專利名稱：編碼新的融合蛋白的dna和通過(guò)該dna的表達(dá)來(lái)制備有用的多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼新的融合蛋白的DNA和這些DNA用于生產(chǎn)可在制藥、科研和其他產(chǎn)業(yè)中利用的生物活性多肽的用途。
多肽物質(zhì)例如用作藥物的激素和生物活性物質(zhì)和用于診斷、工業(yè)應(yīng)用和科研的酶經(jīng)常是通過(guò)提取法從生物體獲取的。然而，靠提取法以低的花費(fèi)獲取大量的純的物質(zhì)卻是困難的。最近，由于基因重組技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)可以通過(guò)使用來(lái)自生物體如微生物、動(dòng)物和植物的各種細(xì)胞而更加經(jīng)濟(jì)地、大量地制備高純度的重組蛋白。
但是，直到目前還尚未完全實(shí)現(xiàn)有用蛋白(或多肽)的經(jīng)濟(jì)的大量生產(chǎn)，因此對(duì)新技術(shù)的開(kāi)發(fā)也一直在連續(xù)不斷地進(jìn)行著。另外，目前所開(kāi)發(fā)出的大量生產(chǎn)體系不能通過(guò)基因重組技術(shù)來(lái)制備所有種類(lèi)的蛋白質(zhì)，因此實(shí)際上它們是根據(jù)蛋白質(zhì)的種類(lèi)而分別開(kāi)發(fā)的。
在采用短芽孢桿菌的重組蛋白表達(dá)體系中，當(dāng)外源蛋白被連接在微生物的細(xì)胞壁蛋白(下文簡(jiǎn)稱為“CWP”)信號(hào)肽的下游并將所得的融合蛋白表達(dá)時(shí)，具有天然結(jié)構(gòu)的外源蛋白從欲被分泌到培養(yǎng)基中的CWP信號(hào)肽上切下(日本專利No．2082727；JP-A-62-201583；YamagataH．等人，細(xì)菌學(xué)雜志，1691239-1245( )1987)；Udaka J日本生物科學(xué)、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，61669-676(1987)；Takano M．等人，微生物學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用，3075-80(1989)；和YamagataH．等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 863589-3593(1989))。當(dāng)將人表皮生長(zhǎng)因子(下文簡(jiǎn)稱為“EGF”)在上述表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，EGF的表達(dá)量比EGF在其他表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的量高10-100倍；所表達(dá)的蛋白保持其原本的活性并被分泌到培養(yǎng)基中；因此，容易對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行分離和純化；并與一些大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)不同，該體系不需要將失活蛋白轉(zhuǎn)變成活性蛋白的復(fù)雜程序。鑒于這些原因，上述表達(dá)體系作為重組蛋白的大量生產(chǎn)體系已引起人們的注意。
但是，并不是所有的與CWP信號(hào)肽相連的蛋白均可以與表達(dá)EGF相當(dāng)?shù)牧窟M(jìn)行表達(dá)，并且它們并不總是能從欲被分泌到培養(yǎng)基中的信號(hào)肽上裂解下來(lái)。
Miyauchi等人在《日本生物科學(xué)、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)化學(xué)協(xié)會(huì)的年會(huì)論談?wù)?7372(1993)中建議了解決上述問(wèn)題的辦法。即，他們制備了一種MWP蛋白N末端的17個(gè)氨基酸(具有9個(gè)或12個(gè)氨基酸的沒(méi)有成功)被插在MWP信號(hào)肽和比目魚(yú)生長(zhǎng)激素蛋白之間的融合蛋白的編碼基因，并將該基因在芽孢桿菌中表達(dá)以獲得融合蛋白。然而，所產(chǎn)生的蛋白不是天然型的蛋白質(zhì)，在其N(xiāo)末端多了一些氨基酸。Miyauchi等人指出該表達(dá)受來(lái)自MWP的N末端的氨基酸數(shù)目的影響。
Miyauchi等人既沒(méi)有明示也沒(méi)有暗示可以通過(guò)向序列中引入化學(xué)或酶促裂解位點(diǎn)來(lái)生產(chǎn)與相應(yīng)的天然型蛋白具有相同氨基酸組成的多肽。事實(shí)上，這樣的裂解是困難的，因?yàn)楸饶眶~(yú)生長(zhǎng)激素包括一些易被化學(xué)或酶促裂解的序列。
在這種情況下，對(duì)于工業(yè)目的而言，開(kāi)發(fā)出一種可使外源多肽在芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中容易地表達(dá)和分泌的技術(shù)是極其有用的，即，開(kāi)發(fā)出一種重組蛋白的高表達(dá)系統(tǒng)是極其有用的，其中多肽具有與天然類(lèi)型的多肽同樣的序列。
本發(fā)明的目的在于提供一種包含融合蛋白的編碼DNA的芽孢桿菌表達(dá)體系，所述的融合蛋白含有有用的多肽序列，該體系具有能大量表達(dá)和分泌融合蛋白的能力，可以選擇性地裂解所述的融合蛋白以得到具有天然型結(jié)構(gòu)的多肽。
本發(fā)明提供一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括由芽孢桿菌的細(xì)胞壁蛋白(CWP)N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的用于化學(xué)或酶促裂解的序列、和外源多肽序列；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“(細(xì)胞壁蛋白的)N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基”是指由自N末端第1個(gè)氨基酸開(kāi)始數(shù)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的序列。例如，由3個(gè)氨基酸組成的序列是指由細(xì)胞壁蛋白的第1至第3個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。
融合蛋白還可包含位于N末端的芽孢桿菌CWP信號(hào)肽序列。
融合蛋白還可包含用作分離及純化標(biāo)記的氨基酸組成的序列和／或用作接頭的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬細(xì)菌是短芽孢桿菌。
作為用于化學(xué)裂解的氨基酸殘基，舉例說(shuō)是甲硫氨酸。在這種情況下，融合蛋白不應(yīng)再含有另外的甲硫氨酸殘基，以便在化學(xué)裂解反應(yīng)(例如用溴化氰進(jìn)行的化學(xué)裂解反應(yīng))中獲得最高的特異性。
用于酶促裂解的氨基酸殘基可包含能被蛋白酶促裂解的序列。所述蛋白酶的例子是TEV蛋白酶、V8蛋白酶等等。
在本發(fā)明的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列、作為接頭的氨基酸序列Gly SerPro Val Pro Ser Gly、用于將目的多肽化學(xué)裂解出來(lái)所需的甲硫氨酸殘基、和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
在該情況下，融合蛋白可包含在N末端的MWP信號(hào)肽序列。所述多肽的一個(gè)例子是人胰島素原。由MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列優(yōu)選包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20或50個(gè)氨基酸。
在本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的10個(gè)或20個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列、作為接頭的人表皮生長(zhǎng)因子序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln(SEQ ID NO2)、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列但在其N(xiāo)末端具有甘氨酸或絲氨酸的的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
在此情況下，融合蛋白還可包含位于N末端的MWP信號(hào)肽序列。至于多肽，可以舉例的是人促生長(zhǎng)素抑制素。
在本發(fā)明的第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的20個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列、作為接頭的氨基酸序列Gly SerPro Val Pro Ser Gly、用V8蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Phe Leu Glu、和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
在該情況下，融合蛋白類(lèi)似地還可包含位于N末端的MWP信號(hào)肽序列。人胰高血糖素是一種有用的所述多肽。
本發(fā)明還涉及一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括芽孢桿菌的CWP信號(hào)肽序列、由氨基酸殘基組成的用于酶促裂解的序列、和外源多肽序列；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。
在該發(fā)明中，所述信號(hào)肽可直接與位于其下游的來(lái)自CWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的序列相連。
所述的芽孢桿菌屬細(xì)菌優(yōu)選為短芽孢桿菌。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由用于酶促裂解的氨基酸殘基組成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含MWP的信號(hào)肽序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp TyrAsp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
在此情況下，所述信號(hào)肽可直接與位于其下游的由來(lái)自CWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的序列相連。作為所述的多肽，可以舉出在其N(xiāo)末端具有甘氨酸或絲氨酸的突變的人生長(zhǎng)激素。
本發(fā)明還提供包含上述一種DNA的載體。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供被上述載體轉(zhuǎn)化的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌為短芽孢桿菌。
本發(fā)明還提供了一種制備重組多肽的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上文定義的細(xì)菌，以在該細(xì)菌細(xì)胞外使包含外源多肽的融合蛋白積聚；從培養(yǎng)基中分離出融合蛋白；從所分離出的融合蛋白中將所述外源多肽裂解出來(lái)；和收集所述的多肽。
本發(fā)明包括在作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件的日本專利申請(qǐng)No．10-87339的說(shuō)明書(shū)和／或附圖中所公開(kāi)的所有或部分內(nèi)容。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示融合蛋白產(chǎn)物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的氨基酸序列和編碼該產(chǎn)物的核苷酸序列。
圖2顯示融合蛋白產(chǎn)物MWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原的氨基酸序列和編碼該產(chǎn)物的核苷酸序列。
圖3顯示融合蛋白產(chǎn)物MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素的氨基酸序列和編碼該產(chǎn)物的核苷酸序列。
圖4顯示融合蛋白產(chǎn)物MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的氨基酸序列和編碼該產(chǎn)物的核苷酸序列。
圖5是顯示將各融合DNA引入短芽孢桿菌表達(dá)載體(pNU211R2L5)的方式的示意圖。
圖6是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的與His-標(biāo)記相連的胰島素原的培養(yǎng)基的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記蛋白(泳道1)、陰性對(duì)照(用不含外源蛋白編碼基因的質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp15-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp40-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp50-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道11)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp100-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道12)。
圖7是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的不含His-標(biāo)記的胰島素原的培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記肽(泳道1)、陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-胰島素原(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp1-Met-胰島素原(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp2-Met-胰島素原(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp3-Met-胰島素原(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp4-Met-胰島素原(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp5-Met-胰島素原(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-Met-胰島素原(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp7-Met-胰島素原(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-Met-胰島素原(泳道11)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-Met-胰島素原(泳道12)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原(泳道13)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-Met-胰島素原(泳道14)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-Met-胰島素原(泳道15)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp13-Met-胰島素原(泳道16)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp14-Met-胰島素原(泳道17)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp15-Met-胰島素原(泳道18)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp17-Met-胰島素原(泳道19)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-Met-胰島素原(泳道20)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp50-Met-胰島素原(泳道21)。
圖8是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的促生長(zhǎng)素抑制素的培養(yǎng)基的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記肽(泳道1)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28(泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28胰島素原(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28(泳道4)、和轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28(泳道5)。
圖9是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的胰高血糖素的培養(yǎng)基的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記肽(泳道1)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-胰高血糖素(泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(泳道4)、和轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(泳道5)。
