專利名稱：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于藥物領(lǐng)域的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)，其具有如抗癌作用的生理活性，并用于此領(lǐng)域。
先有技術(shù)近些年，提出了一種與細(xì)胞組織死亡有關(guān)的細(xì)胞凋亡模型。
不象壞死是細(xì)胞病理死亡，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基因本身原始編程的死亡。因此，起細(xì)胞凋亡作用的基因被一定的外因或內(nèi)因激活，在所述基因作用下，程序死亡蛋白生長，于是細(xì)胞本身由于程序死亡蛋白的形成而分解和死亡。
如果這種細(xì)胞凋亡能在所希望的組織或細(xì)胞中表達(dá)，從自然狀態(tài)的活體中排除不必要的和有害細(xì)胞將成為可能，并且意義非凡。
發(fā)明所解決課題用于臨床治療的藥物包括很多制劑，如抗癌劑(如烷化劑、代謝拮抗劑和植物生物堿)、抗生素、免疫強(qiáng)化劑、免疫調(diào)節(jié)劑等。但很難說這些藥物已完全建立起來。
本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)展具有生理功能如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的高度安全的物質(zhì)，以及提供制備該物質(zhì)的方法和含該物質(zhì)的藥物。
解決課題的手段以下概述本發(fā)明。首先，本發(fā)明的第一部分涉及由以下式[Ⅰ]～[Ⅷ]的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)或其光學(xué)活性體或其鹽。 (式[Ⅲ]中，R1是H、氨基、低級(jí)烷基或在氨基酸有取代基的低級(jí)烷基；R2是從氨基酸中去掉參與肽鍵的氨基和羧基之后的二價(jià)殘基；X是0-或氨基；Yk-是k價(jià)陰離子；m是0-4的整數(shù)；n是0或正整數(shù)；k是正整數(shù)；當(dāng)n為2或大于2時(shí)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的R2可以是相同或不同，當(dāng)X是0-時(shí)，該物質(zhì)是內(nèi)鹽，Yk-不存在。) (式[Ⅵ]中，R3和R4可以是相同或不同，分別為含1-3個(gè)碳的烷基。) (式[Ⅶ]中，R5和R6可以是相同或不同，分別為芳香氨基酸的芳香環(huán)。) 另外，本發(fā)明的第二部分涉及藥物組合物，其特征在于含本發(fā)明的第一部分涉的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)或其光學(xué)活性體或其鹽。
在本發(fā)明的第二部分中的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的藥物組合物是一種抗癌劑。
附圖簡述附

圖1為咪唑基環(huán)戊烯酮的HPLC反相洗提圖。附圖2為咪唑基環(huán)戊烯酮的質(zhì)譜圖。附圖3為咪唑基環(huán)戊烯酮的1H-NMR譜圖。附圖4為咪唑基環(huán)戊烯酮的13C-NMR譜圖。附圖5為咪唑基環(huán)戊烯酮的UV吸收譜圖。附圖6為咪唑基環(huán)戊烯酮的IR吸收譜圖。附圖7為反相HPLC的保留時(shí)間與210nm處吸光度的關(guān)系。附圖8為三羥基苯基乙酰胺的質(zhì)譜圖。附圖9為三羥基苯基乙酰胺的1H-NMR譜圖。附圖10為三羥基苯基乙酰胺的13C-NMR譜圖。附圖11為三羥基苯基乙酰胺的IR吸收譜圖。附圖12為B-UG的反相HPLC洗脫時(shí)間與215nm處吸收的關(guān)系。附圖13為B-UG的質(zhì)譜圖。附圖14為B-UG的1H-NMR譜圖。附圖15為B-UG的13C-NMR譜圖。附圖16為B-UG的UV吸收譜圖。附圖17為B-UG的IR吸收譜圖。附圖18為MC2的質(zhì)譜圖。附圖19為MC2的1H-NMR譜圖。附圖20為MC2的13C-NMR譜圖。附圖21為MC2的UV吸收譜圖。附圖22為MC2的IR吸收譜圖。附圖23為HMC2的1H-NMR譜圖。附圖24為HMC2的13C-NMR譜圖。附圖25為S-1127的反相HPLC洗脫時(shí)間與215nm處吸收的關(guān)系。附圖26為S-1127的質(zhì)譜圖。附圖27為S-1127的1H-NMR譜圖。附圖28為S-1127的13C-NMR譜圖。附圖29為S-1127的UV吸收譜圖。附圖30為S-1127的IR吸收譜圖。附圖31為培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞生存數(shù)的關(guān)系。附圖32為tCD的洗脫時(shí)間與215nm處吸收的關(guān)系。附圖33為LCD1的質(zhì)譜圖。附圖34為LCD1的1H-NMR譜圖。附圖35為LCD1的13C-NMR譜圖。附圖36為LCD1的UV吸收譜圖。附圖37為LCD1的IR吸收譜圖。附圖38為LCD2的質(zhì)譜圖。附圖39為LCD2的1H-NMR譜圖。
發(fā)明的實(shí)施方案以下將對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
首先，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)式[Ⅰ]表示的2-羥基-4-(1-咪唑基)-2-環(huán)戊烯基-1-酮(以下稱為“咪唑基環(huán)戊烯酮”)可由式[Ⅸ]表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯基-1-酮(以下稱為“環(huán)戊烯酮”)與咪唑反應(yīng)制備。所述咪唑基環(huán)戊烯酮具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長活性。 本發(fā)明提供了一種式[Ⅰ]表示的2-羥基-4-(1-咪唑基)-2-環(huán)戊烯基-1-酮、其光學(xué)活性體或其鹽的制備方法，其特征在于由式[Ⅸ]表示的環(huán)戊烯酮、其光學(xué)活性體或其鹽與咪唑反應(yīng)制備。
用于本發(fā)明的式[Ⅸ]表示的環(huán)戊烯酮可通過本發(fā)明公開的方法或一種化學(xué)合成方法[《碳水化合物研究》Carbohydrate Research，247卷，217-222頁(1993)；《瑞士化學(xué)學(xué)報(bào)》Helvetica Chimica Acta，55卷，2838-2844頁(1972)]制備。此外，由熱處理選自糖醛酸、糖醛酸衍生物、含糖醛酸的糖類化合物、含糖醛酸衍生物的糖類化合物、含含糖醛酸糖類化合物的物質(zhì)、含含糖醛酸衍生物糖類化合物的物質(zhì)[見日本癌癥學(xué)會(huì)第56屆年會(huì)論文集，599頁(1997)和PCT／JP97／03052說明書]。本發(fā)明中，熱處理物質(zhì)，制備的化合物和其純化產(chǎn)物也可使用。
含糖醛酸和／或糖醛酸衍生物的糖類化合物的多糖可通過已知的化學(xué)、酶或物理方法制備。例如，可用商品果膠或藻酸。用合成方法合成的糖醛酸、糖醛酸衍生物、寡糖等也可用于本發(fā)明。
例如，當(dāng)D-葡糖醛酸作為糖醛酸使用時(shí)，其1％的溶液于121℃加熱4小時(shí)，經(jīng)該熱處理過程得到[Ⅸ]表示的環(huán)戊烯酮。由該熱處理過程得到的環(huán)戊烯酮用溶劑提取，濃縮提取液。接著，該濃縮提取液用硅膠柱層析分離，濃縮洗脫的環(huán)戊烯酮流分，用氯仿從濃縮液中提取環(huán)戊烯酮，提取濃縮液注入正相柱層析，分離出熱處理生成的環(huán)戊烯酮。
對分離的環(huán)戊烯酮光學(xué)拆分，得到(-)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯基-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯基-1-酮。不必說由合成方法得到的環(huán)戊烯酮也可以進(jìn)行光學(xué)拆分。
光學(xué)活性體的分離可通過使外消旋混合物進(jìn)行機(jī)械拆分，優(yōu)選結(jié)晶，通過結(jié)晶拆分成非對映異構(gòu)體或包和物，通過酶或微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)拆分，通過色譜進(jìn)行拆分等。
色譜拆分可用氣相色譜、液相色譜、薄層層析等，可使用對它們分別適用的手性固定相。用液相色譜進(jìn)行光學(xué)拆分，可采用使用手性固定相的方法、使用手性洗脫液的方法、分離非對映異構(gòu)體等方法。手性固定性如酰胺型、脲型、配位體交換型固定相、多糖-多糖衍生物固定相、蛋白質(zhì)固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等均可用作手性固定相。對于洗脫液，己烷型、醇型、含水(緩沖液)型均適合與上述固定相配合使用。
例如，將環(huán)戊烯酮溶于乙醇。在此乙醇溶液中加己烷／乙醇(94／6)制成環(huán)戊烯酮溶液。將此樣品溶液注入裝有Chiral Pack AS(由DaicelChemical Industries制造)的HPLC，柱溫40℃，流動(dòng)相己烷／乙醇(94／6)，環(huán)戊烯酮可被光學(xué)拆分。
HPLC光學(xué)拆分條件。柱Chiral Pack AS(由Daicel Chemical Industries制造)2．0cm×25．0cm流動(dòng)相己烷／乙醇(94／6)流速14．0毫升／分檢測UV 210 nm樣品注射量150 μl(2．55mg)光學(xué)拆分的(-)-反-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯基-1-酮(以下稱為(-)-環(huán)戊烯基酮)的旋光度為[α]D20-105°(c0．30，乙醇)，光學(xué)拆分的(+)-反-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯基-1-酮(以下稱為(+)-環(huán)戊烯酮)的旋光度為[α]D20+104°(c0．53，乙醇)。旋光度通過上述DIP-370型旋光儀(Nippon Bunko制造)測定。(-)-環(huán)戊烯酮和(+)-環(huán)戊烯酮的HPLC光學(xué)拆分的洗脫時(shí)間分別為33分鐘和40分鐘。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽與咪唑反應(yīng)，在反應(yīng)溶液中生成本發(fā)明式[Ⅰ]表示的咪唑基環(huán)戊烯酮。對于咪唑，可用市售的或由乙二醛、甲醛水溶液和氨合成或由咪唑-4，5-二羧酸脫羧制備。
環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽與咪唑的反應(yīng)優(yōu)選在pH中性進(jìn)行。
通過環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽與咪唑反應(yīng)生成的咪唑環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽具有強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長活性，并且用所述活性作為指標(biāo)，咪唑環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽可從反應(yīng)溶液中純化和分離。對于純化和分離的方式，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)物中咪唑環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體或它們的鹽可被純化和分離。
例如，環(huán)戊烯酮與咪唑在37℃反應(yīng)1小時(shí)，在反應(yīng)溶液中生成式[Ⅰ]表示的咪唑基環(huán)戊烯酮，將含所述衍生物的反應(yīng)產(chǎn)物注入正相柱層析，咪唑環(huán)戊烯酮可被純化和分離，并且，通過光學(xué)拆分可得到光學(xué)活性體。
所述咪唑環(huán)戊烯酮的鹽，是藥物可接受鹽。例子有鹽酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、鈉鹽、鉀鹽和銨鹽，可用已知方法轉(zhuǎn)變成鹽。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加熱N-乙?；禾前范┨腔蚱溲苌飼r(shí)，生成式[Ⅱ]表示的N-(2，3，4-三羥基苯基)乙酰胺，這是一種具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長活性的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明還提供一種制備式[Ⅱ]表示N-(2，3，4-三羥基苯基)乙酰胺或其鹽的方法，其特征在于包括加熱N-乙?；禾前范┨腔蚱溲苌锏牟襟E。
一種所述方法所例子是，在制備N-(2，3，4-三羥基苯基)乙酰胺或其鹽的方法的方法中，N-乙?；禾前范┨腔蚱溲苌锸鞘絒Ⅹ]表示的N-乙酰基-D-半乳糖胺二醛糖或其對映體或其衍生物。 N-乙?；禾前范┨鞘且环N醛，其中N-乙?；禾前返?位被氧化，其分子式為C6H13NO6，其分子量為219．19。
N-乙?；禾前范┨强赏ㄟ^化學(xué)或酶催化的方式將N-乙酰基己糖胺的6位氧化制得。化學(xué)氧化的一個(gè)例子是Fenton法，其中氧化是在二價(jià)鐵存在下用過氧化氫進(jìn)行。而酶催化氧化是使用半乳糖氧化酶[EC 1．1．3．9；Cooper等；生物化學(xué)雜志，J．Biol．Chem．234卷，445-448頁(1959)]。用半乳糖氧化酶氧化N-乙?；?D-半乳糖胺得到N-乙?；禾前范┨?。
