專利名稱：化合物、它們的制備及其在細(xì)胞中核酸轉(zhuǎn)移的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞中核酸轉(zhuǎn)移的新化合物。更具體地，這些新化合物屬于脂多胺家族，它們含有脒官能團(tuán)。這些化合物可用于不同種類的細(xì)胞中目的核酸的轉(zhuǎn)移，在體外、體內(nèi)或離體均可。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有效地向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸越來越必要?？赡苌婕霸隗w外細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)移，例如生產(chǎn)重組蛋白、或在實(shí)驗(yàn)室中研究控制基因表達(dá)、基因克隆或任何其他有關(guān)DNA的操作。還可能涉及在體內(nèi)細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)移，例如生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、制備疫苗、標(biāo)記或還有治療方法的研究。在骨髓移植、免疫治療或其他有關(guān)在從器官抽取的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的其他方法中，也可能涉及離體細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)移。
為了改善細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)移曾研究了不同種類的合成載體。在這些載體中，陽離子脂類具有有意義的性質(zhì)。這些載體由與核酸發(fā)生相互作用的陽離子極性部分，和有利于細(xì)胞滲透的憎水脂類部分構(gòu)成。特定的陽離子脂類實(shí)例具體是單陽離子脂類(DOTMALipofectin)、某些陽離子洗滌劑(DDAB)、脂多胺，特別是雙十八烷基酰氨基甘氨?；?DOGS)或棕櫚?；字；掖及返?-羧基精胺酰胺(DPPES)，例如在專利申請EP 394 111中描述了其制備方法。在專利申請WO 97/18185中描述的化合物代表了另一脂多胺家族，該專利申請引于本文中作為參考。
本發(fā)明涉及具有特別有利性質(zhì)的新類型核酸轉(zhuǎn)移試劑。更確切地，本發(fā)明的化合物是陽離子脂類，它們帶有新穎的陽離子區(qū)，因此帶給分子更好的性質(zhì)。更確切地，這陽離子部分以有一個(gè)或多個(gè)脒官能團(tuán)的特定多胺為代表。
本發(fā)明的第一個(gè)目的更確切地涉及具有下述通式(I)的呈D、L或DL形式的化合物，以及它們的鹽
式中-R1、R2和R3各自代表氫原子或-(CH2)q-NRR′，其中·q是包括1和6在內(nèi)的1-6的整數(shù)，q值在R1、R2和R3基團(tuán)之間是彼此不相關(guān)的，·R和R′各自代表氫原子或下述化學(xué)式(II)基團(tuán)
式中r是包括0和6在內(nèi)的0-6的整數(shù)，R5各自代表氫原子或烴基殘基，其條件是R1、R2和R3基團(tuán)中至少一個(gè)基團(tuán)含有至少一個(gè)化學(xué)式(II)基團(tuán)，-m和n各自代表包括1和6在內(nèi)的1-6的整數(shù)，當(dāng)n大于1時(shí)，m可以取不同的值，而R3可具有通式(I)下不同的含意，-p代表包括1和6在內(nèi)的1-6的整數(shù)，以及-R4代表具有下述通式(III)的基團(tuán)
式中·R7和R8各自代表氫原子或親脂基團(tuán)，R7和R8基團(tuán)中至少一個(gè)基團(tuán)不是氫原子，·t是包括0和10在內(nèi)的0-10的整數(shù)，當(dāng)t是大于1的整數(shù)時(shí)，R6、X、Y和s在不同的結(jié)構(gòu)單元[X-(CHR6)s-Y]中可以具有不同的含意，·X代表氧原子或硫原子，或氨基或烷基氨基，烷基取代基是直鏈或支鏈的并含有1-8個(gè)碳原子，·Y代表羰基或亞甲基，·R6代表氫原子或任選被取代的天然氨基酸側(cè)鏈，以及·s代表包括1和10在內(nèi)的1-10的整數(shù)，并且當(dāng)s等于1時(shí)，R6代表任選被取代的天然氨基酸側(cè)鏈，當(dāng)s大于1時(shí)，R6代表氫原子。
如前面使用的術(shù)語“DL形式”表示任何比例的D和L形式的混合物，例如等比例的混合物。
本發(fā)明中關(guān)于“烴基殘基”，應(yīng)當(dāng)理解是任選鹵化的任何脂族或芳族烷基、氨基甲酸酯基或?；〈Ｔ谥鍤埢?，更具體地可以提到任選鹵化的、環(huán)狀或非環(huán)狀的、直鏈或支鏈的、飽和或未飽和的脂族殘基。更優(yōu)選地，涉及含有1-10個(gè)碳原子的脂族殘基。具體地，涉及烷?；?、烷基和烷氧羰基取代基，例如像甲酰基、丁基、叔丁基或叔丁氧羰基取代基。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，R5代表叔丁氧羰基。
在芳族殘基中，更具體地可以列舉芐基及其衍生物，如氯代芐基、芐氧羰基或氯代芐氧羰基。
優(yōu)選地，R5代表叔丁氧羰基、芐氧羰基或氯代芐氧羰基。
在本發(fā)明的第一個(gè)方案中，R5基團(tuán)中一個(gè)代表氫原子，而另一個(gè)代表含有1-10個(gè)碳原子的脂族殘基。
在本發(fā)明的第二個(gè)方案中，R5基團(tuán)中一個(gè)代表氫原子，而另一個(gè)代表優(yōu)選地選自芐基及其衍生物的芳族殘基。
在本發(fā)明的其他方案中，兩個(gè)R5基團(tuán)都代表氫原子。
有利地，當(dāng)R1、R2和/或R3不是氫原子并含有通式(II)時(shí)，q取值為2或3，而r為0。
優(yōu)選地，在通式(I)中，m選自2、3和4。
正如前面所指出的，R7和R8基團(tuán)中至少一個(gè)基團(tuán)代表親脂基團(tuán)。在本發(fā)明中，“親脂基團(tuán)”應(yīng)當(dāng)理解是有利于如本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞滲透的、憎水脂類類型的任何基團(tuán)。具體地涉及一個(gè)或多個(gè)脂肪脂族鏈、類固醇衍生物、天然或合成的脂類，優(yōu)選能夠生成層狀相或六方形相的脂類，或任選地這些物質(zhì)的組合。更具體地可能涉及任選鹵化的、直鏈或支鏈的、飽和或未飽和的含有5-22個(gè)碳原子的脂族基團(tuán)。還可能涉及類固醇衍生物，或(CH2)u-NH-R9基團(tuán)，式中u是包括2和6在內(nèi)的2-6的整數(shù)，R9是?；?，例如像氯代膽甾醇甲酸酯基、花生四烯?；蚰懰?。
其他的類固醇衍生物的實(shí)例特別有膽固醇、膽甾烷醇、3-α-5-環(huán)-5-α-膽甾烷-6-β-醇、膽酸、膽甾醇甲酸酯、膽甾烷醇甲酸酯、3α，5-環(huán)-5α-膽甾烷-6-β-基甲酸酯、膽甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氫環(huán)戊二烯并[a]環(huán)丙并[2，3]環(huán)戊二烯并[1，2-f]萘-10-基胺，或膽甾烷基胺。
優(yōu)選地，親脂基團(tuán)是含有10-22個(gè)碳原子，優(yōu)選地14、16、17、18或19個(gè)碳原子的脂族基團(tuán)。具體可以列舉親脂基團(tuán)(CH2)13CH3、(CH2)15CH3、(CH2)16CH3、(CH2)17CH3、(CH2)18CH3與油基。
在一特定的實(shí)施方式中，R7和R8兩個(gè)基團(tuán)都代表如上述的親脂基團(tuán)。特別地，在優(yōu)選實(shí)施方式中，R7和R8兩個(gè)基團(tuán)中的每個(gè)基團(tuán)代表含有5-22個(gè)碳原子的脂族鏈，更優(yōu)選地含有12-22個(gè)碳原子的脂族鏈。
根據(jù)本發(fā)明的一種方案，R6代表天然氨基酸的側(cè)鏈。具體地，天然氨基酸側(cè)鏈可以含有脒基結(jié)構(gòu)單元，例如像精氨酸側(cè)鏈。如前面所說明的那樣，這種側(cè)鏈R6還可以被含有1-24個(gè)碳原子的、支鏈或直鏈或環(huán)狀的、飽和或未飽和的脂族基團(tuán)取代。作為實(shí)例，可以列舉被膽甾烯基、花生四烯酰基或視黃?；?、單-或多-芳族基團(tuán)取代的氨基酸側(cè)鏈，所述芳族基團(tuán)例如為取代或未取代的芐氧羰基、芐基酯、若丹明基或生物素基衍生物。
在一種特別有利的實(shí)施方式中，要求保護(hù)的化合物還含有能夠使與其結(jié)合的核酸定向轉(zhuǎn)移的靶向元件。優(yōu)選地，將這種靶向元件加到通式(I)的化合物中用取代基R6表示的氨基酸側(cè)鏈上。更優(yōu)選地，靶向元件以共價(jià)或非共價(jià)方式與本發(fā)明的化合物連接。
這可能涉及一種細(xì)胞外的靶向元件，該元件能夠使核酸轉(zhuǎn)移朝向某些種類的細(xì)胞或某些希望的組織(腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、生血細(xì)胞等)。關(guān)于這一點(diǎn)，可能涉及在靶細(xì)胞類型表面上存在的細(xì)胞受體的配體，例如像糖、葉酸鹽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、脫唾液酸血清類粘蛋白或被細(xì)胞外受體識別的任何生物活性分子。還可能涉及能夠使核酸轉(zhuǎn)移朝向某些特定細(xì)胞部分(線粒體、細(xì)胞核等)的細(xì)胞內(nèi)靶向元件，例如像核定位信號序列(nls)，它有利于在細(xì)胞核中積累已轉(zhuǎn)染DNA。
更一般地，在本發(fā)明范圍內(nèi)能夠使用的靶向元件包括糖、肽、寡核苷酸、類固醇或脂類。優(yōu)選地，涉及糖和/或肽，如抗體或抗體片段、細(xì)胞受體的配體或其片段、受體或其片段等。具體地，可能涉及下列受體的配體生長因子受體、細(xì)胞因子受體、細(xì)胞凝集素受體或粘合蛋白如整聯(lián)蛋白的受體。還可以列舉轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、HDL與LDL脂類受體。靶向元件還可以是能夠靶向于凝集素的糖，如靶向脫唾液酸糖蛋白受體，或能夠靶向于免疫球蛋白片段Fc受體的抗體片段Fab。
同樣地，可能想到將通式(I)化合物與生物素、羅丹明、葉酸類的標(biāo)記試劑通過例如氨基酸側(cè)鏈R6結(jié)合起來。這種標(biāo)記試劑還可以是直鏈或環(huán)狀的肽或假肽序列，該序列含有識別整聯(lián)蛋白類粘合蛋白一級體和/或次級受體的表位Arg-Gly-Asp。
一個(gè)特定的本發(fā)明化合物組是R1包括化學(xué)式(II)基團(tuán)，而R2與R3是氫原子的化合物組。
第二個(gè)特定的本發(fā)明化合物組是R1和R2每個(gè)都包括化學(xué)式(II)基團(tuán)，而R3是氫原子的化合物組。
另一個(gè)特定的本發(fā)明化合物組是R1和R3每個(gè)都包括化學(xué)式(II)基團(tuán)，而R2是氫原子的化合物組。