圖10是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的與His-標(biāo)記相連的胰島素原的培養(yǎng)基的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道1)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp15-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp40-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp50-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp100-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道11)。
圖11是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的不含His-標(biāo)記的胰島素原的培養(yǎng)基的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道1)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-胰島素原(泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp1-Met-胰島素原(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp2-Met-胰島素原(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp3-Met-胰島素原(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp4-Met-胰島素原(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp5-Met-胰島素原(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-Met-胰島素原(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp7-Met-胰島素原(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-Met-胰島素原(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-Met-胰島素原(泳道11)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原(泳道12)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-Met-胰島素原(泳道13)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-Met-胰島素原(泳道14)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp13-Met-胰島素原(泳道15)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp14-Met-胰島素原(泳道14)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp15-Met-胰島素原(泳道17)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp17-Met-胰島素原(泳道18)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-Met-胰島素原(泳道19)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp50-Met-胰島素原(泳道20)。
圖12是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原和通過(guò)溴化氰處理而從中裂解下來(lái)的胰島素原的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記肽(泳道1)、分離并純化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原(30微克，泳道2)、通過(guò)溴化氰處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的胰島素原(30微克，泳道3)和胰島素原(Sigma)(2微克，泳道4)。
圖13是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原和通過(guò)溴化氰處理而從中裂解下來(lái)的胰島素原的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為分離并純化的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原(0．3微克，泳道1)、通過(guò)溴化氰處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的胰島素原(0．3微克，泳道2)和胰島素原(Sigma)(0．3微克，泳道3)。
圖14是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和通過(guò)TEV蛋白酶處理而從中裂解下來(lái)的促生長(zhǎng)素抑制素28的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為分離并純化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28(104微克，泳道1；52微克，泳道3；26微克，泳道5)、通過(guò)TEV蛋白酶處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的促生長(zhǎng)素抑制素28(104微克，泳道2；52微克，泳道4；26微克，泳道6)、和促生長(zhǎng)素抑制素28(BACHEM)(4．5微克，泳道7；1．5微克，泳道8)。
圖15是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素和通過(guò)V8蛋白酶處理而從中裂解下來(lái)的胰高血糖素的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為分離并純化的融合蛋白MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(90微克，泳道1；45微克，泳道3；22．5微克，泳道5)、通過(guò)V8蛋白酶處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的胰高血糖素(90微克，泳道2；45微克，泳道4；22．5微克，泳道6)、和胰高血糖素(日本Shimizu制藥株式會(huì)社)(1．5微克，泳道7)。
圖16是顯示用于估測(cè)所產(chǎn)生的融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的量的電泳／蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原而獲得的培養(yǎng)基(1微升，泳道1；1／3微升，泳道2；1／32微升，泳道3；1／33微升，泳道4；1／34微升，泳道5)和胰島素原(Sigma)(1微升，泳道6；0．3微升，泳道7；0．1微升，泳道8；0．03微升，泳道9；0．01微升，泳道10)。
圖17顯示融合蛋白產(chǎn)物MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的氨基酸序列和編碼該產(chǎn)物的核苷酸序列。
圖18是顯示將融合產(chǎn)物MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH引入短芽孢桿菌表達(dá)載體(pNU211R2L5)的方式的示意圖。
圖19是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的人生長(zhǎng)激素的培養(yǎng)基的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記蛋白(泳道1)、陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-GH(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-TEV-G-GH(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp2-TEV-G-GH(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp3-TEV-G-GH(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp4-TEV-G-GH(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp5-TEV-G-GH(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-TEV-G-GH(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp7-TEV-G-GH(泳道11)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-TEV-G-GH(泳道12)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-TEV-G-GH(泳道13)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-TEV-G-GH(泳道14)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-TEV-G-GH(泳道15)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-TEV-G-GH(泳道16)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp14-TEV-G-GH(泳道17)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(泳道18)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp30-TEV-G-GH(泳道19)。
圖20是顯示含有通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的人生長(zhǎng)激素的培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為陰性對(duì)照(僅用質(zhì)粒pNU211R2L5轉(zhuǎn)化的，泳道1)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-GH(泳道2)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-TEV-G-GH(泳道3)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH(泳道4)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp2-TEV-G-GH(泳道5)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp3-TEV-G-GH(泳道6)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp4-TEV-G-GH(泳道7)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp5-TEV-G-GH(泳道8)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp6-TEV-G-GH(泳道9)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp7-TEV-G-GH(泳道10)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp8-TEV-G-GH(泳道11)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp9-TEV-G-GH(泳道12)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp10-TEV-G-GH(泳道13)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp11-TEV-G-GH(泳道14)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp12-TEV-G-GH(泳道15)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp14-TEV-G-GH(泳道16)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(泳道17)、轉(zhuǎn)化子MWPsp-MWPmp30-TEV-G-GH(泳道18)。
圖21是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH和通過(guò)TEV蛋白酶處理而從中裂解下來(lái)的突變的人生長(zhǎng)激素G-GH的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片，其中，各樣品為標(biāo)記蛋白(泳道1)、分離并純化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH(5微克，泳道2)、通過(guò)TEV蛋白酶處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的突變的人生長(zhǎng)激素G-GH(5微克，泳道3)、和人生長(zhǎng)激素(Biogenesis)(5微克，泳道4)。
圖22是顯示經(jīng)分離并純化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH和通過(guò)TEV蛋白酶處理而從中裂解下來(lái)的突變的人生長(zhǎng)激素G-GH的電泳結(jié)果的照片，其中，各樣品為分離并純化的融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH(0．1微克，泳道1)、通過(guò)TEV蛋白酶處理而從所述融合蛋白中裂解下來(lái)的突變的人生長(zhǎng)激素G-GH(0．1微克，泳道2)、和人生長(zhǎng)激素(Biogenesis)(0．1微克，泳道3)。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明按照本發(fā)明，具有所需的天然型一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽可通過(guò)對(duì)在芽孢桿菌中表達(dá)上述的DNA而產(chǎn)生的融合蛋白進(jìn)行化學(xué)或酶學(xué)處理而得到。
來(lái)自芽孢桿菌的CWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的例子是來(lái)自(但不限于)短芽孢桿菌菌株47-5Q(保藏編號(hào)為FERMBP-1664JP-A-60-58074；JP-A-62-201589)和短芽孢桿菌菌株HPD31(保藏編號(hào)為FERM BP-1087；JP-A-04-0278091)的那些殘基。例如，可以使用下列序列
MWPmp10Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro (SEQ IDNO3；細(xì)菌學(xué)雜志1691239-1245，1989)；OWPmp10Ala Pro Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Gly Gly (SEQ ID NO4；細(xì)菌學(xué)雜志170176-186，1988)；HWPmp10Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met (SEQ IDNO5；細(xì)菌學(xué)雜志1721312-1320，1990)。
來(lái)自所述N末端的氨基酸殘基的數(shù)目通常為一個(gè)或更多，優(yōu)選為6個(gè)或更多，更優(yōu)選為6、7、8、10、11、12、13、14、15、17、20或50個(gè)。
關(guān)于氨基酸殘基的化學(xué)或酶促裂解，化學(xué)裂解的例子包括位于甲硫氨酸C-末端側(cè)的選擇性裂解(生物化學(xué)雜志，2371856-1860，1962)和位于色氨酸C-末端側(cè)的選擇性裂解(酶學(xué)方法，91318-324，1983)；而酶促裂解的例子是通過(guò)因子X(jué)a、凝血酶、腸激酶、V8蛋白酶、TEV蛋白酶或類(lèi)似的酶等對(duì)融合位點(diǎn)的選擇性裂解。因?yàn)閷?duì)氨基酸殘基的化學(xué)或酶促裂解位于目的多肽的N末端側(cè)，隨后的化學(xué)或酶促裂解可導(dǎo)致具有所需一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽的產(chǎn)生。
在本發(fā)明中，外源多肽可是來(lái)源于任何生物體的多肽，只要它不影響上述的化學(xué)或酶促裂解程序即可。具體地講，當(dāng)采用化學(xué)裂解特別是通過(guò)溴化氰進(jìn)行的化學(xué)裂解時(shí)，在目的外源多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)(或氨基酸序列)中不應(yīng)含有甲硫氨酸殘基。所述多肽的例子是(不限于)人胰島素原、人血小板衍生的生長(zhǎng)因子A鏈(PDGF-A)、人腸促胰液素和類(lèi)似物等。在特別采用TEV蛋白酶進(jìn)行酶促裂解時(shí)，為了得到與天然類(lèi)型相同的多肽，所述外源多肽在N末端側(cè)必須具有甘氨酸或絲氨酸殘基。這些外源多肽的例子是人促生長(zhǎng)素抑制素28、人血小板衍生的生長(zhǎng)因子A鏈(PDGF-A)、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)等，然而，所述多肽不限于上面舉出的具體例子，只要在N末端添加甘氨酸或絲氨酸不影響外源多肽的功能就行。當(dāng)使用V8蛋白酶進(jìn)行酶促裂解時(shí)，外源多肽應(yīng)絕不含谷氨酸殘基。這種多肽的例子是人胰高血糖素、人心房鈉尿肽、人降鈣素等等。
