專利名稱：蛇毒酶神經(jīng)生長因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是用蛇毒制備神經(jīng)生長因子的工藝方法。
神經(jīng)生長因子是化學(xué)名稱，中文名神經(jīng)活素(神經(jīng)生因子)，英文名NERVE GROWTH FACTOR，簡稱NGF。
神經(jīng)生長因子(NGF)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，也是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一。從發(fā)現(xiàn)NGF至今已40年，它的發(fā)現(xiàn)和研究開拓了神經(jīng)科學(xué)一個嶄新的領(lǐng)域，促進(jìn)了發(fā)展生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究和進(jìn)展。為此，1986年諾貝爾評委會高度評價了這一工作的理論意義和應(yīng)用價值，并將該年度諾貝爾醫(yī)學(xué)生物學(xué)獎授予在NGF研究中做出杰出貢獻(xiàn)的兩位科學(xué)家Levi-Montalcini(意大利)和Cohen(美國)。
根據(jù)文獻(xiàn)報告NGF已從許多生物材料中分離純化獲得，這些材料包括蛇毒、小鼠頜下腺、人足月胎盤、豚鼠前列腺和牛精囊等，但含量最豐富的仍是雄性小鼠頜下腺和多種蛇毒。
由于NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷起著重要的作用，因此國外一些制藥公司都投入大量的人力和物力對NGF進(jìn)行開發(fā)和研究。目前國外研究與開發(fā)處于領(lǐng)先的是Grentech公司，主要用NGF治療外周神經(jīng)損傷和一些神經(jīng)變形性疾病，目前已進(jìn)入二期臨床，但尚未形成商品。而國內(nèi)目前尚未有得到批準(zhǔn)的NGF商品。國外生產(chǎn)的同類產(chǎn)品售價過于昂貴。據(jù)知美國Sigma公司生產(chǎn)的NGF僅0.01mg，即高達(dá)118美元，實非一般國人所能承受。考慮我國蛇毒資源較為豐富，價格低廉，若從中分離提純NGF將有很大的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值。
神經(jīng)再生的研究一直是國內(nèi)學(xué)者長期致力研究的課題。大量的實驗研究結(jié)果表明神經(jīng)生長因子具有促進(jìn)交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和前腦膽堿能神經(jīng)元等神經(jīng)元發(fā)育和分化，并維持它們的正常功能，促進(jìn)它們損傷后的修復(fù)。所以盡快地使神經(jīng)生長因子應(yīng)用于臨床，解除患者的痛苦，乃是當(dāng)前擺在我們面前一個重要的課題。因此我們首先對神經(jīng)生長因子純化工藝進(jìn)行了研究，目前我們已經(jīng)建立一個中式規(guī)模生產(chǎn)神經(jīng)生長因子的工藝，為我們深入研究神經(jīng)生長因子的藥理學(xué)和臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的，就是提供一種用蛇毒制備神經(jīng)生長因子的工藝方法。
本發(fā)明的目的是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的在大量實驗研究基礎(chǔ)上，確定了神經(jīng)生長因子的最佳制造工藝路線。從產(chǎn)率、比活性等技術(shù)參數(shù)優(yōu)選眼鏡蛇毒作為分離純化神經(jīng)生長因子的基料，經(jīng)三步層析，提純單一組份的神經(jīng)生長因子。
采用上述的技術(shù)方案制備出來的神經(jīng)生長因子，經(jīng)臨床前藥理的動物試驗表明，神經(jīng)生長因子是一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育和生存所必須的神經(jīng)細(xì)胞生長活性物質(zhì)經(jīng)研究證實具有下述作用(1)促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育和分化。(2)營養(yǎng)成熟的神經(jīng)元，維持其存活與功能。(3)具有保護(hù)損傷的效應(yīng)神經(jīng)元，在此基礎(chǔ)上促進(jìn)神經(jīng)纖維再生修復(fù)。(4)神經(jīng)生長因子是受損傷或發(fā)生的運動神經(jīng)元誘向因子。
制備工藝所有操作均在10℃以下完成。