另一個(gè)特定的本發(fā)明化合物組是其中R1、R2和R3每個(gè)都包括化學(xué)式(II)基團(tuán)的化合物組。
本發(fā)明通式(I)新化合物可以呈鹽形式，優(yōu)選地呈非毒性的和藥學(xué)上可接受的鹽的形式。這些無毒的鹽包括與無機(jī)酸(鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、硝酸)生成的鹽、與有機(jī)酸(乙酸、丙酸、琥珀酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、富馬酸、甲磺酸或草酸)生成的鹽，或與無機(jī)堿(氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈣)生成的鹽，或與有機(jī)堿(如三乙胺的叔胺、哌啶、芐基胺)生成的鹽。
作為代表，更具體地可以列舉采用下述子通式定義的本發(fā)明的化合物
R4和R5如前面所定義。
作本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移劑，可以列舉下述化學(xué)式的化合物
化合物3
化合物5
本發(fā)明的化合物可以采用不同的方法進(jìn)行制備，特別是采用溶液合成和/或采用在聚合物載體上固相合成進(jìn)行制備。
根據(jù)第一種合成方法，本發(fā)明通式(I)化合物可以采用下述方法得到讓脲的硫代或氧代衍生物(其胺任選地被保護(hù))與具有下述化學(xué)式(VIII)的脂多胺作用
式中R′1、R′2、R′3各自代表氫原子或(CH2)q-NR9R10基團(tuán)，其中q可以是包括1和6在內(nèi)的1-6的整數(shù)，不同的q彼此不相關(guān)。
R9和R10各自代表氫原子或化學(xué)式(CH2)r-NH3基團(tuán)，其中r各自是包括1和6在內(nèi)的1-6的整數(shù)，以及m、n、p和R4如前面所定義。
一般地，在堿存在下，在合適的親質(zhì)性或非質(zhì)子性溶劑中，在溫度0℃至100℃的條件下進(jìn)行脲衍生物的這種作用。
使用的堿一般地是非親核的堿，例如像叔胺、碳酸鈉或碳酸氫鈉。有利地，使用叔胺，例如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺(DIEA)。
有利地，在如水、醇(甲醇、乙醇、異丙醇等)、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、甲苯、四氯化碳、苯、乙腈、N-甲基吡咯烷酮等之類的溶劑中進(jìn)行該反應(yīng)。優(yōu)選地，反應(yīng)溫度是20-60℃，更優(yōu)選地是30-50℃。
更特別有意義的脲衍生物例如是O-甲基異脲(J.Med.Chem.38(1995)16，3053-3061)，S-甲基異硫脲半硫酸鹽(Int.J.Pept.Prot.Res.，40(1992)，119-126)，雙-Boc-硫脲(Tet.Lett.48(1993)，7677-7680)、N，N′-雙(芐氧基羰基)-S-甲基異硫脲或N，N′-雙(叔丁氧基羰基)-S-甲基異硫脲(Synth.Commun.26(1996)，2，407-413)。
通式(VIII)脂多胺可根據(jù)作為參考文獻(xiàn)列于本文的專利申請WO97/18185所描述的方法，或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的類似方法得到。
根據(jù)本發(fā)明，通式(I)轉(zhuǎn)移劑還可通過下述通式(IX)的酸與脂類分子R4H之間的肽偶合作用得到
式中R1、R2、R3、m、n、p和R4如前面所定義。
根據(jù)常規(guī)方法(Bodanski M.，肽合成原理與實(shí)踐(Principlesand Practices of Peptides Synthesis)，Ed.Springe-Verlag)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法進(jìn)行肽偶合作用。
具體地，一般在合適的非質(zhì)子性溶劑中，在溫度0-100℃下，在非親核堿存在下進(jìn)行該反應(yīng)，同時(shí)其pH調(diào)節(jié)到9-11。
作為實(shí)例，氯仿、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可以用作溶劑。
使用的非親核堿優(yōu)選地是叔胺、碳酸鈣或碳酸氫鈉。更優(yōu)選地，使用的堿是叔胺，例如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺(DIEA)。
有利地，該反應(yīng)在溫度0-50℃，更優(yōu)選地在10-30℃下進(jìn)行。
其中R4如前面所定義的通式R4H脂類分子，可以通過市售的通式(X)化合物與化學(xué)式NHR7R8胺之間的肽偶合作用得到
式中X、Y、s、t、R6、R7和R8如前面所定義。
根據(jù)常規(guī)方法(Bodanski M.，肽合成原理與實(shí)踐，Ed.Springe-Verlag)或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法進(jìn)行肽偶合作用。
具體地，如前面所描述的那樣，一般在合適的非質(zhì)子性溶劑中，在溫度0-100℃下，在非親核堿存在下進(jìn)行該反應(yīng)，同時(shí)其pH調(diào)節(jié)到9-11。
按照分3步的固相合成方法可以得到通式(IX)酸，其方法如下
-將如下的通式(XI)多胺
式中R′1、R′2、R′3、m和n如前面所定義，接枝在聚合物載體
上，得到下述通式(XII)的接枝化合物
優(yōu)選地，在例如氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、甲苯、苯等之類的合適的非質(zhì)子性溶劑存在下，在溫度0-100℃下進(jìn)行該反應(yīng)。有利地，反應(yīng)溫度是室溫。
不同的聚合物載體都適用。有利地選擇在市場上可購到的固相肽合成(Merrifield合成)樹脂。具體地，可以選擇O-氯代三苯甲基型氯化物樹脂或HMP樹脂，這些樹脂提供有游離酸官能團(tuán)的產(chǎn)物，或Rink型樹脂。聚氨基酸可以用在固相上預(yù)合成的有溴代烷基官能團(tuán)或w-醛酸官能團(tuán)的肽直接合成得到。
根據(jù)烷基化方法選擇要得到合適樹脂所使用的烷基化劑。對于通常的烷基化作用，例如選擇溴代乙酸或w-鹵代羧酸。對于還原性烷基化作用，例如選擇w-醛-羧酸，如乙醛酸、半-醛琥珀酸等，或酮-酸，如乙酰乙酸或丙酮酸等。
為了得到支化多胺，通式(XI)的原料多胺可以從市場上購賣，例如亞精胺、精銨、三-(2-氨基乙基)胺、苯二胺、二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)，或者可以采用通常的方法合成，例如用在市場上可購買到的胺如二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)胺、亞精胺、精銨經(jīng)氰乙基化作用合成得到。
-在第二個(gè)步驟中，讓通式(XII)接枝化合物與脲的硫代衍生物或氧代衍生物進(jìn)行反應(yīng)，該脲衍生物中的胺任選地被保護(hù)，得到具有下述通式(XIII)的接枝多氨基脒化合物
式中R1、R2、R3、m、n和p如前面所定義。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(Bergeron，R.J.和McManis，15-Deoxyspergualin的全合成，有機(jī)化學(xué)雜志，1987，52，1700-1703)或根據(jù)類似的方法進(jìn)行該反應(yīng)。
具體地在質(zhì)子或非質(zhì)子性溶劑存在下，在溫度-20℃至100℃下進(jìn)行該反應(yīng)。
作為實(shí)例，可使用水、醇(甲醇、乙醇、異丙醇等)、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、芳族溶劑(甲苯、苯等)、四氯化碳、乙腈、N-甲基吡咯烷酮等作為溶劑。
更特別有意義的脲衍生物例如是O-甲基異脲(J.Med.Chem.38(1995)16，3053-3061)、S-甲基異硫脲半硫酸鹽(Int.J.Pept.Prot.Res.，40(1992)，119-126)，雙-Boc-硫脲(Tet.Lett.48(1993)，7677-7680)、N，N′-雙(芐氧基羰基)-S-甲基異硫脲或N，N′-雙(叔丁氧基羰基)-S-甲基異硫脲(Synth.Commun.26(1996)，2，407-413)。
-最后，在最后的步驟中，從聚合物載體解離出通式(XIII)接枝多氨基脒，以便得到如前面定義的通式(IX)的酸。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通常方法進(jìn)行解離。具體地，通過不使分子殘基降解的弱酸作用進(jìn)行操作。優(yōu)選的弱酸例如是含氟的醇，更特別是1，1，1-三氟乙-2-醇。
因?yàn)橥ㄊ?XIII)多氨基脒含有酸、氨基、烷基氨基和/或脒官能團(tuán)，如果必要的話，優(yōu)選在解離聚合物載體時(shí)預(yù)先保護(hù)它們。這種保護(hù)可以使用其加入和除去都不會(huì)改變分子殘基的任何相容的基團(tuán)。具體地，根據(jù)在T.W.GREENE，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)，A.Wiley-護(hù)基團(tuán)，Plenum Press(1973)中描述的方法進(jìn)行操作。
如果必要的話，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通常方法，在解離聚合物載體之后所得到的通式(IX)酸與化學(xué)式R4H化合物之間肽偶合之前除去保護(hù)基團(tuán)。
作為實(shí)例，保護(hù)基團(tuán)可以選自三甲基甲硅烷基、二苯甲基、四氫吡喃基、甲酰基、乙?；?、氯代乙?；⑷却阴；?、三氟乙酰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、三氯乙氧基羰基、芐氧基羰基、芴氧基羰基等。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可得到本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移劑的任何其他方法，特別是在Bodanski M.，肽合成的原理與實(shí)踐，Ed.Springe-Verlag中描述的方法，也都屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明另外一個(gè)目的涉及一種含有如上述定義的轉(zhuǎn)移劑和核酸的組合物。優(yōu)選地，該化合物與核酸的量是該化合物正電荷與核酸負(fù)電荷的比R應(yīng)為0.1-50，更優(yōu)選地為0.1-20。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)使用的化合物、核酸和所要求的應(yīng)用(具體待轉(zhuǎn)移細(xì)胞類型)，可以很容易地調(diào)整這個(gè)比例。
