專利名稱：含有志賀菌毒素和目的治療肽的嵌合多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于蛋白或多肽的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及某些表位的膜呈遞的物質(zhì)及其應(yīng)用。
逆向轉(zhuǎn)運(yùn)可定義為細(xì)胞膜分子向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RE)的行進(jìn)，有時(shí)經(jīng)過高爾基體。在幾類羧基末端帶有四肽KDEL(或在酵母中為HDEL)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白中證明了這種機(jī)制。生化和形態(tài)學(xué)證據(jù)都表明這些蛋白離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、到達(dá)高爾基體，在這里進(jìn)行糖鏈的修飾，然后再轉(zhuǎn)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。四肽KDEL是一種保留信號(hào)，它能捕捉在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與其結(jié)合的肽或蛋白，如Lewis M.J.等在《自然》(Nature)，348，(6297)1623，1990年11月8日中所述，這種捕捉是通過與基元KEDL的受體蛋白相互作用而發(fā)生的。
證明存在細(xì)胞內(nèi)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的另一些證據(jù)來自對(duì)某些細(xì)菌毒素的研究，它們?cè)谕ㄟ^內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后進(jìn)入真核細(xì)胞的胞質(zhì)中(Pelham等，1992，細(xì)胞生物學(xué)趨勢(shì)(Trends cell.Biol.)，2183-185)。經(jīng)研究的一個(gè)具體實(shí)例是痢疾志賀氏菌的志賀菌毒素(Shiga toxin)以及大腸桿菌的志賀菌型毒素。這些毒素是兩條多肽鏈的復(fù)合物，一條(A片段)是毒性片段并具有脫腺苷酶活性，它通過對(duì)28S核糖體RNA的作用抑制蛋白質(zhì)的合成，另一個(gè)亞單位(B片段)使毒素與其靶標(biāo)偶合(O’Brien等(1992)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.18065-94)。電子顯微鏡研究證明在A431細(xì)胞、Vero細(xì)胞、特別是Dandi細(xì)胞中可檢測(cè)到志賀菌毒素(Sandvig等，1992和1994；KHINE，1994)。另外，用一種真菌代謝物(其可造成高爾基體結(jié)構(gòu)的喪失)處理細(xì)胞可保護(hù)細(xì)胞抗志賀菌毒素，這也提示這些毒素在到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之前通過了高爾基體。Kim等(1996)最后證實(shí)這種毒素的B片段定位于高爾基體中。
在下列文獻(xiàn)中給出了對(duì)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、特別是志賀菌毒素B片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運(yùn)的認(rèn)識(shí)狀態(tài)Sandvig等(1992)，自然，358510-512，Sandvig等(1994)，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)12653-64；Kim等(1996)，細(xì)胞生物學(xué)雜志1341387-1399。
現(xiàn)將細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)定義為細(xì)胞不同區(qū)室間交換的總和。
本申請(qǐng)的作者發(fā)現(xiàn)，B片段不但向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)行進(jìn)，而且向造血細(xì)胞系、特別是樹狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核中行進(jìn)。
作者證明，將這些細(xì)胞在2微摩爾B片段-gly-KDEL如下文所述保溫3小時(shí)、然后固定，在這些細(xì)胞的核中、甚至在核仁中呈現(xiàn)抗該毒素的特異性抗體(結(jié)果未公開)，這清楚地表明存在該片段的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明源自對(duì)志賀菌毒素B片段(B片段)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的這些觀察結(jié)果，并利用其行進(jìn)特性構(gòu)建含有下列元件的嵌合多肽-與該片段或其任何功能等價(jià)物連接的目的治療肽或多肽，或-帶有欲表達(dá)序列的多核苷酸序列。B片段和多核苷酸序列的連接通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)、特別是Allinquant B.等在《細(xì)胞生物學(xué)雜志(Journal of Cell Biology)，1288(5)919-27，(1995)中描述的技術(shù)進(jìn)行。
除DNA分子或其他分子與B片段的共價(jià)連接外，這種連接可以借助于強(qiáng)的非共價(jià)相互作用來實(shí)現(xiàn)。例如，B片段的cDNA與鏈親和素或親和素的任何衍生物的cDNA融合，按已公開的方法進(jìn)行(Johannes等(1987)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，27219544-19561)。