N-乙?；禾前范┨茄苌锏睦影?、醚和所有的可通過加熱處理生成本發(fā)明式[Ⅱ]所示的N-(2，3，4-三羥基苯基)乙酰胺(以下稱為三羥基苯基乙酰胺)的所有物質(zhì)。N-乙酰基己糖胺二醛糖酯的例子有乙酸酯、甲酸酯、硫酸酯和磷酸酯等，其可由N-乙?；禾前范┨侵苽?。也可以通過醚化制備醚化合物，這些醚化合物可用于本發(fā)明。含N-乙酰基己糖胺二醛糖和／或其衍生物的化合物也可用于本發(fā)明。
對于本發(fā)明的N-乙酰基己糖胺二醛糖和其衍生物，只要經(jīng)熱處理能夠生成式[Ⅱ]表示的三羥基苯基乙酰胺，就沒有特別限制。
三羥基苯基乙酰胺具有強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長活性，并且用所述活性作為指標(biāo)，三羥基苯基乙酰胺可從反應(yīng)溶液中純化和分離。對于純化和分離的方式，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)產(chǎn)物中三羥基苯基乙酰胺可被純化和分離。
例如，N-乙?；禾前范┨窃?21℃反應(yīng)4小時(shí)，在反應(yīng)溶液中生成式[Ⅱ]表示的三羥基苯基乙酰胺，將含所述衍生物的反應(yīng)產(chǎn)物注入反相柱層析，三羥基苯基乙酰胺可被純化和分離。
所述三羥基苯基乙酰胺的鹽，是藥物可接受鹽。例子有與堿金屬如鈉、鉀形成的鹽，可用已知方法轉(zhuǎn)變成所述鹽。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)至少一種選自以下(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)在式[Ⅺ]表示的化合物存在下被加熱，生成式[Ⅲ]表示3-羥基-1-取代的吡啶鎓鹽(以下稱為取代的吡啶鎓鹽)，所述物質(zhì)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和抑制癌細(xì)胞生長活性。(a1)糖醛酸或糖醛酸衍生物(a2)含糖醛酸和／或糖醛酸衍生物的糖類化合物，和(a3)含有含糖醛酸和／或含糖醛酸衍生物的糖類化合物的物質(zhì)； (式[Ⅺ]中，R7是H、氨基、低級(jí)烷基或在氨基酸有取代基的低級(jí)烷基；R8是氨基酸中去掉參與肽鍵的氨基和羧基后的二價(jià)殘基；X是OH或氨基；m是0-4的整數(shù)；n是0或正整數(shù)；當(dāng)n為2或大于2時(shí)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的R8可以是相同或不同。)因此，本發(fā)明還提供一種制備式[Ⅲ]表示3-羥基-1-取代的吡啶鎓鹽或其光學(xué)活性體的方法，其特征在于至少一種選自以上(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)在式[Ⅺ]表示的化合物或其衍生物存在下被加熱處理。
糖醛酸(uronic acid)有時(shí)稱為糖醛酸(glycouronic acid)，是醛糖的醛基部分保持不變，而僅另一端的伯醇基被氧化為羧基的羥基醛羧酸的一般名稱。其存在于自然界中，是動(dòng)物和植物的各種多糖的組成部分。
對用于本發(fā)明的糖醛酸沒有特別的限制。因此，糖醛酸的例子包括半乳糖醛酸、葡糖醛酸、古洛糖醛酸、甘露糖醛酸、艾杜糖醛酸和上述一種的鹽，糖醛酸衍生物的例子有上述各種的內(nèi)酯、酯、酰胺、鹽等，糖醛酸內(nèi)酯的例子有葡糖醛酸-6，3-內(nèi)酯、甘露糖醛酸-6，3-內(nèi)酯、和艾杜糖醛酸-6，3-內(nèi)酯。
糖醛酸酯的例子包括糖醛酸甲酯、乙酯、丙二醇酯和羧甲酯等，可由糖醛酸制備。糖醛酸酰胺可由糖醛酸酰胺化制備。其鹽可由常規(guī)方法制備。
在本說明書中對含糖醛酸和／或糖醛酸衍生物的糖類化合物沒有特別限制，合適的例子有果膠、果膠酸、藻酸、透明質(zhì)酸、肝素、巖藻依聚糖、軟骨素硫酸鹽、軟骨素和硫酸皮膚素，以及它們經(jīng)化學(xué)、酶催化或物理處理得到的分解產(chǎn)物、分解產(chǎn)物衍生物和分解產(chǎn)物的鹽。
對于用于本發(fā)明的式[Ⅺ]表示的化合物，只要其與至少一種選自以上(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)、優(yōu)選葡糖醛酸加熱得到式[Ⅲ]表示的取代的吡啶鎓鹽，沒有特別限制。
式[Ⅺ]表示的化合物的類型可根據(jù)目標(biāo)化合物的取代吡啶鎓鹽和其光學(xué)活性體的式[Ⅲ]中R7、R8和X的類型以及m和n的數(shù)值而適當(dāng)加以選擇。對于式[Ⅺ]表示的化合物，可使用α-氨基酸，例如對于含不對稱碳原子的氨基酸，可使用L體、D體和其混合物。對于式[Ⅺ]表示的化合物，可用β-氨基酸、寡肽、多肽或糖肽代替α-氨基酸。也可以使用其衍生物，如鹽、酯、酰胺、內(nèi)酯和內(nèi)酰胺。
在本發(fā)明中，也可使用含式[Ⅺ]表示的化合物的物質(zhì)。
選自以上(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)在式[Ⅺ]表示的化合物存在下被加熱，生成取代的吡啶鎓鹽或其光學(xué)活性體。對于反應(yīng)條件，如加熱時(shí)選自以上(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)的濃度、以及式[Ⅺ]表示的化合物的濃度、pH值、加熱溫度、加熱時(shí)間等沒有特別限制，條件只是取代的吡啶鎓鹽或其光學(xué)活性體能夠生成。
生成的取代的吡啶鎓鹽在其吡啶環(huán)中帶有正電荷，并且當(dāng)式[Ⅲ]中X為O-時(shí)形成內(nèi)鹽，而當(dāng)X為氨基時(shí)，其與一價(jià)負(fù)離子形成鹽。此外，多價(jià)負(fù)離子與多取代的吡啶鎓鹽也形成鹽，這樣的鹽也包含于本發(fā)明。
此外，帶正電和負(fù)電的取代的吡啶鎓鹽能與對映的離子形成鹽。這樣的鹽也包含于本發(fā)明。
可用已知方法對形成的取代的吡啶鎓鹽或其光學(xué)活性鹽進(jìn)行純化和分離，用抑制癌細(xì)胞生長活性作為指標(biāo)。對于純化和分離的方式，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)產(chǎn)物中取代的吡啶鎓鹽或其光學(xué)活性體或其鹽可被純化和分離。
例如，葡糖醛酸與甘氨酸水溶液在121℃反應(yīng)30分鐘，在反應(yīng)溶液中生成式[Ⅻ]表示的1-羧甲基-3-羥基吡啶鎓內(nèi)鹽(以下稱為B-UG)，將含所述衍生物的反應(yīng)產(chǎn)物注入硅膠柱層析和反相柱層析，B-UG可被純化和分離。 當(dāng)純化的取代的吡啶鎓鹽是外消旋物時(shí)，其通過光學(xué)拆分，如上述方法，得到(-)-取代的吡啶鎓鹽和(+)-取代的吡啶鎓鹽。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體可由環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體與醇反應(yīng)制備，并且當(dāng)式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體用酸處理時(shí)，生成式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物；環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體用酸處理時(shí)，生成式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物；并且由此生成的式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物具有強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞生長活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。
因此，本發(fā)明提供了一種由式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成的組合物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備上述組合物的方法，其特征在于包含將式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體用酸處理的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備上述組合物的方法，其特征在于包含將環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體用酸處理的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種藥物組合物，其特征在于含有上述組合物作為其有效組分。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體的方法，其特征在于包括環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體與含1-3個(gè)碳原子的醇或其反應(yīng)性衍生物反應(yīng)的步驟。
當(dāng)環(huán)戊烯酮和／或其光學(xué)活性體與醇反應(yīng)時(shí)，在反應(yīng)溶液中生成了本發(fā)明的式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體。用于本發(fā)明的含1-3個(gè)碳原子的醇的例子有甲醇、乙醇、1-丙醇和2-丙醇。環(huán)戊烯酮和／或其光學(xué)活性體與醇反應(yīng)推薦在酸性pH值進(jìn)行。兩種物質(zhì)的反應(yīng)性衍生物的例子有鹽如鈉鹽，?；u和活性酯等。
對于環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體與醇反應(yīng)生成的環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體的純化和分離，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)產(chǎn)物中環(huán)戊烯酮衍生物或其光學(xué)活性體可被純化和分離。
當(dāng)式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物用酸處理時(shí)，生成式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成的組合物；對于酸的類型和濃度、酸處理的溫度和反應(yīng)時(shí)間沒有特別的限制，只要上述反應(yīng)可以進(jìn)行即可。所用的酸的例子有無機(jī)酸如鹽酸、硫酸和硝酸，有機(jī)酸如乙酸、甲酸、檸檬酸、乳酸和抗壞血酸。
例如，環(huán)戊烯酮溶于10N HCl和甲醇的5∶95混合物中并于37℃反應(yīng)過夜，在反應(yīng)溶液中生成了式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物，將含所述衍生物的反應(yīng)產(chǎn)物注入反相柱層析，環(huán)戊烯酮衍生物可被純化和分離。
當(dāng)式[Ⅵ]表示的環(huán)戊烯酮衍生物溶于1mM HCl并于37℃反應(yīng)16小時(shí)，生成式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成的組合物，將含上述物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物注入反相柱層析，含2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物可被純化。
當(dāng)環(huán)戊烯酮用酸處理時(shí)，生成式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物；對于酸的類型和濃度、酸處理的溫度和反應(yīng)時(shí)間沒有特別的限制，只要上述反應(yīng)可以進(jìn)行的條件即可。所用的酸的例子有無機(jī)酸如鹽酸、硫酸和硝酸，有機(jī)酸如乙酸、甲酸、檸檬酸、乳酸和抗壞血酸。
例如當(dāng)環(huán)戊烯酮溶于300mM硫酸并于100℃反應(yīng)4小時(shí)，生成2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成的組合物，將含上述物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物注入反相HPLC，含2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮的組合物可被純化。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)至少一種選自以下(b1)、(b2)和(b3)的物質(zhì)在至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)存在下被加熱，生成式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽，所述物質(zhì)具有抑制癌細(xì)胞生長活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽的方法，其特征在于至少一種選自以下(b1)、(b2)和(b3)的物質(zhì)在至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)存在下被加熱。(b1)芳香氨基酸(b2)芳香氨基酸衍生物(b3)含有芳香氨基酸和／或芳香氨基酸衍生物的物質(zhì)對于用于本發(fā)明的芳香氨基酸、芳香氨基酸衍生物和含有芳香氨基酸和／或芳香氨基酸衍生物的物質(zhì)沒有特別限制，只要當(dāng)其與至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)一起加熱時(shí)能得到式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽即可。