根據(jù)本發(fā)明，DNA可優(yōu)選含有編碼在融合蛋白N末端的芽孢桿菌CWP信號(hào)肽的核苷酸序列，特別是MWP信號(hào)肽的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA還可含有編碼用作分離及純化的標(biāo)記的氨基酸的核苷酸序列和／或編碼被稱作接頭的氨基酸的核苷酸序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離及純化的標(biāo)記”是指助于將通過(guò)基因重組技術(shù)表達(dá)而制備的融合蛋白分離出來(lái)的肽。
優(yōu)選標(biāo)記序列和能與之結(jié)合的物質(zhì)間的結(jié)合是可逆的。所述的標(biāo)記序列包括(例如)與谷光甘肽有親和性的谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、與直鏈淀粉有親和性的麥芽糖結(jié)合蛋白、其中的組氨酸與金屬有親和性的組氨酸殘基組成的肽序列、抗原及其抗體，等等。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的標(biāo)記序列是His His His His His His(SEQ IDNO61)(即，(His)6)。
接頭通常存在于蛋白質(zhì)內(nèi)的功能性結(jié)構(gòu)域之間，并具有連接所述的結(jié)構(gòu)域但不影響所述結(jié)構(gòu)域的功能的作用。在本發(fā)明中，接頭位于用于分離及純化的標(biāo)記序列和外源多肽之間，并起使帶有所插入的標(biāo)記序列的融合蛋白表達(dá)／分泌的作用。所用接頭的例子是選自Ala、Gly、Pro、Ser和Val的氨基酸殘基不同數(shù)目的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的接頭是Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly。然而，如果沒(méi)有插入用于分離及純化的標(biāo)記序列，可以將接頭摻入融合蛋白中，也可以不將之摻入。在融合蛋白包含促生長(zhǎng)素抑制素28作為外源多肽的情況下，一個(gè)特別的接頭如EGF是保證外源多肽的表達(dá)／分泌所必須的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的1個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選6-50(不包括9)個(gè)、特別是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20或50個(gè)氨基酸殘基組成的序列(下文簡(jiǎn)稱為MWPmp6、MWPmp7、MWPmp8、MWPmp10，等等)，由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列(在本文中以(His)6表示)，作為接頭的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly，用于將目的多肽裂解出來(lái)所需的甲硫氨酸殘基，和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是CWP的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。這種多肽的例子是人胰島素原。所述的標(biāo)記序列或接頭是任選的元件。所述融合蛋白還可進(jìn)一步包含位于N末端的MWP信號(hào)肽序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的1個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選6-50(不包括9)個(gè)、特別是10或20個(gè)氨基酸殘基組成的序列，由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列，作為接頭的人表皮生長(zhǎng)因子序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr PheGln，和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列但在其N(xiāo)末端具有甘氨酸或絲氨酸的的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。所述多肽的例子是促生長(zhǎng)素抑制素28。所述融合蛋白還可進(jìn)一步包含位于N末端的MWP信號(hào)肽序列。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的1個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選6-50(不包括9)個(gè)、特別是20個(gè)氨基酸殘基組成的序列，由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化的標(biāo)記的序列，作為接頭的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly，用V8蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Phe Leu Glu，和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。所述多肽的例子是人胰高血糖素。所述融合蛋白還可進(jìn)一步包含位于N末端的MWP信號(hào)肽序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還涉及一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，所述的融合蛋白包含芽孢桿菌的CWP信號(hào)肽序列、由用于酶促裂解的氨基酸殘基組成的序列、和外源多肽序列；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。
由來(lái)自CWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列可以直接跟著所述的信號(hào)肽序列。用于酶促裂解的序列可以是易被蛋白酶如因子X(jué)a、凝血酶、腸激酶、V8蛋白酶或TEV蛋白酶等裂解的序列。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，融合蛋白包括MWP的信號(hào)肽序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp Tyr AspIle Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
在這種情況下，由來(lái)自MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列可以直接跟著所述的信號(hào)肽序列。如果融合蛋白中包含來(lái)自MWP蛋白N末端的序列，優(yōu)選該序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、20或30個(gè)氨基酸。所述多肽的例子是在N末端為甘氨酸的突變的人生長(zhǎng)激素。
在本發(fā)明中，編碼上述融合蛋白的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。適宜的啟動(dòng)子是(但不限于)來(lái)源于短芽孢桿菌菌株47-5Q(JP-B-01-58950；JP-B-07-108224)的MWP啟動(dòng)子和來(lái)源于短芽孢桿菌菌株HPD31(JP-A-06-278091；JP-A-06-133782)的HWP啟動(dòng)子，等等。
本發(fā)明的DNA可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中的已知技術(shù)的組合來(lái)制備。例如，各元件的DNA序列可通過(guò)化學(xué)合成或克隆來(lái)分別制備；結(jié)合PCR擴(kuò)增(即，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，將所獲得的NDA序列用連接酶按序連接起來(lái)，以得到目的DNA。參考下文所描述的實(shí)施例，其細(xì)節(jié)可更加明晰。關(guān)于可用于本發(fā)明的各種常用技術(shù)，請(qǐng)參見(jiàn)Maniatis，T．等人編輯，分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989)；Innis，NA．等人，PCR Protocols，方法和應(yīng)用指南，Academic出版社(1990)。
編碼外源多肽的DNA可利用常規(guī)的克隆技術(shù)而得到。例如，將外源多肽純化并測(cè)定其部分氨基酸序列；在所測(cè)出的序列的基礎(chǔ)上，合成探針或制備抗體；并用探針或抗體來(lái)篩選含有目的cDNA的cDNA文庫(kù)，由此得到編碼目的多肽的DNA。對(duì)于較短的DNA，可利用亞氨膦酸酯化學(xué)在市售的DNA合成儀上合成。如果必要，可對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中將DNA變性、與引物的退火和延伸循環(huán)重復(fù)20次或以上。
本發(fā)明還提供包含上文定義的DNA的載體?？捎糜诒景l(fā)明的載體必須具有適當(dāng)?shù)牟迦胛稽c(diǎn)或能引入DNA的限制位點(diǎn)，允許DNA在芽孢桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)，并可在該宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。在載體可包含復(fù)制起點(diǎn)、終止子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或可選擇的標(biāo)記如抗藥基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型特征的互補(bǔ)基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選為質(zhì)粒。載體的例子包括pUN200、pHY500(Proc．Natl．Acad．Sci．USA863589-3593)、pHY4831(細(xì)菌學(xué)雜志1691239-1245，1987)、pUN100(應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)3075-80，1989)、pNU211(生化雜志112488-491，1992)、pNU211R2L5(JP-A-07-170984)、pHY700(JP-A-04-278091)、pHT210(JP-A-06-133782)和pHT110R2L5(應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)42358-363，1994)。在下面所述的例子中，可通過(guò)如圖5和18所示的構(gòu)建方法制備表達(dá)載體，即，pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN、pNU-GCN和pNU-G-GH。
本發(fā)明還提供了用上文定義的載體轉(zhuǎn)化的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌?？捎糜诒景l(fā)明的芽孢桿菌是(但不限于)短芽孢桿菌菌株47-5Q(保藏編號(hào)為FERM BP-1664；JP-A-60-58074；JP-A-62-201589)、短芽孢桿菌菌株47K(JP-A-02-257876)、短芽孢桿菌菌株31OK(JP-A-06-296485)、短芽孢桿菌菌株HPD31(保藏編號(hào)為FERM BP-1087；JP-A-04-0278091)，等等。被轉(zhuǎn)入短芽孢桿菌菌株47-5Q的表達(dá)載體pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN和pNU-GCN已分別按照布達(dá)佩斯條約保藏于日本通產(chǎn)商業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)；其保藏編號(hào)為FERM BP-6311、FERM BP-6312、FERM BP-6313和FERM BP-6314。
將如上獲得的載體引入處于感受態(tài)的芽孢桿菌細(xì)胞中，然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中將芽孢桿菌細(xì)胞在能使載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)，由此在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外、優(yōu)選在細(xì)胞外產(chǎn)生重組融合多肽；并通過(guò)常規(guī)技術(shù)收集和純化所產(chǎn)生的多肽。所述引入載體的例子是電穿孔(酶學(xué)方法21723-33，1993)?？刹捎眠m當(dāng)?shù)幕旌夏z過(guò)濾、離子交換色譜、親和色譜、疏水作用層析、電泳等等來(lái)對(duì)所獲得的融合蛋白進(jìn)行純化。
可隨后對(duì)融合蛋白進(jìn)行化學(xué)或酶促裂解，以得到具有天然一級(jí)結(jié)構(gòu)的目的多肽。關(guān)于裂解處理，可采用甲硫氨酸或色氨酸C-末端側(cè)的化學(xué)裂解以及通過(guò)因子X(jué)a、凝血酶、腸激酶、V8蛋白酶或TEV蛋白酶進(jìn)行的酶促裂解。
本發(fā)明還提供了一種制備重組多肽的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上被轉(zhuǎn)化的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌，以在該細(xì)菌的細(xì)胞外使包含外源多肽的融合蛋白積聚；從培養(yǎng)基中分離出融合蛋白；從所分離出的融合蛋白中將所述外源多肽裂解出來(lái)；和收集所述的多肽。
按本發(fā)明的該方法制備出的重組多肽可用于制藥、診斷、科研等等。
在實(shí)施例中，融合蛋白通過(guò)如下步驟制備將化學(xué)合成的正鏈和負(fù)鏈寡核苷酸退火；采用寡核苷酸通過(guò)PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增DNA片段；采用DNA連接酶通過(guò)連接反應(yīng)將擴(kuò)增出的DNA片段連接起來(lái)。在本文中，“MWPsp”是指MWP蛋白的信號(hào)肽，跟在MWPmp后面的數(shù)字(如，MWPmp1、2、3…)是指來(lái)自MWP成熟蛋白N-末端的氨基酸的數(shù)目(如，1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)…氨基酸)。
實(shí)施例1構(gòu)建摻入融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體pPINS-1(1)制備DNA片段MWPsp-MWPmp10將下列(ⅰ)至(ⅳ)加至0．5ml試管中，得到100μl反應(yīng)溶液，按照已知方法(Innis，M．A．等，PCR總論，方法和應(yīng)用指南，Academic Press，1990)進(jìn)行PCR反應(yīng)，重復(fù)30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘；55℃退火1分鐘；72℃延長(zhǎng)DNA鏈1分鐘。
(ⅰ)模板DNA840 ng基因組DNA，是按照已知方法(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))從短芽孢桿菌(菌株47-5Q)中提取的。
(ⅱ)引物正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO6)和反向引物5’-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3’(SEQ IDNO7)，是以Yamagata，H．等(細(xì)菌學(xué)雜志169，1239-1245，1987)和Tsuboi．A．等(細(xì)菌學(xué)雜志170，935-945，1988)確定的MWP蛋白質(zhì)的核苷酸序列為基礎(chǔ)，用有機(jī)合成法制備的，將這些引物加至0．1μM的終濃度。
(ⅲ)Taq DNA合成酶5U市售Taq DNA合成酶(GIBCO BRL)。
(ⅳ)其它Tris-HCl(終濃度為20mM，pH8)，MgCl2(終濃度為2．5 mM)和dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP，終濃度各50μM)。
在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用苯酚濃縮反應(yīng)混合物，然后加至0．8％瓊脂糖凝膠中，在正常條件下，進(jìn)行電泳。用Ultrafree C3H(MolliporeCorp．)從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，即DNA片段MWPsp-MWPmp10。將回收的PCR產(chǎn)物用苯酚處理，經(jīng)乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于適量的蒸餾水中。此后，按制造商的說(shuō)明，將所得PCR產(chǎn)物用DNA Blunting試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd)制成平整末端。
(2)制備DNA片段(His)6根據(jù)遺傳密碼表(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))，化學(xué)合成編碼(His)6的正向寡核苷酸5’-CATCATCATCATCATCAC-3’(SEQ ID NO8)和反向寡核苷酸5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO9)。按制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)將所述寡核苷酸磷酸化，于95℃，在10mM Tris-HCl(pH8)和5mM MgCl2溶液中處理5分鐘，并在37℃退火15分鐘。將退火的雙鏈DNA片段(His)6用苯酚處理，經(jīng)乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于適量的蒸餾水中。
(3)制備DNA片段接頭根據(jù)遺傳密碼表(同上文)，化學(xué)合成編碼接頭Gly Ser Pro Val Pro SerGly(SEQ ID NO1)的正向寡核苷酸5′-GGTTCTCCAGTACCTTCTGGA-3’(SEQ ID NO53)和反向寡核苷酸5′-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3’(SEQ ID NO10)，然后按照本實(shí)施例(2)中所述進(jìn)行退火以得到雙鏈DNA片段接頭。
