專利名稱：獲得用于預防與逆轉錄病毒感染有關的致病作用的疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獲得用于預防人和脊椎動物中與逆轉錄病毒感染有關的致病作用的疫苗的方法。
與逆轉錄病毒感染有關的致病作用是有害的，包括可能出現(xiàn)的致癌作用或免疫抑制作用，它是通過逆轉錄病毒引入宿主(哺乳動物、鳥或者魚)體內(nèi)、然后侵入，并且上述逆轉錄病毒再在作為逆轉錄病毒的靶細胞的宿主細胞中復制而誘導的，也即是說這種細胞是病毒能夠侵入的細胞。
由于逆轉錄病毒通過叫做逆轉錄酶的這種酶將RNA轉錄為DNA，由此而得名，而在生物中，遺傳信息通常是通過信使RNA由染色體的DNA傳遞給蛋白質的。
在逆轉錄病毒的家族中，可以分為三個亞族腫瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
腫瘤病毒是因其與癌癥和惡性感染有關而被命名的逆轉錄病毒。例如，致白血病的病毒(如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MULV)、也叫做Moloney病毒、貓白血病病毒(FELV)、人白血病病毒如HTLV1和HTLV2、猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或BLV)，靈長類D型腫瘤病毒、B型腫瘤病毒，它們是哺乳動物腫瘤的誘導物，或者導致迅速發(fā)展的癌癥的腫瘤病毒(如Rous肉瘤病毒或RSV)；參見如STEHELIN等，《分子生物學雜志》101349-365(1976)。
慢病毒是因其與發(fā)展緩慢的疾病有關而命名的，這類病毒頻繁參與免疫抑制現(xiàn)象，包括AIDS。
附表1通過舉例列出了與某些慢病毒相關的疾病，以及這些慢病毒的主要靶細胞。
泡沫病毒對給出的細胞型或種具有極低的特異性，它們有時與免疫抑制現(xiàn)象有關；對于這種情形，例如有猴泡沫病毒(或SFV)。
本發(fā)明的一個目的是開發(fā)預防與逆轉錄病毒所致的宿主生物體感染有關的致病作用的方法和疫苗產(chǎn)品，其中的致病作用包括致癌作用或免疫抑制作用。
對于大多數(shù)逆轉錄病毒而言，已經(jīng)觀察到與感染有關的免疫抑制作用，可以將其視為逆轉錄病毒感染的致病常數(shù)；參見BENDINELLI等，《癌癥研究進展》45125-181(1985)。這種情形尤見于慢病毒感染。在相當多的腫瘤病毒感染時也有這種情況；參見例如P.SONIGO所著的“SIDA和VIH感染”[AIDS和HIV感染]一書、MONTAGNIER等(Medecine Science Flammarion)，113-122頁(1989)。
已經(jīng)對許多人和動物的疫苗進行了預防逆轉錄病毒感染的致病作用的測試，但一般說來，這些疫苗不是十分有效或者無效。尤其是，在人或動物AIDS領域內(nèi)觀察到，在發(fā)現(xiàn)HIV病毒后14年(BARRE-SINOUSSI等，《科學》220868-871，1983)仍無法找到能夠有效地阻止疫苗后HIV或SIV的疫苗；參見例如LINHART等，《AIDS研究和人逆轉錄病毒》13593-599(1997)；VOGT等，《疫苗》13202-208(1995)；和LETVIN等《病毒學雜志》694569-4571(1995)。
所用的大多數(shù)疫苗制劑包括各種形式的逆轉錄病毒包膜的蛋白質，如失活的病毒、HIV蛋白的gp120和gp160之類的包膜蛋白(參見特別是GORSE，G.J.,《疫苗》10383-388，1992)、含包膜蛋白的病毒核心、或與各種載體有關的包膜蛋白(嵌合蛋白、細菌)；參見Levy J.A.,《Trans醫(yī)學回顧》2265-271，1988和《微生物學回顧》57183-289，1993，尤其是第247頁。
其它制劑使用了來源于包膜糖蛋白的逆轉錄病毒的包膜或優(yōu)勢免疫肽的片段，這些肽以各種形式出現(xiàn)(脂肽、與支持蛋白連接的肽)以便使它們具有免疫原性；參見特別是Eriksson等《疫苗》11859-865(1993)。
通常所述的疫苗方案是，例如在人、猴或貓AIDS領域內(nèi)，建議不修飾包膜蛋白的保守表位和優(yōu)勢免疫表位，這或許是完全合理的。實際上，一方面，這些保守表位是不同病毒株共有的，這對必須誘導直接對抗大多數(shù)毒株的免疫應答的疫苗制劑是有利的。另一方面，這些優(yōu)勢免疫表位很易被疫苗處理和感染過程中的細胞免疫系統(tǒng)或體液免疫系統(tǒng)識別，然而，它們常常代表中和位點；參見如HO等《病毒學雜志》612024-2028(1987)；JOHNSON等，《實驗醫(yī)學雜志》175961-971(1992)；SHAFFERMAN等，P.N.A.S，美國887126-7130(1991)；和HAMMOND等，《免疫學雜志》1461470-1477(1991)。
對比之下，為了獲得有效的疫苗，本發(fā)明方法包括修飾病毒包膜的某些蛋白質的保守表位和優(yōu)勢免疫表位。
實際上，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)逆轉錄病毒的包膜的保守區(qū)域和優(yōu)勢免疫區(qū)域可導致有害的自動免疫現(xiàn)象。舉例來說，在人AIDS中，他們觀察到HIV包膜的某些保守區(qū)域和優(yōu)勢免疫區(qū)域具有三維結構類似物和/或與人免疫系統(tǒng)的至少一種蛋白質的某些區(qū)域的交叉反應，因此，將含上述完整區(qū)域的病毒蛋白質作為疫苗給藥時，可誘導導致有害的自身免疫反應的免疫應答，從而使得疫苗無效。
在本發(fā)明初期，一方面是觀察到如上所述，即通常存在于疫苗制劑中的某些逆轉錄病毒的保守區(qū)和優(yōu)勢免疫區(qū)在許多情況下是確定的區(qū)域，由于這些區(qū)域具有三維結構類似物和/或與病毒的宿主的某些蛋白發(fā)生交叉反應的特性，因此可引起有害的自身免疫反應。在本發(fā)明初期，另一方面是觀察到上述宿主的蛋白用同一靶細胞或同種靶細胞作為上述逆轉錄病毒。本發(fā)明人所進行的所有這些觀察使他們萌生了如下想法具有三維結構類似物和/或交叉反應的逆轉錄包膜蛋白和宿主蛋白在多數(shù)情況下可與同種靶細胞結合，且在這些靶細胞中存在共同的膜受體。
一般認為，當通過采用上述一種蛋白進行體內(nèi)或體外免疫接種可獲得直接對抗其它蛋白的免疫應答時，則這些蛋白具有與另一蛋白的交叉反應性，例如，當根據(jù)已知的檢測T型免疫應答的實驗如體外細胞毒性實驗，這種免疫接種誘導了一種(叫做B型)體液應答、并且可使之獲得和選擇至少一種能夠識別其它蛋白的單克隆抗體時，或者當體外一種蛋白誘導的同樣的細胞免疫應答(也即是T型)可識別兩種蛋白時。已知的是，“免疫接種”一詞是指通過將宿主的免疫活性細胞與抗原在體內(nèi)或體外進行接觸、經(jīng)此刺激后免疫應答的誘導過程，給予疫苗試劑的目的之一是為了準確地獲得這種免疫接種。