可用的芳香氨基酸的例子有酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸、DOPA和多巴胺，以及其L-體、D-體和它們的混合物。對于芳香氨基酸衍生物，可用含芳香氨基酸的寡肽、含芳香氨基酸的多肽和含芳香氨基酸的糖肽。也可以使用其鹽、酯、酰胺、內(nèi)酯和內(nèi)酰胺等。
在本發(fā)明中，也可使用含芳香氨基酸和／或芳香氨基酸衍生物的物質(zhì)。
當(dāng)上述(a3)中含有至少一種選自上述(b1)和(b2)的物質(zhì)，或，當(dāng)上述(b3)中含有至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)時(shí)，不必說在熱處理前另外加入至少一種選自以下(b1)、(b2)和(b3)的物質(zhì)不是必須的。
當(dāng)至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)在至少一種選自上述(b1)、(b2)和(b3)的物質(zhì)的存在下加熱時(shí)，生成式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽。對于加熱條件，如至少一種選自上述(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)和至少一種選自上述(b1)、(b2)和(b3)的物質(zhì)濃度、pH值、溫度、時(shí)間的沒有特別限制，只要是生成所述化合物或其鹽的條件的一種即可。
在加熱處理中，至少一種選自(a1)、(a2)和(a3)的物質(zhì)起氧化劑作用。
可用已知方法對形成的式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽進(jìn)行純化和分離，用抑制癌細(xì)胞生長活性作為指標(biāo)。對于純化和分離的方式，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)產(chǎn)物中式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽可被純化和分離。
例如，葡糖醛酸與酪氨酸的水溶液在121℃反應(yīng)4小時(shí)，在反應(yīng)溶液中生成式[ⅩⅢ]表示的2，4-雙(p-羥苯基)-2-丁烯醛(以下稱為S-1127)或其鹽，將含該化合物的反應(yīng)產(chǎn)物注入硅膠柱層析和反相柱層析，S-1127可被純化和分離。 在本發(fā)明得到的式[Ⅵ]表示的化合物或其鹽中，2位和3位碳原子之間的鍵是雙鍵，因此有順式和反式化合物。本發(fā)明的式[Ⅶ]表示的化合物或其鹽可以是順式和反式化合物的任意一種或其混合物。
本發(fā)明得到的式[Ⅶ]表示的化合物的鹽有藥物可接受鹽。例如鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽和鎂鹽，可用已知方法轉(zhuǎn)變成所述鹽。
本發(fā)明人以下通過環(huán)戊烯酮與半胱氨酸反應(yīng)成功地制備了式[Ⅷ]表示的9-半胱氨酰-S-基-2-氧代-6，12-二硫代-3，14-二氮雜四環(huán)[9，2，1，03，7，07，11]十四烷-4-羧酸(以下稱為tCD)，此外，本發(fā)明完成了tCD的分離。
因此，本發(fā)明提供了一種制備tCD或其光學(xué)活性體或其鹽的方法，其特征在于通過環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體與半胱氨酸反應(yīng)制備。
通過環(huán)戊烯酮或其光學(xué)活性體與半胱氨酸反應(yīng)制備的tCD、其每種非對映異構(gòu)體或其光學(xué)活性體或其鹽具有抑制癌細(xì)胞生長活性，并且用所述活性作為指標(biāo)，tCD、其每種非對映異構(gòu)體或其光學(xué)活性體或其鹽可從反應(yīng)溶液中純化和分離。對于純化和分離的方式，可用已知的化學(xué)方法和物理方法進(jìn)行純化，傳統(tǒng)已知純化方法如凝膠過濾、用分子量分級(jí)膜分級(jí)、溶劑萃取、分餾和使用離子交換樹脂的各種色譜法可聯(lián)合使用，反應(yīng)產(chǎn)物中tCD、其每種非對映異構(gòu)體或其光學(xué)活性體或其鹽可被純化和分離。
例如，環(huán)戊烯酮與L-半胱氨酸于37℃反應(yīng)過夜，在反應(yīng)溶液中生成了式[Ⅷ]表示的tCD，將含所述化合物的反應(yīng)溶液注入反相柱層析，tCD可被純化和分離。
對于tCD的鹽，有藥物可接受的鹽。例子有鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、鈉鹽、鉀鹽和銨鹽，可用已知方法轉(zhuǎn)變成所述鹽。
選自誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡物質(zhì)，由式[Ⅰ]、[Ⅱ]、[Ⅲ]、[Ⅳ]、[Ⅴ]、[Ⅵ]、[Ⅶ]或[Ⅷ]表示的化合物(以下稱為“本發(fā)明化合物”)、其光學(xué)活性體或其鹽具有生理學(xué)活性，如抗癌活性、抑制癌細(xì)胞生長活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性、抑制拓樸異構(gòu)酶Ⅱ活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化活性、抗風(fēng)濕活性、抑制慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性、誘導(dǎo)產(chǎn)生Fas抗原活性、抗菌活性、抗病毒活性、改善肝功活性、誘導(dǎo)熱休克蛋白質(zhì)活性、血液成分的正?；钚浴⒃鰪?qiáng)癌免疫活性、抗炎活性、抑制腫瘤壞死因子表達(dá)活性、抑制一氧化氮產(chǎn)生活性，免疫調(diào)節(jié)活性如遲發(fā)型過敏反應(yīng)抑制活性、淋巴細(xì)胞早幼化反應(yīng)抑制活性、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制活性、IgE產(chǎn)生抑制活性和角叉菜膠水腫抑制活性，由于這些活性，含選自本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽中至少一種化合物作為活性組分的藥物作為起生物防御功能作用的藥物非常有用，如起抗體產(chǎn)生功能的藥物制劑、抗炎劑、抗變態(tài)反應(yīng)劑、抗風(fēng)濕劑和干擾素誘導(dǎo)劑，影響糖代謝的藥物如治療糖尿病，和對病原生物起作用如抗菌劑和抗病毒劑藥物。因此，由本發(fā)明得到的藥物制劑對于對本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽敏感的病癥非常有用，例如，作為藥物組合物用于治療或預(yù)防，如，癌癥、病毒性疾病、風(fēng)濕、糖尿病、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病、炎癥等。
當(dāng)具有不同生理作用的選自本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的至少一種化合物用作有效成分并通過與已知的藥物載體制成藥物制劑，使制備這樣一種藥物組合物成為可行。
本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有細(xì)胞生長抑制作用和對癌細(xì)胞具有抗癌作用，所述癌細(xì)胞如人類前髓白血病細(xì)胞HL-60、人類急性成淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞MOLT-3、肺癌細(xì)胞A-549、SV40-轉(zhuǎn)化肺癌細(xì)胞WI-38VA13、肝癌細(xì)胞Hep G2、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116、人類結(jié)腸癌細(xì)胞SW 480、人類結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr、胃癌細(xì)胞AGS和骨髓瘤細(xì)胞。因此，本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽可以用作抗癌劑的有效成分。此外，這些化合物還具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用。本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的抑制癌細(xì)胞生長作用的機(jī)理不限制本發(fā)明的范圍，并且，例如，抑制拓樸異構(gòu)酶Ⅱ作用和對癌細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用被本發(fā)明的抗癌活性覆蓋。
當(dāng)具有抗癌活性的至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物用作有效成分并與已知的藥物載體混合制成藥物制劑時(shí)，使制備這樣一種抗癌劑成為可行。通常，至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物與藥物可接受的液體或固體載體混合，并且，如需要，加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等制成抗癌制劑，其可以是固體，如片劑、顆粒劑、散劑、粉劑、膠囊等，或液體，如溶液劑、懸浮液劑、乳劑等。此外，其可以是干制劑，可在使用前加入合適的載體制成液體。
藥物載體可選自上述的類型并形成制劑。對于口服制劑，可使用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽等。在制備口服制劑時(shí)，還可以混入粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動(dòng)促進(jìn)劑、矯味劑、色素、調(diào)味劑等。
另一方面，對于腸胃外制劑，可用已知方法制備，其中根據(jù)本發(fā)明作為藥物組合物中用作有效成分的至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物溶解或懸浮于一種分散劑，所述分散劑如蒸餾水、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、注射用植物油，芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等，如需要，在其中加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、止痛劑等。
本發(fā)明的抗癌劑以適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，取決于制劑的形式。對于給藥方法沒有特別的限制，可以通過口服、外用和注射的方式實(shí)施。注射制劑通過，例如，靜脈、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等方式實(shí)施，外用制劑的實(shí)施包括栓劑等。
作為抗癌劑的劑量是由制劑的形式、給藥方式、使用目的、以及年齡、體重和病人要治療的癥狀決定，不是一個(gè)常量，但通常制劑中至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的量為每天0．1μg到200mg／kg(成人)。當(dāng)然，劑量可根據(jù)不同情況改變，因此，有時(shí)低于上述劑量就足夠了，情況相反時(shí)，高于上述劑量是必須的。本發(fā)明的藥物制劑可直接口服，此外，其可加到任何食物和蔬菜中，因此，該藥劑可在日常生活中攝取。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抗癌作用，處于低濃度時(shí)，即表現(xiàn)出誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的能力，因此，其對于癌細(xì)胞作為分化誘導(dǎo)劑(消除癌變劑decancerizing agent)非常有用。含用作有效成分的至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑可根據(jù)上述方法制備成抗癌藥物制劑，并可按抗癌劑同樣的方式給藥。
上述誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑可用于誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的方法中。因此，當(dāng)至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物用作有效成分，其分化癌細(xì)胞成為可能，并且此方法對于說明誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的機(jī)理，對于篩選分化誘導(dǎo)劑都非常有用。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抗菌作用，當(dāng)從這些化合物中選擇的至少一種化合物用作活性組分，并與已知的藥物載體混合制成藥物制劑，就制成了抗菌劑。所述的藥物制劑可以用以上述及的制備抗癌劑的同樣方法制備，并且可以用和抗癌劑的同樣方法給藥。此外，其可以與乙醇、甘氨酸、乙酸鈉、抗壞血酸、脂肪酸甘油酯、鹽、EDTA和其它抗菌物質(zhì)一起使用。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑含至少一種選自本發(fā)明的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分。其藥物制劑可以用以上述及的制備抗癌劑的同樣方法制備，并且可以用和抗癌劑的同樣方法給藥。
作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的劑量不是十分具體，是由制劑的形式、給藥方式、使用目的、以及年齡、體重和誘導(dǎo)劑施用的對象決定，但通常制劑中至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的量為成人每天0．1μg到100mg／kg。當(dāng)然，劑量可根據(jù)不同情況改變，因此，有時(shí)低于上述劑量就足夠了，情況相反時(shí)，高于上述劑量是必須的。本發(fā)明的藥物制劑可直接口服，此外，其可加到日常的食品和／或飲料中服用。