在本發(fā)明中，“核酸”應(yīng)當(dāng)理解是脫氧核糖核酸和核糖核酸?？赡苌婕疤烊换蛉斯ば蛄校唧w地如基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)的序列，雜合序列或合成或半合成的序列，修飾或未修飾的寡核苷酸。這些核酸可以來自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等。它們可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)得到，具體地采用篩選文庫、化學(xué)合成得到，或采用包括化學(xué)或酶修飾由篩選文庫所得到序列的混合方法得到。它們可以采用化學(xué)方法修飾。
特別地，脫氧核糖核酸可以是短的寡核苷酸或較長的序列，可以是單鏈或雙鏈。具體地，這些核酸有利地由質(zhì)粒、載體、附加體、表達(dá)盒等構(gòu)成。這些脫氧核糖核酸可以帶有在其靶細(xì)胞中有功能或否的復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的調(diào)節(jié)序列、有治療意義的目的基因、修飾或未修飾的反義序列、其他細(xì)胞組分連接區(qū)等。
優(yōu)選地，該核酸包括一個(gè)表達(dá)盒，它由靶細(xì)胞中有活性的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個(gè)或多個(gè)具有治療意義的目的基因構(gòu)成。
在本發(fā)明的意義上，具有治療意義的目的基因應(yīng)當(dāng)特別地理解是編碼具有治療作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的任何基因。如此編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)品具體地可以是蛋白質(zhì)或膚。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)品對靶細(xì)胞可以是同源性外源的或內(nèi)源的，即當(dāng)靶細(xì)胞沒有任何疾病時(shí)在該細(xì)胞中正常被表達(dá)的產(chǎn)物。在這種情況下，蛋白質(zhì)表達(dá)例如可緩解該細(xì)胞中表達(dá)不充分，或由于修飾而失活的或低活性蛋白的表達(dá)，或能夠過表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。具有治療意義的目的基因還可編碼穩(wěn)定性提高的、活性改變的細(xì)胞蛋白突變體。蛋白產(chǎn)品對靶細(xì)胞還可以是異源的。在這種情況下，表達(dá)的蛋白例如可以補(bǔ)充或提供細(xì)胞中的缺失活性，使它能夠抵御疾病，或刺激免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明意義上的治療產(chǎn)品中，更具體地可以列舉酶、血液衍生物、激素、淋巴因子白介素、干擾素、TNF等(FR 92/03120)、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶、營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效營養(yǎng)因子等)、原脂蛋白(ApoAI、ApoAIV、ApoE等，F(xiàn)R93/05125)、肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白(FR 91/11947)、與先天性粘液稠厚癥相關(guān)的CFTR蛋白質(zhì)、腫瘤抑制基因(p53，Rb，RaplA，DCC，k-rev等，F(xiàn)R 93/04745)、編碼凝血相關(guān)因子的基因(因子VII、VIII、IX)、參與DNA修復(fù)的基因、自殺基因(胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶)、血紅蛋白或其他蛋白載體的基因、代謝酶、分解代謝酶等。
具有治療意義的核酸還可能是一種基因或一種反義序列，其在靶細(xì)胞中的表達(dá)能夠控制基因表達(dá)或細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄。根據(jù)在專利EP 140308中描述的技術(shù)，這樣一些序列例如能夠在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞mRNA的互補(bǔ)RNA，并因此阻斷其轉(zhuǎn)譯成蛋白。治療基因還包括核酶的編碼序列，它能夠選擇性地破壞靶RNA(EP 321 201)。
核酸還包括一個(gè)或多個(gè)編碼能夠在人體或動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的核酸還包括一個(gè)或多個(gè)編碼能夠在人體或動(dòng)物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原性肽的基因。在這種特定的實(shí)施方式下，本發(fā)明可用于制備疫苗，或者用于人或動(dòng)物的免疫治療，特別是抗微生物、病毒或癌的免疫治療。具體地涉及EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP 185 573)、假狂犬病病毒、“合胞體形成病毒”、其他病毒的特定抗原性肽，或特定的腫瘤抗原性肽(EP 259 212)。
優(yōu)選地，核酸還含有支持具有治療意義的目的基因和/或編碼抗原性肽的基因在所希望的細(xì)胞或器官中表達(dá)的序列。當(dāng)它們在感染細(xì)胞中能夠發(fā)生作用時(shí)，可能涉及天然地負(fù)責(zé)表達(dá)所考慮基因的序列。還可能涉及不同來源的序列(負(fù)責(zé)表達(dá)其他蛋白，或甚至合成的序列)。具體地，可能涉及真核生物或病毒基因的啟動(dòng)子序列。例如，可能涉及來自希望感染細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子序列。同樣地，可能涉及來自病毒基因組的啟動(dòng)子序列。在這方面例如可以列舉E1A、MLP、CMV、RSV等基因的啟動(dòng)子。另外，這些表達(dá)序列可以通過加入激活、調(diào)節(jié)等序列修飾。還可能涉及可誘導(dǎo)或可阻抑性啟動(dòng)子。
另外，核酸特別在具有治療意義的目的基因上游還可能包括一種引導(dǎo)合成的治療產(chǎn)品在靶細(xì)胞分泌道中的信號序列。這種信號序列可能是治療產(chǎn)品的自然信號序列，但也可能涉及任何其他的功能信號序列，或人工的信號序列。該核酸還可能包括將合成的治療產(chǎn)品引向特定胞腔的信號序列。
在另外一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及含有核酸、如前面定義的轉(zhuǎn)染劑(I)和一種或多種添加劑的組合物，該添加劑能夠與轉(zhuǎn)染劑/核酸復(fù)合物結(jié)合，并能夠改善轉(zhuǎn)染能力。這類添加劑(例如脂類、肽或蛋白)能夠很有利地增加化合物的轉(zhuǎn)染能力。
從這點(diǎn)來看，本發(fā)明組合物可以含有一種或多種中性脂類作為添加劑。這樣一些組合物是特別有利的，核酸脂復(fù)合物電荷比R低時(shí)尤其如此。申請人事實(shí)上已表明加入中性脂類能夠改善核酸脂類顆粒的生成，還有利于顆粒滲透到細(xì)胞中，其使細(xì)胞膜不穩(wěn)定。
更優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的中性脂類是具有2個(gè)脂肪鏈的脂類。特別有利地，使用在生理?xiàng)l件下兩性離子的或沒有離子電荷的天然或合成的脂類。更具體地，它可以選自二油?；字；掖及?DOPE)、油?；貦磅；字；掖及?POPE)、二-硬脂酰基、二-棕櫚酰基、二-肉豆蔻?；字；掖及芬约八鼈兊?-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二?；视?、糖基二?；视汀⒛X苷脂類(具體如半乳糖腦苷脂類)、鞘脂類(例如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂類(具體例如是脫唾液酸GM1與GM2)。
這些不同的脂類可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，或者通過合成，或者通過從器官(例如腦)或卵提取得到。具體地，可以采用有機(jī)溶劑提取天然脂類(還可參見Lehninger，生物化學(xué))。
最近，申請人證實(shí)使用一種直接或非直接地參與所述核酸凝集的化合物作為添加劑也是特別有利的(WO 96/25508)。在本發(fā)明組合物中，這種化合物的存在能夠降低轉(zhuǎn)染化合物的量，由此得到在毒理學(xué)方面有益的結(jié)果，而不會(huì)對轉(zhuǎn)染活性帶來任何損害。關(guān)于參與核酸凝集的化合物，應(yīng)當(dāng)定義為一種直接地或非直接地壓縮核酸的化合物。更確切地，這種化合物或者可以在待轉(zhuǎn)染核酸中直接地起作用，或者在一種直接參與核酸凝集的附加化合物中起作用。優(yōu)選地，直接地在核酸中起作用。例如，預(yù)壓縮劑可以是任何多陽離子物，例如聚賴氨酸。根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方式，這種參與核酸凝集的壓縮劑全部或部分地由魚精蛋白、組蛋白或核仁素和/或一種它們的衍生物衍生得到。這種壓縮劑還可以全部或部分由肽結(jié)構(gòu)單元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)單元數(shù)可以是2-10。在本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)中，這些結(jié)構(gòu)單元可以連續(xù)地或非連續(xù)地重復(fù)。也就是說它們可以通過生物化學(xué)性質(zhì)的連接物，例如通過一種或多種氨基酸，或通過化學(xué)性質(zhì)的連接物被分隔。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有每當(dāng)量核酸為0.01-20當(dāng)量的添加劑(摩爾/摩爾)，更優(yōu)選地是0.5-5。
在特別有利的實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物還含有能夠使核酸轉(zhuǎn)移定向的靶向元件。這種靶向元件可以是能夠使DNA轉(zhuǎn)移定向到某些細(xì)胞類型或某些所希望的組織(腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、生血細(xì)胞)的細(xì)胞外靶向元件。還可能涉及能夠使核酸轉(zhuǎn)移定向到某些特定的細(xì)胞區(qū)(線粒體、核等)的細(xì)胞內(nèi)靶向元件。靶向元件可以與本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移劑連接，或還可以與如前面所提到的核酸連接。
