專利名稱：人夏科－萊登晶體2及其編碼序列、以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人夏科-萊登晶體2(Charcot-Leyden Crystal 2,CLC2)的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是人夏科-萊登晶體蛋白的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
夏科-萊登晶體(Charcot-Leyden Crystal,CLC)是自然存在于人體組織和分泌物中的底面為六角的雙錐體形晶體，與寄生過程、過敏性過程中外周血或組織中的嗜酸細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。早在1854年，Charcot和Robin首先在尸體的血液和白血病患者的脾臟中發(fā)現(xiàn)夏科-萊登晶體(Charcot,J.M.；Robin,C.:C.R.Seances Mem.Soc.Biol.Paris 5:44-52,1854)，后來在一位哮喘病患者的唾液中亦發(fā)現(xiàn)了該晶體(Leyden,E.Virchows Arch.Path.Anat.54:324-344,1872)。
CLC在嗜酸細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)的組織和分泌物中被觀察到，這些炎癥反應(yīng)有哮喘、骨髓性白血病、過敏反應(yīng)、寄生蟲病等(Beeson,P.B.1977 et al.The eosinopilIn Problems in the Internal Medicine,Vol.15.；Ottesen,E,A.et al 1978.The eosinophil,eosinophilia and eosinophil-related disorders.In Allergy:Principles and Practice,Vol.2.E.Middleton,C.E.Reed,and E.F.Ellis,eds.C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO,p.584.)。CLC蛋白占嗜酸細(xì)胞總蛋白的約10％(Weller,P.F.et al.1984,J.Biol.Chem.259:15100)，是嗜酸細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，在體液和分泌物中鑒定到這種獨(dú)特的底面為六角的雙錐體形晶體-CLC晶體，可作為嗜酸細(xì)胞相關(guān)的過敏性炎癥的標(biāo)志。
CLC的全長cDNA序列在1993年分離得到，該cDNA序列長598bp，編碼139氨基酸的多肽(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。CLC的基因組序列幾乎同時被獲得，Dyer報(bào)道從特異的19號染色體庫中克隆到包含了CLC編碼序列的基因組片段，對CLC的cDNA和基因組序列分析結(jié)果顯示CLC的編碼順序由4個外顯子拼接而成(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)。
Mastrianni將人夏科-萊登晶體蛋白定位于19號染色體(Mastrianni,D.M.et al1991,Cytogenet.Cell Genet.58 2021)。熒光原位雜交技術(shù)將CLC進(jìn)一步定位于19q13.1(B.Trask and H.Morhrenweiser unpublished observation,cited in Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。
另有一些實(shí)驗(yàn)顯示，夏科-萊登晶體作為一個獨(dú)立的蛋白具有溶血磷脂酶的活性(Gleich,G.J.et al 1976,J.Clin.Invest.57:633-640；Weller,P.F.et al 1980,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.77；7441-7443)。這一結(jié)論同時也被其它一些實(shí)驗(yàn)所支持堿性聚丙烯酰胺膠電泳顯示，溶解的夏科-萊登晶體只有一條條帶，且其分子量為17400，與從嗜酸性顆粒細(xì)胞中分離到的溶血磷脂酶的分子量相符；另外，嗜酸性顆粒細(xì)胞溶血磷脂酶能形成雙錐型的晶體，與夏科-萊登晶體形態(tài)相同。這些都表明，人嗜酸粒細(xì)胞溶血磷脂酶是夏科-萊登晶體的組成成分(Weller,P.F.et al 1980,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.77；7441-7443)。但CLC與其它哺乳動物的溶血磷脂酶沒有結(jié)構(gòu)上的相似性(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)。
而CLC蛋白與外源凝集素家族的某些成員在結(jié)構(gòu)、部分功能上有相似性。CLC的cDNA推導(dǎo)蛋白(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)、基因組順序的內(nèi)含子-外顯子的結(jié)構(gòu)(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)、特征性高度保守殘基(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)、結(jié)合糖的活性(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)、晶體蛋白的整體結(jié)構(gòu)(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)都與galectin家族的某些成員相似，這表明CLC蛋白可能具有g(shù)alectin相關(guān)的一些活性，在細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中通過β-半乳糖苷結(jié)合活性發(fā)揮生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。
CLC是嗜酸細(xì)胞的標(biāo)志，但在嗜堿粒細(xì)胞中也有CLC。亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，CLC存在于嗜酸性細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的顆粒中(Dvorak,A.M.et al.1988,Blood 72:150；Dvorak,A,M.et al.1989,Lab.Invest.60:557)。最近，通過免疫金技術(shù)或間接免疫熒光定位，還發(fā)現(xiàn)CLC存在于嗜酸性細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞中的其他部位，如胞質(zhì)和核(Dvorak,A.M.et al.1990,Lab.Invest.62:590-607；Dvorak,A.M.rtal.1991,Am.J.Pathol.138:69-82；Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)、嗜堿粒細(xì)胞的脫粒通道、脫粒通道膜和一類與嗜酸性細(xì)胞的初級顆粒相似的顆粒。CLC蛋白分布的變化表明嗜堿粒細(xì)胞內(nèi)含物(包括CLC)有釋放與獲得的變化過程，CLC的功能可能與其分布的變化過程相關(guān)(Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸被命名為人CLC2。