(4)制備DNA片段胰島素原按照與本實(shí)施例(1)中所述相同的方法，制備平整末端DNA的片段胰島素原，不同的是(a)用摻入人胰島素原DNA的質(zhì)粒載體10ng作模板DNA，該載體通過(guò)下列方法制備按照制造商的說(shuō)明，用第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia)，從市售人胰腺mRNA(Clontech)合成人胰腺cDNA；以Bell，G．I．等(Nature，282，525-527，1979)確定的人胰島素原基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成正向引物5’-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3’(SEQID NO11)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ IDNO12)；用上述得到的作為模板的cDNA和合成的寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，重復(fù)35個(gè)循環(huán)在94℃處理1分鐘，60℃處理1分鐘，72℃處理1分鐘；將由此得到的PCR產(chǎn)物，即人胰島素原DNA克隆到pGEM-T載體(Promega)中；(b)使用正向引物5’-TTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ IDNO13)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQ IDNO12)；和(c)通過(guò)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈30秒鐘；完成PCR反應(yīng)。
(5)制備DNA片段Met-胰島素原按照本實(shí)施例(4)中所述相同的方法，制備平整末端DNA片段Met-胰島素原，不同之處是(a)用本實(shí)施例(4)中得到的10ng PCR產(chǎn)物胰島素原作模板DNA；和(b)使用正向引物5’-ATGTTTGTGAACCAACACCTG-3’(SEQ ID NO54)。
按照制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，使平整末端DNA片段Met-胰島素原再經(jīng)磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化DNA片段Met-胰島素原。
(6)制備融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6按照本實(shí)施例(1)中所述相同的方法，制備平整末端融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(1)中得到的適量DNA片段MWPsp-MWPmp10與本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段(His)6在16℃反應(yīng)30分鐘來(lái)制備模板DNA；(b)使用反向引物5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO9)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)30秒；完成PCR反應(yīng)。
此后，按照制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，將所得的PCR產(chǎn)物磷酸化。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)將磷酸化的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入HincⅡ切割的載體(BlueScript SK-，Stratagene)中，以便用已知方法(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒載體DNA。為了確定是否得到了融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6，用測(cè)序載體的正向或反向引物(即M13正向或反向引物)，確定載體的核苷酸序列。按照與上述相同的方法，完成第二PCR反應(yīng)，用摻入MWPsp-MWPmp10-(His)6的載體作模板DNA，并使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO6)和反向引物5’-GTGATGATGATGATGATG-3’(SEQ ID NO9)，由此，制備平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6。
(7)制備融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭按照與本實(shí)施例(6)所述相同的方法制備平整末端融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)通過(guò)將上述(6)中所得的適量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6與上述(3)中得到的適量DNA片段接頭在16℃反應(yīng)30分鐘來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3’(SEQ ID NO10)用于第一PCR反應(yīng)。
(8)制備摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體按照與本實(shí)施例(6)中所述相同的方法制備摻入融合產(chǎn)物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體pPINS-1，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將適量本實(shí)施例(7)中所得融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭與適量本實(shí)施例(5)所得DNA片段Met-胰島素原在16℃反應(yīng)30分鐘來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3’(SEQID NO12)用于第一PCR反應(yīng)。
實(shí)施例2分別構(gòu)建摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體(1)制備DNA片段MWPsp-MWPmp6、8、9、11、12、15、40、50、100按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備DNA片段MWPsp-MWPmp6、8、9、11、12、15、40、50、100，不同的是(a)用下列引物作為反向引物MWPmp6 5′-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′ (SEQ ID NO14)MWPmp8 5′-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3′ (SEQ ID NO15)MWPmp9 5′-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3′ (SEQ ID NO16)MWPmp115′-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3′ (SEQ ID NO17)MWPmp125′-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3′ (SEQ ID NO18)MWPmp155′-ATCAGCGTCCATTTTTGG-3′ (SEQ ID NO19)MWPmp405′-GTCTACACCGTATTCGCCGT-3′(SEQ ID NO20)MWPmp505′-AGTAGCGAACTCTGCACGAG-3′(SEQ ID NO21)MWPmp1005′-AGATTTGTCCGGGAAACCTT-3′(SEQ ID NO22)；(b)通過(guò)重復(fù)30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈1分鐘；以完成PCR反應(yīng)。
(2)制備DNA片段(His)6-接頭-Met-胰島素原按照與實(shí)施例1(1)中所述相同的方法，制備平整末端DNA片段(His)6-接頭-Met-胰島素原，不同的是(a)用10ng實(shí)施例1(8)中所得的摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭的載體pPINS-1作為模板DNA；(b)使用正向引物5’-CATCATCATCATCATCAC-3’(SEQ IDNO8)和反向引物5’-CTAGTTGCAGTAGTTCTC-3’(SEQ ID NO23)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，47℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈30秒；以完成PCR反應(yīng)。
按照制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，將平整末端DNA片段(His)6-接頭-Met-胰島素原進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段(His)6-接頭-Met-胰島素原。
(3)分別制備摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體按照實(shí)施例1(8)中所述，制備分別摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接頭-Met-胰島素原的載體，不同的是，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)通過(guò)分別將本實(shí)施例(1)中制備的適量DNA片段MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、11-、12-、15-、40-、50-、100與本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段(His)6-接頭-Met-胰島素原在16℃反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
實(shí)施例3構(gòu)建摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原的載體按照與實(shí)施例1(8)所述相同的方法制備摻入有融合DNAMWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原的載體pPINS-2，不同的是，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將實(shí)施例1(1)中得到的適量DNA片段MWPsp-MWPmp10與實(shí)施例1(5)得到的適量DNA片段Met-胰島素原在16℃反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
實(shí)施例4構(gòu)建分別摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原的載體(1)制備DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、7、13、14、17、20按照與實(shí)施例1所述相同的方法制備平整末端DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、7、13、14、17、20，不同的是(a)用下列引物作為反向引物MWPmp1 5′-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3′ (SEQ ID NO24)MWPmp2 5′-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3′ (SEQ ID NO25)MWPmp3 5′-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3′ (SEQ ID NO26)MWPmp4 5′-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3′ (SEQ ID NO27)MWPmp5 5′-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3′ (SEQ ID NO28)MWPmp7 5′-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3′ (SEQ ID NO29)MWPmp135′-GTCCATTTTTGGAGCTGT-3′ (SEQ ID NO30)MWPmp145′-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3′ (SEQ ID NO31)MWPmp175′-TTCCATATCAGCGTCCAT-3′ (SEQ ID NO32)MWPmp205′-TACGGTTTTTTCCATATCAGC-3′(SEQ ID NO33)；(b)重復(fù)30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈1分鐘；完成PCR反應(yīng)。
(2)制備分別摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原的載體按照與實(shí)施例1(8)所述相同的方法，制備分別摻入有融合DNAMWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原的載體，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)分別將適量實(shí)施例2(1)和本實(shí)施例(1)中所得的DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、17、20、50與實(shí)施例1(5)中所得的適量DNA片段Met-胰島素原在16℃反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
實(shí)施例5構(gòu)建摻入有融合DNA MWPsp-胰島素原的載體(1)制備DNA片段MWPsp按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端DNA片段MWPsp，不同的是，將反向引物5’-TGCGAAAGCCATTGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO34)用于PCR反應(yīng)。
(2)制備摻入有融合DNA MWPsp-胰島素原的載體按照與實(shí)施例1(8)所述相同的方法，制備摻入有融合DNAMWPsp-胰島素原的載體，不同的是，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(1)中所得的適量DNA片段MWPsp與實(shí)施例1(4)中所得的平整末端DNA片段胰島素原在16℃反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
實(shí)施例6構(gòu)建分別摻入有融合DNA MWPsp-促長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWP10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWP10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWP20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的載體(1)制備DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28，不同的是(a)以Shen，L．-P等(Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A，79，4575-4579，1982)確定的核苷酸序列為基礎(chǔ)，用有機(jī)合成法制備作為模板DNA的10ng人促生長(zhǎng)素抑制素28單鏈DNA(5′-TCTGCTAACTCAAACCCGGCTATGGCACCCCGAGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTTAG-3′(SEQID NO55))；(b)使用正向引物5’-TCTGCTAACTCAAACCCG-3’(SEQ IDNO35)和反向引物5’-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3’(SEQ IDNO36)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈10秒；完成PCR反應(yīng)。
按制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)將平整末端DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28。
(2)制備DNA片段EGF
按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端DNA片段EGF，不同的是(a)用10ng人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)單鏈DNA(5′-AACTCTGACTCCGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTATTGCCTGCATGATGGTGTTTGTATGTATATCGAAGCTCTGGACAAATATGCTTGCAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTATCGCGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGT-3′)(SEQ ID NO56))作為模板DNA，該單鏈DNA是以Bell，G．I．等(核酸研究，14，8427-8446，1986)確定的人表皮生長(zhǎng)因子的核苷酸序列為基礎(chǔ)，通過(guò)有機(jī)合成法制備的；(b)使用正向引物5’-AACTCTGACTCCGAATGC-3’(SEQ IDNO37)和反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO38)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈15秒；完成PCR反應(yīng)。
按制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)將平整末端DNA片段EGF進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段EGF。