在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用的靶向元件中，可以列舉糖、肽、蛋白、寡核苷酸、脂類、神經(jīng)介質(zhì)、激素、維生素或它們的衍生物。優(yōu)選地，涉及糖、肽或蛋白質(zhì)，如抗體或抗體片段、細(xì)胞受體配體或它們的片段、受體或受體片段等。具體地，可能涉及生長因子受體的配體、細(xì)胞因子受體的配件、細(xì)胞凝集素類受體的配體，或具有RGD序列且對如整聯(lián)蛋白之類的粘合蛋白受體有親合性的配體。還可以列舉轉(zhuǎn)鐵蛋白、HDL和LDL的受體，或葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體。靶向元件還可以是能夠靶向于凝集素如脫唾液酸糖蛋白受體或syalydes受體的糖，像sialydeLewis X，或?yàn)榭贵w的片段Fab、或單鏈抗體(ScFv)。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如采用與憎水部分偶合，或與本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑與核酸相互作用的部分偶合，或者與本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑或與核酸相互作用的基團(tuán)偶合，使靶向元件與核酸脂類復(fù)合物結(jié)合。根據(jù)優(yōu)選方式，上述相互作用可以是離子性的或共價(jià)性的。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是如上述定義的化合物用于細(xì)胞中核酸(更一般地多陰離子)轉(zhuǎn)移的用途。
對于體內(nèi)應(yīng)用，例如研究基因調(diào)節(jié)、建立動(dòng)物疾病模型或在治療中，本發(fā)明的組合物可以根據(jù)局部、皮膚、口服、直腸、陰道、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)皮的、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)等用藥途徑而配制。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物含有在注射劑中、具體地直接注射到所要求器官中時(shí)、或采用局部方法(在皮膚和/或粘膜上)用藥時(shí)在藥學(xué)上可接受的賦形劑。具體地可能涉及滅菌的等滲溶液，或干組合物，特別是凍干組合物，根據(jù)情況通過添加無菌水或生理血清，上述組合物能夠制成可注射溶液。注射時(shí)所使用核酸的劑量以及用藥次數(shù)可以根據(jù)不同的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，特別是根據(jù)所使用的用藥方式、涉及的疾病、待表達(dá)基因、或?qū)で蟮闹委煏r(shí)間。更具體地關(guān)于用藥方式，可能是直接注入組織中，例如注入腫瘤中或血液循環(huán)途徑中，或者處理培養(yǎng)細(xì)胞接著采用注射或移植術(shù)再植入體內(nèi)。在本發(fā)明范圍內(nèi)有關(guān)組織與血液循環(huán)途徑例如是肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心、淋巴、血液、骨、軟骨、胰、腎、膀胱、胃、腸、睪丸、卵巢、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺、結(jié)締組織等。
本發(fā)明還涉及向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如前面定義的轉(zhuǎn)移劑接觸形成復(fù)合物，和(2)讓細(xì)胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
可以通過與所述的復(fù)合物一起培養(yǎng)細(xì)胞(對于體外或離體的應(yīng)用)或通過在器官中注射復(fù)合物(對于體內(nèi)的應(yīng)用)使細(xì)胞與復(fù)合物進(jìn)行接觸。優(yōu)選地，在例如每106細(xì)胞為0.01-1000微克的核酸存在下進(jìn)行培養(yǎng)。對于體內(nèi)用藥，例如可以使用的核酸劑量是0.01-10毫克。
在本發(fā)明的組合物還含有一種或多種如前面定義的添加劑和/或靶向元件的情況下，這一種或多種添加劑和/或靶向元件預(yù)先與本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑混合或與核酸混合。
本發(fā)明因此提供一種核酸轉(zhuǎn)移、特別是治療疾病的特別有利的方法，該方法包括在體外、體內(nèi)或離體下在上述定義的條件下施用與通式(I)轉(zhuǎn)移劑結(jié)合的能減輕所述疾病的核酸。更具體地，這種方法可用于因缺少蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)品而造成的疾病，使用的核酸編碼所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，或轉(zhuǎn)錄成核酸產(chǎn)品，或構(gòu)成所述的核酸產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明通式(I)轉(zhuǎn)移劑在體內(nèi)、離體或體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞方面的任何應(yīng)用。
本發(fā)明的化合物特別地可用于核酸向初級細(xì)胞中或向穩(wěn)定細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)移?？赡苌婕俺衫w維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元、星形細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞系(淋巴細(xì)胞、CD34、樹狀細(xì)胞等)、上皮細(xì)胞等，它們呈分化或多能(前體)形式。
除了前面說明的方案外，本發(fā)明還包括由下面實(shí)施例與附圖得出的其他特征與優(yōu)點(diǎn)，而這些實(shí)施例應(yīng)認(rèn)為是說明本發(fā)明而不限制其保護(hù)范圍。


圖1/15本發(fā)明化合物1的合成流程圖。
圖2/15在沒有血清蛋白的情況下，測定了在NIH3T3，HepG2和HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物1在體外的轉(zhuǎn)染效率，還與其胺同系物(RPR120535)作了比較。
關(guān)于“胺同系物”，應(yīng)當(dāng)理解是除脒官能和/或胍官能團(tuán)被氨基官能團(tuán)取代之外相同的陽離子脂類。
在橫軸上的不同電荷比下進(jìn)行了測定?？v軸為熒光素酶的表達(dá)，以每個(gè)孔的RLU(相對光單位)表示。
圖3/15沒有(白色條)與有(黑色條)血清蛋白的情況下，測定了在NIH3T3，HepG2和HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物1在體外的轉(zhuǎn)染效率，還與其胺同系物(RPR120535)作了比較。
在橫軸上的不同電荷比下測定?？v軸為熒光素酶的表達(dá)，以每個(gè)孔的RLU(相對光單位)表示。
圖4/15在沒有血清蛋白的情況下，測定了在HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物2在體外的轉(zhuǎn)染效率。對呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物2進(jìn)行了測定。
橫軸表示陽離子脂類與DNA所生成復(fù)合物的電荷比?？v軸是以pg/孔表示的熒光素酶的表達(dá)。每個(gè)孔有100 000個(gè)細(xì)胞。
圖5/15在沒有血清蛋白的情況下，測定了在HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物3在體外的轉(zhuǎn)染效率。對呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物3進(jìn)行了測定。
橫軸表示陽離子脂類與DNA所生成復(fù)合物的電荷比?？v軸是以pg/孔表示的熒光素酶的表達(dá)。每個(gè)孔有100 000個(gè)細(xì)胞。
圖6/15在沒有血清蛋白的情況下，測定了在HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物5在體外的轉(zhuǎn)染效率。對呈微團(tuán)形式和并與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物5進(jìn)行了測定。
橫軸表示陽離子脂類與DNA所生成復(fù)合物的電荷比。縱軸是以pg/孔表示的熒光素酶的表達(dá)。每個(gè)孔有100 000個(gè)細(xì)胞。
圖7/15在沒有血清蛋白的情況下，測定了在HeLa細(xì)胞中本發(fā)明化合物6在體外的轉(zhuǎn)染效率。對呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物6進(jìn)行了測定。
橫軸表示陽離子脂類與DNA所生成復(fù)合物的電荷比。縱軸是以pg/孔表示的熒光素酶表達(dá)。每個(gè)孔有100 000個(gè)細(xì)胞。
圖8/15這些表表明了根據(jù)電荷比與化合物2生成的核酸脂類復(fù)合物所處的物理-化學(xué)相(A、B或C相)，與其胺化類似物比較。
測定了呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物2及其胺同系物的相。
比較2個(gè)表后，觀察到在化合物2的情況下不穩(wěn)定相B向較低電荷比的方向移動(dòng)。
圖9/15這些表表明了根據(jù)電荷比與化合物3生成的核酸脂類復(fù)合物所處的物理-化學(xué)相(A、B或C相)，與其胺類似物比較。
測定了呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物3及其胺同系物的相。
比較2個(gè)表后，觀察到在化合物3的情況下不穩(wěn)定相B向較低電荷比的方向移動(dòng)。
圖10/15這些表表明了根據(jù)電荷比與化合物5生成的核酸脂類復(fù)合物所處的物理-化學(xué)相(A、B或C相)，與其胺化類似物比較。
測定了呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物5及其胺同系物的相。
比較2個(gè)表后，觀察到在化合物5的情況下不穩(wěn)定相B向較低電荷比的方向移動(dòng)。
圖11/15這些表表明了根據(jù)電荷比與化合物6生成的核酸脂類復(fù)合物所處的物理-化學(xué)相(A、B或C相)，與其胺化類似物比較。
測定了呈微團(tuán)形式和與中性輔脂類(DOPE與膽固醇)結(jié)合的化合物6及其胺同系物的相。