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人CLC2蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的CLC2多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的CLC2核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4或12所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人CLC2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4或12氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4或12序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人CLC2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人CLC2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人CLC2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人CLC2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人CLC2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為478個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于28-447位核苷酸，它編碼一種人CLC2蛋白-即CLC2A蛋白。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為617個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.11，其中開放讀框位于87-593位核苷酸，它編碼另一種人CLC2蛋白-即CLC2B蛋白。CLC2A和CLC2B是同一基因經(jīng)不同剪接后所產(chǎn)生的蛋白。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人CLC2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框28-447位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列，或者位于SEQ ID NO.11序列的編碼框87-593位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列，也能編碼出SEQ ID NO.4或12所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人CLC2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4或12序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加數(shù)個核苷酸。本發(fā)明的編碼序列可以是DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人CLC2蛋白多肽”指具有人CLC2蛋白活性的SEQ ID NO.4或12序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人CLC2相同功能的、SEQ ID NO.4或12序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人CLC2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人CLC2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人CLC2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人CLC2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人CLC2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人CLC2多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人CLC2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人CLC2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基((如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人CLC2保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.4或12的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人CLC2多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人CLC2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人CLC2多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人CLC2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人CLC2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人CLC2多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人CLC2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CLC2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CLC2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CLC2蛋白的分子，也包括那些并不影響人CLC2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人CLC2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人CLC2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人CLC2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CLC2功能的抗體以及不影響人CLC2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CLC2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CLC2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人CLC2核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City,CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