因此本發(fā)明的主題是提供一種獲得對抗與逆轉錄病毒所致的動物或人宿主感染有關的致病作用的疫苗的方法，這種逆轉錄病毒能侵入上述宿主的靶細胞，該靶細胞具有上述宿主蛋白的膜受體，在此方法中，以多肽為基礎制備疫苗試劑，該多肽包括上述逆轉錄病毒的致病株的至少部分包膜蛋白，其中將上述多肽制備成修飾形式，可以理解為-上述部分包膜蛋白是選自那些包括上述包膜蛋白的優(yōu)勢免疫區(qū)的至少一個片段者，所述片段含有至少一種氨基酸，它是上述優(yōu)勢免疫區(qū)的一種保守氨基酸，并且存在于上述致病株中；-上述多肽，呈非修飾形式，誘導直接對抗上述優(yōu)勢免疫區(qū)和宿主蛋白兩者的免疫應答；-上述修飾多肽選自[原文如此]那些誘導直接對抗上述包膜蛋白的優(yōu)勢免疫區(qū)、但不對抗宿主蛋白的免疫應答的多肽。
在剛才所給出的本發(fā)明方法的定義中，認為疫苗試劑是“基于”修飾多肽。這意味著疫苗試劑包括這種修飾多肽，但并不意味疫苗試劑必需一類專有的多肽性質。事實上，在這種疫苗試劑中，上述多肽可以任意與任何生物可溶性分子、按本身已知的方式結合(尤其是共價鍵合)或締合，其中生物可溶性分子可選自，例如聚合物、脂類、肽(包括脂肽、糖肽、蛋白質)、核酸、寡糖等等。上述生物可溶性分子尤其可用作多肽免疫原性試劑的載體。它也可用于修飾多肽的構象，在后一種情況中，所述的分子應被視為修飾其所連接的氨基酸殘基的取代基，上述取代基由此而發(fā)生了修飾，最后分析中，氨基酸殘基的多肽的抗原性只是一部分。
在初期研究時，本發(fā)明方法至少可包括選擇多肽(未修飾的)的步驟，如上所述，這種多肽包含逆轉錄病毒的致病株的至少部分病毒包膜蛋白。這種包括優(yōu)勢免疫區(qū)的至少一個免疫原性片段的蛋白部分，即是指能誘導直接對抗病毒蛋白(更準確地是指對抗包含在上述部分中的優(yōu)勢免疫區(qū)的片段)和宿主蛋白兩者的免疫應答的多肽(未修飾的)，正是這種直接對抗病毒包膜蛋白和宿主蛋白的免疫應答的存在，決定了本申請中的病毒株的致病特性。因此可選擇含這種片段的多肽(未修飾的)。
如果用與適當載體(如蛋白質、類脂或多肽)任意結合的上述片段對宿主進行了體內(nèi)或體外免疫接種，則可認為多肽片段具有免疫原性，這樣就能產(chǎn)生免疫反應(B型和/或T型免疫反應，直接對抗上述多肽片段)。
本申請中，體外或體內(nèi)免疫接種后，如果提及免疫應答，沒有任何其它特殊信息，則是指脊椎動物的免疫應答。
本發(fā)明方法也包括至少一個以下步驟，該步驟是按下面將要描述的方式進行的修飾，其中多肽就是由此選擇的；以及在這些被修飾的多肽中進行選擇，其中至少一種修飾多肽可誘導直接對抗病毒包膜蛋白、而不對抗宿主蛋白的免疫應答。
因此，如上所述，現(xiàn)有技術并沒有教導修飾逆轉錄病毒包膜蛋白的保守表位和優(yōu)勢免疫表位，對比之下，本發(fā)明方法的目的在于修飾這種表位的抗原性，以便獲得對病毒包膜蛋白和宿主蛋白的不同的免疫應答。
已知的是，為了修飾多肽的免疫原性片段的抗原性，可以用影響至少一種氨基酸的突變來修飾上述多肽。應把后面將要對“突變”所下的定義理解為與此處的一致。突變的氨基酸可存在于免疫原性片段中、或甚至存在于上述片段外的多肽區(qū)中。實際上已知位于片段外的氨基酸的修飾可影響上述片段的空間結構，由此影響其抗原性；尤其是，已發(fā)現(xiàn)在肽中，位于相對于氨基酸殘基的+8至-8位的氨基酸殘基的特性可影響氨基酸殘基的構象；參見例如GARNIER等，《分子生物學雜志》12097-120(1978)。除此之外，氨基酸殘基的特性仍具有一種影響，但僅從公知的多肽序列的知識來看，這種影響既不是對稱的、也不是可定量的。
因此突變的氨基酸可位于修飾多肽中、免疫原性片段的內(nèi)部或外邊。當它位于免疫原性片段外邊時，通常不能被8個以上(尤其是7個以上)氨基酸殘基從多肽鏈的上述免疫原性片段的最近端分離出來。特別是，根據(jù)本發(fā)明突變的、存在于免疫原性片段外邊的氨基酸通常不能被8個以上氨基酸殘基、尤其是7個以上氨基酸殘基從最近的保守氨基酸中分離出來，這種保守氨基酸屬于優(yōu)勢免疫區(qū)，其中至少一個片段包含在未修飾多肽中。
本發(fā)明的修飾多肽可以是例如被上述的至少一種突變所修飾的致病病毒株的整個包膜蛋白。這種修飾多肽也可以是被上述的至少一種突變所修飾的致病病毒株的部分包膜蛋白，所述的部分包括至少一種如上所述的免疫原性片段。修飾多肽也可以是嵌合蛋白，它包括至少部分包膜蛋白，所述的部分包膜蛋白如上所述且包含至少一種突變。
本發(fā)明所使用的修飾多肽可以是例如逆轉錄病毒的跨膜糖蛋白或跨膜糖蛋白的片段，尤其是包括所述跨膜糖蛋白(修飾的)的外部區(qū)域的片段，也即是說存在于病毒膜的外表面的區(qū)域。當然，這種蛋白片段包括至少部分優(yōu)勢免疫區(qū)，如上所示。如果提及蛋白的“外部”區(qū)域，更準確地說是指易受溶劑影響的表面，特別可以采用X-plor(見下文)之類的軟件、用“Lee和Richards《分子生物學雜志》55379-400，1971”中所述的公式對上述區(qū)域進行定義。上述多肽也可是至少部分上述跨膜糖蛋白的寡聚體形式，該寡聚體呈修飾狀態(tài)。
上述的對本發(fā)明方法的定義提示了所用的多肽包括病毒包膜蛋白的至少部分優(yōu)勢免疫區(qū)和保守區(qū)。在本申請的說明書中，“保守區(qū)”所指的是可任意縮減為單個氨基酸殘基的病毒蛋白的區(qū)域，對于大多數(shù)已給出的病毒株(如10株中約至少6株)而言，有一個或多個相同的或功能類似的氨基酸，這些氨基酸位于上述各種株的蛋白的肽序列的同一排序位置。這種相同或功能類似的氨基酸就叫做保守氨基酸。功能類似的氨基酸的保守概念是已知的，并且其中有許多取代基基體，這樣就有可能對此概念進行定量(Dayhoff,M.O.等，《蛋白序列和結構的示圖》1978，第5卷，增刊3，第22和23章)。
通過所得到的序列的多種排序方法，對所研究的病毒的各種株的蛋白進行排序后，很容易確定保守區(qū)。對此，可使用如Clustal-w程序(Thompson J.D.等，《核酸研究》224673-4680，1994)。而且，在數(shù)據(jù)庫中各種病毒株的蛋白序列經(jīng)常受到影響。例如，Los AlamosHIV數(shù)據(jù)庫的互聯(lián)網(wǎng)服務器有HIV1、HIV2、SIV和FIV序列，它們常常是最新的。此服務器在國際互聯(lián)網(wǎng)上的地址是http//hiv-web.lanl.gov/HTML/sequences.html附表2a、2b、2c和2d是屬于HIV跨膜糖蛋白(進入SWISSPROTENV_HV1 BR)即分別為HIV1、HIV2、FIV和SIV的545-682區(qū)域的同源包膜糖蛋白區(qū)域的序列排序的例子。該表的最后一行用符合表示所觀察到的同源性程度以及保守程度。符號“★”表示同一殘基存在于所有序列中的排序位置，符號“”表示存在于各種序列中的氨基酸非常相似時的排序位置，符號“．”表示存在于各種序列中的氨基酸相似時的排序位置，符號空缺表示存在于各種序列中的氨基酸不十分相似時的排序位置。此符號系統(tǒng)是由Clustal W排序程序(版本1.7)所使用。
在本申請說明書中，蛋白質的優(yōu)勢免疫區(qū)是指在極大多數(shù)情況(例如10種中約至少7種)下，用含上述序列的蛋白或基本包含上述序列的肽進行免疫接種后、可誘導直接對抗上述區(qū)域的免疫系統(tǒng)的體液和/或細胞應答的肽序列。
