專利名稱：對由突變的p53導致的DNA調制的抑制的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對由突變的p53導致的DNA調制的抑制方法，本發(fā)明還涉及用于鑒別適用于這種抑制的物質的系統(tǒng)。
細胞中存在稱為p53的蛋白質，這一蛋白是腫瘤抑制蛋白，其在DNA損傷時活化，然后其與靶基因的啟動子結合并激活該基因的轉錄。結果是，細胞的生長停頓和隨后DNA損傷的修復以及細胞死亡得以實現(xiàn)。
如以前所證實的，p53在許多腫瘤中發(fā)生突變。突變形式的p53通常沒有腫瘤抑制蛋白活性，甚至其以具有致癌性質的蛋白質存在。已進行了各種實驗抑制突變的p53(以下稱為mut p53)的致癌性質。但是這些實驗沒有得到滿意的結果。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種產物，通過其可以研究mutp53，并任選地抑制其致癌性質。
根據(jù)本發(fā)明，這一目的由權利要求書中限定的主題實現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的主題涉及抑制由mut p53導致的DNA調制的方法，包括抑制mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合。
本發(fā)明基于本申請人的發(fā)現(xiàn)，即mut p53而非野生型p53可以導致具有鏈分離勢的DNA的調制。申請人發(fā)現(xiàn)，這種DNA是廣泛分布的并通常存在于MAR DNA。MAR(“基質附著區(qū)”)DNA是指染色質的高級調節(jié)元件，通過其將染色質分成拓撲學獨立的“環(huán)”，從而能對基因表達和DNA復制進行獨立的空間和時序調節(jié)。申請人還發(fā)現(xiàn)具有鏈分離勢的DNA經常包括序列AATATATTT或其變體。除了所述序列外，該DNA還經常包括富含AT的其它區(qū)域。另外，本申請人認識到DNA的調制可以是不同的，例如，mut p53與該DNA的牢固的復合物，或者其鏈分離。申請人發(fā)現(xiàn)當所指示的序列和任選地相鄰序列全部由AT組成時，所述的調制通常是鏈分離。另一方面，如果在序列中不存在或僅存在較弱的全AT性質，則調制通常是牢固的復合物。另外，申請人發(fā)現(xiàn)，當mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合被抑制時，由mut p53導致的DNA調制可被抑制。
根據(jù)本發(fā)明，這些觀察被用于抑制由mut p53導致的DNA調制的方法中。這種方法包括抑制mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合。
術語“mut p53”包括能與具有鏈分離勢的DNA結合的任何p53或其一部分。具體地，p53可以是具有突變的核心區(qū)和/或突變的C-末端的p53。這種p53突變體的例子是Pro273 p53和MethA p53。mutp53也可以與另一種蛋白質共同存在于一種融合蛋白中。
術語“具有鏈分離勢的DNA’包括可由mut p53調制的任何DNA。調制可以是不同的，例如mut p53和具有鏈分離勢的DNA的牢固的復合物，或其鏈分離。特別是，具有鏈分離勢的DNA可以是包括一或幾個拷貝的序列AATATATTT或其變異序列的DNA。另外，該DNA也可進一步包括富含AT的區(qū)域。具有鏈分離勢的DNA優(yōu)選在MAR DNA中發(fā)現(xiàn)。
術語“結合”包括mut p53與具有鏈分離勢的DNA結合的任何類型和方式。特別是結合可以是mut p53直接與DNA結合的方式。結合也可以是mut p53間接即通過其它因子如蛋白質與DNA結合。
術語“抑制”包括可以抑制mut p53與具有鏈分離勢的DNA結合的任何類型和方式。抑制類型取決于mut p53是直接還是間接與DNA結合。在間接結合的情況下，即通過其它因子如蛋白質而結合，可通過抑制所述的其它因子的物質發(fā)生抑制。還可以加入抑制mut p53的物質。在mut p53直接結合DNA的情況下，采用抑制mut p53的物質似乎是實用的。這種物質可以是例如抑制p53的突變核心結構域和/或p53的突變的C-末端的物質。這種物質的例子是抗體PAb 240和PAb 421。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了鑒別適用于抑制由mut p53導致的DNA調制的物質的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)包括mut p53，具有鏈分離勢的DNA以及任選地一種物質，該物質對mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合的抑制效應被測試。對于該系統(tǒng)的各個單獨組分，上述解釋也相應地適用。另外，對DNA的調制及其抑制可用常規(guī)方法確定。例如，可以通過EMSA(“電泳遷移率變動分析”)測試確定DNA鏈分離和復合物形成以及其抑制。為此，常規(guī)地，將mut p53與具有鏈分離勢的標記的雙鏈DNA保溫，并電泳分離該混合物，從而分別可見單鏈DNA的形成和其復合物的形成，以及其抑制。
通過本發(fā)明，可以抑制由mut p53導致的DNA調制。這種調制可以是mut p53與具有鏈分離勢的DNA的牢固的復合物，或其鏈分離。DNA的調制在許多細胞過程中起重要作用。例如，DNA鏈分離是基因表達和DNA復制中的關鍵步驟。DNA鏈分離設置強對照，該對照由mut p53刪除。因此，細胞退化的方式，即腫瘤形成的方式被了解。
通過本發(fā)明，可以對由mut p53導致DNA調制的疾病采取治療步驟。這種疾病特別是腫瘤疾病。另外，本發(fā)明的特征在于提供了鑒別適用于抑制特別是在腫瘤中由mut p53導致的DNA調制的物質的可能性。這種物質也是本發(fā)明的一個主題。
附圖的簡要描述

圖1示出在MARI DNA中由mut p53導致的DNA鏈分離。