此外，利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CLC2發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人CLC2蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人CLC2蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人CLC2蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
CLC與嗜酸細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系，其在體液和分泌物中的鑒定可作為嗜酸細(xì)胞相關(guān)的過敏性炎癥的標(biāo)志。另外，CLC與外源凝集素家族的某些成員在結(jié)構(gòu)、部分功能的相似性表明CLC蛋白可能具有外源凝集素相關(guān)的一些活性，在細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中通過β-半乳糖苷結(jié)合活性發(fā)揮生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。CLC還存在于嗜堿粒細(xì)胞中，其分布有變化的過程，因此CLC的功能可能與其分布的變化過程相關(guān)(Dvorak,A.M.etal.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
此外，由于本發(fā)明的人CLC2具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人CLC2A、CLC2B與人CLC(hCLC)、鼠CLC(mCLC)和猩猩CLC(pCLC)等5種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人CLC2的cDNA序列的克隆和測定(A)人CLC2A的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴(kuò)增以人腦λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物--A:5′-CGAAGAGCTGCCCAGAAGGAGAG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B:5′-TCCTCAACAATGAGGAGTCTGATC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段約為500bp的目的片段。
2．PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl03，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對插入片段進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共478bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO:3，其中開放讀框位于28-447位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人CLC2A的氨基酸序列，共139個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO:4。
(B)人CLC2B的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴(kuò)增采用與克隆CLC2A相同的方法，不同點(diǎn)僅在于所用的一對寡核苷酸引物不同，即將寡核苷酸A′:5′-GTGACAGAGCAAGACCCTATCTC-3′(SEQ ID NO.9)為正向引物，寡核苷酸B′:5′-CAATGAGGAGTCTGATCATCTCC-3′(SEQ ID NO.10)為反向引物，進(jìn)行PCR。電泳檢測得到的PCR片段約為600bp的目的片段。
2．PCR產(chǎn)物的測序如上將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A′/B′與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對插入片段進(jìn)行測序，獲得全長cDNA序列，共617bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO:11，其中開放讀框位于87-593位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出人CLC2B的氨基酸序列，共168個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO:12。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人CLC2的全長cDNA序列及其編碼蛋白(包括CLC2A和CLC2B)，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平和蛋白水平上與人的CLC(gb|L01664)都有較高同源性。其中，CLC2A推導(dǎo)蛋白與人CLC蛋白的同一性達(dá)到50％，相似性達(dá)60％。CLC2B推導(dǎo)蛋白與人CLC蛋白的同一性達(dá)到49％，相似性達(dá)59％。另外，CLC2A和CLC2B與鼠和猩猩中已公布的CLC部分序列也顯示了較高的同源性(CLC2A和CLC2B與hCLC、mCLC及pCLC的氨基酸序列同源比較見圖1)。
此外，CLC2A和CLC2B蛋白幾乎相同，不同點(diǎn)僅在于CLC2B在N端多出了近30個氨基酸(圖1)。因此，這暗示CLC2A和CLC2B是同一基因的不同剪接本。
根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相關(guān)的生物學(xué)原理，可以根據(jù)已知的不同物種中的CLC基因及其編碼蛋白的功能來推測本發(fā)明CLC2的生物學(xué)功能。
CLC在嗜酸細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)的組織和分泌物中觀察到，這些炎癥反應(yīng)有哮喘，骨髓白血病，過敏反應(yīng)，寄生蟲病等(Beeson,P.B.1977 et al.The eosinopil InProblems in the Internal Medicine,Vol.15.；Ottesen,E,A.et al 1978.The eosinophil,eosinophilia and eosinophil-related disorders.In Allergy:Principles and Practice,Vol.2.E.Middleton,C.E.Reed,and E.F.Ellis,eds.C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO,p.584.)。CLC蛋白占嗜酸細(xì)胞總蛋白的約10％(Weller,P.F.et al.1984,J.Biol.Chem.259:15100)，是嗜酸細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，在體液和分泌物中鑒定到這種獨(dú)特的底面為六角的雙錐體形晶體-CLC晶體，可作為嗜酸細(xì)胞相關(guān)的過敏性炎癥的標(biāo)志。
而CLC蛋白與外源凝集素家族的某些成員存在結(jié)構(gòu)、部分功能上的相似性。CLC的cDNA推導(dǎo)蛋白與結(jié)合β-半乳糖苷S-樣動物外源凝集素(galectin)超家族的成員有相似性(Ackeman,S.J.et al 1993,J.Immun.150:456-468)。CLC基因組順序的內(nèi)含子-外顯子的結(jié)構(gòu)與galectin的結(jié)構(gòu)相似，全部β-半乳糖苷結(jié)合位點(diǎn)由一個外顯子-編碼，這一特征與目前為止所有的galectin相符合(Dyer,K.D.et al.1997,Genomics 40:17-221)。