不象壞死是細(xì)胞病理死亡，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基因本身原始編程的死亡。因此，被編程的細(xì)胞凋亡的基因被一定的外因或內(nèi)因激活，在所述基因作用下，程序死亡蛋白生成，于是細(xì)胞本身由于程序死亡蛋白的形成而分解和死亡。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑十分有用，因?yàn)槠淇梢栽谙Ｍ慕M織和細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且可以從自然狀態(tài)的活性器官中除去不必要的細(xì)胞或病理細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑可以用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法中。因此，當(dāng)至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物用作活性成分時(shí)，其可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且所述方法十分有用，例如，用于說明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理，闡明細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和篩選細(xì)胞凋亡抑制劑。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抗風(fēng)濕活性，當(dāng)從這些化合物中選擇的至少一種化合物用作活性組分，并與已知的藥物載體混合制成藥物制劑，就制成了抗風(fēng)濕劑。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有多種生理學(xué)活性，如對關(guān)節(jié)炎的抗炎活性、角叉菜膠水腫抑制活性、抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生活性、增加白介素-10產(chǎn)生活性、抑制一氧化氮產(chǎn)生活性、誘導(dǎo)產(chǎn)生Fas抗原活性、免疫調(diào)節(jié)活性如遲發(fā)型過敏反應(yīng)抑制活性、淋巴細(xì)胞早幼化反應(yīng)抑制活性、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制活性、IgE產(chǎn)生抑制活性等。因此，含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的藥物如抗炎劑或炎癥預(yù)防劑、腫瘤壞死因子產(chǎn)生抑制劑或腫瘤壞死因子產(chǎn)生預(yù)防劑、增強(qiáng)白介素-10產(chǎn)生劑、免疫調(diào)節(jié)劑、一氧化氮產(chǎn)生抑制劑、Fas抗原產(chǎn)生誘導(dǎo)劑、免疫調(diào)節(jié)劑、IgE產(chǎn)生抑制劑、遲發(fā)型過敏反應(yīng)抑制劑和抗變態(tài)反應(yīng)劑可以用以上述及的制備抗風(fēng)濕劑同樣方法制備，并且可以用上述同樣方法實(shí)施。
風(fēng)濕是在骨膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞發(fā)生障礙的自身免疫性疾病，并且本發(fā)明的抗變態(tài)反應(yīng)劑用作自身免疫疾病治療劑也十分有效。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生，后者被認(rèn)為是引起具體器官自身免疫疾病或炎癥如慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或炎癥疾病的直接原因，并且可以增強(qiáng)白介素-10的產(chǎn)生，白介素-10是Th1抑制細(xì)胞因子。因此，炎癥癥狀，如具體器官自身免疫疾病如風(fēng)濕，特別是慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀改善；炎癥因子如C-反應(yīng)蛋白(CRP)值、風(fēng)濕因子(RF)值和紅細(xì)胞沉降速率(血沉)明顯降低；并且并發(fā)癥如步行困難也明顯改善。
腫瘤壞死因子是因誘導(dǎo)腫瘤部位出血性壞死的一個(gè)因素而被發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在被認(rèn)為是廣泛參與了炎癥的生物防御和免疫功能的細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子產(chǎn)生調(diào)整失敗引起宿主各種不適，并且腫瘤壞死因子產(chǎn)生超量或失調(diào)涉及很多疾病，包括慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性脊髓炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、敗血性休克、內(nèi)毒素休克、革蘭氏陰性菌敗血癥、中毒休克綜合癥、大腦性瘧疾、慢性肺炎、移植物抗宿主病、同種移植排斥反應(yīng)、流感等感染性發(fā)熱和肌痛，感染或惡性腫瘤的二級(jí)惡液質(zhì)、人類獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)二級(jí)衰弱期、AIDS、AIDS相關(guān)綜合癥、瘢痕疙瘩、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、自身免疫糖尿病和全身性紅斑狼瘡[分子醫(yī)學(xué)，Molecular Medicine，33卷，1010-1020頁和1182-1189頁(1996)]。本發(fā)明的腫瘤壞死因子產(chǎn)生抑制劑對治療由腫瘤壞死因子引起或加重的疾病的治療非常有用。本發(fā)明還提供控制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的方法，其中至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物用作活性成分。
一氧化氮(以下簡寫為NO)是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的血管平滑肌馳張因子(EDRF)的本體[自然，Nature，327卷，524-526頁(1987)]。本發(fā)明提供了一種含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的藥物，用作治療或預(yù)防需要抑制NO產(chǎn)生的疾病。對需要抑制NO產(chǎn)生的疾病沒有特別的限制，其例子有由中毒性休克或治療一定的細(xì)胞因子引起的全身性低血壓、血壓反應(yīng)降低、自身免疫疾病、炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎性腸疾、血液脈管功能機(jī)能不全、血液脈管病原性擴(kuò)張、組織損傷、心血管局部缺血、敏感性疼痛、腦缺血、血管新生引起的疾病、癌癥等。疾病包括在特表平09／504524；09／505288；08／501069；08／512318和06／508849中提到的疾病。
含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的NO產(chǎn)生抑制劑可用于NO產(chǎn)生的機(jī)理研究和NO的生物活性機(jī)理研究，此外，其可用于說明參與NO產(chǎn)生機(jī)理的物質(zhì)的研究。
本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有在NO產(chǎn)生細(xì)胞中抑制NO產(chǎn)生活性。例如，當(dāng)內(nèi)毒素(脂多糖LPS)加入到巨噬細(xì)胞株時(shí)，誘導(dǎo)型NO合成酶(NOS)被表達(dá)，并且NO分泌到培養(yǎng)基中，而當(dāng)LPS在本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽共存時(shí)加入，NO產(chǎn)生被抑制。當(dāng)提供用LPS處理NO產(chǎn)生被誘導(dǎo)，由于NO激活細(xì)胞病，細(xì)胞存活率降低，而當(dāng)用LPS處理時(shí)加入本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽，NO產(chǎn)生降低，抑制了對細(xì)胞的干擾。
血管發(fā)生對實(shí)體癌的生長是必不可少的，并且血管內(nèi)皮生長因子／血管通透性亢進(jìn)因子(VEGF)在此過程中起重要作用。在各種癌細(xì)胞中，VEGF被NO誘導(dǎo)。當(dāng)本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽抑制NO產(chǎn)生時(shí)，癌細(xì)胞中VEGF產(chǎn)生也被抑制，并且，作為結(jié)果，癌組織周圍的血管發(fā)生被抑制。當(dāng)本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽對小鼠給藥時(shí)，在皮下移植癌細(xì)胞形成了固體腫瘤的小鼠，癌組織周圍的血管形成不全，癌脫落。
亞硝胺是系列化合物，其通過將亞硝基加到仲胺合成，現(xiàn)已知幾百種亞硝胺。其大多數(shù)損傷DNA，并對動(dòng)物具有致癌性。據(jù)說亞硝胺與人類癌癥發(fā)生也特別相關(guān)，并通過亞硝酸鹽與胺在胃中反應(yīng)生成。即使在中性pH值生理?xiàng)l件下，NO與胺反應(yīng)生成亞硝胺。此外，肝吸蟲感染者和患肝硬化者NO產(chǎn)生增加，二者在流行病學(xué)上認(rèn)定與癌癥特別相關(guān)。因此，當(dāng)通過給與本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽抑制NO產(chǎn)生增加時(shí)，避免癌生長，特別是高危人群，將成為可能。因此，本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽在抑制致癌作用和抑制癌組織中血管發(fā)生這兩步表現(xiàn)出抗癌作用。
此外，NO誘導(dǎo)水腫，這在炎癥病變中，如血管通透性，是特征性的[Maeda，et al．，日本癌研究雜志，Japanese Journal of CancerResearch，85卷，331-334頁(1994)]并且也誘導(dǎo)前列腺素的生物合成，前列腺素是炎癥介質(zhì)[Savemini，et al．，美國國家科學(xué)院院報(bào)Proceedings of National Academy of Sciences，U．S．A．，90卷，7240-7244頁(1993)]。另外，認(rèn)為NO與超氧化物自由基迅速反應(yīng)，形成引起細(xì)胞炎癥和組織損傷的過氧化亞硝酸鹽。
當(dāng)在器官中形成激活的免疫細(xì)胞并釋放出細(xì)胞因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生NO。胰島素依賴性糖尿病是由胰島β細(xì)胞的特異性破壞引起的，這種破壞由NO引起。另外，患慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)風(fēng)濕、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)炎并伴生Behcet病的病人的病變關(guān)節(jié)液中，含NO濃度與這種病人的正常關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)液或健康人關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)液的NO濃度相比更高。當(dāng)本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽給藥于這種病人，病變中NO產(chǎn)生被抑制和癥狀被改善。
在腦缺血期問和再灌注后，NO產(chǎn)生增加，其結(jié)果是腦組織受損。當(dāng)本發(fā)明的化合物、其光學(xué)活性體或其鹽實(shí)施于大腦局部缺血病人時(shí)，腦組織受損減輕，并且預(yù)后改善。
現(xiàn)已注意到稱作Fas抗原(APO-1抗原或CD95)的細(xì)胞表面抗原是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子[細(xì)胞，Cell，66卷，233-243頁(1991)；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，J．Exp．Med．，169卷，1747-1756頁(1989)；生物化學(xué)雜志，J．Biol．Chem．，267卷，10709-10715頁(1992)；及免疫學(xué)雜志，J．Immunology，184卷，1274-1279頁(1992)]。