圖2示出在MARII DNA中由mut p53導致的DNA鏈分離。
圖3示出在MAR5 DNA中由mut p53導致的復合物形成。
圖4示出在MAR7和MAR8 DNA中由mut p53導致的復合物形成。
圖5示出在MARI DNA中對由mut p53導致的DNA鏈分離的抑制。
本發(fā)明通過下述實施例詳細描述。
實施例由mut p53對DNA的調制及其抑制DNA調制分別由DNA鏈分離和復合物形成的形式示出。
(a)由mut p53分別誘導DNA鏈分離和復合物形成從位于免疫球蛋白重鏈基因的增強子區(qū)的997bp XbaI IgE MAR片段設計寡核苷酸形式的兩個MAR區(qū)。它們是MARI，即增強子的3’-側翼區(qū)，和MARII，即增強子的5’-側翼區(qū)。這些寡核苷酸具有如下序列MARIIgH增強子3′-側翼區(qū)5′-AGTGTCTTTAATTTCTAATATATTTAGAAAACTGCG-3′MARII IgH增強子5′-側翼區(qū)5′-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3′MARI具有上述所示的序列AATATAATTT。MARII示出這一序列的變異，但全AT性質未變化。
另外，設計了具有MARI變異體的寡核苷酸，從而全AT性質降低。這些寡核苷酸具有如下序列MAR6ACTATGCTTMAR7GCTCTCTTT另外，設計了具有相鄰“GC夾”的MARI序列的寡核苷酸，全AT性質由“GC夾”降低。
合成這些寡核苷酸，用32P末端標記，并進行退火反應，從而獲得雙鏈形式。然后將其分別與野生型p53和mut p53例如MethA p53hPro 273 p53保溫，進行EMSA測試。為此，進行下述步驟分別含有野生型p53，MethA p53和Pro 273 p53的混合物與2微克Poly dldC(非特異性競爭劑)在10mM Hepes，pH7.8；50mM KCl；1mM EDTA；5mM MgCl2；10％甘油中預保溫20分鐘。
預保溫后，加入標記的寡核苷酸，混合物在室溫保溫30分鐘。之后，混合物在4％天然聚丙烯酰胺凝膠上電泳3個小時，然后干燥凝膠并放射自顯影(見圖1-4)。
如圖所示，對于具有鏈分離勢的DNA,mut p53，例如MethA p53或Pro 273 p53可導致DNA調制，例如鏈分離或復合物形成。
(b)對由mut p53導致的DNA鏈分離的抑制進行上述(a)中所述的步驟，只是MethA p53的混合物還含有抗體PAb 421或PAb 240。所用寡核苷酸是含有MARI DNA的寡核苷酸(見圖5)。
如圖所示，通過能抑制mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合的產物，如抗體PAb 421或PAb 240，可以抑制mut p53誘導的鏈分離。
權利要求
1.抑制由mut p53導致的DNA調制的方法，包括抑制mut p53與具有鏈分離勢的DNA的結合。
2.權利要求1的方法，其中所述的調制是mut p53與具有鏈分離勢的DNA的牢固的復合物。
3.權利要求1的方法，其中所述的調制是具有鏈分離勢的DNA的鏈分離。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中mut p53具有突變的核心結構域。
5.權利要求1-3任一項的方法，其中mut p53具有突變的C-末端。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中具有鏈分離勢的DNA包括序列AATATATTT或其變異序列。
7.權利要求6的方法，其中所述的變異序列包括序列AAAATATTT。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中具有鏈分離勢的DNA存在于MAR DNA中。
9.權利要求1-4和6-8任一項的方法，其中抑制通過能抑制p53的突變的核心結構域的物質進行。
10.權利要求9的方法，其中所述的物質是抗體PAb240。
11.權利要求1-3和5-8任一項所述的方法，其中抑制通過能抑制p53的突變的C-末端的物質進行。
12.權利要求11的方法，其中所述的物質是抗體PAb421。
13.權利要求1-8任一項的方法，其中抑制通過能抑制p53的突變的核心結構域和突變的C-末端的物質進行。
14.權利要求13的方法，其中所述的物質是抗體PAb240和PAb421。
15.權利要求1-14任一項的方法，其中在疾病的治療中由mutp53導致的DNA調制被抑制。
16.權利要求15的方法，其中所述的疾病是腫瘤疾病。
17.一種鑒別適用于抑制由mut p53導致的DNA調制的物質的系統(tǒng)，包括mut p53和具有鏈分離勢的DNA。
18.權利要求17的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)還包括一種物質，其對mutp53與具有鏈分離勢的DNA的結合的抑制效應被測試。
19.權利要求17或18的系統(tǒng)，其中mut p53具有突變的核心結構域。
20.權利要求17或18的系統(tǒng)，其中mut p53具有突變的C-末端。
21.權利要求17-20任一項的系統(tǒng)，其中具有鏈分離勢的DNA存在于MAR DNA中。
22.權利要求17-21任一項的系統(tǒng)，其中具有鏈分離勢的DNA包括序列AATATATTT或其變異序列。
23.權利要求22的方法，其中所述的變異序列包括序列AAAATATTT。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制由mutp53導致的DNA調制的方法,包括抑制mutp53與具有鏈分離勢的DNA的結合。本發(fā)明還涉及用于鑒別適用于所述的抑制的物質的系統(tǒng)。
文檔編號C07K14/435GK1289373SQ99802374
公開日2001年3月28日 申請日期1999年1月22日 優(yōu)先權日1998年1月26日
發(fā)明者沃爾夫岡·W·德佩特 申請人:沃爾夫岡·W·德佩特