有關本發(fā)明方法的定義中提及了病毒的靶細胞，該靶細胞是指病毒可侵入其中的細胞。逆轉錄病毒的靶細胞一般是已知的。病毒具有與能受感染的細胞結合的特性。因此，使用常規(guī)的體外實驗可任意檢測所研究的病毒的靶細胞。
本發(fā)明方法的定義中還提及了具有宿主蛋白的膜受體的宿主細胞。通常具有上述宿主蛋白的受體的宿主細胞是已知的，反之，使用常規(guī)實驗可以確定所給的蛋白是否與某些細胞型結合。例如，用放射性標記蛋白質可確定是否結合了上述細胞型。也可以通過用表達上述膜受體的基因轉染的細胞系來檢測該蛋白是否與已知的膜受體結合。
其中某些宿主細胞具有膜受體的宿主蛋白主要是指屬于可溶性蛋白介體范疇的蛋白。根據(jù)情況，這一范疇包括蛋白質、激素、生長因子或細胞因子，但這些各種類型的介體之間沒有明顯的分界；參見如CAVAILLON J.M.,《Les細胞因子》(Masson，巴黎，1996)第一章，第1-3頁和序言。
本申請中，已知通過用本發(fā)明方法制備的修飾多肽進行免疫接種獲得的免疫應答如抗體反應，可直接對抗病毒包膜蛋白而不對抗宿主蛋白，當所得到的抗體對實質上不同的宿主蛋白和逆轉錄病毒的包膜蛋白具有親和性時，在ELISA實驗中可導致非常重要的反應性的不同，例如光密度的比率約為4(或更大)，這意味著上述抗體與病毒蛋白結合后所得到的光密度至少高于上述抗體與宿主蛋白結合所得到的光密度的4倍。同樣，當用候補疫苗對宿主的免疫活性細胞在體外進行免疫接種誘導活性細胞的形成時，細胞型免疫應答可直接對抗包膜蛋白但不對抗宿主蛋白，其表達逆轉錄病毒包膜蛋白的反應細胞(包括轉染細胞系)明顯多于表達宿主蛋白的反應細胞，例如，在實驗所用的最終光學測定或最終放射性計數(shù)(尤其是靶細胞釋放的51Cr放射性)中，或者在通過任何已知的由誘導細胞毒性細胞所致的細胞裂解方法進行計數(shù)時，反應的比例約為4(或更大)。根據(jù)剛才所示的標準，至少可以在所研究的修飾肽中進行最先選擇，但是在最終分析時，由于對宿主蛋白的免疫應答的抑制或減弱(用任何適當方法證實)，可導致失去致病作用或致病作用降低，它將形成選擇能夠構成符合要求的疫苗試劑的修飾肽的標準。
根據(jù)本發(fā)明，對抗原性進行修飾的優(yōu)勢免疫區(qū)和保守區(qū)可以選自在體外產(chǎn)生B型和/或T型的交叉反應、具有上述宿主蛋白者。
這種優(yōu)勢免疫區(qū)和保守區(qū)也可選自其中具有上述宿主蛋白區(qū)域的三維結構類似物已預先確定者，所述的結構類似物與體外和/或體內(nèi)的交叉反應有關。兩種蛋白質的某些區(qū)域之間的三維結構類似物是指特別是其側鏈和/或其功能類似的化學基團相似的氨基酸殘基在空間上排列相同。用核磁共振(NMR)光譜和/或X線衍射光譜可獲得蛋白質的三維結構。例如，用NMR光譜得到了SIV gp41蛋白質的結構(Caffrey M.等，《分子生物學雜志》271，819-826，1997)。另外，某些情況下，采用分子制作模型技術，從已知結構的蛋白質的原子坐標可以得到好的模型。尤其是可以使用分子制作模型軟件X-plor(參考“用于X線晶體學和NMR的系統(tǒng)，版本3.1”，Axel T.Brunger，耶魯大學出版社，1992)。
為了研究三維結構類似物，可以在生物分子的三維結構的圖解屏上使用已知的顯色法和迭加法。有一種軟件，可用不同表現(xiàn)方式對分子的三維結構進行顯色、對幾何參數(shù)(如距離、角度等)進行計算和對數(shù)個分子結構進行客觀和定量迭加(特別是RASMOL軟件Sayle,R.A.和Milner-White E.J.,《分子生物學雜志》247，536-540，1995和ANTHEPROT軟件Geourjon C.和Deleage G.,《分子圖雜志》(J.Mol.Graph.)13，209-212，1995)，以及對溶劑的易受影響性進行評價(X-plor軟件，上面已述，和CCP4軟件協(xié)調(diào)計算工程4(CollaborativeComputational Project Number 4)，Acta Cyrst.,D50，760-763，1994)。
然而，為了較好地評價這些結構類似物，以每一氨基酸為標準，來考慮被比較的兩種蛋白質中以相似方式定位的功能基團是很有用的。對此，為了不僅考慮到全部氨基酸，而且特別要考慮其每一個官能化學基團(例如酰胺、羧基、羥基、硫氫基和胺官能團等等)，本發(fā)明的共同發(fā)明人使用了可計算分子表面積的方法，目的是比較兩種三維結構間的官能特性。因此，在所比較的結構中，可考慮功能上類似的氨基酸，而不僅是完全相同的氨基酸。
因此，如果使用剛才所述的技術可以證實在所對比的兩個區(qū)域中，某些完全相同的或功能類似的氨基酸的相似空間結構，則可認為逆轉錄病毒蛋白的區(qū)域具有含宿主蛋白的給出區(qū)域的三維結構類似物。
應注意的是，空間上功能類似且以相似方式組合在一起的氨基酸在同一肽鏈中可以相互具有相對的距離。但是，被比較的兩種蛋白質之間的三維結構類似物也可涉及相同或功能類似的氨基酸按相似方式的空間排列，在一種蛋白質被寡聚化的情況中，所包含的氨基酸殘基位于寡聚體的不同鏈上，而包含在這種類似物中的其它蛋白質的氨基酸殘基可位于所述的其它蛋白質的相同肽鏈上。
尤其需要找出三維結構類似物和/或與宿主的蛋白質區(qū)域的交叉反應，它們參與了上述蛋白質與其受體的結合。
在本發(fā)明方法的定義中已經(jīng)描述的宿主蛋白質中，尤其要提及的是所述的可溶性介體?？紤]到上面的陳述，即免疫抑制作用與逆轉錄病毒感染有關，找出結構類似物和/或逆轉錄病毒的外部蛋白質和免疫系統(tǒng)的可溶性蛋白質介體之間的交叉反應是尤其重要的。在這些免疫系統(tǒng)介體中，有細胞因子，尤其是白細胞介素2、白細胞介素10、白細胞介素15和白細胞介素8以及趨化因子。
為了制備構成本發(fā)明所獲得的疫苗試劑的修飾多肽，可以使用已知的肽合成方法或基因工程技術。可以分離或制備對病毒的至少部分蛋白質進行編碼的聚核苷酸序列，如果需要，可在此時期引入核苷酸序列、突變，該突變可使之獲得構成修飾多肽的翻譯突變產(chǎn)物。也可直接合成包括一種或多種突變且編碼修飾多肽的修飾聚核苷酸序列。將由此所得到的突變聚核苷酸序列用已知方法引入到適當?shù)妮d體，該載體可使之表達上述任意修飾形式的多肽。這種載體例如有大腸桿菌、桿狀病毒和哺乳動物細胞。也可以在通過前面所述方法之一所獲得的未修飾多肽上進行突變。
在本申請中，“突變”是指對多肽的區(qū)域(任意縮減成單氨基酸殘基)的任何修飾區(qū)域，通過物理方法、化學方法(共價或非共價修飾)和/或生物方法(通過一種或多種氨基酸的取代、缺失和/或插入所致的突變)，導致對上述區(qū)域(叫做“突變區(qū)域”)所組成的氨基酸的潛在功能的修飾。舉例來說，可以進行導致二硫鍵和氫鍵的特性的去除、獲得和/或調(diào)節(jié)，靜電作用和/或疏水作用的突變，對蛋白質容量的修飾可形成雜絡物，或者在寡聚蛋白質中，對寡聚狀況或寡聚體的穩(wěn)定性進行修飾。
