專利名稱：對還原條件敏感的轉(zhuǎn)染化合物,含有它們的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的新試劑。更具體地，這種轉(zhuǎn)移試劑特征是含有一個或多個對還原性條件敏感的二硫橋。這種新試劑可用于在體外、體內(nèi)或離體在不同類型的細胞中轉(zhuǎn)移目的核酸。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在細胞中有效轉(zhuǎn)移核酸日益變得必不可少。例如為了生產(chǎn)重組蛋白，或在實驗室對基因表達調(diào)控、基因克隆的研究，或任何其他牽涉DNA的操作，都可能涉及體外細胞中的核酸轉(zhuǎn)移。再例如在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物、實現(xiàn)免疫接種、研究標記或治療方法中，也可能涉及在體內(nèi)細胞中的核酸轉(zhuǎn)移。在骨髓移植方法、免疫治療方法或涉及在從器官取出的細胞中轉(zhuǎn)移基因以便隨后回輸?shù)钠渌椒ㄖ校部赡苌婕霸陔x體細胞中的轉(zhuǎn)移核酸。
為了改善細胞中的核酸轉(zhuǎn)移，迄今研制的不同合成載體結(jié)構(gòu)差異相當大，這反映在以下的現(xiàn)象它們的效率因所尋求的應(yīng)用和針對的細胞類型而不同。這種效率主要取決于它們的結(jié)構(gòu)。
在直到現(xiàn)在已研制的合成載體中，陽離子脂類占重要位置。這些載體由與核酸作用的陽離子極性部分、和能夠保護生成的復(fù)合物不受外部環(huán)境影響的疏水脂部分構(gòu)成。作為實例可以列舉單陽離子脂類(DOTMA:Lipofectin)、脂多胺，特別是雙十八烷基氨基甘氨?；?DOGS)或棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺的5-羧基精胺基酰胺(DPPES)，在專利申請EP 394 111中描述過它的制備方法，或在專利申請WO96/17823與WO97/18185(作為參考文獻列于本文)列出的陽離子脂類。
許多研究工作清楚地表明，陽離子脂類具有能夠促進轉(zhuǎn)染的性質(zhì)。但是，今天還有必要研制具有新結(jié)構(gòu)的陽離子脂類，以便帶來一些其它的有利性質(zhì)。例如，存在對更適合通過膜屏障的陽離子脂類的需求。事實上，許多障礙影響轉(zhuǎn)染的實際效率，其中有核酸越過生物膜和滲入細胞腔室的困難(“Cellular and Molecular Barriers to Gene Transferby a Cationic Lipid”,Zabner,J.和Al.,J.Biol.Chem.,1995年，第32期，第18997-19007頁)。這正是本發(fā)明提出要解決的技術(shù)難點。
因此，本發(fā)明涉及新的核酸轉(zhuǎn)移試劑，該試劑包括至少一個能夠以非共價方式與核酸結(jié)合的陽離子親水區(qū)域，和至少一個親脂區(qū)域，這些區(qū)域彼此通過所謂的“間隔臂”連接起來，還包含至少一個二硫橋，其位于還原后可引起親脂區(qū)域部分降解的位置，或位于還原后可引起所述轉(zhuǎn)移試劑對稱時一分為二的位置。
這些轉(zhuǎn)移試劑能夠通過陽離子親水部分有效地與核酸復(fù)合，這種相互作用強烈地壓緊所述核酸，而親脂區(qū)域通過給形成的微粒包裹脂質(zhì)膜使這種離子相互作用變得對外界環(huán)境不敏感。
但是，除了這些載體化所要求的性質(zhì)之外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑具有極有利的去污劑性質(zhì)，在還原性細胞介質(zhì)中，因存在一個或多個二硫橋，產(chǎn)生多胺化烷基鏈類型的分子，這些分子是膜的去穩(wěn)定劑。事實上，二硫橋在氧化性介質(zhì)中能夠構(gòu)成穩(wěn)定的共價鍵，而在還原性介質(zhì)中被打斷，如下述示意圖X-S-S-Y→X-SH+HS-Y這類結(jié)構(gòu)見于例如在某些具有半胱氨酸的蛋白質(zhì)中，并對這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)作出貢獻，因此對生物活性作出貢獻。另外，二硫橋已經(jīng)被引入某些設(shè)計的蛋白質(zhì)中，特別是免疫毒素中，以便將靶向結(jié)構(gòu)域與活性結(jié)構(gòu)域連接起來。
關(guān)于“還原性介質(zhì)”，在本發(fā)明中應(yīng)該理解是自然的還原性介質(zhì)，例如細胞內(nèi)的介質(zhì)，特別是細胞質(zhì)，尤其是內(nèi)體。代表這些自然條件的人工還原性介質(zhì)例如是含0.1-20％二硫蘇糖醇(DTT)的介質(zhì)。
相反地，關(guān)于氧化性介質(zhì)”應(yīng)該理解是與大氣氧接觸的任何介質(zhì)，這些介質(zhì)不含有還原劑，特別是是細胞外介質(zhì)。有代表性的氧化介質(zhì)例如由150mM氯化鈉的等滲溶液或由含5％葡萄糖的溶液構(gòu)成。
申請人非常意外地證明，可以核酸轉(zhuǎn)移的合成載體中、特別是陽離子脂類型的載體中引入一個或多個二硫橋，而不會影響該試劑在非還原性介質(zhì)中結(jié)合核酸的能力。申請人還證實，保持了這些試劑的核酸轉(zhuǎn)移性質(zhì)，甚至還得到改善。另外，生成的復(fù)合物在還原性介質(zhì)中、特別是在細胞中降解，這樣能夠產(chǎn)生去污劑分子，因此使得更大量的核酸可接觸細胞轉(zhuǎn)錄機器。
在本發(fā)明中，關(guān)于“去污劑”應(yīng)該理解是具有插入生物膜中并使它們?nèi)シ€(wěn)定化性質(zhì)的任何兩親分子。這是出于去污劑兩親分子通過插入磷脂雙層并溶解脂類和蛋白質(zhì)而破壞這些膜的能力(La Cellule,Vigot和Decaire編，1998年，第581-583頁)。
本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的另一個優(yōu)點還在于其固有毒性低。事實上，由于這些轉(zhuǎn)移試劑在細胞中在對還原性條件敏感的二硫鍵處降解，所以不會出現(xiàn)由通常轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生的毒性作用。此外，膜通過性的改善使得可以使用較低劑量的核酸/轉(zhuǎn)移試劑復(fù)合物，由此產(chǎn)生毒性方面的有利結(jié)果。
最后，申請人還證明了，當轉(zhuǎn)移試劑具有足夠的親脂性，并且它們的用量也適當時，轉(zhuǎn)移性質(zhì)可獲得顯著的改善。更具體地，已證明增加這些轉(zhuǎn)移試劑的親脂性，或加入類固醇衍生物鏈的一個主要好處是誘導(dǎo)一種改善的血清抗性。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑可以有兩類結(jié)構(gòu)，而對它們的技術(shù)效果沒有影響。在第一種情況下，這種結(jié)構(gòu)可以用下述方式表達陽離子親水區(qū)域-間隔臂-親脂區(qū)域在這樣一種結(jié)構(gòu)中，一個或多個二硫橋定位在親脂區(qū)域中，以便它們被還原時產(chǎn)生去污劑兩親分子。