Fas抗原在免疫細(xì)胞如胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞中表達(dá)。針對外來的非自身抗原的侵入，免疫系統(tǒng)誘發(fā)免疫反應(yīng)，這樣非自身抗原被排斥。因此，不顯示免疫反應(yīng)，而建立了自身耐受。這是由于自身反應(yīng)性淋巴干細(xì)胞進(jìn)行了負(fù)選擇克隆排異，這樣通過細(xì)胞凋亡發(fā)生了排斥。然而，當(dāng)由于活體異常如Fas抗原的遺傳缺陷導(dǎo)致細(xì)胞不進(jìn)行細(xì)胞凋亡，例如自身反應(yīng)性T細(xì)胞在末梢區(qū)域積累。在正常活體中，自身耐受甚至對負(fù)責(zé)免疫的B細(xì)胞起作用，并且由于細(xì)胞凋亡自反應(yīng)B細(xì)胞通常死亡，但，當(dāng)由于異常如Fas抗原的遺傳缺陷導(dǎo)致自反應(yīng)T細(xì)胞不進(jìn)行細(xì)胞凋亡，自反應(yīng)T細(xì)胞在末梢區(qū)域積累。此外，對于關(guān)節(jié)風(fēng)濕，上述的自反應(yīng)免疫異常和滑膜細(xì)胞翻轉(zhuǎn)異常是疾病的部分誘因。
一種含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的產(chǎn)生Fas抗原的的誘導(dǎo)劑可用于誘導(dǎo)由于翻轉(zhuǎn)異常和淋巴自反應(yīng)產(chǎn)生的未能從體內(nèi)排除的多余細(xì)胞凋亡，并可用于誘導(dǎo)產(chǎn)生Fas抗原方法。含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的產(chǎn)生Fas抗原的的誘導(dǎo)劑可用作預(yù)防和治療與Fas抗原非正常產(chǎn)生相關(guān)的疾病。在本發(fā)明中，對與Fas抗原非正常產(chǎn)生相關(guān)的疾病沒有特別限制，例子有關(guān)節(jié)風(fēng)濕和由自反應(yīng)T細(xì)胞和自反應(yīng)B細(xì)胞引起的自身免疫疾病。包括W097／0965說明書中提到的疾病。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有免疫調(diào)節(jié)活性，如增強(qiáng)白介素-10產(chǎn)生活性，抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)活性、抑制淋巴細(xì)胞早幼化活性、抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)活性、抑制IgE產(chǎn)生活性和抑制角叉菜膠水腫活性。含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的免疫調(diào)節(jié)劑可作為藥劑用于預(yù)防和治療由免疫系統(tǒng)和免疫因子失調(diào)引起的疾病。
因此，減少白介素-10產(chǎn)生的結(jié)果是Th1被激活和Th1-顯性自身免疫炎癥被激活。這些炎癥參與了器官專有自身促進(jìn)免疫疾病如腎炎和肝炎以及移植排斥和變態(tài)反應(yīng)源接觸性皮炎。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑增強(qiáng)了白介素-10產(chǎn)生和抑制了Th1活性，因此其可用于治療和預(yù)防這些疾病。
淋巴細(xì)胞早幼化是一種反應(yīng)，其中有絲分裂鍵連在淋巴細(xì)胞表面的受體上，活化淋巴細(xì)胞，這樣促進(jìn)其生長和分裂。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)是一種反應(yīng)，其中從相同物種但不同株的動(dòng)物得到的淋巴細(xì)胞放入混合培養(yǎng)基，由不協(xié)調(diào)主組織適應(yīng)抗原活化這些淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其生長和分裂。上述免疫調(diào)節(jié)劑抑制這些反應(yīng)，特另適于治療和預(yù)防由淋巴細(xì)胞非正常亢進(jìn)如慢性腎炎、慢性結(jié)腸炎、Ⅰ型糖尿病和慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的慢性自身免疫疾病，也適用于抑制移植排斥。
角叉菜膠足水腫模型是一種反應(yīng)，其中誘導(dǎo)炎癥的角叉菜膠皮下注射到獸足誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞，這樣由引起水腫的細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子引起血管滲透性增強(qiáng)。上述對于水腫的免疫調(diào)節(jié)劑的抑制作用可用于治療和預(yù)防需要血管滲透性增強(qiáng)控制的疾病如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕。
以哮喘和過敏性皮炎為代表的變態(tài)反應(yīng)性疾病中，在變態(tài)反應(yīng)中從肥大細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)起著重要作用。當(dāng)IgE與細(xì)胞膜上的受體鍵連形成交聯(lián)時(shí)引起該反應(yīng)，抑制IgE產(chǎn)生的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑可用于改善癥狀和／或預(yù)防由IgE產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)和惡化的疾病，由IgE誘導(dǎo)的過敏性疾病如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎、過敏性結(jié)膜炎、蕁麻疹、過敏性休克等。此外，本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)劑抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)，可用于與遲發(fā)型過敏反應(yīng)相關(guān)的疾病的治療和預(yù)防，如接觸性過敏、變態(tài)反應(yīng)性接觸性皮炎、細(xì)菌變態(tài)反應(yīng)、真菌變態(tài)反應(yīng)、病毒變態(tài)反應(yīng)、藥物變態(tài)反應(yīng)、甲狀腺炎和變態(tài)反應(yīng)性腦炎、作為近些年的病理學(xué)研究結(jié)果，有報(bào)道說在正常系統(tǒng)胰島素作用中正常脂肪細(xì)胞起著重要作用，對于順利進(jìn)行糖代謝，正常脂肪細(xì)胞是必須的[實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，14卷，61-68頁(1996)]。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞前體分化如成纖維細(xì)胞前體的能力，并且誘導(dǎo)所述細(xì)胞變成脂肪細(xì)胞的分化。因此，當(dāng)發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽被給藥時(shí)，正常脂肪細(xì)胞增加，糖尿病的癥狀被改善。
發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有降血糖活性，現(xiàn)可以制備成治療和預(yù)防糖尿病的藥劑，其含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分。
因此，當(dāng)至少一種選自該化合物的化合物用作活性成分，并與已知的藥物載體制成藥物制劑，就成為治療和預(yù)防糖尿病的藥劑。所述可用上述制備抗癌劑同樣的方法制備，并可按上述藥物同樣的方法給藥。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有改善高血脂活性，或減少血清中膽固醇總量的活性、減少血清中甘油三脂的活性和減少血清中游離脂肪酸的活性，當(dāng)具有該活性的至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物與已知的藥物載體制成藥物制劑，就成為治療和預(yù)防高血脂的藥劑。其制備可按上述制備治療和預(yù)防糖尿病劑同樣的方法完成，并可按上述治療和預(yù)防糖尿病劑同樣的方法給藥。當(dāng)服用含本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的藥物后，改善了高血脂，血液中脂質(zhì)水平明顯降低。
此外，當(dāng)具有誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞前體分化成脂肪細(xì)胞能力的本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽與已知的藥物載體制成藥物制劑，就制成誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞前體分化成脂肪細(xì)胞的藥劑。其制備可按上述制備治療和預(yù)防糖尿病劑同樣的方法完成，并可按上述治療和預(yù)防糖尿病劑同樣的方法給藥。
另外，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生活性，并用于治療和預(yù)防由腫瘤壞死因子引起的非胰島素依賴糖尿病[自然，Nature，389卷，610-614頁(1997)]。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抗病毒活性，當(dāng)至少一種選自其中的化合物用作活性成分并與已知的藥物載體制成藥物制劑，就成為抗病毒藥劑。制備抗病毒藥劑可按上述抗癌劑同樣的方法完成，并可按上述藥物同樣的方法給藥。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽對DNA病毒、RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、類病毒具有抗病毒活性。
因此，由于對病毒疾病的有效性，其可以作為人類抗病毒劑，非人類抗病毒劑，(例如，用于家畜、家禽和養(yǎng)殖動(dòng)物如魚和蝦)，作為植物抗病毒劑如用于農(nóng)作物和園藝作物(例如花和蔬菜)以及生物抗病毒劑。
鳥類的病毒疾病如Marek病可用本發(fā)明使用的混合物通過已知的方法預(yù)防和／或治療，即本發(fā)明的抗病毒劑給鳥類注射或加入到飼料或飲用水中。此外，如將本發(fā)明使用的混合物直接加入到池塘、水罐、收集槽、或水、海水等、繁殖區(qū)或與飼料混合，病毒疾病同樣可以預(yù)防和／或治療。
對非人類動(dòng)物實(shí)施本發(fā)明的抗病毒劑可以保持其健康，因此明顯改善其成活率、生長率、產(chǎn)卵率等。
用于本發(fā)明的本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽抑制病毒蛋白的合成和抑制病毒基因組的合成，因此，其具有強(qiáng)抗病毒作用。此外，其選擇性殺死被這些病毒感染的細(xì)胞。
例如，即使對患人類獲得性免疫缺陷綜合癥(以下，縮寫為AIDS)的病人，并非所有的CD4-陽性細(xì)胞都被HIV感染，只有一部分被其感染。本發(fā)明抗病毒劑抑制HIV在那些被感染的細(xì)胞中產(chǎn)生，同時(shí)，選擇性殺死被感染的細(xì)胞，并誘導(dǎo)非感染細(xì)胞對病毒的抵抗能力，因此可以從細(xì)胞中將HIV除去。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有改善肝功的能力并激活熱休克蛋白。含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物的改善肝功能力的試劑和激活熱休克蛋白的試劑可按上述制備抗病毒藥劑同樣的方法完成，并可按抗病毒藥劑同樣的方法給藥。
服用了本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽，紊亂的肝功被改善，GOT、GPT值變?yōu)檎！?br> 此外，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽對熱休克蛋白70kDa(HSP70)具有誘導(dǎo)活性作用，對DNA病毒和RNA病毒如肝炎病毒、AIDS病毒、流感病毒、皰疹性口腔炎病毒和皰疹病毒具有抗病毒活性。熱休克蛋白參與了癌細(xì)胞免疫作用，這些化合物對癌細(xì)胞免疫作用也有效。此外，這些化合物具有生物防御活性，如抗炎癥活性。由于，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽對熱休克蛋白具有高誘導(dǎo)能力，其對DNA病毒、RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、類病毒具有抗病毒活性。這些病毒和類病毒的例子是以上述及的那些。
另外，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽對癌基因轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞生長有抑制活性，而且對由于癌基因的致癌作用有預(yù)防作用。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抑制HPV16型癌基因E7癌變的癌細(xì)胞生長活性。因此，可提供一種含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物作為活性成分的抑制由病毒致癌變的癌細(xì)胞生長的抑制劑，由癌基因致癌變可被防止。
此外，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽在致癌作用的兩個(gè)階段起始和增強(qiáng)具有抑制活性，并且現(xiàn)可提供一種含至少一種選自上述化合物的化合物作為活性成分的化學(xué)致癌變抑制劑。
本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有抑制IgE產(chǎn)生和遲發(fā)型過敏反應(yīng)的活性，當(dāng)至少一種選自上述化合物的化合物作為活性成分并與已知藥物載體制成藥物制劑，就制成了抗過敏劑。所述制劑的制備可通過上述抗致癌劑同樣的方法制備。另外，本發(fā)明的抗過敏劑可根據(jù)劑量形式以合適的途徑給藥。