(3)制備DNA片段TEV根據(jù)遺傳密碼表(同上文)，化學(xué)合成編碼由TEV蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列的正向寡核苷酸5′-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA-3′(SEQ ID NO57)和反向寡核苷酸5′-TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3′(SEQ IDNO58)，并按照實(shí)施例1(2)所述進(jìn)行退火，由此得到雙鏈DNA片段TEV。
(4)制備融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF按照實(shí)施例1(6)所述，制備平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，將實(shí)施例1(6)中所得的適量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6與本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段EGF在16℃反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO38)用于第一PCR反應(yīng)。
(5)制備融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV按照實(shí)施例1(6)所述，制備平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將實(shí)施例1(6)中所得的適量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6與本實(shí)施例(3)中所得的適量DNA片段TEV反應(yīng)30分鐘，制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO39)用于第一PCR反應(yīng)。
(6)制備融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV按照與實(shí)施例1(6)所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將本實(shí)施例(4)中所得的適量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF與本實(shí)施例(3)中所得的適量DNA片段TEV反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO39)用于第一PCR反應(yīng)。
(7)制備融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6按照與實(shí)施例1(6)中所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將實(shí)施例4(1)中所得的適量融合DNAMWPsp-MWPmp20與實(shí)施例1(2)中所得的適量DNA片段(His)6反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
(8)制備融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF按照與實(shí)施例1(6)中所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16C，通過(guò)將本實(shí)施例(7)中所得適量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6與(2)所得的適量DNA片段EGF反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-ACGCAGTTCCCACCATTT-3’(SEQ ID NO38)用于第一PCR反應(yīng)。
(9)制備融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV按照與實(shí)施例1(6)中所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將本實(shí)施例(8)中所得適量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF與本實(shí)施例(3)所得的適量DNA片段TEV反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO39)用于第一PCR反應(yīng)。
(10)制備分別摻入有融合DNA MWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的載體按照與實(shí)施例1(8)所述相同的方法，制備分別摻入有融合DNAMWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的載體，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將實(shí)施例5(1)中所得的DNA片段MWPsp與本實(shí)施例(1)中所得的DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于MWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28的第一PCR反應(yīng)的模板DNA；并用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將適量DNA片段促生長(zhǎng)素抑制素28分別與本實(shí)施例(5)、(6)和(9)中所得的適量融合DNAMWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV反應(yīng)30分鐘，制備用于MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的第一PCR反應(yīng)的模板DNA；將反向引物5’-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3’(SEQ ID NO36)用于第一PCR反應(yīng)。
實(shí)施例7構(gòu)建分別摻入有融合DNA MWPsp-胰高血糖素、MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素、MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(pGCN)和MWPsp-MWPmp30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的載體(1)制備DNA片段胰高血糖素按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段胰高血糖素，不同的是(a)用10ng人胰高血糖素單鏈DNA(5′-CACAGCCAAGGTACTTTCACATCCGACTACTCTAAATATCTGGATTCCCGTCGCGCTCAAGATTTCGTTCAATGGCTGATGAACACT-3′(SEQ ID NO59))作為模板DNA，該單鏈DNA是以Drucher，D．J等(生物化學(xué)雜志，263，13475-13478，1988)確定的人胰高血糖素核苷酸序列為基礎(chǔ)，通過(guò)有機(jī)合成法制備的；(b)使用正向引物5’-CACAGCCAAGGTACTTTC-3’(SEQ IDNO40)和反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQ IDNO41)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈10秒；完成PCR反應(yīng)。
按制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)將平整末端DNA片段胰高血糖素進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段胰高血糖素。
(2)制備DNA片段V8-胰高血糖素按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端DNA片段V8-胰高血糖素，不同的是(a)用10ng本實(shí)施例(1)中得到的人胰高血糖素DNA為模板DNA；(b)使用正向引物5’-TTCCTGGAACACAGCCAA-3’(SEQ IDNO42)和反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQ IDNO41)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈10秒；完成PCR反應(yīng)。
按制造商的說(shuō)明，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)將平整末端DNA片段V8-胰高血糖素進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段V8-胰高血糖素。
(3)制備DNA片段MWPsp-MWPmp30按照與實(shí)施例1(6)所述相同的方法，制備平整末端的融合DNA片段MWPsp-MWPmp30，不同的是，使用反向引物5’-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3’(SEQ ID NO43)。
(4)制備融合DNA MWPsp-MWPmp30-(His)6按照與實(shí)施例1(6)所述相同的方法，制備平整末端的融合DNA片段MWPsp-MWPmp30-(His)6，不同的是，用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將本實(shí)施例(3)中所得的適量DNA片段MWPsp-MWPmp30與實(shí)施例1(2)中所得的適量DNA片段(His)6反應(yīng)30分鐘，制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA。
(5)制備融合DNA MWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接頭按照與實(shí)施例1(6)所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接頭，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將實(shí)施例1(3)中所得的適量DNA片段接頭分別與實(shí)施例6(7)和本實(shí)施例(4)中所得的適量融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6和MWPsp-MWPmp30-(His)6反應(yīng)30分鐘，制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)在第一PCR反應(yīng)中使用反向引物5′-TCCAGAAGGTACTGGAGAACC-3′(SEQ IDNO10)。
(6)制備分別摻入有融合DNA MWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的載體按照與實(shí)施例1(8)所述相同的方法，制備分別摻入有融合DNAMWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的載體，不同的是(a)用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，Co．，Ltd．)，在16℃，通過(guò)將實(shí)施例5(1)中所得的適量DNA片段MWPsp與本實(shí)施例(1)中所得的適量DNA片段胰高血糖素反應(yīng)30分鐘，制備用于MWPsp-胰高血糖素的第一PCR反應(yīng)的模板DNA；并用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，通過(guò)將本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段V8-胰高血糖素分別與實(shí)施例1(7)和本實(shí)施例(5)中所得的適量融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭和MWPsp-MWPmp20-、30-(His)6-接頭反應(yīng)30分鐘，制備用于MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的第一PCR反應(yīng)的模板DNA；和(b)將反向引物5’-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3’(SEQID NO41)用于第一PCR反應(yīng)。
實(shí)施例8融合DNA的表達(dá)／分泌和產(chǎn)物的選擇性裂解(1)融合產(chǎn)物的氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列在實(shí)施例1-7中所得的融合產(chǎn)物中，在SEQ ID NOS48-51、62-65和圖1-4中分別列出了下列產(chǎn)物的核苷酸序列和氨基酸序列。
MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原(SEQ ID NO48，62)MWPsp-MWPmp10-Met-胰島素原(SEQ ID NO49，63)MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28(SEQ ID NO50，64)MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素(SEQ ID NO51，65)(2)融合產(chǎn)物的表達(dá)／分泌表達(dá)由實(shí)施例1-7中所得的融合DNA編碼的融合蛋白質(zhì)。圖5是一個(gè)代表性實(shí)例，是分別將上述4個(gè)融合DNA導(dǎo)入表達(dá)載體的方法。
具體地講，用限制酶ApaLⅠ和HindⅢ(當(dāng)相對(duì)于M13引物的方向，以正向插入融合DNA時(shí))或ApaLⅠ和KpnⅠ(當(dāng)相對(duì)于M13引物的方向，以反向插入融合DNA時(shí))處理?yè)饺肓松鲜鋈诤螪NA的載體(pPINS-1、pPINS-2、pSTN、pGCN)。然后，將限制片段經(jīng)0．8％瓊脂糖凝膠電泳以分離出具有融合DNA的DNA片段。用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，在16℃，將由此所得的適量的各融合DNA與適量已用ApaLⅠ和HindⅢ(當(dāng)相對(duì)于M13引物的方向，以正向插入融合DNA時(shí))裂解的短芽孢桿菌表達(dá)載體pNU211R2L5(JP-A-5-304962和JP-A-7-170984)反應(yīng)30分鐘，由此，將各融合DNA導(dǎo)入表達(dá)載體。因此，得到分別摻入了各融合DNA的表達(dá)載體pNU-PINS-1、pNU-PINS-2、pNU-STN和pNU-GCN。按照已知方法(Methods in Enzymol21723-33，1993)，用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌菌株47-5Q(FERM BP-1664)，此后，使所得轉(zhuǎn)化體在T2瓊脂培養(yǎng)基[polypeptone(1％)，肉提取物(0．5％)，酵母提取物(0．2％)，尿嘧啶(0．1mg／ml)，葡萄糖(1％)，紅霉素(10μg／ml)，瓊脂(1．5％)，pH7]中生長(zhǎng)。
在37℃，將各轉(zhuǎn)化體在T2培養(yǎng)基(從T2培養(yǎng)基中除去瓊脂)中培養(yǎng)1天。然后，按照已知方法(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))，從各培養(yǎng)基中純化質(zhì)粒DNA，并用ApaLⅠ和HindⅢ(或KpnⅠ)處理，以確定融合DNA是否被導(dǎo)入了轉(zhuǎn)化體。對(duì)于摻入了融合DNA的轉(zhuǎn)化體，檢測(cè)由摻入的融合DNA編碼的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)／分泌。具體地講，以1∶1000的體積比，將從T2培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞懸浮液分別加至5YC培養(yǎng)基[polypeptone(3％)，酵母提取物(0．2％)，葡萄糖(3％)，CaCl2·2H2O(0．01％)，MgSO4·7H2O(0．01％)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0．001％)，MnSO4·4H2O(0．001％)，ZnSO4·7H2O(0．0001％)，對(duì)羥苯基甘氨酸(0．3％)，紅霉素(10μg／ml)，pH7]中，在30℃振蕩培養(yǎng)4天。
在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，以15000rpm，將培養(yǎng)基離心2分鐘以得到上清液，用于按已知方法(Laemmli，U．KNature，227，680-685，1970)電泳分析蛋白質(zhì)。具體地講，將18μl各上清液加至2μl緩沖液1[125 mM Tris-HCl(pH6．8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巰基乙醇]中，煮沸5分鐘，然后加至4μl緩沖液2[250mM Tris-HCl(pH6．5)，50％甘油，0．5％BPB]中。用市售15／25％SDS聚丙烯酰胺凝膠(Daiichi Chemicals，Co．LtdJapan)電泳所得的上清液(電泳緩沖液為100mM Tris，100mM麥黃酮(Tricine)，0．1％SDS)，以便用考馬斯藍(lán)染色確定是否存在融合蛋白質(zhì)的表達(dá)／分泌。
MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、10-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接頭-Met-胰島素原的表達(dá)／分泌結(jié)果列于圖6，作為外源多肽胰島素原的代表。除MWPsp-MWPmp9-(His)6-接頭-Met-胰島素原(泳道5)外，所有融合產(chǎn)物均有表達(dá)／分泌。MWPsp-胰島素原、MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原的表達(dá)／分泌結(jié)果列于圖7。除MWPsp-胰島素原(泳道3)和MWPsp-MWPmp9-Met-胰島素原(泳道12)外，所有融合產(chǎn)物均有表達(dá)／分泌。對(duì)于MWPsp-MWPmp6-、8-、9-、10-、11-、12-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原還觀察到較高的表達(dá)／分泌水平。MWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28、MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的表達(dá)／分泌結(jié)果列于圖8，作為外源多肽促生長(zhǎng)素抑制素28的代表。未觀察到MWPsp-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp10-(His)6-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28有表達(dá)／分泌，但是觀察到MWPsp-MWPmp10-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28和MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28有表達(dá)／分泌。而且MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的表達(dá)／分泌水平較高。MWPsp-胰高血糖素和MWPsp-MWPmp10-、20-、30-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的表達(dá)／分泌結(jié)果列于圖9，作為外源多肽胰高血糖素的代表。只觀察到MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素有表達(dá)／分泌。
(3)鑒定胰島素原用胰島素原C-肽的抗體免疫鑒定胰島素原。以15000rpm將培養(yǎng)基離心2分鐘以得到各培養(yǎng)基的上清液。然后，按上述將各1微升的上清液電泳，并按已知方法(Towbin，H．等，76，4350-4354，1979)電印跡到硝酸纖維素膜上。將該膜在溶于緩沖液3[20mM Tris-HCl(pH7．4)，150mM NaCl，0．1％Tween 20]的5％脫脂奶中浸1小時(shí)，然后，在振蕩條件下，再浸在用緩沖液3以1∶2000稀釋的兔抗-C-肽抗體(LINCORESEARCH)中，30分鐘。在振蕩條件下，用緩沖液3，將所述膜洗滌3次，每次10分鐘，然后再在振蕩條件下，浸在用緩沖液3以1∶2000稀釋的以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(E-Y實(shí)驗(yàn)室)中30分鐘。浸漬完成后，將膜用緩沖液3振蕩洗滌3次，每次10分鐘，以便用ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham International plc)按照制造商的說(shuō)明確定胰島素原的存在與否。如圖10和11所示，對(duì)于MWPsp-MWPmp6-、8-、10-、11-、12-、15-、40-、50-、100-(His)6-接頭-Met-胰島素原，檢測(cè)到了表示胰島素原存在的信號(hào)，但對(duì)于不含融合DNA的pNU211R2L5和MWPsp-MWPmp9-(His)6-接頭-Met-胰島素原，沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。對(duì)于MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、17-、20-、50-Met-胰島素原，檢測(cè)到了表示胰島素原存在的信號(hào)，但對(duì)于pNU211R2L5、MWPsp-胰島素原和MWPsp-MWPmp9-胰島素原，沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。
(4)胰島素原的裂解在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有摻入了融合DNA MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。將所得的培養(yǎng)基以20000rpm離心15分鐘。向上清液中加入飽和度為30％的硫酸銨。將所得的上清液再以20000rpm離心20分鐘以得到沉淀，將所得沉淀溶解于適量的2mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中，以相同的緩沖液進(jìn)行透析。在透析結(jié)束時(shí)，將溶液的緩沖液用20mM磷酸鈉(pH7)和150mM NaCl置換。將所得的溶液加到螯合柱(Pharmacia)上，并用含300mM咪唑的相同緩沖液洗脫以便將融合蛋白質(zhì)與其它雜質(zhì)蛋白質(zhì)分離并得到純化。將分離出的融合蛋白質(zhì)用硫酸銨沉淀并按上述方法離心，收集沉淀。將顆粒沉淀溶解于2mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中以便用相同的緩沖液進(jìn)行透析。
然后，將甲酸加到經(jīng)透析的溶液中，達(dá)到70％的終濃度，向其中加入溴化氰，溴化氰的加入量與蛋白質(zhì)的克數(shù)相等。將混合物在室溫放置過(guò)夜，以便從融合蛋白質(zhì)中化學(xué)裂解出胰島素原。將所得溶液用2mM磷酸鈉緩沖液(pH7)進(jìn)行透析，然后加至螯合柱上，用含60mM咪唑的相同緩沖液洗脫胰島素原。圖12列出了將融合蛋白MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原和胰島素原在15／25％聚丙烯酰胺凝膠上電泳和考馬斯藍(lán)染色的結(jié)果，該融合蛋白已用螯合柱分離并純化，但還未裂解，所述胰島素原已用溴化氰裂解。圖13表示用蛋白質(zhì)電泳，然后用抗-C-肽抗體將電泳結(jié)果印跡在硝酸纖維素膜上來(lái)鑒定胰島素原。對(duì)于融合蛋白證實(shí)了胰島素原的存在。
(5)促生長(zhǎng)素抑制素28的裂解在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有摻入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。將所得的培養(yǎng)基以20000rpm離心15分鐘。向所得上清液中加入50％飽和度的硫酸銨。再將所得上清液以20000rpm離心20分鐘，得到顆粒沉淀，將所述沉淀溶解于適量的2mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中，用相同的緩沖液進(jìn)行透析。在透析結(jié)束時(shí)，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)和150mM NaCl置換溶液的緩沖液。將所得溶液加至螯合柱(Pharmacia)上，用含300mM咪唑的相同緩沖液洗脫，以便將融合蛋白質(zhì)MWPmp20-(His)6-EGF-TEV-促生長(zhǎng)素抑制素28與其它雜質(zhì)蛋白分離并純化。用TEV蛋白酶(GIBCO BRL，10U)按照制造商的說(shuō)明，處理不同量的分離出的融合蛋白質(zhì)(104，52和26微克)，以便從融合蛋白質(zhì)中裂解出促生長(zhǎng)素抑制素28。將用TEV蛋白酶處理的蛋白質(zhì)以及未處理的蛋白質(zhì)電泳，印跡在硝酸纖維素膜上，然后用兔抗促生長(zhǎng)素抑制素抗體(MEDAC，稀釋2000倍)和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(E-Y實(shí)驗(yàn)室，稀釋2000倍)檢測(cè)。圖14表示用TEV蛋白酶促裂解出促生長(zhǎng)素抑制素28。
(6)胰高血糖素的裂解在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有摻入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。將所得的培養(yǎng)基以20000rpm離心15分鐘。向所得上清液中加入50％飽和度的硫酸銨。再將所得上清液以20000rpm離心20分鐘，得到顆粒沉淀，將所述沉淀溶解于適量的2mM磷酸鈉緩沖液(pH7)中，用相同的緩沖液進(jìn)行透析。在透析結(jié)束時(shí)，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)和150mM NaCl置換溶液的緩沖液。將所得溶液加至螯合柱(Pharmacia)上，用含300mM咪唑的相同緩沖液洗脫，以便將融合蛋白質(zhì)MWPmp20-(His)6-接頭-V8-胰高血糖素與其它雜質(zhì)分離并純化。用V8蛋白酶(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd2微克)的0．1M碳酸鈉溶液處理不同量的分離出的融合蛋白質(zhì)(90，45和22．5微克)，以便從融合蛋白質(zhì)中裂解出胰高血糖素。將用V8蛋白酶處理的蛋白質(zhì)以及未處理的蛋白質(zhì)電泳，印跡在硝酸纖維素膜上，然后用兔抗胰高血糖素抗體(SANBIO，稀釋2000倍)和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(E-Y實(shí)驗(yàn)室，稀釋2000倍)檢測(cè)。圖14表示用V8蛋白酶促裂解出了胰高血糖素。
(7)胰島素原的氨基酸分析通過(guò)氨基酸分析鑒定從融合蛋白質(zhì)MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原中裂解出的胰島素原。具體地講，分析按如下步驟完成在在Hitachi氨基酸分析儀L-8500(Hitachi，Ltd．)上進(jìn)行分析前，用溴化氰處理融合蛋白，然后用6N-HCl(含0．1％苯酚)于110℃水解已經(jīng)用螯合柱分離純化過(guò)的胰島素原20小時(shí)。如下表所示，來(lái)自融合蛋白的胰島素原的氨基酸組成與天然胰島素原的理論氨基酸組成基本一致。
表1氨基酸理論值測(cè)定值(nM)氨基酸組成A 43．3744．80R 42．9774．24N+D 43．0834．39C 61．2531．78Q+E 15 10．634 15．13G 118．173 11．63H 21．5842．25I 21．2121．72L 128．709 12．39K 21．6022．28F 32．3043．28P 33．0944．40S 52．5413．62T 32．2113．15Y 42．8053．99V 54．1785．9585 59．734 85．00(8)評(píng)估產(chǎn)量以融合產(chǎn)物MWPsp-MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原為例，用Western印跡評(píng)估其在培養(yǎng)基中分泌出的產(chǎn)量。將以15000rpm離心2分鐘得到的1微升上清液和1微升胰島素原(Sigma)分別進(jìn)行3n-倍稀釋，電泳，然后印跡到硝酸纖維素膜上以便比較用抗C肽抗體檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度。如圖16所示，3倍稀釋的上清液的信號(hào)強(qiáng)度似乎與0．03微克至0．1微克的胰島素原的相似。因此，推測(cè)出MWPmp10-(His)6-接頭-Met-胰島素原的產(chǎn)量為100至300mg／升。
實(shí)施例9構(gòu)建摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的載體(pG-GH)(1)制備DNA片段MWPsp-MWPmp20按照與實(shí)施例4(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段MWPsp-MWPmp20，不同的是，重復(fù)30個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈1分鐘；完成PCR反應(yīng)。
(2)制備DNA片段TEV根據(jù)遺傳密碼表(同上文)，化學(xué)合成編碼氨基酸序列(AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln(SEQ ID NO2)正向寡核苷酸5′-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA-3′(SEQ ID NO57)和反向寡核苷酸5′-TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3′(SEQ ID NO58)，該氨基酸序列能夠被TEV蛋白酶識(shí)別。然后，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按照制造商的說(shuō)明，將所述寡核苷酸磷酸化，在95℃，10mM Tris-HCl(pH8)和5mM MgCl2溶液中處理5分鐘，然后在37℃退火15分鐘。將退火的雙鏈DNA片段TEV用苯酚處理，用乙醇沉淀，真空干燥，然后溶解于適量蒸餾水中。
(3)制備DNA片段人生長(zhǎng)激素GH按照與本實(shí)施例(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段GH，不同的是(a)用摻入有DNA片段GH的質(zhì)粒載體作為模板DNA，用下列方法制備該載體用第一鏈cDNA合成試劑盒(Pharmacia)，按照制造商的說(shuō)明，從市售人垂體mRNA(Clonteeh)合成人垂體cDNA；以Roskam，W．G．等(核酸研究，7，305-320，1979)和Martial，J．A．等(科學(xué)，205，602-607，1979)確定的人生長(zhǎng)激素基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成正向引物5，-ATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3’(SEQ ID NO44)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；用上述cDNA為模板并使用合成的寡核苷酸，重復(fù)35個(gè)循環(huán)94℃處理1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘；完成PCR反應(yīng)；然后將由此得到的PCR產(chǎn)物即人生長(zhǎng)激素DNA克隆至pGEM-T載體(Promega)中；(b)正向引物5’-TTCCCAACCATTCCCTTATC-3’(SEQ ID NO46)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈30秒；完成PCR反應(yīng)。
(4)制備在N末端與Gly連接的突變體人生長(zhǎng)激素(G-GH)的DNA片段按照與本實(shí)施例(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段G-GH，不同的是(a)用10ng本實(shí)施例(3)中所得的PCR產(chǎn)物GH為模板DNA；(b)使用正向引物5’-GGTTTCCCAACCATTCCCTTATC-3’(SEQ ID NO47)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈30秒；完成PCR反應(yīng)。
用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的說(shuō)明，將平整末端的DNA片段G-GH進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，由此得到磷酸化的DNA片段G-GH。
(5)制備融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV按照與本實(shí)施例(1)所述相同的方法，制備平整末端的融合DNAMWPsp-MWPmp20-TEV，不同的是(a)在16℃，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(1)中得到的適量DNA片段MWPsp-MWPmp20與本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段TEV反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備用于第一PCR反應(yīng)的模板DNA；(b)在第一PCR反應(yīng)中使用反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO39)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)30秒；完成PCR反應(yīng)。
此后，用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的說(shuō)明，將所得的PCR產(chǎn)物磷酸化。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd)，將磷酸化的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入HincⅡ切割的載體(BlueScript SK-，Stratagene)中，以便按照已知方法(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。從所述轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒載體DNA。為了確認(rèn)得到了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV，用用于確定載體序列的正向或反向引物(即M13正向或反向引物)確定所述載體的核苷酸序列。按照與上述相同的方法，用摻入有MWPsp-MWPmp20-TEV的載體為模板DNA，使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO6)和反向引物5’-TTGGAAGTACAGGTTTTC-3’(SEQ ID NO39)完成第二PCR反應(yīng)，由此制備平整末端的融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV。
(6)制備摻入有融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的載體按照與本實(shí)施例(5)所述相同的方法，制備摻入有融合DNAMWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的載體，不同的是(a)在16℃，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(5)中得到的適量融合DNA片段MWPsp-MWPmp20-TEV與本實(shí)施例(4)中所得的適量DNA片段G-GH反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備模板DNA；(b)用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)1分鐘；完成PCR反應(yīng)。