可將融合產(chǎn)生的蛋白(B-鏈親和素)與利用生物素化引物經(jīng)PCR或用任何其他生物素化物質(zhì)獲得的生物素化DNA反應(yīng)。形成的復(fù)合物存在于靶細(xì)胞中并將如細(xì)胞內(nèi)B片段那樣被轉(zhuǎn)運(yùn)。
另一種連接方法求助于B片段的位點(diǎn)特異性生物素化步驟。為此，將B片段的cDNA與編碼酶BirA識(shí)別位點(diǎn)的cDNA融合(Boer等(1995)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacterial)，1772572-2575；Saou等(1996)，基因(Gene)，16959-64)。體外生素化后，通過鏈親和素或親和素的任何其他四價(jià)衍生物的作用B片段與生物素化的其他分子連接(如cDNA，見上文)。
功能等價(jià)物應(yīng)理解為通過突變、缺失或添加而衍生自B片段并具有B片段的行進(jìn)特性的任何序列。
廣義地講，功能等價(jià)物可由任何具有如對(duì)B片段所述的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)特性、甚至到達(dá)細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)特性的片段構(gòu)成。例如，可舉出美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proceedings of the National Academy of Science ofthe United States of America)，84(13)；4364-8(1987年7月)中描述的Vero細(xì)菌毒素的B片段，或Lamb F.I.等在《歐洲生物化學(xué)雜志》(European Journal of Biochemistry)，148(2)265-70(1995)中描述的蓖麻蛋白的B片段。在描述了這些片段轉(zhuǎn)運(yùn)的具體特性后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)選擇最好的這種片段作為將任何序列引入任何細(xì)胞腔室的載體。
因此，本發(fā)明包括以下片段的應(yīng)用志賀菌毒素的B片段、或具有相似活性的細(xì)菌毒素的任何其他亞單位，特別是具有與B片段類似的行進(jìn)特性的那些，其中包括模擬志賀菌毒素B片段的多肽。這些多肽、更廣地講這些功能類似物可通過篩選方法鑒定，篩選方法的共同原則是檢測(cè)隨機(jī)多肽序列和受體Gb3或該受體可溶類似物間的相互作用。例如，可利用表達(dá)隨機(jī)多肽序列的噬菌體文庫，用于在載有Gb3的親和柱上篩選，或在與Gb3的可溶性放射活性類似物雜交后進(jìn)行篩選。糖脂Gb3被鑒定為志賀菌毒素的細(xì)胞受體(Lingwood(1993)，Adv.Lipid Res.25189-211)。Gb3被對(duì)所述毒素敏感的細(xì)胞表達(dá)，該毒素的內(nèi)在化借助于與Gb3的相互作用進(jìn)行。本申請(qǐng)的發(fā)明人證明，在抑制了受體Gb3表達(dá)的Hela細(xì)胞中(圖1)A)，內(nèi)在化的B片段不轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，而在胞漿中泡囊結(jié)構(gòu)水平積累，主要由溶酶體代表。在對(duì)照細(xì)胞中，B片段被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體(圖1)B)。
該假說已通過生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)(圖2)，根據(jù)該假說，無Gb3時(shí)，B片段不再向生物合成或分泌的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。
發(fā)明人已證明，在受體Gb3的合成抑制劑PPNP存在下(+PPNP)，內(nèi)在化B片段的多達(dá)50％被以可溶性TCA物質(zhì)的形式降解，這與向外部降解腔室如內(nèi)體或溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)活性一致。由于受體Gb3的合成不被抑制(-PNPP)，內(nèi)在化B片段變?yōu)榭扇苄訲CA的比例要小得多。由此可以得出，受體Gb3對(duì)于將B片段投送至特定腔室是必需的，這支持這樣的觀點(diǎn)B片段活性的優(yōu)勢(shì)方面是與受體Gb3結(jié)合。
本發(fā)明的主題是嵌合的多肽序列，這些序列至少含有志賀菌毒素B片段或其功能性等價(jià)物，和與其羧基末端連接的一個(gè)或多個(gè)多肽X，相應(yīng)于下式B-X，其中-B代表志賀菌毒素樣毒素的B片段，其序列在N.G.Seidah等(1986)J.Biol.Chem.26113928-31和在Strockbine等(1988)，細(xì)菌學(xué)雜志，1701116-22中有述，或其功能等價(jià)物，或Vero細(xì)胞毒素或蓖麻蛋白的B片段(文獻(xiàn)見上文)。
-X代表一個(gè)或多個(gè)多肽，其全長(zhǎng)上限與逆向轉(zhuǎn)運(yùn)或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相適應(yīng)。
本發(fā)明還涉及如下結(jié)構(gòu)的嵌合分子B-X’其中B具有上述相同的意義，X’代表編碼欲表達(dá)之多肽序列X(特別是抗原表位)的核苷酸序列。
本發(fā)明的嵌合分子另外可包含a)修飾位點(diǎn)，如由約20個(gè)氨基酸組成的N-糖基化位點(diǎn)，磷酸化位點(diǎn)或任選的分子成熟所需的任何序列，b)四肽KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)型的保留信號(hào)，當(dāng)其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白的羧基末端連接時(shí)，在蛋白經(jīng)過高爾基體成熟后引起保留。在M.J.Lewis等(1992)，細(xì)胞，68353-64中給出了保留信號(hào)在蛋白成熟中的作用的綜述。