第二類結(jié)構(gòu)可以表達如下陽離子親水區(qū)域-間隔臂-親脂區(qū)域｜陽離子親水區(qū)域-間隔臂-親脂區(qū)域在這種情況下，一個或多個二硫橋位于其還原引起轉(zhuǎn)移試劑的兩個對稱部分分離的位置，即在兩個間隔臂之間。
在本發(fā)明中，關(guān)于“陽離子親水部分”應(yīng)該理解是在生理pH的條件下，即pH為5-8的條件下，總電荷是正的并具有核酸結(jié)合性質(zhì)的任何親水分子。這種結(jié)合具體講是非共價鍵類型的結(jié)合，例如像離子相互作用。優(yōu)選地，在本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑中存在的陽離子親水區(qū)域是多胺或多氨基胍。
根據(jù)一種有利的實施方式，陽離子親水區(qū)域滿足下述通式 式中，m是大于或等于2的整數(shù)，l是大于或等于1的整數(shù)，m可以在兩個胺所含碳的不同組合之間變化。優(yōu)選地，m是2-6，其中包括2和6在內(nèi)，l是1-5，其中包括1和5在內(nèi)。更優(yōu)選地，多胺區(qū)域用精胺代表。
另一個優(yōu)選的多胺區(qū)域滿足在專利申請WO97/18185中描述的下述通式 式中R1、R2、R3各自代表氫原子或-(CH2)q-NRR′基團，q可以在1、2、3、4、5和6中改變，在不同的基團R1、R2和R3之間可獨立改變，R和R′各自代表氫原子或-(CH2)q-NH2,q如前面所定義，m和n各自是0-6之間的整數(shù)，當n大于1時，m可以取不同的值，R3在上述通式中可代表不同的意義。
在本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑中存在的親脂區(qū)域由至少一個脂肪脂族鏈和一個或多個其他脂族鏈構(gòu)成，后者為一個或多個類固醇衍生物、天然或合成的脂類，或選擇性地一種它們的組合，優(yōu)選地能夠生成層狀或六角相。這些結(jié)構(gòu)的特征在于層或管之間的距離，這取決于脂肪脂族鏈的長度或脂類的極性部分。
術(shù)語“脂肪脂族鏈”在本發(fā)明中表示支鏈或直鏈的、有10-22個碳原子的、選擇性地飽和和/或含氟的烴基鏈。優(yōu)選地，該烴基鏈有12-22個碳原子。更具體地可以列舉C12、C13、C14、C16、C18、C19脂族基團等，尤其是基團(CH2)11CH3、(CH2)12CH3、(CH2)13CH3和(CH2)17CH3。
當親脂區(qū)域含有類固醇衍生物時，其優(yōu)選地選自膽固醇、膽酸或膽甾烯基胺。
在一種優(yōu)選實施方式中，親脂區(qū)域含至少兩個脂肪脂族鏈。更優(yōu)選地，親脂區(qū)域含兩個或三個脂肪脂族鏈。
根據(jù)本發(fā)明另一種有利的實施方案，親脂部分由一個脂肪脂族鏈和一個類固醇衍生物組成。
當本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑具有對稱結(jié)構(gòu)時，該分子的每個對稱部分含有至少一個脂肪脂族鏈。
陽離子親水區(qū)域和親脂區(qū)域彼此可以通過所謂的“間隔臂”連接起來。間隔臂可以非限制性地描述為含有可水解官能團的酸或胺基團，這些基團是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員知道的。優(yōu)選地，所謂的間隔臂區(qū)域含有脂族鏈或芳族鏈。優(yōu)選地，間隔臂區(qū)域例如可以選自酰胺、氨基甲酸酯、酯、醚或芳族環(huán)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑含有一個或多個二硫橋。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)轉(zhuǎn)移試劑的結(jié)構(gòu)與所尋求的性質(zhì)可以決定這些橋鍵數(shù)目。有利地，轉(zhuǎn)移試劑含有一個或兩個二硫橋，優(yōu)選地一個二硫橋。在轉(zhuǎn)移試劑中，一個或多個二硫鍵可以處在不同的地方。其位置取決于橋鍵數(shù)和轉(zhuǎn)移試劑的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)第一種實施方式，二硫橋定位于其還原可引起親脂區(qū)域部分降解的位置，降解后在細胞周圍產(chǎn)生了一種去污劑兩親分子。當親脂區(qū)域有多個脂族鏈時，這種部分降解可能尤其相當于喪失一個脂族鏈，或當親脂區(qū)域有一個類固醇衍生鏈時，相當于類固醇衍生鏈的喪失。關(guān)于脂肪脂族鏈的喪失，應(yīng)該理解是或者該鏈完全喪失，或者部分喪失，余下部分這時對于構(gòu)成脂肪鏈來說太短(長度小于10個碳原子)。這樣一種斷裂破壞了復(fù)合物的完整性，該復(fù)合物然后逐漸地降解，放出離解的元件，其中至少一個是去污劑兩親分子。這種復(fù)合物降解可通過顯微鏡或采用電泳法很容易檢測。
根據(jù)另一種實施方案，二硫橋定位在對稱結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移試劑的兩個間隔臂之間，其結(jié)果是其還原引起所述轉(zhuǎn)移試劑分成兩部分。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)移試劑含有-作為陽離子親脂區(qū)域的多胺或多氨基胍，-作為親脂區(qū)域的至少兩個脂肪脂族鏈，或至少一個類固醇的衍生鏈和一個脂肪脂族鏈，和-二硫橋，其還原導(dǎo)致一個脂肪脂族鏈喪失，或當轉(zhuǎn)移試劑含有一個類固醇衍生鏈時喪失一個類固醇衍生鏈。
特別有利地，本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑含有一個多胺區(qū)域、三個脂族鏈-其中至少兩個是脂肪脂族鏈、一個二硫橋，在還原性介質(zhì)中，該二硫橋?qū)е乱粋€脂族鏈喪失。
另一種特別有利的轉(zhuǎn)移試劑含有一個多胺區(qū)域、一個脂肪脂族鏈和一個類固醇的衍生鏈和一個二硫橋，而二硫橋在還原性介質(zhì)中導(dǎo)致類固醇的衍生鏈喪失。
另一種特別有利的轉(zhuǎn)移試劑是由兩個對稱的脂肪多胺和一個二硫橋構(gòu)成，該二硫橋在還原性介質(zhì)中導(dǎo)致分成兩部分。
在實施例中說明樂這樣一些轉(zhuǎn)移試劑。作為非限制性的實例列出下述化合物-NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2: -NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3:
-NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)11CH3]-NH(CH2)17CH3 -NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2: -NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-Cholestérol]-NH(CH2)17CH3: -[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCysNH(CH2)17CH3]2:
本發(fā)明另一個目的涉及一種含有一種如前面定義的轉(zhuǎn)移試劑和至少一種核酸的組合物。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移試劑和核酸的量是這樣的，轉(zhuǎn)移試劑正電荷與核酸負電荷的比為0.1-50。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)使用的轉(zhuǎn)移試劑、核酸和待轉(zhuǎn)染細胞類型很容易調(diào)整這個比例。有利地，這個比例是每微克核酸為3-12納摩爾本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑，優(yōu)選地是每微克核酸為3-9納摩爾轉(zhuǎn)移試劑。
關(guān)于本發(fā)明中的“核酸應(yīng)該理解是脫氧核糖核酸或核糖核酸。可能涉及自然或人工的序列，特別是基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、雜合序列或合成或半-合成序列、修飾或未修飾的寡核苷酸。這些核酸可以來自人、動物、植物、細菌、病毒等。采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，特別是采用文庫篩選、化學(xué)合成，或采用混合方法，其中包括化學(xué)修飾或酶修飾采用篩選文庫所得到的序列，可以得到這些核酸。這些核酸可以采用化學(xué)方法進行修飾，即可以涉及假核酸(PNA)、用各種化學(xué)鍵(例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯)修飾的寡核苷酸，或官能化的寡核苷酸，即與一種或多種具有不同特性的分子偶聯(lián)的寡核苷酸。更具體低涉及脫氧核糖核酸，它們可以是單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸，以及短的寡核苷酸或更長的序列。具體地，這些核酸有利地是由質(zhì)粒、載體、附加體、表達盒等組成。這些脫氧核糖核酸可以帶有治療意義的基因、轉(zhuǎn)錄或復(fù)制調(diào)控序列、修飾或未修飾的反義序列、與其他細胞組分結(jié)合的區(qū)域等。
優(yōu)選地，核酸含有一個表達盒，該盒由在靶細胞中有活性的一個或多個啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個或多個有治療意義的基因構(gòu)成。
在本發(fā)明中，關(guān)于“有治療意義的基因”尤其應(yīng)該理解為任何具有治療作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的編碼基因。如此編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)品可以是一種蛋白質(zhì)、肽等。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)品對靶細胞可以是同源的(即當靶細胞不存在任何病理性問題時，在該細胞中正常表達的產(chǎn)品)。在這種情況下，蛋白質(zhì)的表達例如能夠克服在該細胞中表達不充分或因修飾失活或低活性的蛋白質(zhì)的表達，或超量表達所述蛋白質(zhì)。治療基因還可以編碼細胞蛋白質(zhì)的突變體，其穩(wěn)定性提高、活性改變等。蛋白質(zhì)產(chǎn)品對靶細胞還可以是異源的。在這種情況下，表達的蛋白質(zhì)例如可以補足或提供在該細胞中缺失的活性，使它們能夠抵抗疾病，或刺激免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明有治療意義的產(chǎn)品中，更具體地可列舉酶、血液衍生物、激素、淋巴因子[白介素、干擾素、TNF等(FR92/03120)]、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶、營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效因子等)、肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白(minidystrophine)(FR91/11947)，與先天性粘液稠厚癥相關(guān)的CFTR蛋白質(zhì)、腫瘤抑制基因[p53,Rb,Rapl A,DCC,k-rev等(FR93/04745)]、凝血相關(guān)因子的編碼基因(因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ)、參與DNA修復(fù)的基因、自殺基因(胸腺嘧啶核苷激酶、胞嘧啶脫胺酶)、血紅蛋白基因或其他轉(zhuǎn)運蛋白的基因、參與脂質(zhì)代謝的蛋白選自載脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、B、C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白類的相應(yīng)基因、代謝酶如像脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶、7-α-膽固醇羥化酶、磷脂酸磷酸酶，或脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白和磷酯轉(zhuǎn)移蛋白、HDL結(jié)合蛋白質(zhì)或例如選自LDL受體、乳靡微粒-遺余物受體和清除劑受體等的受體。
有治療意義的核酸還可以是這樣一種基因或一種反義序列，它們在靶細胞中的表達能夠控制基因表達或細胞mRNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)專利EP 140308中描述的技術(shù)，這樣的序列例如可以在靶細胞中轉(zhuǎn)錄成細胞mRNA的互補RNA，并因此阻斷它們轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。治療基因還含有核酶編碼序列，這些核酶能夠選擇性地破壞靶RNA(EP 321 201)。
如前面所指出的，核酸還可以含有一個或多個編碼抗原性肽的基因，這種肽在人體或動物中能夠造成免疫應(yīng)答。在這種特定實施方式中，本發(fā)明因此使得有可能制備用于人體或動物的疫苗或進行免疫治療，尤其是用于抗微生物、病毒或癌。具體地涉及對E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185 573)、偽狂犬病病毒、“合包體形成病毒”或其他病毒特異的、或?qū)δ[瘤特異的抗原性肽(EP 259 212)。
優(yōu)選地，核酸還含有能夠使有治療意義的基因和/或抗原肽編碼基因在細胞或所希望的器官中表達的序列?？梢陨婕疤烊回撠?zé)所考慮的基因表達的序列，只要這些序列在感染的細胞中能夠起作用。還涉及不同來源的序列(負責(zé)其他的蛋白質(zhì)的表達，或甚至是合成的)。具體地，可以涉及真核細胞或病毒基因的啟動子序列。例如，可以涉及來自人們希望感染的細胞基因組的啟動子序列。同樣地，可以涉及來自病毒基因組的啟動子序列。為此，例如可以列舉基因E1A、MLP、CMV、RSV等的啟動子。另外，這些表達序列可以通過加入活化序列、調(diào)節(jié)序列等進行修飾。也可以涉及可誘導(dǎo)的或可抑制的啟動子。