對多肽鏈的氨基酸a的修飾(包括對該多肽的末端氨基酸的修飾)可影響鏈中的鄰近氨基酸的構象，如上所述，包括通過許多氨基酸殘基從a中分離的氨基酸b的構象，該氨基酸殘基可以是7或8的高度，當氨基酸b是表位的一部分時，對氨基酸a的任何修飾(尤其是取代基的任意加入或取代基的任意修飾)可修飾所考慮的表位的抗原性。
在尋找本發(fā)明的修飾多肽的過程中，可以按任意方式或合理方式選擇將要突變的氨基酸和/或選擇突變方法。特別是可以使用至少一種下列修飾方法1)用具有親水側鏈(如Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Lys)或中性鏈(如Gly、Pro)的一種或多種氨基酸置換具有疏水側鏈(如Ala、Leu、Val、Ile、Phe、Trp、Met、Tyr、Cys)的一種或多種氨基酸，反過來亦如此；2)用具有帶負電側鏈(如Asp、Glu)的一種或多種氨基酸或中性鏈置換具有帶正電側鏈(如Arg、Lys、His)的一種或多種氨基酸，反過來亦如此；3)一種或多種二硫鍵的獲得、抑制和/或修飾；4)模擬位(mimotopes)產(chǎn)物，尤其是由逆向倒位所獲得的；5)至少一種氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修飾，該氨基酸是氫鍵的潛在供體或受體；6)至少一種氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修飾，該氨基酸是離子鍵的潛在供體或受體；7)由一種或多種氨基酸的取代、抑制、加入和/或其它修飾產(chǎn)生的空間位阻的改變；8)使用不是天然存在于蛋白質中的氨基酸；9)糖基化的修飾(糖基化位點或其相關糖的產(chǎn)生、抑制或修飾)。
當然，為了選擇誘導直接對抗包膜蛋白而不對抗宿主蛋白的免疫應答的修飾多肽，如上所述對由此得到的修飾多肽進行實驗。
本發(fā)明方法可用于獲得疫苗，尤其是對抗下列病毒的疫苗HIV、FIV、SIV、致白血病的腫瘤病毒(禽、鼠、貓、人、猴和牛白血病病毒，也即分別是ALV、MULV、FELV、HTLV、STLV、BLV)、靈長類D型逆轉錄病毒、哺乳動物腫瘤誘導B型逆轉錄病毒、Rous肉瘤病毒、Maedi-visna病毒(感染羊)、貓肉瘤病毒、禽髓細胞瘤病病毒和禽成髓細胞過多癥病毒。
如上所述，本發(fā)明的主題還在于，修飾多肽在制備用于預防與逆轉錄病毒所致的宿主感染有關的致病作用的疫苗組合物中的應用。
本發(fā)明還涉及可通過本發(fā)明方法獲得的疫苗組合物，該組合物包含上述的修飾多肽這一活性成分。這種組合物可用于預防逆轉錄病毒感染的致病作用的疫苗接種法中，此方法實質上是對包括人在內(nèi)的脊椎動物給予足夠量的上述修飾多肽，以獲得疫苗接種效果。有關疫苗組合物的形成及其給藥方法是已知的，在此不再做進一步描述。
本發(fā)明的主題還在于提供一種如上所述的編碼修飾多肽的修飾逆轉錄病毒聚核苷酸。這種修飾聚核苷酸可按上面所述獲得。本發(fā)明提供了一種其中插入了上述修飾聚核苷酸的表達載體，所述的表達載體能表達修飾多肽。
為了通過免疫接種誘導可特別用于治療逆轉錄病毒感染的抗體的形成，根據(jù)本發(fā)明獲得的修飾多肽也可用作免疫原性試劑，因此本發(fā)明還涉及在用免疫試劑對動物(包括人)進行體內(nèi)或體外免疫接種的反應中獲得的抗體，其中疫苗試劑包含上述修飾多肽。本發(fā)明抗體尤其是指具有識別逆轉錄病毒包膜蛋白而不識別宿主蛋白特性的純化的多克隆抗體或單克隆抗體。可以使用病毒蛋白和宿主蛋白進行多克隆抗體的純化和單克隆抗體的選擇，以便選擇僅僅識別病毒蛋白而不識別宿主蛋白的抗體。本發(fā)明的抗體尤其可用于對上述宿主中由被直接對抗的逆轉錄病毒所致的感染進行早期治療。劑量為抗體的常用劑量。提供含這種抗體的藥學組合物也是本發(fā)明的主題之一。
下列實施例是對本發(fā)明的舉例說明。
實施例l下面描述了本發(fā)明人尋找對于病毒的包膜蛋白質即HIV1的gp41蛋白質、與細胞因子即人白細胞介素2(縮寫IL-2)之間的結構和抗原性類似物的方法。
注意gp41和人IL-2的肽序列不是同源的。實際上，這兩種蛋白質之間總的來說僅有16.5％的序列等同，這一同源性閾值并不重要，通過在含同樣組合物的序列上進行硅(in silico)刺激很容易發(fā)現(xiàn)這一點，但該組合物中的氨基酸的順序已被隨機修飾。
前面的研究(Bost等，《免疫》65611-615，1988)已報道了gp41蛋白質與IL-2(序列LERILL)之間的序列同源性。應注意此gp41的LERILL序列不構成這種蛋白質的優(yōu)勢免疫區(qū)域；參見LEVY J.A.,《微生物學回顧》57183-289(1993)，尤其是第232頁。序列LERILL實際上是位于病毒顆粒的內(nèi)部；與gp41的C末端部分一致。
已經(jīng)觀察到IL-2和AIDS相關逆轉錄病毒顯示具有相同的靶細胞，本發(fā)明人提出如下假說人白細胞介素2的受體可以與IL-2和HIV的gp41蛋白質是共同的，因此他們找出了對于后兩種之間的三維結構類似物。
在本申請中，白細胞介素2和gp41的肽序列的氨基酸殘基數(shù)是指用于SWISSPROT庫(版本34)的那些。
IL-2和gp41蛋白質的肽序列是已知的。本申請中，提及了下列公開序列-IL-2代碼為IL2_HUMAN的SWISSPROT條目(版本34)；-gp41代碼為ENV_HV1BR的SWISSPROT條目(版本34)。
已經(jīng)使用的公開結構如下-IL-2PDB條目(Brookhaven數(shù)據(jù)庫)1IRL；-gp41PDB條目(Brookhaven數(shù)據(jù)庫)。
-1AIK，-1ENV。
而且，已知通過NMR測定的IL-2的三維結構(Mott,P.C.等，《分子生物學雜志》248979，1995)以及gp41蛋白質的某些區(qū)域的結構，該結構是通過X線衍射光譜得到的(Chan,D.C.等，《細胞》89，263-273，1997；Weissenhorn,W.等《自然》387，426-430，1997)。另外，本發(fā)明的共同發(fā)明人通過分子造模，在545-671區(qū)域中獲得了gp41蛋白質的部分外部區(qū)域的三維模型(三聚體形式)。這種分子模型是使用X-plor軟件、按照類似NMR限制下的分子造模的方案獲得的。三聚體形式的分子造模必需的限制是從蛋白質GCN4(PDB密碼IGCM)的“亮氨酸拉鏈”區(qū)域的pⅡ突變體的三維結構推出的，上述結構以“卷曲螺旋”型的三聚體形式結晶。
通過檢驗所獲得的結構，在gp41蛋白質的某些區(qū)域與參加與其受體結合的白細胞介素2的某些區(qū)域之間發(fā)現(xiàn)了三維結構類似物。IL-2與其受體結合的方式以及參與這種結合的IL-2的區(qū)域實際上是已知的；參見BAZAN J.F.,P.N.A.S.美國876934-6938(1990)；Bamborough P.等《結構》2839-851(1994)；Gnarra J.,R.等P.N.A.S.美國873440-3444(1990)；Takeshita T.等《科學》257379-382(1992)；和CAVAILLON J.M.,《Les細胞因子》(Masson，巴黎，1996)，第119-125頁。