更一般地講，這些嵌合多肽序列可含有-在所采用細(xì)胞體系中蛋白成熟所需的任何序列，-由嵌合分子識(shí)別給定細(xì)胞類型所需的任何序列，從而允許作用的選擇性和穿透至細(xì)胞漿中的選擇性。
結(jié)構(gòu)B-X或B-X’的所有嵌合序列的共同點(diǎn)是含有B片段或其功能等價(jià)物。
本發(fā)明的嵌合分子使得可以將序列X或X’的表達(dá)產(chǎn)物引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。當(dāng)X與B片段連接時(shí)，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中經(jīng)過高爾基體并可能經(jīng)過內(nèi)體。另外，在某些情況下，本發(fā)明的分子可進(jìn)行成熟化，導(dǎo)致含于嵌合多肽序列中的某些表位的膜呈遞。
成熟化應(yīng)理解為從給定的多肽產(chǎn)生其本身可在某細(xì)胞腔室(包括胞漿)中存在的肽的任何過程?？赏ㄟ^在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的酶切或通過在胞漿中的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行這種成熟化，在所述轉(zhuǎn)運(yùn)中多肽被切割，然后所得肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在這種切割后，I類主要組織相容性復(fù)合物分子(MHC cl I)可裝載目標(biāo)多肽分子X或X’，并呈遞在細(xì)胞膜上。
當(dāng)本發(fā)明的嵌合分子由B片段或其等價(jià)物與多核苷酸分子或含有欲表達(dá)序列的表達(dá)載體偶聯(lián)所構(gòu)成時(shí)，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄、然后在胞漿中翻譯后所合成的多肽可經(jīng)歷上述嵌合多肽序列同樣的切割、成熟化和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的階段。
本發(fā)明的嵌合多肽分子可構(gòu)成用于免疫治療的藥物組合物的活性成分，其機(jī)制在適于產(chǎn)生免疫反應(yīng)之抗原的呈遞方面與生物過程相似。片段X因而代表尋求細(xì)胞表面膜呈遞的一個(gè)或多個(gè)表位。片段X的長(zhǎng)度只受相關(guān)嵌合分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的限制。
這一途徑可設(shè)想用作抗感染或抗癌的免疫治療，也可在某些自身免疫病中用作抗原誘導(dǎo)物。
所有被MHC cl I呈遞的抗原類型都是用于選擇本發(fā)明結(jié)構(gòu)中簡(jiǎn)單或嵌合表位的良好侯選者。我們舉出以下實(shí)例a)衍生自黑素瘤細(xì)胞蛋白的人表位-源自酪氨酸酶的BAGE(Boel，P等(1995)，免疫(Immunity 2，167-75)；-源自gp 75的GAGE(Van den Eynde，B等(1995)，J.Exp.Med.182，689-98)；-酪氨酸酶(Brichard V.等(1993)，J.Exp.Med.178，489-95)；-源自Melan A/MART-1的p15(Coulie P.G.等(1994)，J.Exp.Med.180，35-42；Kawakami Y等(1994)，J.Exp.Med.180，347-52)；
-源自β-連環(huán)蛋白的MAGE-1和3(De Plaen E.等(1994)，免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics 40，369-9；Traversari C等(1992)，J.Exp.Med.176，1453-7)。
b)參與癌形成的病毒蛋白衍生的人表位-衍生自HPV16的E6和E7蛋白的肽(Feltkamp M.C.等(1993)，歐洲免疫學(xué)雜志23，2242-9；Davis H.L.等(1995)，人類基因治療(Hum.Gene Ther.)6，1447-56)；-衍生自HVB的Hbs蛋白的肽(Rehermann B.等(1995)，J.Exp.Med.181，1047-58)；-衍生自EBV蛋白的肽(Murray R.J.等(1992)，J.Exp.Med.176，157-68)；-巨細(xì)胞病毒的衍生肽。
c)癌基因衍生的人表位-p21 ras(Peace D.J.(1993)，J.Immumnother 14，110-4；CiernikI.F.等(1995)，雜交瘤(Hydridoma)14，139-142)；-p53(Gnjatic S.(1995)歐洲免疫學(xué)雜志，25，1638-42)。
d)與自身免疫病有關(guān)的表位這些表位可選自Chiez R.M.等(1994)在《今日免疫學(xué)》(Immunol.Today)15，155-60中描述的那些。
e)與感染性疾病有關(guān)的表位作為這種表位的實(shí)例，可舉出Furukawa K.等(1994)在J.Clin.Invest.94，1830-9中描述的那些。
在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中，X或X’的表達(dá)產(chǎn)物還可以代表可使由某種原因擾亂的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)得以恢復(fù)的多肽序列。例如，由于突變、缺失或添加一種序列的修飾，可將一種生物分子捕獲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，具有阻斷該分子的成熟或轉(zhuǎn)移的作用。例如對(duì)于突變體CFTR(ΔF508)就是如此，其與伴侶分子(如鈣聯(lián)接蛋白)的結(jié)合被修飾而阻礙或延遲其擴(kuò)增(relargage)，從而阻礙其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。這種突變是粘稠物阻塞癥的病因。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中引入未突變的復(fù)本可使與鈣聯(lián)接蛋白作用位點(diǎn)的糖蛋白CFTR(ΔF508)的N-糖基化鏈移動(dòng)，具有使該蛋白重新轉(zhuǎn)運(yùn)至漿膜的效果，并使肺的上皮細(xì)胞有正常功能。