一種抑制IgE產(chǎn)生和遲發(fā)型過敏反應(yīng)的含至少一種選自本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的化合物用作有效成分的藥劑，可通過上述抗過敏劑同樣的方法制備制備成藥物制劑，并可按抗過敏劑同樣的方式給藥。
本發(fā)明的抗過敏劑抑制IgE產(chǎn)生，對于改善和／或治療由IgE產(chǎn)生介導(dǎo)或惡化的疾病非常有用，所述疾病如由IgE誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病支氣管哮喘、過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、過敏性結(jié)膜炎、蕁麻疹、過敏性休克。其也可以抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)，可用于與遲發(fā)性過敏反應(yīng)相關(guān)的疾病的治療和預(yù)防，如接觸性過敏、接觸性過敏皮炎、細(xì)菌過敏、真菌過敏、病毒過敏、藥物過敏、甲狀腺炎和過敏性腦炎。
對于小鼠，只通過口服本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽，即使明顯達(dá)到生理活性劑量，沒有觀察到死亡病例。
因此，由于其各種生理功能，本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域是非常有用的化合物。實(shí)施例以下將通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而本發(fā)明決不限于這些實(shí)施例。此外，用于實(shí)施例的“％”表示“重量％”。實(shí)施例1(1) D-葡糖醛酸(G5269；Sigma公司制)(10g)溶于1升水中，于121℃加熱4小時(shí)，真空濃縮至10ml。與40ml乙酸丁酯、乙酸和水3∶2∶2混合液的上層混合，離心，上層液體真空濃縮至約10ml。
上述提取液過硅膠色譜柱(BW-300SP；2×28cm；Fuji Silycia制)，用乙酸丁酯、乙酸和水3∶2∶2混合液的上層作為洗脫液，用壓縮機(jī)加0．2kg／cm2壓力，以5ml／分鐘流速洗脫。流分分成每10ml一份，每份流分用薄層層析分析，在第61份至第80份流分中含高濃度的(±)-環(huán)戊烯酮。收集這些流分，真空濃縮，用40ml氯仿提取，提取液真空濃縮得到100mg(±)-環(huán)戊烯酮。
該餾份用Palpack型S柱正相HPLC分離，當(dāng)用215nm紫外吸收計(jì)檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)純度為為98％。(2)環(huán)戊烯酮與咪唑反應(yīng)100mM環(huán)戊烯酮與500 mM咪唑水溶液(pH7．4)在37℃放置反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)液(200μL)用反相HPLC在下述條件下分離。柱TSK gel ODS-80Ts(由Tosoh制造)20mm×250mm保護(hù)柱TSKguard柱ODS-80Ts(由Tosoh制造)20mm×50mm流動(dòng)相0．1三氟乙酸水溶液流速9毫升／分檢測215nm吸光度分離14．75分鐘峰，真空蒸發(fā)至干，得到咪唑基環(huán)戊烯酮。
結(jié)果在附圖1顯示。因此，附圖1通過顯示洗脫時(shí)間與215nm吸光度的關(guān)系給出咪唑基環(huán)戊烯酮反相HPLC的洗脫圖，其中橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)表示于215nm吸光度。實(shí)施例2
實(shí)施例1分離的咪唑基環(huán)戊烯酮的快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)測定。隨后，將其溶于重水，用核磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。使用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi制)。紫外吸收譜(UV)用UV-2500分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。紅外吸收譜(IR)用擴(kuò)散反射率法測定。結(jié)果在下面給出。FAB-MSm／z 165[M+H]+甘油用作基準(zhǔn)物。下文中imidazole為咪唑，water為水。
1H-NMR δ2．45 (1H，d，J=19．5，5-H)，3．05(1H，dd，J=6．5，19．5Hz，5-H)，5．56(1H，m，4-H)，6．44(1H，m，3-H)，7．30(1H，d，J=1．0，imidazole 4-H or 5-H)，7．39(1H，d，J=1．0Hz，imidazole 4-H or 5-H)，8．65(1H，s，imidazole 2-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
13C-NMRδ41．6(5-C)，55．3(4-C)，120．8(imidazole 4-Cor 5-C)，121．1(imidazole 4-C or 5-C)，125．7 (3-C)，134．8(imidazole 2-C)，157．2(2-C)，202．9(1-C)以上，二噁烷的化學(xué)位移定為67．4ppm。
UVλmax208，245nm(water)IRνKBrmaxcm-13100，2846，1722，1633，1573，1299，1085結(jié)果在附圖2-附圖6給出。附圖2顯示咪唑基環(huán)戊烯酮的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖3顯示咪唑基環(huán)戊烯酮的H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖4顯示咪唑基環(huán)戊烯酮的C13-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖5顯示咪唑基環(huán)戊烯酮的UV吸收光譜，其中橫坐標(biāo)表示波長(nm)，縱坐標(biāo)表示吸光度。附圖6顯示咪唑基環(huán)戊烯酮的IR吸收光譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。
H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬如下式[ⅪⅤ]。 實(shí)施例3在96孔微滴定板的每個(gè)孔上滴加1000、500、250、125、62．5或31．3μg／ml由實(shí)施例1-(2)得到的咪唑基環(huán)戊烯酮水溶液或其對照水。用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮HL-60(ATCC CCL-240)，在上述微滴定板的每個(gè)孔加濃度5×104細(xì)胞／ml各90μl，在5％二氧化碳條件下于37℃培養(yǎng)48小時(shí)。加入10μl溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT；Sigma公司制)的磷酸鹽緩沖的鹽水溶液的溶液(5mg／ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。隨后，加入100μl含0．04N鹽酸的2-丙醇，攪拌，測定590nm吸光度。
結(jié)果是，加入62．5μg／ml咪唑基環(huán)戊烯酮(最終濃度6．25μg／ml)的部分沒有細(xì)胞生長。因此，很明顯在濃度6．25μg／ml咪唑基環(huán)戊烯酮完全抑制HL-60細(xì)胞的生長。實(shí)施例4將0．25M磷酸鈉緩沖液(pH7．0)(0．5ml)、10mg／gl N-乙?；肴樘前?和光純藥制；013-12821)水溶液10 ml、50mg／ml半乳糖氧化酶水溶液[按 Tressel等方法制備酶學(xué)方法，Methods inEnzymology，89卷，163-171頁(1982)]0．1ml和2．35單位／ml過氧化氫酶(Boehringer-Mannheim制；106810)水溶液0．5ml混合在一起，加水至25ml。在壓縮泵導(dǎo)入空氣的情況下，混合反應(yīng)液于37℃反應(yīng)16小時(shí)。
以上反應(yīng)物加入到20ml用2M NaCl洗過并用水平衡的Amberlitf IRA-900柱(Organo制)，得到非吸附流分。實(shí)施例5實(shí)施例4的非吸附流分用HCl調(diào)節(jié)到pH3，于121℃加熱1小時(shí)。產(chǎn)生的熱處理溶液用無菌水稀釋到2、4、8、16、32、64倍，其對HL-60細(xì)胞的生長抑制性通過實(shí)施例3同樣的方法測定。
其結(jié)果是，根據(jù)細(xì)胞生長情況，加熱前加入樣品部分與用作對照的加水部分沒有差異，加2倍水稀釋的加熱1小時(shí)溶液部分，細(xì)胞生長完全被抑制，加8倍水稀釋的溶液部分，細(xì)胞生長被抑制為約一半。根據(jù)顯微鏡觀察的結(jié)果，可以確定產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡小體(apoptpticbody)。
加水的對照部分與加4mg／ml N-乙?；肴樘前凡糠只蚣油瑯訚舛萅-乙?；肴樘前酚趐H3加熱1小時(shí)部分的細(xì)胞生長沒有差異。
從以上結(jié)果表明，經(jīng)半乳糖氧化酶處理的N-乙酰基半乳糖胺，Amberlitf IRA-900柱非吸附餾份被加熱時(shí)，產(chǎn)生了抑制癌細(xì)胞生長物質(zhì)。實(shí)施例6實(shí)施例4得到非吸附餾份冷凍干燥，溶于25ml水，用HCl調(diào)節(jié)至pH3，于121℃加熱4小時(shí)。形成的熱處理溶液(40μl)用以下的反相HPLC分離。柱TSKgel0DS-80Ts(由Tosoh制造)4．6mm×250mm流速1毫升／分溶劑A0．1％三氟乙酸(TFA；Merck制)水溶液溶劑B0．1％TFA水溶液和50％乙腈水溶液梯度變化0→15分鐘溶劑A15→45分鐘 溶劑A→溶劑B45→60分鐘 溶劑B檢測210nm吸光度收集主吸收峰和其問的流分，真空蒸發(fā)至干，每個(gè)流分用水40μl溶解或再稀釋3或9倍，其對HL-60細(xì)胞的生長抑制活性通過實(shí)施例3同樣的方法測定，只是每孔加入5μl樣品并培養(yǎng)18小時(shí)。結(jié)果是，加入保留時(shí)間為17．1分鐘餾份水溶液部分，加入3倍稀釋溶液部分，注意抑制癌細(xì)胞生長活性。也可以確定產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡小體。
附圖7給出其色譜。附圖7顯示保留時(shí)間與210nm吸光度的關(guān)系，其中，橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)表示210nm吸光度。
重復(fù)操作反相HPLC，分離保留時(shí)間為17．1分鐘流分，冷凍干燥，分離出抑制癌細(xì)胞生長物質(zhì)。實(shí)施例7在實(shí)施例6中，從保留時(shí)間17．1分鐘的峰分離出的抑制癌細(xì)胞生長物質(zhì)，進(jìn)行質(zhì)譜分析，用核磁共振(NMR)和紅外吸收譜(IR)分析其結(jié)構(gòu)。分別用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)、JNM-A50(NipponDenshi制)和FTIR-8000(Shimadzu制)進(jìn)行質(zhì)譜分析、NMR譜和IR譜測定。結(jié)果如下。FAB-MSm／z 184[M+H]+，206[M+Na]+n-硝基芐醇作為基準(zhǔn)物。
1H-NMR2．04(3H，s，9-H)，6．22(1H，d，J=9．0Hz，5-H)，6．60(1H，d，J=9．0Hz，6-H)，8．21(1H，br-s，3-OH)，8．71(1H，br-s，4-OH)，9．11(1H，br-s，2-OH)，9．48(1H，br-s，7-H)樣品溶于重二甲亞砜，殘留的二甲亞砜的化學(xué)位移為2．49ppm。
13C-NMRδ23．0(9-C)，106．3(5-C)，112．7(6-C)，119．0(1-C)，134．3(3-C)，138．5(2-C)，143．3(4-C)，169．1(8-C)樣品溶于重二甲亞砜，殘留的二甲亞砜的化學(xué)位移為39．5ppm。IRνKBrmaxcm-13423，1641，1500，1205，1024根據(jù)以上結(jié)果，可以確定該抑制癌細(xì)胞生長的物質(zhì)是由式[Ⅱ]表示結(jié)構(gòu)的N-(2，3，4-三羥基苯基)乙酰胺。
附圖2顯示其質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖9顯示其H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖10顯示其C13-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖11顯示其IR吸收光譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)測定值顯示以下結(jié)構(gòu)式[ⅩⅤ]。 實(shí)施例8(1)50mM D-葡糖醛酸和500mM甘氨酸(均自Nacalai Tesque公司)的水溶液用HCl調(diào)節(jié)至pH3，于121℃加熱30分鐘。
(2)在3ml得自實(shí)施例8-(1)的熱處理溶液中加入5ml 1-丁醇，3ml乙醇和0．05ml乙酸，混合后，形成的化合物過硅膠柱層析。填料用于柱層析的硅膠BW-300SP(Fuji Silycia制)柱規(guī)格2．0cm×45cm流動(dòng)相比例為5∶3∶3∶0．05的1-丁醇、乙醇、乙酸和水用泵加0．4Kgf／cm2空氣壓力下洗脫。頭100ml放棄，然后每次用7．5ml洗脫。收集第25份和第28份餾份，真空蒸發(fā)至干，然后溶于200μl水中。