另外，核酸還可以特別在有治療意義的基因上游含有指導(dǎo)合成的治療產(chǎn)品至靶細胞分泌通道中的信號序列。這種信號序列可以是治療產(chǎn)品的天然信號序列，但也可以涉任何其他功能性信號序列或人工信號序列。核酸還可以含有將合成的治療產(chǎn)品引導(dǎo)向特定的細胞室的信號序列。
本發(fā)明的組合物還可以含有能夠與轉(zhuǎn)移試劑/核酸復(fù)合物結(jié)合并能夠改善其轉(zhuǎn)染能力的添加劑。在這種選擇中，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種中性脂作為添加劑。這樣一些組合物是特別有利的，當轉(zhuǎn)移試劑正電荷與核酸負電荷的比很低時尤其如此。事實上，已表明加一種中性脂能夠改善核脂顆粒的生成，還通過使膜失穩(wěn)定有利于細胞穿透。
更優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的中性脂是具有兩個脂肪鏈的脂類。
特別有利地，使用在生理條件下為兩性離子或無離子電荷的天然或合成脂類。更具體地，它們可以選自二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、油?；貦磅；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂?；?、二棕櫚酰基-、二膽甾烯基-、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视?、糖基二酰基甘油、腦苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。這些不同的脂類采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法用合成方法，或者從器官(例如腦)或蛋提取的方法得到。具體地，采用有機溶劑的方法可以提取天然脂類(也可參見Lehninger Biochemistry)。
最近，申請人已證明，使用干預(yù)或非直接地干預(yù)所述核酸縮合的化合物作為添加劑，也是特別有利的，如在專利申請WO96/25508中列舉的化合物。在以脂多胺為主要成分的轉(zhuǎn)染組合物中，這樣一種化合物的存在，能夠大大降低這種轉(zhuǎn)移試劑的量，在毒理學(xué)方面由此獲得有益結(jié)果，對所述組合物的轉(zhuǎn)染活性不會帶來任何損害。關(guān)于干預(yù)核酸縮合的化合物，應(yīng)該定義為直接或非直接地壓緊核酸的化合物。更確切地，這種化合物或者直接作用于待轉(zhuǎn)染核酸，或者所用于直接參與核酸縮合作用的其它化合物。優(yōu)選地，直接作用于核酸。具體地，預(yù)致密(precompactant)劑可以是任何多陽離子物，例如聚賴氨酸。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，干預(yù)核酸縮合作用的這種預(yù)致密劑完全或部分地從魚精蛋白、組蛋白、核仁蛋白和/或它們的衍生物得到。這樣一種預(yù)致密劑還可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，基元數(shù)可以是2-10。在本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)中，這些基元可以連續(xù)地或不連續(xù)地重復(fù)。因此它們可以通過生物化學(xué)性質(zhì)的連接(例如一個或多個氨基酸)隔開，或通過化學(xué)性質(zhì)的連接隔開。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有每核酸當量為0.01-20當量的添加劑(重量/重量)，更優(yōu)選地是0.5-5。
本發(fā)明的組合物還可以使用一種或多種靶向元件，這些元件能夠?qū)⒑怂釓?fù)合物引導(dǎo)向細胞表面的受體或配體。作為實例，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種抗細胞表面分子的抗體，或膜受體的一種或多種配體如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸或任何其他的生長因子、細胞因子或維生素。有利地，該組合物可以使用修飾或未修飾的凝集素，以便靶向于細胞表面或鄰近細胞外基質(zhì)上的特定多糖。還可以使用具有RGD基元的蛋白質(zhì)、含有串聯(lián)RGD基元的環(huán)狀或非環(huán)狀的肽、以及聚賴氨酸肽。最近，還報道了一些天然或合成的配體肽，它們尤其對一些特定細胞具有選擇性并能夠提高這些細胞中的內(nèi)在化效率(Bary等人，天然藥物(naturemedicine),1996年，第2期，第299-305頁)。這些靶向試劑一般與所研究的陽離子轉(zhuǎn)染劑偶聯(lián)。
在如上述定義的任何組合物中，本發(fā)明還包括如上所定義平含有一種或多種已知用于轉(zhuǎn)染核酸的其他轉(zhuǎn)染劑的組合物。具體地，可以列舉在專利EP 394 111中或在專利申請WO96/17823或WO97 18185(以參考文獻列于本文中)中描述的產(chǎn)品。
本發(fā)明另一個目的還涉及如上述定義的轉(zhuǎn)移試劑在向細胞中轉(zhuǎn)移核酸中的應(yīng)用。
含有本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的組合物經(jīng)配制可以采用局部、皮膚、口、直腸、陰道、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)等方式用藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物含有下述藥學(xué)上可接受的賦形劑，該賦形劑適用于注射劑，尤其是用于在所希望器官中直接注射的注射劑，或適于用局部方式(皮膚和/或粘膜上)用藥。特別涉及等滲的無菌溶液，或干的尤其是凍干的組合物，這些組合物可根據(jù)情況加入無菌水或生理鹽水配制成注射溶液。注射使用的核酸劑量以及用藥次數(shù)可以根據(jù)不同的參數(shù)而變化，特別是根據(jù)用藥方式、涉及的疾病、待表達基因或所進行治療的時間長短。更具體地對于用藥方式，可以在組織或循環(huán)通路中直接注射，或者處理培養(yǎng)細胞接著采用注射或移植方法將它們再植入。
本發(fā)明還涉及在細胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如前面定義的轉(zhuǎn)移試劑進行接觸，以便生成核酸/轉(zhuǎn)移試劑復(fù)合物，(2)讓細胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
在含有一種或多種其他轉(zhuǎn)移試劑和/或一種或多種添加劑的組合物的情況下，步驟(1)之前有不同轉(zhuǎn)染劑的接觸步驟和/或轉(zhuǎn)染劑與一種或多種添加劑的接觸步驟。