經(jīng)比較2個(gè)表后，觀察到在化合物6的情況下不穩(wěn)定相B向較低電荷比的方向移動(dòng)。
圖12/15這些表說明了呈微團(tuán)形式的化合物2、3、5和6在加溴圖12/15這些表說明了呈微團(tuán)形式的化合物2、3、5和6在加溴化乙錠之后的熒光降低。被脂類取代的DNA的溴化乙錠是與DNA連結(jié)的指示。只有DNA時(shí)所得到的熒光定為100％。
圖13/15這些表說明了在膽固醇存在下，化合物2、3、5和6在加溴化乙錠之后熒光降低。被脂類取代的DNA的溴化乙錠是與DNA連結(jié)的指示。只有DNA時(shí)所得到的熒光定為100％。
圖14/15這些表說明了在DOPE存在下，化合物2、3、5和6在加溴化乙錠之后熒光降低。被脂類取代的DNA的溴化乙錠是與DNA連結(jié)的指示。只有DNA時(shí)所得到的熒光定為100％。
圖15/15表示質(zhì)粒pXL3031。
縮寫與符號AcOEt乙酸乙酯BOC叔丁氧羰基BOP苯并三唑-1-氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽DDC二環(huán)己基碳化二亞胺DCU二環(huán)己基脲DIEAN-乙基二異丙胺DMAP4-二甲基氨基吡啶DMF二甲基甲酰胺DMSO二甲亞砜DODA雙十八烷基胺EP石油醚EtOH乙醇NEt3三乙胺Rf保留系數(shù)TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氫呋喃
UV紫外SPPS固相肽合成HPLC高壓液相色譜Z芐氧基羰基CIZ對氯芐氧基羰基化學(xué)合成用的材料與方法a)化合物-為了獲得支化多胺，其原料多胺可從市場上購買到，例如亞精胺、精胺、三-(2-氨基乙基)胺、苯二胺、二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)，或可以采用通常的方法合成得到，例如在市場上購買到的胺經(jīng)氰乙基化作用得到，所述的胺為如二氨基乙烷(丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)胺、亞精胺、精胺。
-使用的聚合物是市場上可購買到的固相肽合成(Merrifield合成)用的樹脂，特別是O-氯代三苯甲基氯化物樹脂、HMP樹脂，它們提供有游離酸官能團(tuán)的產(chǎn)品，或Rink類樹脂。多氨基酸可以直接地用在固相上預(yù)合成的、帶溴烷基官能團(tuán)或w-醛酸的肽合成得到。
-雙十八烷基胺、三乙胺、三氟乙酸、BOP、DMAP、氯代甲酸芐基酯是市售的產(chǎn)品。NaCl與NaHCO3溶液是飽和溶液，KHSO4溶液是0.5M。
b)物理測定質(zhì)子NMR譜用Bruker 400與600MHZ光譜儀記錄。
用API-MS/II測定質(zhì)譜(MS)。
c)純化與分析技術(shù)a)正相色譜條件-用厚度為0.2毫米的Merck硅膠板進(jìn)行了薄層色譜分析(TLC)。
在UV(254nm)下顯示，或?qū)τ诎坊蝓０肥褂密崛@色，即在150℃加熱蒸去(輕微噴灑)茚三酮乙醇溶液(40毫克/100毫升EtOH)，對于伯胺使用熒光胺顯色，即蒸發(fā)溶液(40毫克/100毫升丙酮)，或在碘中通過形成碘粉斑而顯色。
-用粒度0.063-0.200毫米的60 Merck硅膠進(jìn)行了正相柱色譜分析。
b)分析性色譜技術(shù)使用Merck-Hitachi儀進(jìn)行了分析性HPLC(高效液相色譜)，該儀器配置了D 2500 HITACHI積分-計(jì)算器、AS-2000A自動(dòng)取樣器、L-6200A智能泵和分析性分離時(shí)可調(diào)節(jié)波長至220 nm的L-4000紫外-可見光檢測器。用于分析性分離的柱是Perkin-Elmer的BU-300 aquaporeButyl 7m，300×4.6mm柱。流動(dòng)相是含有0.1％TFA的去離子水和含有0.1％TFA的乙腈。在100微升的環(huán)形閥中約1毫克/毫升溶液注入量是20微升。分析流量調(diào)節(jié)到1毫升/分。
分離條件溶劑A溶劑B去離子水 2500毫升HPLC用的乙腈2500毫升三氟乙酸2毫升三氟乙酸2.5毫升梯度
c)制備性色譜技術(shù)設(shè)備是一種能夠進(jìn)行UV測定的以梯度方式進(jìn)行液相色譜的組合裝置。該制備鏈由下述部分組成泵A配置50 SC頭的GILSON 305型。
泵B配置50 SC頭的GILSON 303型。
注射環(huán)配置25 SC頭的GILSON 303型。
注射環(huán)配置25 SC頭的GILSON 303型。
壓力組件GILSON 806型。
混合器配置23毫升頭的GILSON 811C型。
UV檢測器配置制備室的GILSON 119型。
級份收集器配置21號架的GILSON 202型。
積分儀SHIMADZU C-R6A型。
柱長為25厘米、直徑為2.2厘米的不銹鋼C4柱(10毫米)，由VYDAC公司以214 TP 1022型號銷售。
用注射泵以流量15毫升/分往柱中裝待純化產(chǎn)品的溶液。每30秒用一支管子收集洗脫液。將檢測器的波長調(diào)節(jié)為220nm和235nm。
流動(dòng)相以下述方式確定溶劑A 溶劑B去離子水 2500毫升HPLC用的乙腈2500毫升三氟乙酸2毫升 三氟乙酸2.5毫升梯度
d)固相肽合成技術(shù)(SPPS)在手工生產(chǎn)型SPPS肽合成手動(dòng)反應(yīng)器中進(jìn)行固相合成，攪拌器是Flask Shaker A5-6021型攪拌器。采用Kaiser[Kaiser，E.，Colescolt，D.L.Bossinger，C.D.和Cook，P.I.Anal.Biochem.34(2)，595(1970)]試驗(yàn)跟蹤多胺與固相連接過程及在SPPS中多胺的保護(hù)過程。在SPPS實(shí)施例中使用的樹脂是NOVABIOCHEM的“Chlorotrityl chloride Resin”(氯代三苯甲基氯化物樹脂)。
實(shí)施例實(shí)施例1從化合物RPR 120535(其制備方法在作為參考文獻(xiàn)列出的WO 97/18185專利申請中描述過)合成化合物1(N-雙十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基氨基]-丙基氨基}-乙酰胺)。
在附圖的圖1/15中列出了合成步驟。
將0.784毫摩爾RPR 120535溶解于25毫升甲醇中，該甲醇裝在配有磁棒的燒杯中。往這種溶液添加10.21毫摩爾三乙胺TEA。然后，緩慢地(5分鐘)往這種混合物倒入1.173毫摩爾O-甲基異脲/硫酸(H2SO4)在9毫升水中的溶液。在倒完之后，出現(xiàn)混濁。該混合物保持在40℃達(dá)16小時(shí)，然后將溶液蒸發(fā)至干。得到的產(chǎn)物再用制備性HPLC進(jìn)行純化。將有用的級份合并并凍干。
得到0.157毫摩爾成鹽的化合物1，即產(chǎn)率為20.1％。
HPLC分析Rt＝14.94分。
1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm為單位)0.86(t，J＝7Hz，6H脂肪鏈的CH3)，1.24(mt，60H脂肪鏈中心的(CH2)15)；1.43和1.53(2mt，每個(gè)2H每個(gè)脂肪鏈的1CH2)；1.63(mt，4H丁基中心的(CH2)2)；1.81和1.96(2mt，每個(gè)2H丙基中心的CH2)；2.85-3.10與3.22(2mt，共16H丁基的NCH2-丙基NCH2與脂肪鏈的NCH2)；3.81(寬s，2HNCH2CON)；4.03(d，J＝4.5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.32-7.97-8.62-8.75和9.02(分別為mf-t-t-mf與mf；H相應(yīng)于可交換的質(zhì)子)。
MH+＝863。
實(shí)施例2從化合物RPR 120527(其制備方法在作為參考文獻(xiàn)列出的WO 97/18185專利中請中描述過)合成化合物2(2-{2-[雙-(2-胍基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-N，N-雙十八烷基-乙酰胺)。
將48微摩爾RPR 120527溶解于10毫升甲醇中，然后，添加85微升DIEA(10當(dāng)量)和32毫克1，3-雙-(叔丁氧基羰基)-2-甲基-2-硫代假脲(2.3當(dāng)量)。采用HPLC跟蹤該反應(yīng)。在24小時(shí)之后，蒸去溶劑，往得到的殘余物添加20毫升TFA/二氯甲烷溶液(以體積計(jì)為1∶1)。在真空下蒸發(fā)之后，其殘余物用制備/性HPLC進(jìn)行純化。將有用的級份混合，在液氮中冷凍，再凍干。
這樣得到0.035毫摩爾化合物2，即產(chǎn)率為73％。
分析性HPLCRt＝16.20分。
1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm為單位)0.9(m∶6H∶CH3)，1.2(m∶60H∶CH2)，1.6(m∶4H∶CH2CH2N)，2.7-2.9(m∶6H∶CH2N(CH2)2)，3.0(m∶2H∶CH2CH2N(CH2)2)，3.2(m∶8H∶CH2N)，3.8(m∶4H∶CH2NCOCH2N)。
MH+＝793。
實(shí)施例3從化合物RPR 122766(其制備方法在作為參考文獻(xiàn)列出的WO 97/18185專利申請中描述過)合成化合物3(N-雙十四烷基氨基甲?；谆?2-{3-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基氨基]-丙基氨基}-乙酰胺))。
將0.784毫摩爾RPR 122766溶解于25毫升甲醇中，該甲醇裝在配有磁棒的燒杯中。往這種溶液添加10.21毫摩爾三乙胺TEA。然后，緩慢地(5分鐘)往這種混合物倒入1.173毫摩爾O-甲基異脲/硫酸(H2SO4)在9毫升水中的溶液。在倒完之后，出現(xiàn)混濁。該混合物保持在40℃達(dá)16小時(shí)，然后將溶液蒸發(fā)至于。得到的產(chǎn)物再用制備性HPLC進(jìn)行純化。將有用的級份合并并凍干。
這樣得到0.2289毫摩爾化合物3，即產(chǎn)率為29％。
分析性HPLCRt＝9.8分。
1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm為單位)0.87(t，J＝7Hz，6H脂肪鏈的CH3)，1.15-1.40(mt，44H脂肪鏈中心的(CH2)11)；1.46和1.55(2mt，每個(gè)2H每個(gè)脂肪鏈的1CH2)；1.63(mt，4H丁基中心的(CH2)2)；1.81和1.95(2mt，每個(gè)2H丙基中心的CH2)；2.85-3.10(mt，10H丁基的2NCH2-2個(gè)丙基之一的2NCH2-另一個(gè)丙基的2NCH2中的一個(gè))；3.15-3.25(mt，6H另一個(gè)丙基的另一NCH2和脂肪鏈的NCH2)；3.82(mf，2HNCH2CON)；4.04(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.00-7.60-8.60-8.75和9.00(分別為扁平的mf與2mf，3H-5H與2HNH3+CF3COO--NH2+CFCOO-與＝NH)；7.78(寬t，J＝5.5Hz，1HN＝CNH)；8.65(mf相應(yīng)于CONH的1H).