對CLC蛋白和人galectin的蛋白序列分析表明，CLC2A與該家族的特征性的13個高度保守殘基中的11個相同或相似，它們是第24位的G、第53位的Q、第55位的R、第57位的H、第65位的N、第72位的W、第75位的E、第77位的K、第83位的F、第86位的G和第115位的R。而CLC2B與該家族的特征性的13個高度保守殘基中的11個相同或相似，它們是第53位的G、第82位的Q、第84位的R、第86位的H、第97位的V、第101位的W、第104位的E、第106位的K、第112位的F、第115位的G和第144位的R。
CLC蛋白能結(jié)合于偶合乳糖的瓊脂糖樹脂，而且這種結(jié)合作用還依賴于糖的劑量(Dyer,K.D.et al.1996,Life Sci.58:2073-2082)。X-射線晶體衍射表明，CLC晶體蛋白的整體結(jié)構(gòu)與galectin-1和-2高度相似。CLC含有保守的galectin的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域的大部分殘基(Leonidas,D.D.et al.1995,Structure 3:1379-1393)。這些結(jié)果都表明CLC蛋白可能具有外源凝集素相關(guān)的一些活性，可能在細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中通過β-半乳糖苷結(jié)合活性發(fā)揮生物功能(Dyer,K.D.et al.1997,Gemonics 40:217-221)。
CLC是嗜酸細(xì)胞的標(biāo)志，但在嗜堿粒細(xì)胞中也有CLC。亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，CLC存在于嗜酸性細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞的顆粒中(Dvorak,A.M.et al.1988,Blood 72:150；Dvorak,A,M.et al.1989,Lab.Invest.60:557)。最近，通過免疫金技術(shù)或間接免疫熒光定位，還發(fā)現(xiàn)CLC存在于嗜酸性細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞中的其他部位，如胞質(zhì)和核(Dvorak,A.M.et al.1990,Lab.Invest.62:590-607；Dvorak,A.M.rtal.1991,Am.J.Pathol.138:69-82；Dvorak,A.M.et al 1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)、嗜堿粒細(xì)胞的脫粒通道、脫粒通道膜和一類與嗜酸性細(xì)胞的初級顆粒相似的顆粒。CLC蛋白分布的變化表明嗜堿粒細(xì)胞內(nèi)含物(包括CLC)有釋放與獲得的過程變化，CLC的功能可能與其分布的變化過程相關(guān)(Dvorak,A.M.et al.1997,Clin.Exp.Allergy 27:452-474)。
本發(fā)明的人CLC2除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人CLC2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人CLC2的N端與鼠CLC的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
本發(fā)明的人CLC2還可用于篩選抑制本發(fā)明蛋白活性的拮抗劑、或增強(qiáng)本發(fā)明蛋白活性的激動劑等。
針對本發(fā)明人CLC2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人CLC2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人CLC2的表達(dá)水平或者抑制人CLC2的過度表達(dá)。本發(fā)明的人CLC2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人CLC2缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3(A)人CLC2A在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人CLC2A的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人CLC2A cDNA作為插人片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5-TCAGGTCGACATGTCATCACTACCCTACC-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CLC2A編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGAAGCTTTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人CLC2A的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CLC2A的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g,20分鐘)。超聲裂解培養(yǎng)物，收集細(xì)胞裂解液并將其稀釋于6M鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人CLC2A。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人CLC2A?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為16kDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
(B)人CLC2B在大腸桿菌中的表達(dá)采用與實(shí)施例3(A)相同的程序?qū)θ薈LC2B進(jìn)行表達(dá)，不同點(diǎn)僅在于以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A′/B′為模板，用對應(yīng)于人CLC2B的cDNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.13和6)代替SEQ ID NO:5和6所示的引物。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5-CAAGGTCGACATGTCCCTGACCCACAGGC-3′(SEQ ID NO.13)，該引物含有SalⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CLC2B編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGAAGCTTTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人CLC2B的部分編碼序列。
隨后，用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接昆合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CLC2B的cDNA片段已正確插入了載體。
獲得的表達(dá)蛋白用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為20kDa。用常規(guī)方法對人CLC2B蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.12的序列一致。
