核苷酸，或權(quán)利要求12的載體。
14.一種以權(quán)利要求12的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
16.包含有權(quán)利要求15的細(xì)胞的生物組織。
17.一種動(dòng)物，包含有權(quán)利要求16的生物組織和/或權(quán)利要求15的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的動(dòng)物，其中該動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的豬或綿羊。
19.一種使組織或器官適合于移植的方法，包括在該組織或器官中的內(nèi)皮細(xì)胞表面，表達(dá)權(quán)利要求1-10中任何之一的蛋白質(zhì)。
20.一種移植方法，包括將權(quán)利要求16的生物組織從供體動(dòng)物移植到受體動(dòng)物體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于對(duì)血液凝結(jié)作用的抑制,尤其是在器官排異作用的過(guò)程中,并且特別是對(duì)延遲性血管排異作用的抑制。本發(fā)明提供了可錨定于細(xì)胞膜的抗凝血蛋白。其抗凝血功能優(yōu)選地是由肝素,抗凝血酶,水蛭素,TFPI,蜱抗凝血肽或蛇毒液因子所提供。優(yōu)選地,這些抗凝血蛋白可被阻止在細(xì)胞表面組成型表達(dá)。特別是,在細(xì)胞表面的表達(dá)是由細(xì)胞的激活調(diào)節(jié)的,例如通過(guò)使該蛋白質(zhì)定向進(jìn)入合適的分泌顆粒。這些蛋白質(zhì)的表達(dá),可使細(xì)胞,組織和器官在移植之后(例如在異種移值之后)較少受排異作用的損害。
文檔編號(hào)C07K14/74GK1265148SQ9880545
公開(kāi)日2000年8月30日 申請(qǐng)日期1998年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月26日
發(fā)明者K·里斯貝克, A·多林, A·J·T·喬治, R·L·萊赫列爾 申請(qǐng)人:帝國(guó)學(xué)院創(chuàng)新有限公司