MH+＝751。
實(shí)施例4化合物4(2-{2-[雙-(2-胍基-乙基)-氨基]-乙基氨基}-N-雙十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)的合成步驟A將過量10摩爾的三(氨基乙基)胺溶于50毫升二氯甲烷中，再將這種溶液加到裝有溴代乙酰(氯)三苯甲基樹脂(預(yù)先通過溴代乙酸與氯代三苯甲基樹脂反應(yīng)得到)的反應(yīng)器中。該反應(yīng)器在室溫下攪拌2小時(shí)，過濾溶劑，樹脂每次用50毫升二氯甲烷和異丙醇洗滌10次。Kaiser試驗(yàn)是陽性的。
步驟B得到的樹脂與溶于二氯甲烷的過量10當(dāng)量的1，3-雙-(叔丁氧基羰基)-2-甲基-e-硫代假脲在攪拌下接觸24小時(shí)，過濾掉溶劑，樹脂每次用50毫升二氯甲烷和異丙醇洗滌10次。冷卻3分鐘的Kaiser試驗(yàn)是陰性的。
步驟C將50毫摩爾DIEA溶于50毫升二氯甲烷中，再將混合物加到裝有在步驟B所得到的產(chǎn)物的反應(yīng)器中。然后，倒入48毫摩爾二碳酸二叔丁酯。反應(yīng)器攪拌一夜。次日，Kaiser試驗(yàn)是陰性的。過濾掉溶劑，樹脂每次用50毫升二氯甲烷和異丙醇洗滌10次，50毫升甲醇2次和50毫升醚2次，樹脂再在氮?dú)饬飨赂稍?。Kaiser試驗(yàn)總是陰性的。
步驟D將在步驟C所得到的樹脂加到配有磁棒的250毫升燒瓶中。往其加入由50毫升二氯甲烷與25毫升1，1，1-三氟乙-2-醇組成的溶液，將該混合物攪拌2小時(shí)。過濾溶液，樹脂每次用10毫升二氯甲烷洗滌2次。合并這樣得到的有機(jī)相，并在真空下蒸發(fā)。產(chǎn)物再采用硅膠純化(洗脫劑∶氯仿/甲醇，以體積計(jì)為8∶2)。合并有用的級份，然后在真空下蒸發(fā)得到168毫克具有下述結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物
即產(chǎn)率為20％。
TLCRf＝0.9MH+＝789。
步驟E將9毫摩爾Boc-甘氨酰-二-十四烷基胺加入有磁棒的燒瓶中。加入溫度為4℃的30毫升三氟乙酸。將該溶液攪拌一小時(shí)，在真空下蒸去TFA。所得到的產(chǎn)物重新用70毫升DMF溶解，然后加入30毫摩爾TEA與9毫摩爾前面所得到的酸。將其pH調(diào)節(jié)到10，添加33毫摩爾BOP。攪拌該溶液2小時(shí)，并采用TLC跟蹤。當(dāng)完成連接時(shí)，添加700毫升硫酸鉀溶液，再每次用100毫升乙酸乙酯提取產(chǎn)物3次。有機(jī)相每次用50毫升硫酸鉀洗滌3次，50毫升碳酸鈉3次，及50毫升氯化鈉3次。然后有機(jī)相用硫酸鎂進(jìn)行干燥，過濾與真空蒸發(fā)。所得到的產(chǎn)物用NMR、TLC及MS進(jìn)行分析，并用50毫升TFA去保護(hù)，TFA添加到?jīng)]有預(yù)先純化的所得到的產(chǎn)物中。然后攪拌該溶液1.5小時(shí)。最后，蒸去TFA，最后的產(chǎn)物用半制備性HPLC進(jìn)行純化。
最后得到8.1毫摩爾化合物4，即這個(gè)最后步驟的產(chǎn)率為90％。
分析性HPLCRt＝11.4分1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，δ以ppm為單位)0.89(t，J＝7Hz，6H脂肪鏈的CH3)，1.15-1.35(mt，44H脂肪鏈中心的(CH2)11)；1.45和1.54(2mts，每個(gè)2H每個(gè)脂肪鏈的1CH2)；2.65-2.78-3.06與3.23(分別t，J＝6.5Hz-寬t，J＝6,5Hz-mf與mt，分別4H-2H-2H與8HNCH2CH2N-2NCH2CH2NC＝N與脂肪鏈的NCH2)；3.83(寬s，2HNCH2CON)；4.04(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；7.34(扁平mf，＝NH與NH2)；7.61(t，J＝5.5Hz，2HNH)；8.65(t，J＝5Hz，1HNH)；8.75(mfNH)。
MH+＝737。
步驟E中使用的甘氨酰-二-十四烷基胺預(yù)先由下述方法得到將10毫摩爾用取代基Boc保護(hù)的甘氨酸與10毫摩爾二-十四烷基胺加到250毫升燒瓶中。往其加入100毫升氯仿，攪拌混合物直到完全溶解。然后加入30毫摩爾TEA與33毫摩爾BOP。借助三乙胺將pH保持在10。攪拌反應(yīng)2小時(shí)。當(dāng)用TLC跟蹤反應(yīng)完成時(shí)，蒸去氯仿。得到的固體再溶于300毫升乙酸乙酯中，有機(jī)相再每次用100毫升硫酸鉀洗滌4次，100毫升碳酸鈉4次及100毫升氯化鈉4次。然后有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾與真空蒸發(fā)。所得到的產(chǎn)物采用TLC、NMR與MS分析，不經(jīng)其他純化便可使用。
實(shí)施例5化合物5(N-雙十四烷基氨基甲?；谆?2-{(3-胍基-丙基)-[4-(3-胍基-丙基氨基)-丁基]-氨基}-乙酰胺)的合成與前面化合物4的同樣方法進(jìn)行操作，但是用精胺作為原料多胺得到具有下述結(jié)構(gòu)的酸
在從樹脂上裂解之后，這種殘留物用硅膠進(jìn)行純化(洗脫劑∶氯仿/甲醇，以體積計(jì)為8∶2)。將有用的級份混合起來，然后在真空下蒸發(fā)，得到0.69毫摩爾所述的分子，即產(chǎn)率為50％。
TLCRf＝0.5。
MH+＝845。
將前面合成的酸與根據(jù)與實(shí)施例4描述的同樣方法得到的甘氨酰-雙十四烷基胺連接得到化合物5。甘氨酰-雙十四烷基胺還可以用與前面同樣的方法得到。
這樣得到0.65毫摩爾化合物5，即這個(gè)步驟的產(chǎn)率為94％。
分析性HPLCRt＝10.1分。
1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，溫度為393K，δ以ppm為單位)0.92(t，J＝7Hz，6H脂肪鏈的CH3)；1.25-1.45(mt，44H脂肪鏈中心的(CH2)11)；1.57(mt，4H丁基中心的2CH2)；1.57與1.67(2mt，每個(gè)2H每個(gè)脂肪鏈的1CH2)；1.74與1.91(2mt，每個(gè)2H丙基中心的CH2)；2.62-2.85與3.20-3.35(3mt，共16HNCH2-、CH2NC＝N與脂肪鏈的NCH2)；3.17(s，2HNCH2CON)；4.02(d，J＝5Hz，2H甘氨酰的CONCH2CON)；6.89與7.30-7.55和7.65(分別mf-扁平的mf與mf可交換的H)。
MH+＝845。
實(shí)施例6化合物6(2-{(3-[{4-[雙-(3-胍基-丙基)-氨基]-丁基}-(3-胍基-丙基)-氨基]-丙基氨基}-N-雙十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)的合成以與前面化合物4和5同樣的方式操作，但是用N，N，N′，N′-(四氨基丙基)丁二胺作為原料多胺得到具有下述結(jié)構(gòu)的酸
在從樹脂上裂解之后，得到的殘留物用硅膠進(jìn)行純化(洗脫劑∶氯仿/甲醇，以體積計(jì)為8∶2)。將有用的級份混合起來，然后在真空下蒸發(fā)，得到0.099毫摩爾產(chǎn)物，即產(chǎn)率為20％。
TLCRf＝0.3。
MH+＝1201。
將前面合成的酸和根據(jù)與實(shí)施例4描述的同樣方法得到的甘氨酰-雙十四烷基胺連接得到化合物6。甘氨酰-雙十四烷基胺還可以用與前面同樣的方法得到。
這樣得到0.09毫摩爾化合物6，即這個(gè)步驟的產(chǎn)率為90％。
分析性HPLCRt＝11.2分。
1H NMR譜(400MHz，(CD3)2SO d6，添加幾滴CD3COODd4，δ以ppm為單位)0.87(t，J＝7Hz，6H脂肪鏈的CH3)；1.20-1.40(mt，44H脂肪鏈中心的(CH2)11)；1.45與1.54(2mt，每個(gè)2H每個(gè)脂肪鏈的1CH2)；1.67(mt，4H丁基中心的CH2)；1.80-2.10(mt，8H丙基中心的CH2)；2.95-3.30(mt，20H丙基的NCH2與丁基的NCH2)；3.15-3.30(mt，4H脂肪鏈的NCH2)；3.84(s，2HNCH2CON)；4.05(s，2H甘氨酰的CONCH2CON)。
MH+＝949。
實(shí)施例7化合物1在遺傳物質(zhì)體外轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用使用的遺傳物質(zhì)使用的核酸是pXL2774質(zhì)粒(WO 97/10343)，它包含在人的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的熒光素酶編碼基因。
核酸溶液在生理血清中(氯化鈉0.15M NaCl)稀釋到20微克/毫升。
轉(zhuǎn)染溶液(臨時(shí)制備)將本發(fā)明中描述的產(chǎn)品制成水溶液，濃度為60-240μM，與DNA溶液以等體積比混合。最后的鹽濃度是75mM。
轉(zhuǎn)染在24孔(2平方厘米/孔)微板中在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長階段并融合達(dá)50-70％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
這些細(xì)胞每次用500微升貧含血清蛋白的介質(zhì)洗滌2次，然后，或者在無血清培養(yǎng)基中[在沒有血清的情況下轉(zhuǎn)染]，或者在完全培養(yǎng)基中[在血清存在的情況下轉(zhuǎn)染]再進(jìn)行生長。將50微升轉(zhuǎn)染混合物[即0.5微克DNA/孔]加到細(xì)胞中[3個(gè)孔/載體-DNA條件]。當(dāng)在沒有血清存在的情況下細(xì)胞被轉(zhuǎn)染時(shí)，在轉(zhuǎn)染2小時(shí)后生長培養(yǎng)基中要補(bǔ)充適當(dāng)量的血清。