實(shí)施例4(A)人CLC2A在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人CLC2A的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人CLC2A cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGTCATCACTACCCTACC-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CLC2A編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGGGATCCTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和人CLC2A的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(flori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CLC2A的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris.HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris.HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris.HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為16kDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
(B)人CLC2B在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)采用與實(shí)施例4(A)相同的程序?qū)θ薈LC2B進(jìn)行表達(dá)，不同點(diǎn)僅在于以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A′/B′為模板，用對應(yīng)于人CLC2B的cDNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.14和8)代替SEQ ID NO:7和8所示的引物。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-CAAGAAGCTTATGTCCCTGACCCACAGGC-3′(SEQ ID NO.14)該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人CLC2B編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGGGATCCTCAATCGCTGATAAGCACT-3(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和人CLC2B的部分編碼序列。
隨后，用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人CLC2B的cDNA片段已正確插入了載體。
如上用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、表達(dá)蛋白并分離純化。獲得的蛋白用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為20kDa。用常規(guī)方法對人CLC2B蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.12的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的CLC2A或CLC2B重組蛋白分別用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人CLC2A基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人復(fù)旦大學(xué)(ⅱ)發(fā)明名稱人夏科-萊登晶體2及其編碼序列，以及制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目14(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1:CGAAGAGCTG CCCAGAAGGAGAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2TCCTCAACAA TGAGGAGTCTGATC 24(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度478bp(B)類型核酸
(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.3:CGAAGAGCTG CCCAGAAGGA GAGAACAATG TCATCACTAC CCGTACCATA CACACTGCCT 60GTTTCCTTGC CTGTTGGTTC GTGCGTGATA ATCACAGGGA CACCGATCCT CACTTTTGTC 120AAGGACCCAC AGCTGGAGGT GAATTTCTAC ACTGGGATGG ATGAGGACTC AGATATTGCT 180TTCCAATTCC GACTGCACTT TGGTCATCCT GCAATCATGA ACAGTCGTGT GTTTGGCATA 240TGGAGATATG AGGAGAAATG CTACTATTTA CCCTTTGAAG ATGGCAAACC ATTTGAGCTG 300TGCATCTATG TGCGTCACAA GGAATACAAG GTAATGGTAA ATGGCCAACG CATTTACAAC 360TTTGCCCATC GATTCCCGCC AGCATCTGTG AAGATGCTGC AAGTCTTGAG AGATATCTCC 420CTGACCAGAG TGCTTATCAG CGATTGAGGG AGATGATCAG ACTCCTCATT GTTGAGGA478(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度139個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.4:Met Ser Ser Leu Pro Val Pro Tyr Thr Leu Pro Val Ser Leu Pro 15Val Gly Ser Cys Val Ile Ile Thr Gly Thr Pro Ile Leu Thr Phe 30Val Lys Asp Pro Gln Leu Glu Val Asn Phe Tyr Thr Gly Met Asp 45Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Gln Phe Arg Leu His Phe Gly His 60Pro Ala Ile Met Ash Ser Arg Val Phe Gly Ile Trp Arg Tyr Glu 75Glu Lys Cys Tyr Tyr Leu Pro Phe Glu Asp Gly Lys Pro Phe Glu 90Leu Cys Ile Tyr Val Arg His Lys Glu Tyr Lys Val Met Val Asn 105Gly Gln Arg Ile Tyr Ash Phe Ala His Arg Phe Pro Pro Ala Ser 120Val Lys Met Leu Gln Val Leu Arg Asp Ile Ser Leu Thr Arg Val 135Leu Ile Ser