通過對gp41和IL-2的結構的全面比較、和尤其是集中對每一結構的類似功能基團的局部比較所做出的研究已經(jīng)證實了這些結果，這已經(jīng)在上面的說明書中描述了。
尤其是觀察到以α螺旋形式組構的IL-2的53-61和88-93區(qū)域，與三個gp41的中心三聚體的螺旋中的兩個螺旋按符合要求的形式迭加。這提示在兩種蛋白質中，不同螺旋帶有的基團具有可比的易受影響性和相關構成。
在HIV的gp41糖蛋白的高度保守的優(yōu)勢免疫區(qū)域(更準確的是545-682區(qū)域)和人IL-2之間還發(fā)現(xiàn)了局部三維結構類似物。
在附表3中再現(xiàn)了HIV1(SWISSPROT密碼ENV_HV1BR)的gp41蛋白質的545-682區(qū)域的肽序列。
在附表3bis中，已經(jīng)描述了此gp41區(qū)域的四個區(qū)(555-577、572-601、590-620和628-663)的肽序列，其中用IL-2注明了結構類似物和/或交叉反應。
剛才所述的結構類似物相關的IL-2區(qū)域是指IL-2的27-47、45-69、99-121和131-153區(qū)域。這些區(qū)域的肽序列示于附表4中。
重點要注意IL-2的27-47區(qū)域參與IL-2與其受體的β鏈結合。實際上，27-47區(qū)域中的氨基酸屬于A螺旋，該螺旋參與與IL-2(RIL-2)的受體的結合，更準確地說是βRIL-2。
45-69區(qū)域中的氨基酸屬于IL-2區(qū)域，該區(qū)域參與與αRIL-2的結合。
99-121區(qū)域中的氨基酸屬于E螺旋，該螺旋參與與βRIL-2的結合。
IL-2的131-153區(qū)域中的氨基酸屬于F螺旋，該螺旋參與與γRIL-2的結合。
舉例來說，在gp41的572-601區(qū)域和人IL-2的27-47區(qū)域之間所發(fā)現(xiàn)的結構類似物說明在附表4bis中。表4bis中，在這種三維結構類似物中所包含的外部氨基酸在下邊劃了線。
但是，應指出，gp41的同一區(qū)域可具有含幾種不同IL-2區(qū)域的三維結構類似物。
另外，本發(fā)明人觀察到在gp41的600-612區(qū)域中，在gp41三聚體的三個鏈上的606位置上的三個賴氨酸(K)可形成構象表位，gp41的這些賴氨酸在空間上可對應于IL-2的賴氨酸52、96和55。
他們還觀察到IL-2和gp41蛋白質之間的免疫交叉反應性。尤其是使用ELISA和PEPSCAN技術，通過使用在含固定化的人IL-2的柱上進行免疫純化、從純化的HIV+血清獲得的抗體，他們觀察到這些抗體中有一些可識別IL-2的區(qū)域，該區(qū)域參與IL-2與其受體的α、β和γ鏈的結合，尤其是屬于A螺旋(KTQLQLEHLLLTLQ)、E螺旋(RPRDLISNINVIVLELK)、F螺旋(TIVEFLNRWITFCQSIISTLT)、AB環(huán)和起始的B螺旋(NNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK)的區(qū)域。
使用濾膜斑點印跡技術和Western印跡型免疫轉移技術，還顯示從HIV+患者的血清獲得、并在人IL-2中進行了免疫純化的多克隆抗體可識別gp41蛋白質的寡聚體。
所進行的這些研究還表明，直接對抗HIV的gp41蛋白質的優(yōu)勢免疫保守區(qū)的鼠和人抗gp41單克隆抗體可識別IL-2區(qū)域，該區(qū)域參與后者與IL-2受體的α、β和γ鏈的結合。
因此根據(jù)本發(fā)明可獲得抗HIV病毒的疫苗，尤其是通過制備含至少一種表3bis所述的gp41區(qū)域的多肽，所述的多肽呈修飾形式，也即是說包含上面所述的至少一種突變。應清楚地認識到，545-682區(qū)域的這些被劃分的區(qū)域可具有某種專一性，這就是為什么上述一些區(qū)域可以重迭的原因。
實施例2=HIV1的gp41中的突變根據(jù)已知方法制備突變的gp41包膜糖蛋白。在列有gp41的有關序列和排列在后邊的突變序列的附表5中，對這些突變進行了描述。通過在相關的氨基酸下面劃線表示了這些突變的位置。
在無菌和無致熱原、含水鹽水溶液中制備疫苗組合物，每一組合物包括一種上述所獲得的突變gp41蛋白質。
用獲得的突變蛋白質對兔或鼠進行免疫接種，例如通過ELISA或PEPSCAN技術，來確定由這些動物產(chǎn)生的抗體是否能識別人白細胞介素2。選擇可誘導不能識別IL-2、但能識別gp41蛋白的抗體形成的突變蛋白質。
在《“肽抗原-實驗方法”》(G.B.WISDOW Ed.)，牛津大學出版社(1994)中，J.WORTHINGTON和K.MORGAN，“使用合成肽的表位作圖”描述了PEPSCAN技術。
實施例3=FIV的gp36中的突變FIV的gp36蛋白質的序列是已知的(參考ENV-FIVPE)。
附表6中描述了這種蛋白質中的一些序列，它與表3bis所述的gp41的保守區(qū)域是同源的，表6中有突變的例子。
表1
EIAV表示馬的貧血感染性病毒CAEV表示羊的腦炎病毒FIV貓免疫缺損病毒SIV猴免疫缺損病毒HIV人免疫缺損病毒表2aGP41_HV1Z2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1Z6 QARQLMSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1EL QARQLMSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1ND QARQLMSGIVHQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1MA QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLQDQRLLGMWGCSGP41_HV1Z8 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVESYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1C4 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIKAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGFWGCSGP41_HV1Sl QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1BN QARLLLSGIVQQQNNLLMAIEAQQHMLELTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1JR QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLMGIWGCSGP41_HV1J3 QARLLLSGIVQQQNNLLRAIEGQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1SC QARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1KB QARQLLPGIVQQQNNLLRAIDAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLMGIWGCSGP41_HV1Y2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1MN QARLLLSGIVQQQNNLLKAIEAQQHMLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGFWGCSGP41_HV1A2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGGSGP41_HV1QY QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1RH QARHLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1S3 QARKLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1H2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1H3 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1B1 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1PV QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1B8 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEGQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1MF QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1BR QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGP41_HV1W1 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1W2 QARQLLSGIVQQQNNLLRAIDAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGP41_HV1ZH QARRLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCS*** *:.***:****** **..***:*.************:**** **:**:*:*:****GP41_HV1Z2 GKLICTTTVPWNSSWSNRSLNDIWQNMTWMEWEREIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQEGP41_HV1Z6 GKLICTTTVPWNSSWSNRSLNDIWQNMTWMEWEREIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQEGP41_HV1EL GKHICTTNVPWNSSWSNRSLNEIWQNMTWMEWEREIDNYTGLIYSLIEESQTQQEKNEKEGP41_HV1ND GRHICTTNVPWNSSWSNRSLDEIWQNMTWMEWEREIDNYTGLIYSLIEESQIQQEKNEKEGP41_HV1MA GKHICTTFVPWNSSWSNRSLDDIWNNMTWMQWEKEISNYTGIIYNLIEESQIQQEKNEKEGP41_HV1Z8 GKHICTTTVPWNSSWSNKSLEEIWNNMTWIEWEREIDNYTGVIYSLIENSQIQQEKNEQDGP41_MV1C4 GKLICTTAVPWNASWSNKTLDQIWNNMTWMEWDREIDNYTHLIYTLIEESQNQQEKNQQEGP41_HV1S1 GKLICTTAVPWNASWSNKSLDQIWNNMTWMEWEREIDNYTNLIYTLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1BN GKLICTTAVPWNASWSNKSLSDIWDNMTWMEWEREIDNYTNLIYSLIEDSQIQQEKNEKEGP41_HV1JR GKLICTTAVPWNTSWSNKSLDSIWNNMTWMEWEKEIENYTNTIYILIEESQIQQEKNEQEGP41_HV1J3 GKLICTTAVPWNASWSNKSLEEIWDNMTWMEWEREIDNYTSLIYTLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1SC GKLICTTTVPWNTSWSNKSLDKIWGNMTWMEWEREIDNYTSLIYTLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1KB GKFICTTAVPWNTSWSNKSFNEIWDNMTWMEWEREINNYTNLIYNLIEESQNQQEKNEQDGP41_HV1Y2 GKLICTTTYPWNTSWSNKSLNEIWDNMTWMKWEREIDNYTHIIYSLIEQSQNQQEKNEQEGP41_HV1MN GKLICTTTVPWNASWSNKSLDDIWNNMTWMQWEREIDNYTSLIYSLLEKSQTQQEKNEQEGP41_HV1A2 GKLICTTAVPWNASWSNKSLEDIWDNMTWMQWEREIDNYTNTIYTLLEESQNQQEKNEQEGP41_HV1OY GKLICTTTVPWNASWSNKSLNEIWDNMTWMQWEREIDNYTHLIYTLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1RH GKLICTTTVPWNASWSNKSLNMIWNNMTWMQWEREIDNYTGIIYNLLEESQNQQEKNEQEGP41_HV1S3 GKLICTTTVPWNTSWSNKSLDKIWNNMTWMEWEREIDNYTSLIYTLLEESQNQQEKNEQEGP41_HV1H2 GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1H3 GKLLCTTAVPWNASWSNKSLEQIWNHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1B1 GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIRSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1PV GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1B8 GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1MF GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQFWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIDESQNQQEKNEQEGP41_HV1BR GKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1W1 GKLICTTTVPWNASWSNKSMDQIWNNMTWMEWEREIQNYTSLIYNLIEESQNQQEKNEQEGP41_HV1W2 GKLICTTTVPWNASWSNKSMNQIWDNLTWMEWEREIDNYTSIIYSLIEESQNQQGKNEQEGP41_HV1ZH GKIICPTNVPWNSSWSNKSQSDIWDKMTWLEWDKEVSNYTQVIYNLIEESQTQQEINERD*: :*.* ****:****:: . :* : **::*::*:.*** *: *:: ** ** *:::
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表3gp41(區(qū)域545-682)545-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITN - 682表3bisgp41的區(qū)域區(qū)域555-577QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG區(qū)域572-601QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW區(qū)域590-620RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS區(qū)域628-663WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ表4
表4bis
表5555-577區(qū)域中的突變區(qū)域555-577QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG突變1QQQNNLLAAIEAQQHLLQLTVWG突變2QQQNNLLRAIERQQHLLQLTVWG突變3QQQNNLLAAIERQQHLLQLTVWG突變4QQQNNLLRAIEAQQELLQLTVWG突變5QQQNNLLRAIEAQQQLLQLTVWG突變6QQQNNLLRAIEAQQHLLRLTVWG突變7QQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWG突變8QQQNNLLRAIEAQQQLLKLTVWG572-601區(qū)域中的突變區(qū)域572-601QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW突變1QLTVWGIKQLQARILAVERYLKAQQLLGIW突變2QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKDQQLLGIW突變3QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKAQQLLGIW突變4QLTVWGIKQLQARILAVEDYLKRQQLLGIW突變5QLTVWGIKQLQARITAVERYLKDQQLLGIW
表5(續(xù))590-620區(qū)域中的突變區(qū)域590-620RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變1KYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變2RYLKDQALLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變3RYLKDQQQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變4RYLKDQAQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變5RYLKDQARLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變6RYLKDQQLLNSWGCSGKLICTTAVPWNASWS突變7RYLKDQQLLGIWGCSQKLICTTAVPWNASWS突變8RYLKDQQLLGIWGCSFKLICTTAVPWNASWS突變9RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSS突變10 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNADTL突變11 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNATNR突變12 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTR突變13 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTS628-663區(qū)域中的突變區(qū)域628-663WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ突變1WNNMTWMEWDREINNYESLIHSLIEESQNQQEKNEQ突變2WNNMTWMEWDREINNYTSNIHSLIEESQNQQEKNEQ
表6區(qū)域651-673 EAIEKVTGALKINNLRLVTLEHQ突變1EAIEKVTRALKINNLRLVTLEHQ突變2EAIEKVTDALKINNLRLVTLEHQ變突3EAIEKVTAALKINNLRLVTLEHQ突變4EAIEKVTQALKINNLRLVTLEHQ區(qū)域668-697 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQEL突變1VTLEHQVLVIGLKVEAMEAFLYTAFAMQEL突變2VTLEHQVLVIGLKVEAMENFLYTAFAMQEL突變3VTLEHQVLVIGLKVEAMEYFLYTAFAMQEL突變4VTLEHQVLVIGLKVEAMERFLYTAFAMQEL突變5VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLKTAFAMQEL突變6VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLETAFAMQEL突變7VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLQTAFAMQEL突變8VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLRTAFAMQEL突變9VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLATAFAMQEL突變10 