本發(fā)明還涉及含有編碼嵌合蛋白之核酸序列的核酸構(gòu)建物，特別是DNA或cDNA，其中嵌合蛋白的結(jié)構(gòu)和不同變化形式定義如上。更具體地講，本發(fā)明涉及帶有如上構(gòu)建物并適于在細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)的表達(dá)載體或質(zhì)粒。例如，表達(dá)載體可以是G.F.Su等(1992)，Infect.Immum.，603345-59中描述的質(zhì)粒pSU108。
更具體地講，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建物，其含有-編碼B片段的序列，-編碼一種或多種欲表達(dá)多肽的序列。這可以是在細(xì)胞表面尋求膜表達(dá)的表位；這還可以是可將蛋白保留在高爾基體中的多肽；最后這還可以是可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)受擾的轉(zhuǎn)運(yùn)功能的多肽。
該構(gòu)建物另外可含有編碼在待用本發(fā)明分子處理之目標(biāo)細(xì)胞中存在時(shí)允許正確細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽的任何核酸序列。這特別可為-編碼N-糖基化信號(hào)的序列，-編碼KDEL保留信號(hào)的序列。
本發(fā)明的多核苷酸結(jié)構(gòu)處于啟動(dòng)子的控制之下，優(yōu)選使得在所轉(zhuǎn)染細(xì)菌中有適當(dāng)表達(dá)率的強(qiáng)啟動(dòng)子。
本發(fā)明還涉及含有這些構(gòu)建物并適于產(chǎn)生本發(fā)明嵌合蛋白或多肽的轉(zhuǎn)染的細(xì)菌。
用本發(fā)明的分子處理的宿主細(xì)胞也構(gòu)成本發(fā)明的一部分；這可以是任何類型的細(xì)胞，特別是-可被離體處理的細(xì)胞，如細(xì)胞免疫激發(fā)中的活性免疫系統(tǒng)細(xì)胞，例如樹狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、或B淋巴細(xì)胞；-可被原地處理的細(xì)胞，如用于恢復(fù)已變異功能(由于遺傳缺陷或由于代謝紊亂)的上皮細(xì)胞；-癌細(xì)胞。
一般地講，本發(fā)明的嵌合分子使得接近一種新的治療方法，其解決了與用于在動(dòng)物細(xì)胞中整合或表達(dá)外源分子的常規(guī)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有關(guān)的問題。這種治療方法，如源自本發(fā)明分子的方法，包括患者細(xì)胞的直接處理，可以在離體條件下進(jìn)行，也可以是嵌合多肽序列的立體定位型直接應(yīng)用，或按粘膜治療的常規(guī)方法進(jìn)行，如氣霧劑。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的嵌合多肽或編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列在制備治療性組合物中的用途，其中特定的多肽在靶細(xì)胞的膜水平表達(dá)。這些多肽最好是這樣的表位希望產(chǎn)生對(duì)抗它的免疫反應(yīng)，并且它被呈遞在免疫系統(tǒng)細(xì)胞、特別是樹狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞的表面。志賀菌毒素的B片段作為可被抗原呈遞細(xì)胞呈遞之表位的載體。
本發(fā)明涉及一種免疫治療方法，即當(dāng)不希望的抗原出現(xiàn)在機(jī)體中后提高細(xì)胞免疫力，該方法包括使細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞如樹狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)特定的表位。本發(fā)明的治療方法旨在通過目的表位限于靶細(xì)胞中后載于MHC cl I或cl II分子，從而激發(fā)細(xì)胞和體液的調(diào)節(jié)性免疫。這導(dǎo)致在遇到欲消除的抗原時(shí)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活。
由本發(fā)明構(gòu)建物呈遞的表位來自欲消除的病毒、寄生蟲、細(xì)菌、或任何細(xì)胞、細(xì)胞單元或微生物抗原，如可以是癌細(xì)胞或被感染細(xì)胞。這些表位還可以是使得在自身免疫病中被認(rèn)作外來抗原的“自身”分子被本發(fā)明表位替代的誘導(dǎo)物，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)延緩或減弱。
這些表位的實(shí)例已在上文描述嵌合多肽序列時(shí)舉出。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的嵌合分子在制備治療性組合物中的用途，其中希望表達(dá)的特定多肽可恢復(fù)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致被捕獲在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并且表達(dá)缺陷的蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)成熟化(包括糖基化、硫酸化、折疊等)的膜表達(dá)蛋白就是如此。
一個(gè)具體的實(shí)例是突變體CFTR(ΔF508)的表位，由于蛋白的修飾其與伴侶分子如鈣聯(lián)接蛋白的結(jié)合被改變；這導(dǎo)致該分子被捕捉(這是粘稠物阻塞癥的原因)，表現(xiàn)為外分泌腺的分泌普遍不足，特別是在胰腺和肺中。
本發(fā)明涉及由于缺乏蛋白質(zhì)的分泌所致疾病的治療方法，該方法包括直接施用嵌合多肽或在患者細(xì)胞中施加質(zhì)粒形式的遺傳信息，所述質(zhì)粒帶有編碼可恢復(fù)細(xì)胞缺陷功能的肽或多肽的外源序列。