一種含有微膠粒狀的或六角層狀相的本發(fā)明轉(zhuǎn)染劑的溶液，另一種含有待轉(zhuǎn)染核酸的溶液，將這兩種溶液以逐體積(volumeàvolume)進行混合，可生成本發(fā)明轉(zhuǎn)染劑/核酸的復(fù)合物。在幾秒鐘內(nèi)生成了這些復(fù)合物。根據(jù)加入核酸的脂的量，它們可以帶負電荷、正電荷或為中性(Pitard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第94卷，第14412-14417頁，1997年12月)。這些復(fù)合物的尺寸是直徑50-300納米(采用光的準-彈性散射與采用透射電子顯微鏡測定)。另外，這些復(fù)合物的形態(tài)隨電荷比R(陽離子脂類帶的正電荷與核酸帶的負電荷之比)而改變。帶負電荷的復(fù)合物被核酸分子包圍。相反地，帶正電荷的復(fù)合物在其表面有陽離子的脂類。至于中性復(fù)合物，它們是膠體狀不穩(wěn)定復(fù)合物。因此，申請人證明，加入足量的非離子表面活性劑可以使這些復(fù)合物穩(wěn)定。優(yōu)選的非離子表面活性劑具體是poloxamers、聚氧化乙烯醇、聚氧乙烯壬基苯基醚或具有樹狀芐基聚醚端的PEG(聚乙二醇)。
細胞與復(fù)合物的接觸可以通過細胞與所述復(fù)合物一起培養(yǎng)(體外或離體使用)，或給生物體注入復(fù)合物(體內(nèi)使用)來實現(xiàn)。優(yōu)選地，106個細胞例如在0.01-1000微克核酸存在下進行培養(yǎng)。體內(nèi)用藥時，可以使用的核酸劑量為0.01-10毫克。
在初級細胞中或在已建的細胞系中轉(zhuǎn)移核酸使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑是特別有意義的。這可以涉及成纖維細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞(神經(jīng)元、星形細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞)、肝細胞、生血細胞(淋巴細胞，CD34、樹狀細胞等)、上皮細胞等，它們呈已分化形式或多潛能形式(前體)。
本發(fā)明因此提供了一種特別有利的治療疾病的方法，該方法包括在體內(nèi)、體外或離體使用與本發(fā)明的化合物結(jié)合的一種能夠緩和所述疾病的核酸。更具體地，這種方法可用于因蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)品不足或缺乏而引起的疾病。使用的核酸可編碼該蛋白質(zhì)產(chǎn)品或含有所述核酸產(chǎn)品。
除了前面的因素外，本發(fā)明還包括由下述實施例和附圖得出的其他特點和優(yōu)點，這些實施例和附圖應(yīng)該認為是說明本發(fā)明而不是限制其保護范圍。具體地，申請人非限制性地提出各種操作方案，以及可用于制備本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的反應(yīng)中間體。當然，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在這些方案或中間體的啟示下能夠找到類似的方法或中間體用于制備這些同樣的化合物。
附1表示用Triton X-100對脂質(zhì)體EPC/EPA(10∶1)溶解情況的曲線，使用分光光度計測定溶液燭度得出該溶解曲線。橫坐標為添加Triton X-100的量，以mM表示。縱坐標表示含有脂質(zhì)體的溶液的吸光度。
圖2表示用化合物(Ⅶ)對脂質(zhì)體EPC/EPA(10∶1)溶解情況的曲線，使用分光光度計測定溶液燭度得出該溶解曲線。橫坐標為添加化合物(Ⅶ)的量，以mM表示?？v坐標表示含有脂質(zhì)體的溶液的吸光度。
圖3在沒有血清的情況下，在細胞HepG2中化合物(Ⅶ)的轉(zhuǎn)染活性，用化學(xué)式H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGly[(CH2)17CH3]2陽離子脂類作參比轉(zhuǎn)移試劑(在本申請下文中稱之REF)進行比較。
圖4在有或沒有血清存在下，在細胞HepG2和HeLa中化合物(Ⅰ)和化合物(Ⅳ)的轉(zhuǎn)染活性，用參比REF陽離子脂類進行比較。
圖5該矩形圖表示在沒有輔助脂質(zhì)或在輔助脂質(zhì)DOPE或膽固醇存在下，在HeLa細胞中化合物(Ⅰ)的體外轉(zhuǎn)移活性?？v軸表示每孔中熒光素酶的表達，以pg表示。橫軸表示化合物(Ⅰ)/DNA比，以納摩爾/微克DNA表示。
圖6該矩形圖表示在沒有輔助脂質(zhì)或在輔助脂質(zhì)DOPE或膽固醇存在下，在HeLa細胞中化合物(Ⅳ)的體外轉(zhuǎn)移活性?？v軸表示每孔中熒光素酶的表達，以pg表示。橫軸表示化合物(Ⅳ)/DNA比，以納摩爾/微克DNA表示。
圖7在有或沒有血清的情況下，在細胞HepG2中化合物(Ⅱ)的轉(zhuǎn)染活性，用參比REF陽離子脂類進行比較。
圖8該矩形圖表示在沒有輔助脂質(zhì)或在輔助脂質(zhì)DOPE或膽固醇存在下，在HeLa細胞中化合物(Ⅱ)的體外轉(zhuǎn)移活性?？v軸表示每孔中熒光素酶的表達，以pg表示。橫軸表示化合物(Ⅰ)/DNA比，以納摩爾/微克DNA表示。
圖9在有或沒有血清的情況下，在細胞HepG2和HeLa中化合物(Ⅴ)的轉(zhuǎn)染活性，用參比REF陽離子脂類進行比較。
實施例實施例1本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的化學(xué)合成A、材料-三乙胺、N-乙基二異丙基胺、雙十八烷基胺、Nα,Nα′-二Boc胱氨酸和BOP試劑在市場上可購到的。
-戊胺、十八烷胺、戊硫醇、十二烷硫醇、十八烷硫醇和硫代膽固醇同樣可購到。
-在實驗室中，根據(jù)在專利申請WO97/18185和Byk G.,Frederic M,和Scherman D.，在“四面體通訊”(Tetrahedron Letters)(1997)38，第3219-3222頁發(fā)表的文章中所述操作方式，已合成出BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2CO2H。
B方法a)光譜分析用Brucker 250和400MHz光譜儀記錄了質(zhì)子NMR譜(核磁共振)。
b)色譜技術(shù)HPLC分析(高效液相色譜)使用HITACHI裝置，它配置了AS-2000A自動取樣器、L-6200A泵、220納米的UV L 4000檢測器和D 2500計算機積分儀。使用的柱是APPLIED BIOSYSTEMS銷售的柱，用不銹鋼制成，長為3厘米，直徑為4.6毫米。流動相是水和補加三氟乙酸的乙腈，固定相是Aquapore butyl,7微米。流量是1-4毫升/分。
薄層色譜(TLC)使用涂有硅膠的20×20鋁板。
c)制備性HPLC純化-使用的裝置是一套梯度方式的液相色譜裝置，能進行U.V.檢測。這種制備性流水線組成如下泵A:GILSON 305型，配置50 SC頭。
泵B:GILSON 303型，配置50 SC頭。
注射泵GILSON 303型，配置25 SC頭。
壓力組件GILSON 806型。
混合器GILSON 811型，配置23毫升頭。