根據(jù)Promega試劑盒[熒光素酶檢測系統(tǒng)]所給出的使用說明，通過測定熒光素酶的表達(dá)可評價(jià)轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后的轉(zhuǎn)染效率。通過測定細(xì)胞溶胞裂解物中蛋白濃度可估算出轉(zhuǎn)染混合物的毒性。
結(jié)果使用化合物1作為DNA載體轉(zhuǎn)染三種不同細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞與HeLa細(xì)胞，與RPR 120535陽離子脂類(TFA鹽)[作為參考文獻(xiàn)列入的WO 97/18185專利申請中描述的]進(jìn)行比較。對于這三種細(xì)胞，我們未發(fā)現(xiàn)如實(shí)施例1中所述制備的化合物1有顯著的毒性。在三種細(xì)胞中化合物1與對比陽離子脂類的轉(zhuǎn)染效率示于圖2/15中，化合物納摩爾/DNA微克之比為3-12。
由圖2/15可以得出，對于NIH3T3細(xì)胞，陽離子脂類納摩爾/DNA微克之比為6時(shí)，對于HeLa細(xì)胞與HepG2細(xì)胞，陽離子脂類納摩爾/DNA微克之比為9時(shí)，可達(dá)到最大的轉(zhuǎn)染效率。對于在沒有血清情況下的轉(zhuǎn)染，在HeLa細(xì)胞與HepG2細(xì)胞中達(dá)到的表達(dá)水平，化合物1比對比試驗(yàn)產(chǎn)品高2-4倍。
圖3/15表示了化合物1/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，還與前面描述的同樣的陽離子脂類(RPR120535)與DNA的復(fù)合物進(jìn)行比較。白色條表示在沒有血清存在下在2小時(shí)內(nèi)核酸脂類復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。黑色條表示在血清存在下核酸脂類復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。
由圖3/15因此可以證明本發(fā)明轉(zhuǎn)移劑的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，觀察到在有或沒有血清蛋白時(shí)的轉(zhuǎn)染水平在本發(fā)明化合物1的情況下都是相同的，而使用對比的陽離子脂類，觀察到因血清蛋白存在而受到強(qiáng)烈的抑制。這對于體內(nèi)轉(zhuǎn)染來說是一個(gè)特別有意義的性質(zhì)。
實(shí)施例8化合物2、3、5和6在遺傳物質(zhì)體外轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用使用的遺傳物質(zhì)使用的核酸是pXL3031質(zhì)粒，它包含在人的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下熒光素酶編碼基因。該pXL3031質(zhì)粒示于圖15/15。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方案，特別是根據(jù)Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.和Sambrook，分子生物學(xué)方法實(shí)驗(yàn)室手冊，1982年，第83-94頁，Cold Spring Harbor Lab.，NY.的方案分離該質(zhì)粒。
更具體地，使用的方法是堿溶胞方法和氯化銫梯度純化方法。
轉(zhuǎn)染
在24孔微板中在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)這些細(xì)胞。在生長一夜之后，每個(gè)孔含有約100 000個(gè)細(xì)胞。
在每個(gè)孔中，加入轉(zhuǎn)染混合物，該混合物含有在0.5毫升DMEM中的1微克DNA，沒有血清。在轉(zhuǎn)染之后5小時(shí)，往生長培養(yǎng)基中補(bǔ)充適當(dāng)量的血清(DMEM與10％牛胎血清)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后回收細(xì)胞裂解產(chǎn)物，根據(jù)Promega試劑盒[熒光素酶檢測試劑盒]所給出的使用說明，通過測定熒光素酶的表達(dá)可評價(jià)轉(zhuǎn)染效率。
結(jié)果在圖4/15、5/15、6/15與7/15中示出了轉(zhuǎn)染水平。
每次測定呈微團(tuán)形式和與輔脂類(DOPE或膽固醇)混合物形式的質(zhì)類轉(zhuǎn)染效率。由這些表可以得出，轉(zhuǎn)染水平是非常高的，甚至電荷比非常低時(shí)也是如此，由此得出在毒性方面有益的結(jié)果。這是本發(fā)明化合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，使用不含有脒官能團(tuán)的陽離子脂類，為達(dá)到這樣的轉(zhuǎn)染水平往往必需將電荷比調(diào)到更高，這樣一般會(huì)引起毒性增高。
實(shí)施例9化合物2、3、5和6對DNA親和力的研究如前面實(shí)施例所描述的，使用的核酸是pXL3031質(zhì)粒。
在濃度為0.25毫克DNA/毫升下，根據(jù)所要求的電荷比，使用適當(dāng)量的如本發(fā)明所定義的脂類制備復(fù)合物。在含有5％葡萄糖和20mM氯化鈉溶液的介質(zhì)中制備該復(fù)合物。然后將50微升核酸脂類復(fù)合物稀釋在950微升含有5％葡萄糖和20mM氯化鈉溶液的溶液中，稀釋20倍。
復(fù)合物的尺寸可借助Coulter N4+儀器通過光的動(dòng)力學(xué)散射測定流體動(dòng)力學(xué)直徑而得出。
對于所有的化合物，根據(jù)電荷比證明了3種不同的物理-化學(xué)相-A相，其中DNA未被陽離子脂類飽和，即在混合物中還有裸露的DNA，這意味著DNA沒有完全地被脂類保護(hù)，因此可能被酶降解。所生成的復(fù)合物總體上為負(fù)電荷，這樣使其難以通過細(xì)胞膜。因此優(yōu)選的是DNA轉(zhuǎn)染不應(yīng)處在這個(gè)區(qū)域。
-B相，其中DNA完全被陽離子脂類飽和，復(fù)合物總體上是中性的或稍微陽性。由于離子排斥作用最大，這個(gè)相是不穩(wěn)定的?？赡艹霈F(xiàn)“交聯(lián)”現(xiàn)象，因此導(dǎo)致復(fù)合物沉淀。處于這種狀態(tài)的復(fù)合物因此不可能在注射中使用。
-C相，其中DNA被脂類過飽和，因此復(fù)合物總體上是陽性的。這樣DNA完全被脂類保護(hù)了，它通過細(xì)胞膜(總體上為負(fù)電荷)是較容易的。因此C相的復(fù)合物特別適合在細(xì)胞中核酸轉(zhuǎn)移的應(yīng)用。
這些表明各相的表在圖8/15、9/15、10/15與11/15中示出，表明復(fù)合物根據(jù)電荷比不同所處的相。
圖8/15、9/15、10/15與11/15中的這些表，根據(jù)電荷比比較了本發(fā)明化合物和它們的胺類似物，胺類似物即為脒官能團(tuán)或胍官能團(tuán)被氨基官能團(tuán)取代的陽離子脂類?？煽吹紹相向電荷比低得多的方向移動(dòng)。這樣，在陽離子頭上加入脒官能團(tuán)可使化合物對DNA的親和力增加作出貢獻(xiàn)。這是本發(fā)明化合物的一個(gè)重要性質(zhì)，因?yàn)榕cDNA生成的復(fù)合物可以在C相中使用，而對此并不必定位在非常高的電荷比，由此得到在毒性方面有益的效果。
還可以通過在添加溴化乙錠之后測定熒光降低來評價(jià)本發(fā)明化合物對DNA的親和力。事實(shí)上，用脂類取代DNA的溴化乙錠是一種與DNA結(jié)合的指示。
這樣，往制備的復(fù)合物中添加4微升1毫克/毫升溴化乙錠溶液，然后在激發(fā)波長260nm處和發(fā)射波長590nm處測定熒光。僅有DNA時(shí)所得到的熒光規(guī)定為100％。
在圖12/15、13/15與14/15的表中列出了這些結(jié)果。這些結(jié)果表明本發(fā)明的化合物對DNA具有非常好的親和力，這是本發(fā)明化合物所具有的特別有意義的性質(zhì)。
權(quán)利要求
1.具有下述通式(I)的呈D、L或DL形式的脂多胺，以及它們的鹽
式中-R1、R2和R3各自代表氫原子或-(CH2)q-NRR′，其中·q是包括1和6在內(nèi)的1-6中的整數(shù)，q值在不同R1、R2和R3基團(tuán)之間是彼此不相關(guān)的，·R和R′各自代表氫原子或下述化學(xué)式(II)基團(tuán)
式中r是包括0和6在內(nèi)0-6中的整數(shù)，R5各自代表氫原子或烴殘基，條件是R1、R2和R3基團(tuán)中至少一個(gè)基團(tuán)含有至少一個(gè)化學(xué)式(II)基團(tuán)，-m和n各自代表包括1和6在內(nèi)的1-6中的整數(shù)，當(dāng)n大于1時(shí)，m可以取不同的值，而R3在通式(I)中可具有不同的含意，-p代表包括1和6在內(nèi)的1-6中的整數(shù)，以及-R4代表具有下述通式(III)的基團(tuán)