這種恢復(fù)可以是由多肽X補(bǔ)充缺陷功能的結(jié)果，或突變蛋白和從外源序列合成的多肽間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞器的特異分子或受體的結(jié)果。一個(gè)具體的實(shí)例是通過施予攜帶編碼蛋白CFTR與其伴侶分子結(jié)合位點(diǎn)之序列的載體、或通過直接施予嵌合多肽，治療上述的突變，即粘稠物阻塞癥的病因。
本發(fā)明的構(gòu)建物為人類或動(dòng)物醫(yī)療界提供了一種治療病因在于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷之疾病、提高或誘導(dǎo)分子、多肽或目的表位的膜呈遞的新治療方法。
在下列實(shí)施例和附圖的啟示下，本發(fā)明的其它特征將會(huì)顯而易見。


圖1)A已抑制了受體Gb3表達(dá)的Hela細(xì)胞。內(nèi)在化的B片段不向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，但在泡囊結(jié)構(gòu)中積累。
圖1)B在其中B片段向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的對(duì)照Hela細(xì)胞。
圖2表明B片段轉(zhuǎn)運(yùn)缺乏的生化試驗(yàn)。
圖3融合蛋白志賀菌毒素B-Mage 1在外周血單核細(xì)胞(PBMC)上的限制性I類MHC呈遞序列KDEL的作用。PBMC(5×104)用下列蛋白致敏過夜肽Mage 1(1μM)、或Mart 1(1μM)、或帶有向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)再循環(huán)之活性序列(B-Mage 1-Glyc-KDEL)或無活性序列(B-Mage 1-Glyc-KDELGL)的融合蛋白志賀菌毒素B-Mage 1(1μM)。洗滌后，將致敏的PBMC細(xì)胞與2×104個(gè)Mage 1表位特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(克隆82/30)保溫24小時(shí)。然后收集上清液并檢測(cè)γ-干擾素的產(chǎn)生。
圖4不同類抗原呈遞細(xì)胞對(duì)融合蛋白志賀茵毒素B-Mage 1的限制性I類MHC呈遞。類淋巴母細(xì)胞B(

)、樹狀細(xì)胞(+)、或T細(xì)胞(□)克隆如圖3中用可溶性融合蛋白志賀菌毒素B-Mage 1致敏。用細(xì)胞系82/30 CTL檢測(cè)Mage 1肽的呈遞。
圖5類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系對(duì)融合蛋白志賀菌毒素B-Mage 1限制性I類MHC呈遞的特異性分析。類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系的細(xì)胞BM21(HLA-A1)或BV1(HLA-A2)用以下蛋白致敏過夜僅培養(yǎng)基、或合成肽Mage 1或Mart 1(1μM)、或融合蛋白志賀菌毒素B-Mage1(1μM)、或融合蛋白Antp-Mage 1、或野生志賀菌毒素B片段。洗滌后，Mage 1 CTL 82/30(A)或Mart 1 CTL LB373(B)的特異細(xì)胞與致敏的B-EBV細(xì)胞保溫24小時(shí)。然后收集上清液，并檢測(cè)γ-干擾素的產(chǎn)生。
I-重組嵌合多核苷酸的構(gòu)建和相應(yīng)多肽的產(chǎn)生I-1)質(zhì)粒的構(gòu)建選擇的表位X是表位MAGE，它存在于患黑素瘤之患者的癌細(xì)胞中。所用的質(zhì)粒為Su等，1992，Infact.Immun.，60，33-45，3359中描述的質(zhì)粒pSU108。
所用的PCR引物如下5＇-ACTAGCTCTGAAAAGGATGAACTTTGAGAATTCTGACTCAGAATAGCTC-3＇5＇-CTTTTCAGAGCTAGTAGAATTAGGATGATAGCGGCCGCTACGAAAAATAACTTCGC-3＇這些引物與載體ShigaAtpE(5’)的特異性引物一起使用5＇-CACTACTACGTTTTAAC-3＇5＇-CGGCGCAACTATCGG-3＇產(chǎn)生的片段被克隆在質(zhì)粒pUS108的限制性位點(diǎn)SphI和SaII處。
含有糖基化位點(diǎn)和序列KDEL的適配片段，由寡核苷酸硫酸酯1(5’-磷酸化；5’-GGCCGCCATCCTAATTCTACTTCT-3’)和硫酸酯2(5’-CTCAGAAGTAGAATTAGGATGGC-3’)或硫酸酯3(5’-GAGTCTGAAAAAGATGAACTTTGATGAG-3’)組成，在16℃下連接過夜。
將生成的片段克隆在pSU108的限制位點(diǎn)NotI和EcoRI中，并含有編碼B-Glyc-KDEL的cDNA。
I-2)蛋白的純化重組片段的純化也按Su等，1991(上文所引述)中描述的技術(shù)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將含有從pSU108所得重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞在30℃培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物在補(bǔ)有50mg/ml氨芐青霉素的LB中50℃下稀釋5倍。在42℃下保溫4小時(shí)后，細(xì)胞用大量10mM Tris/HCl(pH8)洗滌，在10mM Tris/HCl，pH8；25％蔗糖，1mM EDTA中保溫10分鐘，最后迅速重懸在含1mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(亮抑蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑、抗蛋白酶和抑蛋白酶肽)的冰水混合物中。這最后一步導(dǎo)致周質(zhì)破裂。澄清后將上清液載于QFF柱(Pharmacia)上，用20mM Tris/HCl，pH7.5中的NaCl線性梯度洗脫。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，B片段在120mM和400mM之間被洗脫。然后將含有B片段的流份對(duì)20mM Tris/HCl，pH7.5透析，再載于monoQ柱(Pharmacia)上，如前述相同的方式洗脫。得到的蛋白于-80℃保存到使用時(shí)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳估測(cè)其純度為95％。