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFQMQEL突變11 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFKMQEL突變12 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFRMQEL突變13 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQIL突變14 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQAL突變15 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQSL突變16 VTLEHQVLVIGLKVEAMEKFLYTAFAMQFL區(qū)域686-718 KFLYTAFAMQELGCNQNQFFCKIPLELWTRYNM突變1KFLYTAFAMQELGCNQNKFFCKIPLELWTRYNM突變2KFLYTAFAMQELGCNQNRFFCKIPLELWTRYNM突變3KFLYTAFAMQELGCNQNGFFCKIPLELWTRYNM突變4KFLYTAFAMQELGCNQNAFFCKIPLELWTRYNM突變5KFLYTAFAMQELGCNQNQLFCKIPLELWTRYNM突變6KFLYTAFAMQELGCNQNQHFCKIPLELWTRYNM突變7KFLYTAFAMQELGCNQNQIFCKIPLELWTRYNM突變8KFLYTAFAMQELGCNQNQAFCKIPLELWTRYNM突變9KFLYTAFAMQELGCNQNQQFCKIPLELWTRYNM突變10 KFLYTAFAMQELGCNQNQRFCKIPLELWTRYNM區(qū)域727-762 WNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變1WNHGNITLGEWYNQTKDLQNKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變2WNHGNITLGEWYNQTKDLQHKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變3WNHGNITLGEWYNQTKDLQSKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變4WNHGNITLGEWYNQTKDLQAKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變5WNHGNITLGEWYNQTKDLQGKFYEIIMDIEQNNVQGKT突變6WNHGNITLGEWYNQTKDLQEKFYEIIMDIEQNNVQGKT
權利要求
1．獲得對抗與逆轉錄病毒所致的動物或人宿主感染有關的致病作用的疫苗的方法，這種逆轉錄病毒能夠侵入所述宿主的靶細胞，所述的靶細胞具有宿主蛋白的膜受體，其中疫苗試劑是基于包含所述逆轉錄病毒的致病株的至少部分包膜蛋白的多肽制備的，其中將所述多肽被制備成修飾形式，可以理解為-所述部分包膜蛋白選自那些包括上述包膜蛋白的優(yōu)勢免疫區(qū)的至少一個片段的包膜蛋白，所述片段含有至少一種氨基酸，它是上述優(yōu)勢免疫區(qū)的一種保守氨基酸，并且存在于所述致病株中，-所述多肽，呈非修飾狀態(tài)，其誘導直接對抗所述優(yōu)勢免疫區(qū)和宿主蛋白兩者的免疫應答，-所述修飾多肽選自那些誘導直接對抗所述包膜蛋白的優(yōu)勢免疫區(qū)、但不對抗宿主蛋白的免疫應答的多肽。
2．根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的優(yōu)勢免疫區(qū)選自-那些與所述宿主蛋白產(chǎn)生B型和/或T型交叉反應者，和/或-那些三維結構類似物，它含有前面已經(jīng)確定的部分的所述宿主蛋白。
3．根據(jù)前述任一項權利要求所述的方法，它具備至少一種下述的特性-所上述宿主蛋白是可溶性介體；-所述可溶性介體選自生長因子、蛋白質激素和細胞因子；-所述細胞因子為白細胞介素-2、白細胞介素-10、白細胞介素-15、白細胞介素-8或趨化因子。
4．根據(jù)前述任一項權利要求所述的方法，它具有至少一種下述的特性-所述病毒選自以下病毒HIV、FIV、SIV、ALV、MULV、FELV、HTLV、STLV、BLV、Rous肉瘤病毒、綿羊肺腺瘤病-綿羊脫髓鞘性腦白質炎病毒、貓肉瘤病毒、禽髓細胞瘤病病毒、禽成髓細胞過多癥病毒、靈長類D型逆轉錄病毒、哺乳動物腫瘤誘導B型逆轉錄病毒；-所述包膜蛋白是所述逆轉錄病毒的一種跨膜糖蛋白；-所述跨膜糖蛋白是HIV、FIV或SIV病毒的跨膜糖蛋白；-所述糖蛋白為HIV1的gp41蛋白；-所述疫苗試劑包含修飾形式的多肽，該多肽包括HIV1的gp41蛋白的至少部分545-682區(qū)域；-所述修飾多肽包含選自表5所述的突變；-所述糖蛋白為FIV的gp36蛋白；-所述修飾多肽包含選自表6所述的突變。
5．根據(jù)前述任一項權利要求所述的方法，其中所述多肽為所述逆轉錄病毒的至少部分跨膜糖蛋白的寡聚體形式，所述多肽呈修飾狀態(tài)。
6．疫苗組合物，它包含按照權利要求1-5的任一項權利要求所述的方法得到的疫苗試劑。
7．按照權利要求6所述的疫苗組合物通過免疫接種獲得的抗體，以及含這種抗體的藥物組合物，所述抗體能識別所述包膜蛋白，而不能識別宿主蛋白。
8．按照權利要求1-5的任一項權利要求所述的方法可獲得的修飾多肽在制備疫苗組合物中的應用，這種組合物可預防與逆轉錄病毒所致的動物或人宿主感染有關的致病作用，該逆轉錄病毒能夠侵入所述宿主的靶細胞，所述的靶細胞具有宿主蛋白的膜受體。
9．編碼權利要求1-5的任一項權利要求所述的修飾多肽的聚核苷酸，以及含所述聚核苷酸的表達載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于獲得對抗與逆轉錄病毒所致的宿主感染有關的致病作用的疫苗的方法,在本發(fā)明中,逆轉錄病毒的靶細胞具有宿主蛋白的膜受體,這種病毒感染誘導直接對抗病毒的包膜蛋白和宿主蛋白的免疫應答。本方法包括以修飾形式的多肽為基礎制備疫苗試劑,因此這種疫苗試劑可誘導直接對抗包膜蛋白、但不對抗宿主蛋白的免疫應答,所述多肽包括逆轉錄病毒包膜蛋白的優(yōu)勢免疫區(qū)和保護區(qū)的片段。
文檔編號C07K16/24GK1281371SQ98811909
公開日2001年1月24日 申請日期1998年11月17日 優(yōu)先權日1997年11月17日
發(fā)明者皮埃爾·弗朗索瓦·塞爾 申請人:茜泊坎普公司