實(shí)施例10構(gòu)建摻入有融合DNA MWPsp-GH的載體(1)制備DNA片段MWPsp按照與實(shí)施例1(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段MWPsp，不同的是(a)使用反向引物5’-TGCGAAAGCCATTGGAGCAAC-3’(SEQ ID NO34)；和(b)重復(fù)30個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)30秒；完成PCR反應(yīng)。
(2)制備摻入有融合DNA MWPsp-GH的載體按照與實(shí)施例9(5)所述相同的方法，制備摻入有融合DNAMWPsp-GH的載體，不同的是(a)在16℃，用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(1)中得到的適量DNA片段MWPsp與實(shí)施例9(3)中所得的適量DNA片段GH反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備模板DNA；(b)用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ IDNO6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ IDNO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)1分鐘；完成PCR反應(yīng)。
實(shí)施例11構(gòu)建分別摻入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的載體(1)制備DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30按照與實(shí)施例9(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30，不同的是(a)用下列引物作為反向引物MWPmp1 5′-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3′ (SEQ ID NO24)MWPmp2 5′-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3′ (SEQ ID NO25)MWPmp3 5′-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3′ (SEQ ID NO26)MWPmp4 5′-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3′ (SEQ ID NO27)MWPmp5 5′-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3′ (SEQ ID NO28)MWPmp6 5′-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′ (SEQ ID NO14)MWPmp7 5′-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3′ (SEQ ID NO29)MWPmp8 5′-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3′ (SEQ ID NO15)MWPmp9 5′-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3′ (SEQ ID NO16)MWPmp105′-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3′(SEQ ID NO7)MWPmp115′-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3′ (SEQ ID NO17)MWPmp125′-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3′ (SEQ ID NO18)MWPmp145′-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3′ (SEQ ID NO31)MWPmp305′-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3′(SEQ ID NO43)；(b)重復(fù)30個(gè)循環(huán)在94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃將DNA鏈延長(zhǎng)30秒；完成PCR反應(yīng)。
(2)制備DNA片段TEV-G-GH按照與實(shí)施例9(1)所述相同的方法，制備平整末端的DNA片段TEV-G-GH，不同的是(a)用10ng實(shí)施例9(6)中得到的摻入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的載體pG-GH為模板DNA；(b)使用正向引物5’-GACTATGATATCCCGACCACT-3’(SEQ ID NO60)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈30秒；完成PCR反應(yīng)。
用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene)，按制造商的說(shuō)明，將所得的平整末端的DNA片段TEV-G-GH磷酸化，由此得到磷酸化的DNA片段TEV-G-GH。
(3)制備分別摻入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的載體按照與實(shí)施例9(5)所述相同的方法，制備分別摻入有MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH的載體，不同的是(a)在16℃，用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，通過(guò)將本實(shí)施例(1)中得到的適量DNA片段MWPsp-MWPmp1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、30與本實(shí)施例(2)中所得的適量DNA片段TEV-G-GH反應(yīng)30分鐘，來(lái)制備模板DNA；(b)使用正向引物5’-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3’(SEQ ID NO6)和反向引物5’-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3’(SEQ ID NO45)；和(c)重復(fù)25個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，53℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)DNA鏈1分鐘完成PCR反應(yīng)。
實(shí)施例12融合蛋白質(zhì)的表達(dá)／分泌和所述產(chǎn)物的選擇性裂解(1)融合產(chǎn)物的氨基酸序列和編碼所述產(chǎn)物的核苷酸序列就實(shí)施例9-11得到的融合產(chǎn)物，下列產(chǎn)物的核苷酸序列和氨基酸序列分別列于SEQ ID NOS52、66和圖17中。
MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH(SEQ ID NOS52、66)(2)融合產(chǎn)物的表達(dá)／分泌表達(dá)由實(shí)施例9-11所得的融合DNA編碼的融合蛋白質(zhì)。圖18舉例說(shuō)明，將MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH導(dǎo)入表達(dá)載體的方法。
具體地講，用限制酶ApaLⅠ和HindⅢ(當(dāng)相對(duì)于用于測(cè)序的M13引物的方向，以正向插入融合DNA時(shí))或ApaLⅠ和KpnⅠ(當(dāng)相對(duì)于用于測(cè)序的M13引物的方向，以反向插入融合DNA時(shí))處理在實(shí)施例9-11中制得的摻入了上述融合DNA的載體。然后，將限制片段經(jīng)0．8％瓊脂糖凝膠電泳以分離出具有融合DNA的DNA片段。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo，CoLtd．)，在16℃，將由此所得的適量的各融合DNA與適量的已用ApaLⅠ和HindⅢ(或當(dāng)相對(duì)于M13引物的方向，以反向插入融合DNA時(shí)，用KpnⅠ)裂解的短芽孢桿菌表達(dá)載體pNU211R2L5(JP-A-5-304962和JP-A-7-170984)反應(yīng)30分鐘，由此，將各融合DNA導(dǎo)入各自的表達(dá)載體。按照已知方法(Methods in Enzymol21723-33，1993)，用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌菌株47-5Q(FERMBP-1664，JP-A-60-58074和JP-A-62-201589)，此后，使所得轉(zhuǎn)化體在各自的T2瓊脂培養(yǎng)基[polypeptone(1％)，肉提取物(0．5％)，酵母提取物(0．2％)，尿嘧啶(0．1mg／ml)，葡萄糖(1％)，紅霉素(10μg／ml)，瓊脂(1．5％)，pH7]中生長(zhǎng)。
在37℃，分別將轉(zhuǎn)化體在T2培養(yǎng)基(從T2培養(yǎng)基中除去瓊脂)中培養(yǎng)1天。然后，按照已知方法(分子克隆第二版，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1989))，從各F培養(yǎng)基中純化質(zhì)粒DNA，并用ApaLⅠ和HindⅢ(或KpnⅠ)處理，以確定融合DNA是否被導(dǎo)入了轉(zhuǎn)化體。對(duì)于摻入了融合DNA的轉(zhuǎn)化體，檢測(cè)由摻入的融合DNA編碼的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)／分泌。具體地講，以1∶1000的體積比，將從T2培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞懸浮液分別加至培養(yǎng)基[polypeptone(3％)，酵母提取物(0．4％)，葡萄糖(3％)，MgSO4·7H2O(0．01％)，MnSO4·4H2O(0．001％)，紅霉素(10μg／ml)，pH8]中，在30℃在試管(2ml／20ml試管)或Erlenmeyer燒瓶(50ml／500ml)中振蕩培養(yǎng)4天。
在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，以15000rpm，將培養(yǎng)基離心2分鐘以得到上清液，用于按已知方法(Laemmli，U．KNature，227，680-685，1970)電泳分析蛋白質(zhì)。具體地講，將18μl各上清液加至2μl緩沖液1[125 mMTris-HCl(pH6．8)，20％甘油，4％SDS，10％2-巰基乙醇]中，煮沸5分鐘，然后加至4μl緩沖液2[250mM Tris-HCl(pH6．5)，50％甘油，0．5％BPB]中。用市售15／25％SDS聚丙烯酰胺凝膠(Daiichi Chemicals，Co．LtdJapan)電泳所得的上清液(電泳緩沖液為100mM Tris，100mM麥黃酮(Tricine)，0．1％SDS)，以便用考馬斯藍(lán)染色確定是否存在融合蛋白質(zhì)的表達(dá)／分泌。
圖19顯示了下列融合蛋白表達(dá)／分泌的結(jié)果其中MWP信號(hào)肽正好在人生長(zhǎng)激素前的MWPsp-GH；其中MWP信號(hào)肽正好在融合產(chǎn)物TEV-G-GH(即TEV蛋白酶的識(shí)別序列和突變體人生長(zhǎng)激素G-GH的組合)前的MWPsp-TEV-G-GH；其中MWP信號(hào)肽通過(guò)來(lái)自MWP蛋白質(zhì)N末端的至少一個(gè)氨基酸殘基與融合產(chǎn)物TEV-G-GH相連的MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH蛋白質(zhì)。MWPsp-GH的電泳圖與不含外源多肽基因的載體pNU211R2L5的表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖相似。因此，MWPsp-GH沒(méi)有一個(gè)對(duì)應(yīng)于生長(zhǎng)激素的清晰的帶。另一方面，對(duì)于MWPsp-TEV-G-GH和MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，觀察到了融合蛋白的表達(dá)／分泌(圖19中箭頭所指明的)。與MWPsp-MWPmp1-TEV-G-GH相比，MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、20-、30-TEV-G-GH蛋白質(zhì)的表達(dá)水平更高。
(3)鑒定人生長(zhǎng)激素GH和突變體人生長(zhǎng)激素G-GH用人生長(zhǎng)激素抗體免疫鑒定人生長(zhǎng)激素和突變體人生長(zhǎng)激素(Western印跡法)。將本實(shí)施例(2)中所得的各轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基以15000rpm離心2分鐘，以得到各培養(yǎng)基的上清液。按本實(shí)施例(2)所述，將各1微升的上清液電泳，然后按照已知方法(Towbin，H．等76，4350-4354，1979)將其電印跡到硝酸纖維素膜上。將該膜在溶于緩沖液3[20mM Tris-HCl(pH7．4)，150mM NaCl，0．1％Tween 20]的5％脫脂奶中浸15分鐘，然后，在振蕩條件下，再浸在用緩沖液3以1∶2000稀釋的兔抗人生長(zhǎng)激素抗體(Biostride，Inc．)中30分鐘。在振蕩條件下，用緩沖液3，將所述膜洗滌3次，每次10分鐘，然后浸在用緩沖液3以1∶2000稀釋的以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(E-Y實(shí)驗(yàn)室)中30分鐘。浸漬完成后，將膜用緩沖液3洗滌3次，每次10分鐘，同時(shí)振蕩，以便用ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham International plc)按照制造商的說(shuō)明確定GH的存在。如圖20所示，所有融合蛋白即MWPsp-GH、MWPsp-TEV-G-GH、MWPsp-MWPmp1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、14-、30-TEV-G-GH，均檢測(cè)到了信號(hào)，但對(duì)于不含外源多肽基因的pNU211R2L5，沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。對(duì)于信號(hào)肽正好位于人生長(zhǎng)激素前的MWPsp-GH，用考馬斯藍(lán)染色和SDS-PAGE沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于人生長(zhǎng)激素的帶，其中，在SDS-PAGE中用Western印跡法檢測(cè)信號(hào)?？紤]到Western印跡法比考馬斯藍(lán)染色敏感得多，當(dāng)MWP信號(hào)肽位于人生長(zhǎng)激素前時(shí)，MWPsp-GH能夠表達(dá)／分泌，但其表達(dá)水平低。
(4)突變體人生長(zhǎng)激素的裂解在培養(yǎng)基中將含有摻入了融合DNA MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)基懸浮液(體積比為1∶1000)加至10個(gè)500毫升Erlenmeyer燒瓶中，每個(gè)燒瓶各含50毫升用于在實(shí)施例4(2)中表達(dá)的相同培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)4天。在4℃，將所得的各培養(yǎng)基以10000rpm離心20分鐘。加入EDTA，達(dá)到5mM的終濃度，加入硫酸銨達(dá)到60％的飽和度，以進(jìn)行沉淀。再次以10000rpm離心20分鐘后，將顆粒沉淀溶解于適量Tris-HCl緩沖液(20mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8)中，然后加到Sephadex G-25(Pharmacia)柱上，進(jìn)行緩沖液交換。將所得溶液加到并吸附到已用緩沖液A[20mMTris-HCl，1mM EDTA，1M脲，20％丙醇，pH8]平衡過(guò)的陰離子交換樹(shù)脂(Pharmacia，QXL)柱上，再用緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)進(jìn)行梯度洗脫。將以220-300mM NaCl洗脫下來(lái)的抗人生長(zhǎng)激素抗體陽(yáng)性級(jí)分用Ultrafree(Millipore CorpUFV2BCC40)濃縮，同時(shí)用緩沖液C(0．1％TFA，10％乙腈)替換，然后加到RPC柱(Pharmacia)上，進(jìn)行反相色譜。隨后用緩沖液D
進(jìn)行梯度洗脫的結(jié)果是，靶融合蛋白MWPmp20-TEV-G-GH被45-50％的乙腈洗脫了下來(lái)。將由此得到的融合蛋白用2mM Tris-HCl(pH8)透析，然后用TEV蛋白酶處理。按照制造商的說(shuō)明，用TEV蛋白酶(GIBCO BRL，5U)處理5微克融合蛋白，以裂解出突變體人生長(zhǎng)激素G-GH。圖21和22是分別表示裂解結(jié)果的SDS-PAGE和Western印跡圖。按照與本實(shí)施例(2)和(3)所述相同的方法完成SDS-PAGE和Western印跡。就圖21和22而言，在與市售人生長(zhǎng)激素(陽(yáng)性對(duì)照)相同的位置(箭頭標(biāo)明的)上，裂解出了在N末端帶有額外Gly的突變體人生長(zhǎng)激素G-GH。
還可按照與本實(shí)施例相同的方法，表達(dá)其它多肽hNGF，mLIF，bSCF和hPDGF-B。當(dāng)來(lái)自MWP N末端的氨基酸數(shù)目為10、40或100時(shí)，觀察不到分泌作用。這表明通過(guò)與來(lái)自MWP N末端的至少一個(gè)氨基酸的融合而引起的分泌作用的機(jī)會(huì)依賴于所用外源多肽的類(lèi)型。
通過(guò)與外源蛋白質(zhì)的新融合，本發(fā)明能夠進(jìn)行高水平的表達(dá)／分泌，還可通過(guò)化學(xué)或酶促選擇性裂解生產(chǎn)天然蛋白質(zhì)。
本文所引用的所有文獻(xiàn)包括專利申請(qǐng)均全文引入本文作為參考。