I-3)體外CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)按已建立的方法(Romani等，1994)培養(yǎng)樹狀細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將PBMC懸浮在Iscove培養(yǎng)基中，在6孔板中37℃保溫2小時(shí)。洗去沒有粘附的細(xì)胞，剩余的細(xì)胞在GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)存在于37℃保溫。培養(yǎng)5天后，分別加入濃度為50U/ml和150U/ml的IL-1α和IFN-γ，在30℃下繼續(xù)保溫24小時(shí)。然后將樹狀細(xì)胞懸浮在Iscove培養(yǎng)基中，其中存在遞增濃度的與MAGE表位偶聯(lián)的B片段和3μg/ml人β2微球蛋白，以便改善細(xì)胞的膜表位呈遞能力。將該混合物在30℃下保溫4小時(shí)。將內(nèi)在化了與該表位偶聯(lián)的B片段的樹狀細(xì)胞以5000拉德照射，離心收集，重懸，與CD8+淋巴細(xì)胞(從PBMC制得)混合。然后將用抗原致敏的樹狀細(xì)胞與CD8+在5ng/ml IL-7存在下共培養(yǎng)。
10天后用新制備的照射后的樹狀細(xì)胞再刺激應(yīng)答性CD8+淋巴細(xì)胞，并且在遞增濃度的與同樣表位偶聯(lián)的B片段存在下保溫。在10U/ml和5ng/ml的IL-2和IL-7存在下進(jìn)行樹狀細(xì)胞與應(yīng)答性CD8+淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)。重復(fù)該再刺激過程3次。
為了測(cè)定對(duì)CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)，將如上述預(yù)刺激的應(yīng)答性CD8+淋巴細(xì)胞在癌細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞存在下保混。將表達(dá)所選擇表位的細(xì)胞用Na251CrO4標(biāo)記，然后與應(yīng)答性CD8+接觸5小時(shí)(Bakker等，1994)。然后測(cè)定釋放在培養(yǎng)液中的放射活性，可對(duì)預(yù)刺激的應(yīng)答性CD8+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性進(jìn)行定量。
結(jié)果II用帶有抗原MAGE 1的B片段刺激的PenaEBV細(xì)胞和樹狀細(xì)胞對(duì)該抗原的呈遞II-1)攜帶MAGE-1表位之B片段細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的形態(tài)學(xué)研究。
我們已證明，可以在志賀菌毒素B片段的羧基末端融合肽序列而保持該蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)行進(jìn)的特性。在此證明過程中，構(gòu)建了含有B片段、N-糖基化位點(diǎn)和保留信號(hào)KDEL的嵌合多肽。作為對(duì)照，使用了保留信號(hào)KDELGL，它是肽KDEL的無活性形式，Misendock和Rothman，1995，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)，129，309-319。通過形態(tài)學(xué)和生化研究表明，修飾的B片段從漿膜通過內(nèi)體和高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運(yùn)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)被BFA(真菌代謝物布菲爾德菌素(Brefeldine)A)抑制，被諾考達(dá)唑(微管的解聚劑)減弱。
這些實(shí)驗(yàn)清楚地表明，保留了融合蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)行進(jìn)的特性。為了體外評(píng)價(jià)B片段作為表位的載體用于抗腫瘤免疫接種的潛力，在上文所述試驗(yàn)條件下將表位MAGE-1加入到片段B-Glyc-KDEL上，該新蛋白稱為B-MAGE-Glyc-KDEL。將蛋白B-MAGE-Glyc-KDEL與熒光團(tuán)DTAF偶聯(lián)，以便通過聚焦顯微鏡跟蹤其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。在其內(nèi)在化以后，在HeLa細(xì)胞、Pena-EBV細(xì)胞(用EB病毒永生化的B淋巴細(xì)胞系)的高爾基體中和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中可檢測(cè)到該蛋白。這些結(jié)果證實(shí)了關(guān)于羧基末端修飾(如上所述)的B片段細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的原始觀察結(jié)果，并可以確認(rèn)造血細(xì)胞系的某些呈遞細(xì)胞能夠內(nèi)在化B片段并將該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
我們現(xiàn)明確提出測(cè)定蛋白B-MAGE-Glyc-KDEL的N-糖基化的研究。N-糖基化是一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中特異地進(jìn)行的修飾。我們以前已證明帶有N-糖基化識(shí)別位點(diǎn)的B片段若被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)確實(shí)可被糖基化。