①CM-Sephadex C50層析取眼鏡蛇毒10g，溶于0.01M酸鈉緩沖液、(FH5.8)100ml中，溶解后，離心10000轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清，對上述緩沖液5000ml透析，換3次緩沖液，然后樣品上樣于用0.01M乙酸鹽緩沖液平衡好的層析柱(5.5×100cm)中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品，溶于20ml 0.01M乙酸鈉緩沖液(FH5.8)中，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液(PH5.8)平衡好的層析柱(2.6×50cm)中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。
③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml 0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8內(nèi)含0.15MNaCL中，離心10000轉(zhuǎn)，取上清，上sephdexG75(2.6×100cm)柱(已用0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15M/L平衡好)，收集含有NGF活性的對稱峰，經(jīng)電泳及高效液相色譜證明為單一峰后，透析除鹽，凍干即得半成品(約3mg)。
④制劑處方原料神經(jīng)生長因子半成品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定半成品的活性，每支規(guī)格1000單位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍干制得。
適應(yīng)癥用于治療各種原因引起的周圍神經(jīng)損傷；①牽拉傷、切割傷、挫傷等所致周圍神經(jīng)損傷；②代謝性疾病糖尿病、尿毒癥等引起周圍神經(jīng)病變；③椎間盤突出，頸椎病變引起神經(jīng)病變；
④抗腫瘤藥物紫杉醇等引起的神經(jīng)病變，感染性周圍神經(jīng)元等。
用法和用量及給藥途徑①每次1000-2000單位，肌肉注射，每日一次，20天為一個療程。
②四肢損傷手術(shù)中，可在術(shù)局部噴灑給藥或損傷神經(jīng)處局部注射，每次1-2支。
注意事項①本品為蛋白類制劑，過敏體質(zhì)慎用。若出現(xiàn)過敏反應(yīng)，按過敏反應(yīng)處理。
②溶解藥品時需反復(fù)振蕩才能溶解。
有效期及貯藏條件10℃以下保存，暫定2年。
權(quán)利要求
1.蛇毒酶神經(jīng)生長因子，其特征在于他有一個科學(xué)的制備工藝所有操作均在10℃以下完成。①CM-Sephadex C50層析取眼鏡蛇毒10g，溶于0.01M乙酸鈉緩沖液、(FH5.8)100ml中，溶解后，離心10000轉(zhuǎn)，10分鐘，取上清，對上述緩沖液5000ml透析，換3次緩沖液，然后樣品上樣于用0.01M乙酸鹽緩沖液平衡好的層析柱(5.5×100cm)中，用0-0.7MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。②CM-SpharoseFF層析將上述濃縮的樣品；溶于20ml 0.01M乙酸鈉緩沖液(FH5.8)中，上樣于用0.01M乙酸鈉緩沖液(PH5.8)平衡好的層析柱(2.6×50cm)中，用0-1MNaCL線性梯度洗脫，收集具有神經(jīng)生長因子活性的蛋白峰，濃縮凍干。③SephdexG75層析將上述CM-SpharoseFF層析下的樣品，溶解在10ml 0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8內(nèi)含0.15MNaCL中，離心10000轉(zhuǎn)，取上清，上sephdexG75(2.6×100cm)柱(已用0.01M乙酸鈉緩沖液，PH5.8，內(nèi)含0.15M/L平衡好)，收集含有NGF活性的對稱峰，經(jīng)電泳及高效液相色譜證明為單一峰后，透析除鹽，凍干即得半成品(約3mg)。④制劑處方原料神經(jīng)生長因子半成品，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定半成品的活性，每支規(guī)格1000單位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1萬)，及每支藥中含有1.5mg人血白蛋白，過濾分裝，凍干制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是用蛇毒制備神經(jīng)生長因子的工藝方法,在大量實驗基礎(chǔ)上,優(yōu)選眼鏡蛇毒,在10℃以下條件下操作,經(jīng)CM－SepnadexC50、CM－SphatoseFF、SepndexG75三步層析,制成半成品,加入穩(wěn)定劑白蛋白和凍干制品的賦形劑右旋糖苷,過濾分裝,凍干制得。
文檔編號C07K14/435GK1285357SQ99111530
公開日2001年2月28日 申請日期1999年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者潘 清, 郝文學(xué) 申請人:郝文學(xué)