Asp 139(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGTCATCACTACCCTACC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.6:TAGGAAGCTT TCAATCGCTG ATAAGCACT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGTCATCAC TACCCTACC 29(2)SEQ ID NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.8TAGGGGATCC TCAATCGCTG ATAAGCACT 29(2)SEQ ID NO.9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.9:GTGACAGAGC AAGACCCTAT CTC 23(2)SEO ID NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10CAATGAGGAG TCTGATCATC TCC 23(2)SEQ ID NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度617bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.11:GTGACAGAGC AAGACCCTAT CTCAAAAATA CAGAAAAATC ATCAACCACT TGCAGTCGTC 60GTAGAAATCA ATCATTCCCT CCAGTTATGT CCCTGACCCA CAGGCTTCAT TTGTGCAAGT 120ACTGGGGCTG TGCTGTCAGT AATGTGTGCC GCTTCTGGGA AGGACGTCCA TTGCCCTTGA 180TGATTGTGGT ACCATACACA CTGCCTGTTT CCTTGCCTGT TGGTTCGTGC GTGATAATCA 240CAGGGACACC GATCCTCACT TTTGTCAAGG ACCCACAGCT GGAGGTGAAT TTCTACACTG 300GGATGGATGA GGACTCAGAT ATTGCTTTCC AATTCCGACT GCACTTTGGT CATCCTGCAA 360TCATGAACAG TCGTGTGTTT GGCATATGGA GATATGAGGA GAAATGCTAC TATTTACCCT 420TTGAAGATGG CAAACCATTT GAGCTGTGCA TCTATGTGCG TCACAAGGAA TACAAGGTAA 480TGGTAAATGG CCAACGCATT TACAACTTTG CCCATCGATT CCCGCCAGCA TCTGTGAAGA 540TGCTGCAAGT CTTGAGAGAT ATCTCCCTGA CCAGAGTGCT TATCAGCGAT TGAGGGAGAT 600GATCAGACTC CTCATTG 617(2)SEQ ID NO.12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度168個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.12:Met Ser Leu Thr His Arg Leu His Leu Cys Lys Tyr Trp Gly Cys 15Ala Val Ser Ash Val Cys Arg Phe Trp Glu Gly Arg Pro Leu Pro 30Leu Met Ile Val Val Pro Tyr Thr Leu Pro Val Ser Leu Pro Val 45Gly Ser Cys Val Ile Ile Thr Gly Thr Pro Ile Leu Thr Phe Val 60Lys Asp Pro Gln Leu Glu Val Asn Phe Tyr Thr Gly Met Asp Glu 75Asp Ser Asp Ile Ala Phe Gln Phe Arg Leu His Phe Gly His Pro 90Ala Ile Met Ash Ser Arg Val Phe Gly Ile Trp Arg Tyr Glu Glu 105Lys Cys Tyr Tyr Leu Pro Phe Glu Asp Gly Lys Pro Phe Glu Leu 120Cys Ile Tyr Val Arg His Lys Glu Tyr Lys Val Met Val Asn Gly 135Gln Arg Ile Tyr Asn Phe Ala His Arg Phe Pro Pro Ala Ser Val 150Lys Met Leu Gln Val Leu Arg Asp Ile Ser Leu Thr Arg Val Leu 165Ile Ser Asp 168(2)SEQ ID NO.13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.13:CAAGGTCGAC ATGTCCCTGA CCCACAGGC 29(2)SEQ ID NO.14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.14:CAAGAAGCTT ATGTCCCTGA CCCACAGGC 29
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4或12所示的序列。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列。
4．一種分離的人CLC2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4或12氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4或12序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人CLC2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人CLC2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人CLC2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸28-447位的核苷酸序列或SEQ ID NO.11中從核苷酸87-593位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人CLC2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人CLC2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人CLC2蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求4所述的人CLC2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人夏科－萊登晶體2(Charcot－Leyden Crystal 2,簡稱為“CLC6”)的cDNA序列,該cDNA編碼的蛋白是人夏科－萊登晶體蛋白的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K16/00GK1303940SQ99119870
公開日2001年7月18日 申請日期1999年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月27日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 張宏來, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)