II-2)用蛋白B-MAGE-Gly-KDEL刺激的Pena-EBV細(xì)胞和樹狀細(xì)胞對(duì)抗原MAGE-1呈遞的研究為了評(píng)價(jià)B片段作為表位載體的能力，我們利用了一個(gè)特異性識(shí)別與單倍型HLA-A1呈遞細(xì)胞的I類MHC結(jié)合的MAGE-1表位的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL 82/30)。在用蛋白B-MAGE-Glyc-KEDL刺激的Pena-EBV細(xì)胞或樹狀細(xì)胞存在下保持這些CTL。如果表位MAGE-1被這些呈遞細(xì)胞呈遞，CTL將被活化并分泌γ干擾素(IFN-γ)，隨后定量測(cè)定。
所分泌INF-γ的量與呈遞細(xì)胞對(duì)CTL的刺激程度成正比。
20000個(gè)呈遞細(xì)胞(Pena-EBV和樹狀細(xì)胞)(每個(gè)圓底微孔中的細(xì)胞數(shù))用4％PBS-多聚甲醛固定1小時(shí)，或不固定。然后用OptiMEM洗2次，與蛋白B-MAGE-Glyc-KDEL稀釋液保溫15小時(shí)。以4個(gè)稀釋度試驗(yàn)該蛋白，從10μM終濃度開始，在OptiMEM培養(yǎng)液(無血清培養(yǎng)液)中5倍稀釋。15小時(shí)后，低速離心洗板。將CTL(CTL 82/30)以5000 CTL/孔的比例再加到100μl培養(yǎng)液(ID-HS-AAG+25U/ml IL-2)中。作為陽性對(duì)照，將CTL 82/30在G43細(xì)胞系(被MAGE-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B淋巴細(xì)胞系)存在下保持。培養(yǎng)24小時(shí)后，收集上清，定量測(cè)定IFN-γ產(chǎn)物。
所得結(jié)果示于下表I中。
表I

結(jié)果以每個(gè)條件下產(chǎn)生的IFNγ單位表示(均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n＝3)。
我們注意到，用蛋白B-MAGE-Glyc-KEDL刺激的樹狀細(xì)胞和Pena-EBB細(xì)胞可被CTL很好地識(shí)別，甚至在低蛋白濃度下也是如此。相反，被預(yù)先固定的樹狀細(xì)胞和Pena-EBV細(xì)胞不被識(shí)別，看來發(fā)生了蛋白B-MAGE-Glyc-KDEL的胞吞作用和加工。這些令人鼓舞的結(jié)果現(xiàn)可得到體外接種實(shí)驗(yàn)的支持。
III.小鼠體內(nèi)的抗腫瘤和/或抗病毒活性試驗(yàn)準(zhǔn)備小鼠的樹狀細(xì)胞并用衍生自蛋白P21RAS、P53或PE2/NER的抗原標(biāo)記(以測(cè)定抗腫瘤活性)或用衍生自HBV、EBV或HPV的抗原標(biāo)記(以測(cè)定抗病毒活性)。按上文I-4)中所述方法準(zhǔn)備樹狀細(xì)胞。
然后將這些樹狀細(xì)胞引入小鼠體內(nèi)。
通過對(duì)移植了表達(dá)該抗原的腫瘤細(xì)胞或病毒的小鼠進(jìn)行后續(xù)處理，觀察到了抗病毒或抗腫瘤效果。
結(jié)論當(dāng)所述病毒或所述癌細(xì)胞的特定表位被整合在重組核苷酸序列中、導(dǎo)致合成被限于I類MHC并在免疫系統(tǒng)細(xì)胞膜表面表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的多肽序列或多核苷酸序列可有利地構(gòu)成用于治療某些癌癥或某些病毒或細(xì)菌感染的藥物組合物的活性成分。
IV借助于志賀菌毒素B片段恢復(fù)突變蛋白CFTR(ΔF508)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。
蛋白CFTR(囊性纖維變性跨膜調(diào)節(jié)蛋白)是漿膜的氯通道。在絕大部分患粘稠物阻塞癥的病人中，CFTR基因帶有突變。最常見的突變體(ΔF508)的通道活性仍有效，只是被阻滯在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而不是被轉(zhuǎn)運(yùn)至漿膜上。我們借助于志賀菌毒素的B片段向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中引入已知與鈣聯(lián)接蛋白(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的“伴侶分子”)相互作用的CFTR蛋白結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域與B片段的羧基端融合。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該嵌合蛋白可將糖蛋白CFTR(ΔF508)與鈣聯(lián)接蛋白作用位點(diǎn)的N-糖基化鏈轉(zhuǎn)移，這使得蛋白CFTR(ΔF508)不再被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而可被轉(zhuǎn)運(yùn)至漿膜上，發(fā)揮正常功能。
我們第一次構(gòu)建了由B片段和衍生自蛋白CFTR的相互作用結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白。在該蛋白的羧基端加上了再循環(huán)信號(hào)(肽KEDL)，以增加其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保留。首先證實(shí)了這種新蛋白也被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在用CFTR(ΔF508)的cDNA轉(zhuǎn)染的LLCPK1穩(wěn)定細(xì)胞系中研究了CFTR(ΔF508)的遷移。該細(xì)胞系由Mlle.M.A.Costa deBeauregard和M.D.Louvard(巴黎居里研究所，CNRS UMR 144)建立。在這些細(xì)胞中表達(dá)的蛋白CFTR(ΔF508)另外裝有一個(gè)表位標(biāo)簽。因而可能通過免疫熒光檢測(cè)蛋白CFTR(ΔF508)是否到達(dá)漿膜。在沒有這種處理時(shí)，LLCPK1細(xì)胞系的漿膜中沒有CFTR(ΔF508)的特異性標(biāo)志。如果這些初步試驗(yàn)的結(jié)果是積極的，我們將著眼于粘稠物阻塞癥的治療開發(fā)這一途徑。