式中·R7和R8各自代表氫原子或親脂基團(tuán)，R7和R8基團(tuán)中至少一個(gè)基團(tuán)不是氫，·t是包括0和10在內(nèi)的0-10中的整數(shù)，當(dāng)t是大于1的整數(shù)時(shí)，R6、X、Y和s在不同的結(jié)構(gòu)單元[X-(CHR6)s-Y]中可以具有不同的含意，·X代表氧原子或硫原子，或氨基或烷基氨基，烷基取代基是直鏈或支鏈的并含有1-8個(gè)碳原子，·Y代表羰基或亞甲基，·R6代表氫原子或任選被取代的天然氨基酸側(cè)鏈，以及·s代表包括1和10在內(nèi)的1-10中的整數(shù)，并且當(dāng)s等于1時(shí)，R6代表任選被取代的天然氨基酸側(cè)鏈，當(dāng)s大于1時(shí)，R6代表氫原子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于在化學(xué)式(II)基團(tuán)中，R5是氫原子或任選鹵代的脂族或芳族烴殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其特征在于在化學(xué)式(II)中，其中一個(gè)R5基團(tuán)是氫原子，另一個(gè)是含有1-10個(gè)碳原子的脂族殘基，或優(yōu)選地選自芐基及其衍生物的芳族殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其特征在于在化學(xué)式(II)中，兩個(gè)R5基團(tuán)都是氫原子。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其特征在于當(dāng)R1、R2和/或R3不是氫并含有化學(xué)式(II)時(shí)，q的值為2或3，而r為0。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其特征在于在通式(I)中，m選自2、3和4。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其特征在于在化學(xué)式(III)中，R7和R8基團(tuán)中至少一個(gè)代表由一個(gè)或多個(gè)脂族脂肪鏈、類固醇衍生物、天然的或合成的脂類、或它們的組合構(gòu)成的親脂基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于親脂基團(tuán)為含有5-22個(gè)碳原子的飽和或未飽和的、直鏈或支鏈的任選被鹵代的脂族基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于親脂基團(tuán)為類固醇衍生物，該類固醇衍生物選自膽固醇、膽甾烷醇、3-α-5-環(huán)-5-α-膽甾烷-6-β-醇、膽酸、膽固醇甲酸酯、膽甾烷醇甲酸酯、3α-5-環(huán)-5α-膽甾烷-6-β-醇甲酸酯、膽甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基十六氫環(huán)戊二烯并[a]環(huán)丙并[2，3]環(huán)戊二烯并[1，2]萘-10-基胺，或膽甾烷基胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于親脂基團(tuán)為(CH2)u-NH-R9基團(tuán)，式中u是包括2和6在內(nèi)的2-6的整數(shù)，R9是酰基，例如膽固醇甲酸酯、花生四烯?；蚰懰?。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R7和R8兩個(gè)基團(tuán)都代表親脂基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于R7和R8兩個(gè)基團(tuán)都代表含有5-22個(gè)碳原子，優(yōu)選地12-22個(gè)碳原子的脂族鏈。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1含有化學(xué)式(II)的基團(tuán)，而R2和R3是氫原子。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R2每個(gè)都含有化學(xué)式(II)的基團(tuán)，而R3是氫原子。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R3每個(gè)都含有化學(xué)式(II)的基團(tuán)，而R2是氫原子。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1、R2和R3每個(gè)都含有化學(xué)式(II)的基團(tuán)。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其特征在于它與細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的靶向元件結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其特征在于它在R6氨基酸側(cè)鏈上加入靶向元件。
19.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其特征在于它在R6氨基酸側(cè)鏈上加入生物素、羅丹明、葉酸類標(biāo)記劑，或加入含有Arg-Gly-Asp表位的直鏈或環(huán)狀肽序列或假肽序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它選自下述化學(xué)式的化合物，式中R4和R5具有在權(quán)利要求1中所給出的意義
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它選自
化合物3
化合物4
化合物5
化合物6
22.含有上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的化合物及核酸的組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于它還含有一種或多種添加劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于添加劑是一種或多種中性脂類。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的組合物，其特征在于中性脂類是具有兩個(gè)脂肪鏈的脂類。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25之一所述的組合物，其特征在于中性脂類是在生理?xiàng)l件下為兩性離子或沒有離子電荷的天然或合成的脂類，它們例如選自二油?；字；掖及?DOPE)、油?；貦磅；字；掖及?POPE)、二硬脂?；?、二棕櫚?；?、二肉豆蔻?；字；掖及芬约八鼈兊?-3次N-甲基衍生物、磷脂?；视汀⒍；视?、糖基二酰基甘油、腦苷脂類(特別如半乳糖腦苷脂類)、鞘脂類(特別例如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(特別例如是脫唾液酸GM1和GM2)。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于添加劑是一種直接或非直接地參與核酸聚集的化合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-25所述的組合物，其特征在于所述的添加劑全部或部分來自魚精蛋白、組蛋白或核仁素和/或一種它們的衍生物，或全部或部分由肽結(jié)構(gòu)單元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)單元數(shù)可以是2-10，這些結(jié)構(gòu)單元可以連續(xù)地或非連續(xù)地重復(fù)。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于它還含有靶向元件。
30.根據(jù)權(quán)利要求22-29之一所述的組合物，其特征在于它還含有用于注射制劑的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求22-29之一所述的組合物，其特征在于它含有用于皮膚和/或粘膜施用的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-21之一所述的化合物的向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸的應(yīng)用。
33.如權(quán)利要求1-21所限定化合物的制備方法，其特征在于通過脲的硫代或氧代衍生物與脂多胺反應(yīng)生成脒基團(tuán)，或其特征在于通過肽偶聯(lián)在脂類上接枝多氨基脒。
34.向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，其特征在于該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如權(quán)利要求1-21中限定的化合物和必要時(shí)的一種或多種添加劑和/或靶向元件接觸，形成一種復(fù)合物，(2)讓細(xì)胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于細(xì)胞中轉(zhuǎn)移核酸的新化合物。更具體地,這些新化合物屬于脂多胺類,它們含有脒官能團(tuán)。這些化合物可用于向不同種類的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移目的核酸,在體外、在體內(nèi)或離體均可。
文檔編號C07C279/12GK1257480SQ9880547
公開日2000年6月21日 申請日期1998年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月28日
發(fā)明者G·柏克, C·都伯特萊特, D·舍曼 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司