UV檢測器配置制備池的GILSON 119型，調(diào)節(jié)到220納米。
餾分收集器GILSON 202型，配置21號架。
積分儀SHIMADZU C-R6A型。
柱VYDAC公司銷售的214TP 1022型C4柱(10毫米)，不銹鋼制，長為25厘米，直徑為2.2厘米。
用注射泵以15毫升/分的流量將待純化的產(chǎn)品溶液裝入柱中。流動相是水和乙腈。
C．化學(xué)合成a)用二硫橋構(gòu)建可還原的具有脂肪鏈的轉(zhuǎn)移試劑這些分子具有下述一般結(jié)構(gòu) 它們以下述方式構(gòu)建
步驟1 步驟2 步驟3
用下述非限制性實施例來說明這些轉(zhuǎn)移試劑化合物(Ⅰ):R1=(CH2)4CH3；R2=(CH2)17CH3；R3=(CH2)17CH3[制備例3.1]化合物(Ⅱ):R1=(CH2)17CH3；R2=(CH2)17CH3；R3=H[制備例3.2]化合物(Ⅲ):R1=(CH2)11CH3；R2=(CH2)17CH3；R3=H[制備例3.3]化合物(Ⅳ):R1=(CH2)11CH3；R2=(CH2)17CH3；R3=(CH2)17CH3[制備例3.4]化合物(Ⅴ):R1=膽甾烯基；R2=(CH2)17CH3；R3=H[制備例3.5]步驟1·制備例1.1:NHBocCys[S-S-(CH2)4CH3]-OH將Nα,Nα′-二-Boc胱氨酸(6.81毫摩爾)溶于二甲基甲酰胺(20毫升)中。往該溶液添加三乙胺(58.1毫摩爾)，然后加1-戊硫醇(6.81毫摩爾)。將混合物在室溫下攪拌2小時。蒸去三乙胺，然后將濃縮物加到0.5M硫酸鉀溶液(300毫升)中。沉淀出的產(chǎn)物每次用100毫升氯仿提取3次。將有機相合并，用無水硫酸鎂干燥，然后再蒸去氯仿。干提取物用乙醚(100毫升)溶解，然后每次用50毫升飽和碳酸鈉(NaHCO3)溶液提取3次。合并水相，加0.5M KHSO4溶液(350毫升)中和直到pH=3。沉淀的產(chǎn)物每次用100毫升氯仿提取3次。將有機相合并，再每次用50毫升飽和氯化鈉溶液洗滌2次，然后用無水硫酸鎂干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去氯仿。得到的產(chǎn)物在硅膠柱上用氯仿/甲醇混合物(體積比9/1)洗脫。
得到2.31毫摩爾產(chǎn)品，即產(chǎn)率為34％。
TLC Rf=0.63(CH3/MeOH,9∶1)。
·制備例1.2:NHBocCys[S-S-(CH2)17CH3]-OH將Nα,Nα′-二-Boc胱氨酸(6.81毫摩爾)溶于二甲基甲酰胺(20毫升)中。往該溶液添加三乙胺(58.1毫摩爾)，然后加1-十八烷硫醇(6.81毫摩爾)。將混合物在40℃下攪拌2小時。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去三乙胺，然后將濃縮物加到0.5M硫酸氫鉀溶液(300毫升)中。沉淀出的產(chǎn)物每次用100毫升氯仿提取3次。將有機相合并，用無水硫酸鎂干燥，然后再蒸去氯仿。干提取物用乙醚(100毫升)溶解，然后每次用50毫升飽和NaHCO3溶液洗滌3次。乙醚相每次用100毫升0.5M KHSO4溶液攪拌酸化2次，再每次用50毫升飽和氯化鈉溶液洗滌2次。乙醚相用無水硫酸鎂干燥，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至干。得到的粗產(chǎn)物在石油醚中結(jié)晶。
得到1.36毫摩爾產(chǎn)品，即產(chǎn)率為20％。
TLC Rf=0.67(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=17.80分。
·制備例1.3:NHBocCys[S-S-膽甾醇]-OH該合成與制備例1.2相同，但是使用硫代膽甾醇。
得到的產(chǎn)率為58％。
TLC:Rf=0.59(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=19.16分。
·制備例1.4:NHBocCys[S-S-(CH2)11CH3]-OH該合成與制備例1.2相同，但是在室溫下使用1-十二烷硫醇。
得到的產(chǎn)率為40％。
TLC:Rf=0.69(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=13.23分。
步驟2·制備例2.1:NHBocCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2將1.1得到的產(chǎn)品(1.15毫摩爾)溶解于二氯甲烷(10毫升)中，加入N-乙基二異丙基胺(2.86毫摩爾)、雙十八烷胺(1.15毫摩爾)和BOP(1.27毫摩爾)。
將該混合物攪拌2小時，接著進行TLC和HPLC。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去二氯甲烷。將“粗產(chǎn)物”溶解于氯仿(100毫升)，然后相繼地進行如下洗滌每次用50毫升0.5MKHSO4洗滌3次，然后每次用50毫升飽和NaHCO3溶液洗滌3次，最后用50毫升飽和NaCl溶液洗滌2次。有機相用無水硫酸鎂干燥，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去氯仿。得到的產(chǎn)率為64％。
TLC:Rf=0.90(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=25.96分。
·制備例2.2:NHBocCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3該合成與制備例2.1相同，但是使用在制備例1.2中得到的產(chǎn)品作為起始反應(yīng)物。
得到的產(chǎn)率為97％。
TLC:Rf=0.89(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=24.84分。
·制備例2.3:NHBocCys[S-S-(CH2)11CH3]-NH(CH2)17CH3
該合成與制備例2.1相同，但是使用在制備1.4中得到的產(chǎn)品作為起始反應(yīng)物。
得到的產(chǎn)率為86％。
TLC:Rf=0.90(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=22.22分。
·制備例2.4:NHBocCys[S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2該合成與制備2.1相同，但是使用雙十八烷胺和在制備1.4中得到的產(chǎn)品作為起始反應(yīng)物。
得到的產(chǎn)率為85％。
TLC:Rf=0.90(CH3/MeOH,9∶1)。
·制備例2.5:NHBocCys[S-S-膽甾醇]-NH(CH2)17CH3該合成與制備2.1相同，但是使用十八烷胺和在制備1.3中得到的產(chǎn)品作為起始反應(yīng)物。
得到的產(chǎn)率為90％。
TLC:Rf=0.88(CH3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=26.98分。