(3)在實(shí)施例8-(2)得到的部分純化的樣品進(jìn)一步用以下的反相HPLC純化。柱CAPCELL PAK C18SG300 5μm(由Shiseido制造)6mm×250mm流動(dòng)相0．1％三氟乙酸水溶液流速1毫升／分檢測215nm吸光度樣品(30μl)注入后，在保留時(shí)間6．9分鐘收集主峰，該操作重復(fù)4次，收集的溶液真空蒸發(fā)至干，得到B-UG。
結(jié)果在附圖12顯示。因此，附圖12顯示B-UG的反相HPLC洗脫時(shí)間與在215nm吸光度的關(guān)系。其中，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)表示在215nm吸光度。實(shí)施例9實(shí)施例8分離的B-UG的快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)測定。隨后，將其溶于重水，用核磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。使用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi制)。紫外吸收譜(UV)用UV-2500分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。紅外吸收譜(IR)FTIR-8000紅外分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。結(jié)果在下面給出。FAB-MSm／z 154 [M+H]+，176[M+Na]+，MW153甘油用作基準(zhǔn)物。
1H-NMRδ5．06(2H，s，7-H)，7．74(1H，dd，J=6．0，9．0Hz，5-H)，7．86(1H，ddd，J=1．0，2．5，9．0Hz，4-H)，8．14(1H，dd，J=1．0，6．0Hz，6-H)，8．20(1H，m，2-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
13C-NMRδ62．8(7-C)，129．2(5-C)，133．4(4-C)，134．6(2-C)，137．9(6-C)，157．3(3-C)，170．6(8-C)以上，二噁烷的化學(xué)位移定為67．4ppm。
UVλmax290nm(water)IRνKBrmaxcm-13100，1678，1499，1325，1198，721從以上可以確定B-UG是式[Ⅻ]表示的1-羧甲基-3-羥基吡啶鎓內(nèi)鹽。
結(jié)果在附圖13-附圖17給出。附圖13顯示B-UG的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖14顯示B-UG的H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖15顯示B-UG的C13-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖16顯示B-UG的UV吸收譜譜，其中橫坐標(biāo)表示波長(nm)，縱坐標(biāo)表示吸光度。附圖17顯示B-UG的IR吸收譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。
H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬如下式[ⅩⅥ]所示。 實(shí)施例10(1)實(shí)施例1-(1)得到的環(huán)戊烯酮(6mg)溶于1．5ml 5∶95的10N HCl和甲醇的混合物中，并于37℃反應(yīng)過夜。加入碳酸銀中和，離心分離后懸浮液體真空蒸發(fā)至于，溶于70μl 0．1％三氟乙酸水溶液(TFA)。該樣品用反相HPLC分離。柱TSKge10DS-80Ts(由Tosoh制造)20mm×250mm保護(hù)柱TSK保護(hù)柱ODS-80Ts(由Tosoh制造)20mm×50mm溶劑A0．1三氟乙酸水溶液溶劑B0．1三氟乙酸水溶液，50％乙腈水溶液洗脫溶劑A(20分鐘)→從溶劑A到溶劑B線性濃度梯度(40分鐘)流動(dòng)相0．1三氟乙酸水溶液流速9毫升／分檢測215nm吸光度主峰的保留時(shí)間為48．58分鐘，收集主峰餾份，真空蒸發(fā)至干，得到MC2。
(2)從實(shí)施例10-(1)得到的MC2溶于1mM HCl，于37℃反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)溶液用以下反相HPLC分離。柱TSK膠ODS-80Ts(由Tosoh制造)4．6mm×250mm溶劑0．1三氟乙酸水溶液流速1毫升／分檢測215nm吸光度因?yàn)楸Ａ魰r(shí)間為6．6分鐘的主峰是新發(fā)現(xiàn)的，將其收集，濃縮并真空蒸發(fā)至干，得到HMC2。
(3)從實(shí)施例1-(1)得到的環(huán)戊烯酮溶于300mM硫酸中，使?jié)舛葹?．6mg／ml，于100℃反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用實(shí)施例10-(1)同樣的反相HPLC分離，收集保留時(shí)間為6．6分鐘的主峰。實(shí)施例11(1)MC2的質(zhì)譜用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)測定。隨后，將其溶于0．1N重鹽酸，核磁共振(NMR)用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi制)。紫外吸收譜(UV)用UV-2500分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。紅外吸收譜(IR)用FTIR-8000PC紅外分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。結(jié)果在下面給出。FAB-MSm／z 143 [M+H]+，165[M+Na]+m-硝基芐基醇用作基準(zhǔn)物。
1H-NMRδ2．23(1H，dd，J=1．5，19．0Hz，5-H)，2．72(1H，dd，J=6．0，19．0Hz，5-H)，3．26(3H，s，4-OCH3)，3．61(3H，s，2-OCH3)，4．52(1H，m，4-H)，6．52(1H，d，J=3．0Hz，3-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
13C-NMRδ40．8(5-C)，56．7(2-OCH3)，58．4(4-OCH3)，74．7(4-C)，127．3(3-C)，159．0(2-C)，203．9(1-C)以上，二噁烷的化學(xué)位移定為67．4ppm。
UVλmax247 nm(water)IRνKBrmaxcm-11728，1631，1346，1120，1093，987根據(jù)以上結(jié)果，可以確定MC2是2，4-二甲氧基-2-環(huán)戊烯-1-酮，H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬顯示為以下結(jié)構(gòu)式[ⅩⅦ]。 (2)將MC2溶于0．1N重鹽酸，核磁共振(NMR)用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi制)測定，結(jié)果如下。
1H-NMRδ2．13(1H，dd，J=1．5，19．0Hz，5-H)，2．75(1H，dd，J=6．0，19．0Hz，5-H)，2．76(2H，t，J=2．5Hz，4′-H)，4．78(1H，m，4-H)，6．10(1H，td，J=2．5，6．5Hz，2′-H)，6．40(1H，d，J=2．5Hz，3-H)，7．78(1H，td，J=2．5，6．5Hz，3′-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
13C-NMRδ43．2(5-C)，44．7(4′-C)，65．7(4-C)，93．3(5′-C)，130．0(2′-C)，132．5(3-C)，154．6(2-C)，166．6(3′-C)，205．4(1-C)，207．3(1′-C)以上，二噁烷的化學(xué)位移定為67．4ppm。
根據(jù)以上結(jié)果，可以確定HMC2是由式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和由式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成，在0．1N重鹽酸中的摩爾比為2∶1，H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬顯示分別為以下結(jié)構(gòu)式[ⅩⅧ]和結(jié)構(gòu)式[ⅪⅩ]。
(3)測定從實(shí)施例10-(3)得到的保留時(shí)間為6．6分鐘的餾份的NMR譜，結(jié)果與實(shí)施例11-(2)的HMC2完全一致，因此很明確該餾份的物質(zhì)是由式[Ⅳ]表示的2，4-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和由式[Ⅴ]表示的5，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮組成的摩爾比約為2∶1的組合物。
結(jié)果在附圖18-附圖24給出。附圖18顯示MC2的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖19顯示MC2的1H-NMR譜和附圖20顯示MC2的13C-NMR譜，，在附圖19和20中，橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖21顯示MC2的UV吸收譜譜，其中橫坐標(biāo)表示波長(nm)，縱坐標(biāo)表示吸光度。附圖22顯示MC2的IR吸收光譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。附圖23顯示HMC2的1H-NMR譜和附圖24顯示HMC2的13C-NMR譜，在附圖23和24中，橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)施例12用實(shí)施例3同樣的方法測定1mM的MC2水溶液和350μM的HMC2水溶液對HL-60細(xì)胞的生長抑制活性。
結(jié)果是加入1mM的MC2(最終濃度100μm)部分和加入350μM的HMC2(最終濃度35μm)部分細(xì)胞生長被抑制。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀測到細(xì)胞凋亡小體。實(shí)施例13(1)30mM D-葡糖醛酸和30mM酪氨酸(均自Nacalai Tesque公司)的水溶液用HCl調(diào)節(jié)至pH3，于121℃加熱4小時(shí)。
(2)得自實(shí)施例13-(1)的熱處理溶液用乙酸乙酯提取，真空提取的經(jīng)濃縮的液體，用以下硅膠柱層析分離。填料用于柱層析的硅膠BW-300SP(Fuji Silycia制)柱規(guī)格2．0cm×45cm流動(dòng)相比例為3∶7的己烷和乙酸乙酯用泵加0．25Kgf／cm2空氣壓力下洗脫。頭40ml放棄，然后每次用4ml洗脫。收集第6份至第11份餾份，真空蒸發(fā)至干，然后溶于5ml比例為3∶2的己烷和乙酸乙酯混合物中。
用上述同樣方式進(jìn)行該溶液的硅膠柱層析分離，使用比例為3∶2的己烷和乙酸乙酯作流動(dòng)相。頭30ml放棄，然后每次用6ml洗脫。收集第19份至第32份餾份，真空蒸發(fā)至干，然后溶于1ml 50％的乙腈水溶液中。
(3)在實(shí)施例13-(2)得到的部分純化的樣品進(jìn)一步用以下的反相HPLC純化。柱CAPCELL PAK C18SG300 5μm(由Shiseido制造)6mm×250mm流速1毫升／分流動(dòng)相A0．1％三氟乙酸(TFA)水溶液B含0．1％TFA的50％的乙腈水溶液洗脫(流動(dòng)相B濃度)55％(0-8分鐘)→55％～80％線性濃度梯度(8-13分鐘)→100％(13分鐘以后)檢測215nm吸光度樣品(50μl)注入后，在保留時(shí)間18．7分鐘收集主峰，該操作重復(fù)19次，收集的溶液真空蒸發(fā)至干，得到4．7mg S-1127。
結(jié)果在附圖25顯示。因此，附圖25顯示洗脫時(shí)間與在215nm吸光度的關(guān)系。其中，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)表示在215nm吸光度。實(shí)施例14實(shí)施例13分離的S-1127的快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)測定。隨后，將其溶于重二甲基亞砜，用核磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。使用核磁共振儀JNM-A500(NipponDenshi制)。紫外吸收譜(UV)用UV-2500分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。紅外吸收譜(IR)用FTIR-8000 PC紅外分光光度計(jì)測定。結(jié)果在下面給出。FAB-MSm／z 253 [M-H]-甘油用作基準(zhǔn)物。
1H-NMRδ3．54 (2H，d，J=7．5Hz，4-H)，6．69(2H，d，J=8．5Hz，7-H)，6．80(2H，d，J=9．0Hz，11-H)，6．88(1H，t，J=7．5Hz，3-H)，6．97(2H，d，J=8．5Hz，6-H)，7．00(2H，d，J=9．0Hz，10-H)，9．25(1H，s，8-OH)，9．53(1H，s，12-OH)，9．58(1H，s，1-H)以上，重二甲基亞砜的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移定為2．49ppm。
13C-NMRδ34．3(4-C)，114．9(11-C)，115．4(7-C)，122．6(9-C)，128．3(5-C)，129．3(6-C)，130．6(10-C)，142．6(2-C)，154．1(3-C)，155．9(8-C)，157．0(12-C)，194．5(1-C)以上，重二甲基亞砜的化學(xué)位移定為39．5ppm。下文中methanol為甲醇。