結(jié)論上述試驗(yàn)證明，其中X代表蛋白CFTR和鈣聯(lián)接蛋白間相互作用結(jié)構(gòu)域的合成多肽可有利地構(gòu)成用于治療粘稠物阻塞癥的藥物組合物的活性成分。事實(shí)上，在突變者中存在的突變作用結(jié)構(gòu)域與合成多肽片段間與鈣聯(lián)接蛋白相互作用的競(jìng)爭(zhēng)可使得突變蛋白在支氣管中恢復(fù)分泌。
抗原呈遞實(shí)驗(yàn)將抗原呈遞細(xì)胞(PBMC，B-EBV細(xì)胞，T細(xì)胞，樹狀細(xì)胞)在96孔微板中以105個(gè)細(xì)胞/孔的密度在37℃保溫、并用溶于100μl Iscove培養(yǎng)液的抗原敏(刺)4小時(shí)或15小時(shí)。保溫結(jié)束后，除去培養(yǎng)液，在每孔的100μl含25U/ml IL2的CTL培養(yǎng)基中加入20000個(gè)CTL細(xì)胞。24小時(shí)后，收集50μl上清液，通過ELISA(Diaclone)試驗(yàn)測(cè)定γ干擾素。在某些試驗(yàn)中，細(xì)胞用1％多聚甲醛在室溫下固定10分鐘，在轉(zhuǎn)入微孔板中之前充分洗滌。
權(quán)利要求
1.下式的含有志賀菌毒素的B片段或其功能等價(jià)物和與其連接的一個(gè)或多個(gè)多肽的嵌合序列B-X其中B代表B片段，X代表其長(zhǎng)度上限與逆向轉(zhuǎn)運(yùn)相適應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的序列，其特征在于它另外含有-糖基化位點(diǎn)，或-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)，或-硫酸化位點(diǎn)，或-上述要素的聯(lián)合。
3.一種嵌合序列，其包含志賀菌毒素B片段或其功能等價(jià)物和與它連接的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸X’，X’含有編碼欲表達(dá)多肽X的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的序列，其特征在于X為易被I類主要組織相容性復(fù)合物呈遞的表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的序列，其特征在于X為源自希望在免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面表達(dá)的多肽或蛋白的表位，特別是源自癌細(xì)胞蛋白、病毒蛋白或癌基因的表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的序列，其特征在于X為黑素瘤細(xì)胞特異的MGE表位。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的序列，其特征在于X為可恢復(fù)或激活在細(xì)胞表面表達(dá)蛋白的細(xì)胞中的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)功能的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的序列，其特征在于X為蛋白CFTR和伴侶分子間的相互作用結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求1-8之一的序列在呈遞表位至免疫系統(tǒng)細(xì)胞上的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞為樹狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的應(yīng)用，其特征在于所述表位源自病毒抗原、寄生蟲抗原或細(xì)菌抗原，或衍生自癌細(xì)胞的特異蛋白，衍生自癌基因或衍生自致癌病毒的蛋白。
12.權(quán)利要求1-3之一的序列作為活性成分在恢復(fù)與伴侶分子結(jié)合位點(diǎn)突變之蛋白的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中突變蛋白為引起粘稠物阻塞癥的蛋白CFTR。
14.用于治療的組合物，其特征在于它含有權(quán)利要求1-8之一的序列作為活性成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其特征在于所述序列為權(quán)利要求1的多肽序列。
16.權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的序列在制備用于恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷的藥物中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的序列在制備用于刺激機(jī)體免疫力抗病毒、寄生蟲、細(xì)菌感染或抗癌抗原的藥物中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求1-8之任一項(xiàng)的序列在制備用于減低或抑制自身免疫病中免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及式B－X含有志賀菌毒B片段或其功能等價(jià)物和結(jié)合于其羧基末端的一個(gè)或幾個(gè)多肽的多肽序列,其中B代表志賀菌毒素B片段,X代表一個(gè)或多個(gè)有治療意義的多肽。還涉及該多肽序列在治療性組合物中作為活性成分的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1272882SQ9880879
公開日2000年11月8日 申請(qǐng)日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月18日
發(fā)明者B·古德, L·約翰尼斯 申請(qǐng)人:居里研究所, 國(guó)家科研中心