步驟3·制備例3.1[化合物(Ⅰ)]:NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2將三氟乙酸(10毫升)加到制備例2.1的產(chǎn)品中。將該介質(zhì)攪拌1.5小時，用HPLC跟蹤BOC的分解。蒸去三氟乙酸，為趕掉微量三氟乙酸，每次用5毫升乙醚蒸發(fā)3次。
將干提取物溶于10毫升二氯甲烷中，然后加N-乙基二異丙胺(3.34毫摩爾)、BocNH(CH2)3NBocNH(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2CO2H(0.644毫摩爾)和BOP(0.708毫摩爾)。將該混合物攪拌2小時，用TLC和HPLC跟蹤反應(yīng)。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去二氯甲烷。粗產(chǎn)物溶于氯仿(100毫升)中，然后相繼地進行如下洗滌每次用50毫升0.5MKHSO4洗滌3次，然后每次用50毫升飽和NaHCO3溶液洗滌3次，最后用50毫升飽和NaCl溶液洗滌2次。有機相用無水硫酸鎂干燥，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去氯仿。
將三氟乙酸(10毫升)加到干提取物中。將該介質(zhì)攪拌1.5小時，用HPLC跟蹤BOC的分解。蒸去三氟乙酸，為趕掉微量三氟乙酸，每次用5毫升乙醚蒸發(fā)3次。
得到的粗產(chǎn)物用制備HPLC進行純化。收集目標餾分并凍干。
得到0.081毫摩爾成鹽產(chǎn)品，即產(chǎn)率為11％。
HPLC:Rt=17.79分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SO,δ，以ppm表示)0.90(mt,9H兩個十八烷基氨基的CH3和戊基二硫基的CH3)；1.15-1.50(mt,64H兩個十八烷基氨基之一的15個CH2-另一個十八烷基氨基的15個CH2和戊基二硫基的2CH2)；1.47(mt,2H兩個十八烷基氨基之一的1CH2)；1.55-1.75(mt,4H兩個十八烷基氨基之一的1CH2和戊基二硫基的1CH2)；1.65(mf,4H丁基中心的2CH2)；1.85-2.05(mt,4H兩個丙基中心的CH2)；2.70-2.85(mt,1H半胱氨酸CH2S的1H)；2.78(mt,2H戊基二硫基的SCH2)；2.85-3.50(mt，丁基的2NCH2-兩個丙基的2NCH2-半胱氨酸CH2S的另一個H和兩個十八烷基氨基的NCH2)；3.80(寬s,2H甘氨酰基氨基的NCH2CON)；5.07(mt,1H半胱氨酸的CONCHCON)；9.05(d,J=8Hz,1H半胱氨酸的CONH)；7.95-8.85和8.90-9.15(分別為2mf和展寬的mf相應(yīng)于NH和NH2的H)。
MH+=969制備例3.2[化合物(Ⅱ)]:NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3該方法與制備例3.1中描述的方法相同，但是用制備例2.2得到的產(chǎn)品。
得到產(chǎn)率為31％成鹽產(chǎn)品。
HPLC:Rt=15.63分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SO,δ，以ppm表示):0.89(t,J=7.5Hz,6H十八烷基氨基的CH3和十八烷基二硫基的CH3)；1.15-1.45(mt,60H十八烷基氨基的15CH2和十八烷基二硫基的15CH2)；1.42(mt，十八烷基氨基CH2中的1CH2)；1.55-1.70(mt,2H十八烷基二硫基CH2中1CH2)；1.66(mf,4H丁基中心的2CH2)；1.85-2.05(mt,4H兩個丙基中心的CH2)；2.76(t,J=7.5Hz,2H十八烷基二硫基的SCH2)；2.85-3.10(mt,14H丁基的2NCH2-兩個丙基的2NCH2-十八烷基氨基NCH2的1H和半胱氨酸CH2S的1H)；3.10(dd,J=13.5和6Hz,1H半胱氨酸CH2S另一個H)；3.18(mt,1H十八烷基氨基NCH2的另一個H)；3.82(非常限制的AB,2H甘氨?；被腘CH2CON)；4.60(mt,1H半胱氨酸的CONCHCON)；8.27(t,J=5.5Hz,1H十八烷基氨基的CONH)；8.90(d,J=8Hz,1H半胱氨酸的CONH)；7.95-8.82和9.07(3個mf相應(yīng)于NH和NH2的H)。
MH+=899制備例3.3[化合物(Ⅲ)]:NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-(CH2)11CH3]-NH(CH2)17CH3該方法與制備例3.1中描述的方法相同，但是用制備例2.3得到的產(chǎn)品。
得到產(chǎn)率為26.5％成鹽產(chǎn)品。
HPLC:Rt=12.36分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SO,δ，以ppm表示)0.90(t,J=7.5Hz,6H十八烷基氨基的CH3和十二烷基二硫基的CH3)；1.15-1.50(mt,48H十八烷基氨基的15CH2和十二烷基二硫基的9CH2)；1.43(mt，十八烷基氨基CH2的1CH2)；1.55-1.70(mt,2H十八烷基二硫基的1CH2)；1.65(mf,4H丁基中心的2CH2)；1.85-2.05(mt,4H兩個丙基中心CH2)；2.76(t,J=7.5Hz,2H十二烷基二硫基的SCH2)；2.80-3.05(mt,14H丁基的2NCH2-兩個丙基的2NCH2-十八烷基氨基NCH2的1H和半胱氨酸CH2S的1H)；3.11(dd,J=13.5和6Hz,1H半胱氨酸CH2S另一個H)；3.17(mt,1H十八烷基氨基NCH2另一個H)；3.83(限制的AB,2H甘氨?；被腘CH2CON)；4.60(mt,1H半胱氨酸的CONCHCON)；8.25(t,J=5.5Hz,1H十八烷基氨基的CONH)；8.99(d,J=8Hz,1H半胱氨酸的CONH)；7.96-8.84和9.09(3個mf相應(yīng)于NH和NH2的H)。
MH+=815制備例3.4[化合物(Ⅳ)]:NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2
將制備例2.4得到的產(chǎn)品用于與制備例3.1相同的合成中。
得到產(chǎn)率為39％成鹽產(chǎn)品。
HPLC:Rt=19.75分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SO,δ，以ppm表示)0.87(t,J=7.5Hz,9H兩個十八烷基氨基的CH3和十二烷基二硫基的CH3)；1.15-1.50(mt,78H兩個十八烷基氨基的15CH2-另一個十八烷基氨基的15CH2和十二烷基二硫基的9CH2)；1.47(mt,2H兩個十八烷基氨基之一的1CH2)；1.50-1.70(mt,4H兩個十八烷基之一的1CH2和十二烷基二硫基的1CH2)；1.68(mf,4H丁基中心的2CH2)；1.85-2.10(mt,4H兩個丙基中心的CH2)；2.77(t,J=7.5Hz,2H十二烷基二硫基的SCH2)；2.80(mt,1H半胱氨酸的CH2S的1H)；2.70-3.50(mt丁基的2NCH2-兩個丙基的2NCH2-半胱氨酸CH2S另一個H和兩個十八烷基氨基的NCH2)；3.80(寬s,2H甘氨?；被腘CH2CON)；5.05(mt,1H半胱氨酸的CONCHCON)；9.07(d,J=8Hz,1H半胱氨酸的CONH)；7.75-8.20和8.65-9.25(2個展寬的mf相應(yīng)于NH和NH2的H)。