UVλmax225，278nm(methanol)IRνKBrmaxcm-13294，1672，1610，1514，1228，837從以上可以確定S-1127是式[ⅩⅢ]表示的2，4-雙(p-羥苯基)-2-丁烯醛。
結(jié)果在附圖26-附圖30給出。附圖26顯示S-1127的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖27顯示S-1127的H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖28顯示S-1127的C13-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖29顯示S-1127的UV吸收譜譜，其中橫坐標(biāo)表示波長(nm)，縱坐標(biāo)表示吸光度。附圖30顯示S-1127的IR吸收譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。
H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬如下式[ⅩⅩ]所示。 實(shí)施例15HL-60細(xì)胞(ATCC CCL-240)在含10％于56℃處理30分鐘的胎牛血清(Gibco制)的RPMI 1640(Nissui制)培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，懸浮于上述培養(yǎng)基中使其濃度為2．5×105細(xì)胞4．5ml。在此懸浮液加0．5ml的10μM、20μM、40μM或80μM的S-1127水溶液，接著在5％二氧化碳于37℃培養(yǎng)15或39小時(shí)。
經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，對活細(xì)胞和死亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，反現(xiàn)加入40μM以上的S-1127的部分，細(xì)胞培養(yǎng)15小時(shí)后被殺死。同時(shí)，加入20μM的S-1127的部分，與加水的對照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)39小時(shí)后活細(xì)胞數(shù)明顯減少。培養(yǎng)15小時(shí)后從細(xì)胞提取出DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在加入20μM以上的S-1127的部分發(fā)現(xiàn)有DNA斷裂。這種現(xiàn)象在加水的對照組沒有發(fā)現(xiàn)。
結(jié)果示于附圖31。附圖31表示培養(yǎng)時(shí)問和當(dāng)S-1127加入到HL-60培養(yǎng)液時(shí)培養(yǎng)液中存活的細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。其中，橫坐標(biāo)表示培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)表示培養(yǎng)液中存活的細(xì)胞數(shù)(×105細(xì)胞數(shù)／5ml)。附圖31中，○表示加入10μM S-1127；△表示加入20μMS-1127；□表示加入40μM S-1127；×表示加入80μM S-1127；和●表示加水的對照組。實(shí)施例161M環(huán)戊烯酮水溶液(0．2ml)與1M鹽酸L-半胱氨酸(NacalaiTesque制；103-13)水溶液(1．8ml)混合，于37℃反應(yīng)一夜。pH約為4。反應(yīng)溶液(150μl)用以下的反相HPLC分離，保留時(shí)間為28．7分鐘和29．1分鐘的峰被收集在一起。柱TSK膠ODS-80Ts(由Tosoh制造)4．6mm×250mm流動(dòng)相A0．1％三氟乙酸(TFA)水溶液B含0．1％TFA的50％的乙腈水溶液洗脫流動(dòng)相A(15分鐘)→從流動(dòng)相A到流動(dòng)相B線性濃度梯度(15分鐘)→流動(dòng)相B(15分鐘)流速1毫升／分檢測210nm吸光度該操作重復(fù)11次，收集的溶液真空蒸發(fā)至干，得到tCD。再進(jìn)行一次色譜分離，分別從保留時(shí)間為28．7分鐘和29．1分鐘的峰得到LCD1和LCD2。
結(jié)果示于附圖32。因此，附圖32表示洗脫時(shí)間(分鐘)與215nm吸光度的關(guān)系，其中，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)表示215nm吸光度。實(shí)施例17實(shí)施例16分離的LCD1和LCD2的快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi制)測定。隨后，將其溶于重水，用核磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。使用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi制)。紫外吸收譜(UV)用UV-2500分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。紅外吸收譜(IR)用FTIR-8000紅外分光光度計(jì)(Shimadzu制)測定。結(jié)果在下面給出。LCD1FAB-MSm／z 404 [M-H]-甘油用作基準(zhǔn)物。
1H-NMRδ2．05(1H，dd，J=4．0，15．5Hz，10-H)，2．40(1H，dd，J=9．5，13．0Hz，8-H)，2．61(1H，dd，J=8．0，13．0，8-H)，2．79(1H，dd，J=11．0，15．5Hz，10-H)，3．05(1H，dd，J=7．0，15．0Hz，1′-H)，3．10(1H，d，J=11．0Hz，5-H)，3．13(1H，dd，J=4．0，15．0Hz，1′-H)，3．19(1H，dd，J=6．0，11．0Hz，5-H)，3．22(1H，dd，J=8．5，12．5Hz，13-H)，3．40(1H，m，9-H)，3．50(1H，dd，J=8．5，12．5Hz，13-H)，4．15(1H，dd，J=4．0，7．0，2′-H)，4．30(1H，d，J=6．0Hz，4-H)，4．82(1H，t，J=8．5Hz，1-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
13C-NMRδ31．9(13-C)，32．1(1′-C)，37．7(9-C)，40．9(10-C)，41．9(5-C)，47．0(8-C)，53．1(2′-C)，61．8(1-C)，63．1(4-C)，83．8(7-C)，88．7(11-C)，171．0(4′-C)，171．4(3′-C)，173．7(2-C)以上，二噁烷的化學(xué)位移定為67．4ppm。UV末端吸收(水)IRVKBrmaxcm-12937、1730、1664、1390、1195、1141LCD2FAB-MSm／z 404 [M-H]-甘油用作基準(zhǔn)物。
1H-NMRδ2．25(2H，m，8-H，10-H)，2．63(1H，dd，J=8．0，14．0，8-H)，2．95(1H，dd，J=6．5，14．5Hz，10-H)，3．04(1H，dd，J=7．0，15．0Hz，1′-H)，3．12(1H，dd，J=4．5，15．0Hz，1′-H)，3．12(1H，d，J=11．0Hz，5-H)，3．18(1H，dd，J=5．5，11．0Hz，5-H)，3．26(1H，dd，J=8．5，12．5Hz，13-H)，3．49(1H，dd，J=8．5，12．5Hz，13-H)，3．63(1H，m，9-H)，4．16(1H，dd，J=4．5，7．0，2′-H)，4．29(1H，d，J=5．5Hz，4-H)，4．85(1H，t，J=8．5Hz，1-H)以上，HOD的化學(xué)位移定為4．65ppm。
結(jié)果在附圖33-附圖39給出。附圖33顯示LCD1的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖34顯示LCD1的H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖35顯示LCD1的C13-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。附圖36顯示LCD1的UV吸收譜，其中橫坐標(biāo)表示波長(nm)，縱坐標(biāo)表示吸光度。附圖37顯示LCD1的IR吸收譜，其中橫坐標(biāo)表示波數(shù)(cm-1)，縱坐標(biāo)表示透光度(％)。附圖38顯示LCD2的質(zhì)譜，其中橫坐標(biāo)表示m／z值，縱坐標(biāo)表示相對強(qiáng)度(％)。附圖39顯示LCD2的H1-NMR譜，其中橫坐標(biāo)表示化學(xué)位移(ppm)，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。H1-NMR和C13-NMR的信號(hào)歸屬如下式[ⅩⅪ]所示。 從以上可以明確，tCD是LCD1和LCD2的混合物，LCD1和LCD2是非對映異構(gòu)體，LCD1和LCD2都可用平面結(jié)構(gòu)式[ⅩⅪ]表示。實(shí)施例18．注射劑(1)咪唑基環(huán)戊烯酮以1％的濃度溶于生理鹽水(日本藥典品)制成注射劑。
(2)分別以0．5％和0．1％濃度將咪唑基環(huán)戊烯酮和甘草酸溶于生理鹽水(如上)制成注射劑。
(3)tCD以1％的濃度溶于生理鹽水(日本藥典品)制成注射劑。
(4)分別以0．5％和0．1％濃度將tCD和甘草酸溶于生理鹽水(如上)制成注射劑。
用同樣方法制成本發(fā)明其它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試劑的注射劑。實(shí)施例19片劑(1)100mg咪唑基環(huán)戊烯酮和適量的微晶纖維素制片，包糖衣，制成片劑。
(2)0．1mg咪唑基環(huán)戊烯酮，10mg甘草酸二鉀鹽和適量的微晶纖維素制片，包糖衣，制成片劑。
(3)100mg tCD和適量的微晶纖維素制片，包糖衣，制成片劑。
(6)0．1mg tCD，10mg甘草酸二鉀鹽和適量的微晶纖維素制片，包糖衣，制成片劑。
用同樣方法制成本發(fā)明其它誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡劑的片劑。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供的本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽具有生理活性，如抗癌活性、抑制癌細(xì)胞生長活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性、抑制拓樸異構(gòu)酶活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化活性、抗風(fēng)濕活性、抑制慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕活性、誘導(dǎo)產(chǎn)生Fas抗原活性、抗菌活性、抗病毒活性、改善肝功活性、誘導(dǎo)熱休克蛋白活性、血液成分的正常化活性、增強(qiáng)癌免疫活性、抗炎活性、抑制腫瘤壞死因子表達(dá)活性、抑制一氧化氮產(chǎn)生活性，免疫調(diào)節(jié)活性如遲發(fā)型過敏反應(yīng)抑制活性、淋巴細(xì)胞早幼化抑制活性、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制活性、IgE產(chǎn)生抑制活性和角叉菜膠水腫抑制活性。本發(fā)明還提供含本發(fā)明化合物、其光學(xué)活性體或其鹽的具有生理活性的藥物組合物。
權(quán)利要求
1．一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，分別由以下式[Ⅰ]～[Ⅷ]表示的物質(zhì)或其光學(xué)活性體或其鹽， 式[Ⅲ]中，R1是H、氨基、低級(jí)烷基或在氨基酸有取代基的低級(jí)烷基；R2是從氨基酸中去掉參與肽鍵的氨基和羧基之后的二價(jià)殘基；X是0-或氨基；Yk-是k價(jià)陰離子；m是0-4的整數(shù)；n是0或正整數(shù)；k是正整數(shù)；當(dāng)n為2或大于2時(shí)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的R2可以是相同或不同，當(dāng)X是0-時(shí)，該物質(zhì)是內(nèi)鹽，Yk-不存在， 式[Ⅵ]中，R3和R4可以相同或不同，分別是含1-3個(gè)碳原子的烷基， 式[Ⅶ]中，R5和R6可以相同或不同，分別是芳香氨基酸的芳香環(huán)。
2．一種藥物組合物，其特征在于含權(quán)利要求1所述的用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡物質(zhì)或其光學(xué)活性體或其鹽。
3．一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其是一種抗癌劑。
全文摘要
一種用下述結(jié)構(gòu)式表示的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)。含所述物質(zhì),用于抗癌劑的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07C49/753GK1281426SQ98812031
公開日2001年1月24日 申請日期1998年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月11日
發(fā)明者榎竜嗣, 小山信人, 豬飼勝重, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶酒造株式會(huì)社