下列是本文所述的SEQ ID NOS48-52，62-66的序列資料SEQ ID NO48gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca catcatcatc atcatcacgg ttctccagta 120ccttctggaa tgtttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 180ctagtgtgcg gggaaagagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 240ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 300gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 360tccctctacc agctggagaa ctactgcaac 390SEQ ID NO49gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca atgtttgtga accaacacct gtgcggctca 120cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaaagag gcttcttcta cacacccaag 180acccgccggg aggcagagga cctgcaggtg gggcaggtgg agctgggcgg gggccctggt 240gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc agaagcgtgg cattgtggaa 300caatgctgta ccagcatctg ctccctctac cagctggaga actactgcaa c 351SEQ ID NO50gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacaa ctctgactcc gaatgcccgc tgtctcacga cggttattgc 180ctgcatgatg gtgtttgtat gtatatcgaa gctctggaca aatatgcttg caactgtgtt 240gttggttaca tcggtgagcg ttgccagtat cgcgacctga aatggtggga actgcgtgac 300tatgatatcc cgaccactga aaacctgtac ttccaatctg ctaactcaaa cccggctatg 360gcaccccgag aacgcaaagc tggctgcaag aatttcttct ggaagacttt cacatcctgt 420SEQ ID NO51gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120catcatcatc atcatcacgg ttctccagta ccttctggat tcctggaaca cagccaaggt 180actttcacat ccgactactc taaatatctg gattcccgtc gcgctcaaga tttcgttcaa 240tggctgatga acact 255SEQ ID NO52gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaag gtttcccaac cattccctta 180tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac 240acctaccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag 300aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa cagggaggaa 360acacaacaga aatccaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg 420ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 480gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 540aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600gacacaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 660aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 720ggcagctgtg gcttc 735SEQ NO ID62Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro His His20 25 30His His His His Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Met Phe Val Asn Gln35 40 45His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly50 55 60Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp65 70 75 80Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser85 90 95Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val100 105 110Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr115 120 125Cys Asn130SEQ ID NO63Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro15 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Met Phe20 25 30Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu35 40 45Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu50 55 60Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly65 70 75 80Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg85 90 95Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu100 105 110Glu Ash Tyr Cys Asn115SEQ ID NO64Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro15 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asn Ser35 40 45Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly50 55 60Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val65 70 75 80Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp85 90 95Glu Leu Arg Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln100 105 110Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly115 120 125Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys130 135 140SEQ ID NO65Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro1 5 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Gly Ser35 40 45Pro Val Pro Ser Gly Phe Leu Glu His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser50 55 60Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln65 70 75 80Trp Leu Met Asn Thr85SEQ ID NO66Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro15 10 15Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met20 25 30Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu35 40 45Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe50 55 60Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp65 70 75 80Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr85 90 95Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile100105 110Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu115 120 125Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val130 135 140Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser145 150 155 160Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln65 170 175Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile180 185 190Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp195 200 205Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met210 215 220Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu225 230 235 240Gly Ser Cys Gly Phe24權(quán)利要求
1．一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括由芽孢桿菌的細(xì)胞壁蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由用于化學(xué)或酶促裂解的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列、和外源多肽序列；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。
2．權(quán)利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N(xiāo)末端還包含芽孢桿菌細(xì)胞壁蛋白的信號(hào)肽序列。
3．權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中所述的融合蛋白還包含由被用作分離及純化用的標(biāo)記的氨基酸殘基組成的序列。
4．權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的融合蛋白還包含由被用作接頭的氨基酸殘基組成的序列。
5．權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌是短芽孢桿菌。
6．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的由用于化學(xué)裂解的氨基酸殘基組成的序列是甲硫氨酸。
7．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的由用于酶促裂解的氨基酸殘基組成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
8．權(quán)利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化用的標(biāo)記的序列、作為接頭的氨基酸序列Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly、用于將目的多肽化學(xué)裂解出來(lái)所需的甲硫氨酸殘基、和在其氨基酸序列中不含甲硫氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
9．權(quán)利要求8所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N(xiāo)末端還包含MWP信號(hào)肽序列。
10．權(quán)利要求8或9所述的DNA，其中所述的多肽是人胰島素原。
11．權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述由源自MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列包含6、7、8、10、ll、12、13、14、15、17、20或50個(gè)氨基酸。
12．權(quán)利要求1所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的10個(gè)或20個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化用的標(biāo)記的序列、作為接頭的人表皮生長(zhǎng)因子序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列但在其N(xiāo)末端具有甘氨酸或絲氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
13．權(quán)利要求12所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N(xiāo)末端還包含MWP信號(hào)肽序列。
14．權(quán)利要求12或13所述的DNA，其中所述的多肽是人促生長(zhǎng)素抑制素28。
15．權(quán)利要求1的DNA，其中所述的融合蛋白包含由源自MWP蛋白N末端的20個(gè)氨基酸殘基組成的序列、由6個(gè)組氨酸殘基組成的用作分離及純化用的標(biāo)記的序列、作為接頭的氨基酸序列Gly Ser ProVal Pro Ser Gly、用V8蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Phe Leu Glu、和在其氨基酸序列中不含谷氨酸的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
16．權(quán)利要求15所述的DNA，其中所述的融合蛋白在其N(xiāo)末端還包含MWP信號(hào)肽序列。
17．權(quán)利要求15或16所述的DNA，其中所述的多肽是人胰高血糖素。
18．一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA，其中所述的融合蛋白包括芽孢桿菌的細(xì)胞壁蛋白信號(hào)肽序列、由用于酶促裂解的氨基酸殘基組成的序列、和外源多肽序列；所述的這些序列彼此按序線性連接，并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’-末端相連。
19．權(quán)利要求18的DNA，其中緊跟所述信號(hào)肽序列的是由源自細(xì)胞壁蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列。
20．權(quán)利要求18或19所述的DNA，其中所述的芽孢桿菌是短芽孢桿菌。
21．權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述的由用于酶促裂解的氨基酸殘基組成的序列包含能被蛋白酶促裂解的序列。
22．權(quán)利要求18所述的DNA，其中所述的融合蛋白包含MWP的信號(hào)肽序列、用TEV蛋白酶將目的多肽裂解出來(lái)所需的氨基酸序列Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln、和在其氨基酸序列中不含TEV蛋白酶識(shí)別序列的多肽序列，其中所述的MWP蛋白是細(xì)胞壁蛋白的一種；所述的這些序列彼此按序線性連接。
23．權(quán)利要求22所述的DNA，其中緊跟所述信號(hào)肽序列的是由源自MWP蛋白N末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成的序列。
24．權(quán)利要求22或23所述的DNA，其中所述的多肽是在其N(xiāo)末端有甘氨酸或絲氨酸的突變體人生長(zhǎng)激素。
25．包含根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的DNA的載體。
26．由權(quán)利要求25所述的載體轉(zhuǎn)化的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
27．權(quán)利要求26所述的細(xì)菌，它是短芽孢桿菌。
28．一種制備重組多肽的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求26所述的細(xì)菌，以在該細(xì)菌的細(xì)胞外使包含外源多肽的融合蛋白積聚；從培養(yǎng)基中分離出融合蛋白；從所分離出的融合蛋白中將所述外源多肽裂解出來(lái)；和收集所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含編碼融合蛋白的核苷酸序列的DNA、包含所述DNA的載體、包含所述載體的屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌和通過(guò)培養(yǎng)所述的細(xì)菌來(lái)制備有用的多肽的方法,其中所述的融合蛋白包括:由芽孢桿菌的細(xì)胞壁蛋白的信號(hào)肽序列、用于分離及純化所述融合蛋白的標(biāo)記序列、接頭序列、由用于化學(xué)或酶促裂解的序列、和外源多肽序列;所述的這些序列彼此按序線性連接,所述的信號(hào)肽序列、標(biāo)記和接頭是任選的序列,并且其中所述的核苷酸序列與包含芽孢桿菌啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列的3’－末端相連。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1289780SQ99120748
公開(kāi)日2001年4月4日 申請(qǐng)日期1999年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月25日
發(fā)明者佐藤靜治, 東久邇真彥, 工藤季之, 近藤雅昭 申請(qǐng)人:伊藤火腿株式會(huì)社, 鵜高重三