MH+=1067制備例3.5[化合物(Ⅴ)]:NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-膽甾醇]-NH(CH2)17CH3將制備例2.5得到的產(chǎn)品用于與制備例3.1相同的合成中，BOC的最后分解除外，這種分解使用下述的混合物10毫升TFA、0,5毫升水、0,5毫升苯硫基甲烷和0.75克苯酚。
得到產(chǎn)率為5.6％成鹽產(chǎn)品。
HPLC:Rt=16.59分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SOd6，溫度383K,δ，以ppm表示)0.74和1.05(2s，每個3H膽甾烯基18位的CH3和19位的CH3)；0.80-0.95(mt相應(yīng)于十八烷基氨基CH3和膽甾烯基26位CH3-27位CH3和21位CH3的H)；1.77(mt相應(yīng)于丁基中心2CH2的4H)；1.85-2.10(mt相應(yīng)于兩個丙基中心的CH2的4H)；2.90-3.25(mt相應(yīng)于丁基2NCH2-兩個丙基的2NCH2-半胱氨酸CH2S和十八烷基氨基的NCH2的16H)；3.63(限制的AB,2H甘氨?；被腘CH2CON)；4.61(mt,1H半胱氨酸的CONCHCON)；5.39(mt,1H膽甾烯基6位的CH)；7.69(mt,1H十八烷基氨基的CONH)；8.25(mf,1H半胱氨酸的CONH)。對于膽甾烯基和十八烷基氨基的所有其他質(zhì)子，相應(yīng)的信號在0.60-3.00ppm之間。
MH+=1015b)用二硫橋構(gòu)建可一分為二的對稱轉(zhuǎn)移試劑這些分子的一般結(jié)構(gòu)如下多胺-間隔臂-脂｜S｜S｜多胺-間隔臂-脂它們以下述方式構(gòu)建
步驟1) 步驟2)
用下列非限制性的實施例說明這些轉(zhuǎn)移試劑化合物(Ⅵ):R1=(CH2)17CH3；R2=H步驟1·制備例1:[NHBoc-CH(CH2)17CH3]CH2-S-]2將Nα,Nα′-二-Boc胱氨酸(0.57毫摩爾)溶于氯仿(15毫升)中，再加入N-乙基二異丙基胺(5.67毫摩爾)、十八烷基胺(0.10毫摩爾)和BOP(1.24毫摩爾)。
該混合物攪拌2小時，采用TLC和HPLC跟蹤。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去氯仿。“粗產(chǎn)物”溶于乙酸乙酯(100毫升)，然后相繼地進行如下洗滌每次用50毫升0.5M KHSO4洗滌3次，然后每次用50毫升飽和NaHCO3溶液洗滌3次，最后每次用50毫升飽和NaCl溶液洗滌2次。有機相用無水硫酸鎂干燥，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去乙酸乙酯。
得到0.346毫摩爾產(chǎn)品，即產(chǎn)率69％。
TLC:Rf=0.94(CHCl3/MeOH,9∶1)。
步驟2·制備例2[化合物(Ⅵ)]:[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCyNH(CH2)17CH3]2將三氟乙酸(5毫升)加到由制備例1得到的產(chǎn)品中。將混合物攪拌1.5小時，采用HPLC跟蹤BOC的分解。蒸去三氟乙酸，為了趕掉微量三氟乙酸，每次用5毫升乙醚蒸發(fā)3次。干提取物溶于二氯甲烷(25毫升)中，然后加N-乙基二異丙基胺(3.44毫摩爾)、BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2CO2H(0.697毫摩爾)和BOP(0.86毫摩爾)。將混合物攪拌2小時，采用TLC和HPLC跟蹤該反應(yīng)。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去二氯甲烷。將“粗產(chǎn)物”溶于乙酸乙酯(100毫升)，然后相繼地進行如下洗滌每次用50毫升0.5M KHSO4洗滌3次，然后每次用50毫升飽和NaHCO3溶液洗滌3次，最后每次用50毫升飽和NaCl溶液洗滌2次。有機相用無水硫酸鎂干燥，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去乙酸乙酯。
TLC:Rf=0.90(CHCl3/MeOH,9∶1),HPLC:Rt=26.10分。
將三氟乙酸(5毫升)加到干提取物中。將混合物攪拌1.5小時，采用HPLC跟蹤BOC的分解。蒸去三氟乙酸，為了趕掉微量三氟乙酸，每次用5毫升乙醚蒸發(fā)3次。
得到的粗產(chǎn)品采用制備性HPLC進行純化。收集目標餾分并凍干。
得到0.099毫摩爾成鹽產(chǎn)品，即產(chǎn)率為28.5％。
HPLC:Rt=10.55分。
1HNMR譜(400MHz,(CD3)2SO,δ，以ppm表示)0.91(t,J=7.5Hz,6H兩個十八烷基氨基的CH3)；1.10-1.40(mt,60H兩個十八烷基氨基之一的15CH2和另一個十八烷基氨基的15CH2)；1.43(mt,4H兩個十八烷基氨基的1CH2)；1.64(mf,8H兩個丁基中心2CH2)；1.85-2.10(mt,8H四個丙基中心的CH2)；2.80-3.15(mt,32H兩個丁基的2NCH2-四個丙基的2NCH2-兩個十八烷基氨基的NCH2和兩個半胱氨酸的CH2S)；3.84(mf,4H兩個甘氨?；被腘CH2CON)；4.60(mt,2H兩個半胱氨酸的CONCHCON)；8.27(mf,2H兩個十八烷基氨基CONH)；8.95(mf,2H兩個半胱氨酸的CONH)；7.97-8.87和9.15(3個mf相應(yīng)于NH和NH2的H)。
MH+=1227。
實施例2本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑凈化作用的評價這個實施例的目的是證明本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑具有去污劑性質(zhì)，即它們能夠溶解膜。
為此，使用了代表生物膜的體外模型，即脂質(zhì)體EPC/EPA(卵的磷脂酰膽堿/卵的磷脂酸，10∶1)。與生物膜完全一樣，這些脂質(zhì)體的壁是由雙層磷脂構(gòu)成，因此它們具有可比較的性能。
這些脂質(zhì)體的制備方法如下將不同的組分在氯仿中制成溶液，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去所述的氯仿。得到的脂薄膜再分散在水中，然后采用聲處理和加熱處理生成脂質(zhì)體。
采用分光光度法測定濁度，可評價添加到脂質(zhì)體中的產(chǎn)品的去污劑作用。
作為參比，用Triton X-100進行了第一個試驗，Triton X-100是人們熟知的市售去污劑。正如

圖1曲線所表明的，達到了脂質(zhì)體的完全溶解(100％溶解作用)。
第二個試驗產(chǎn)品是一種兩親分子，該分子含有通過間隔臂與有18個碳原子的脂肪鏈連接的多胺(化合物(Ⅶ))。因此涉及還原本發(fā)明化合物(Ⅱ)二硫橋所得到的分子。圖2的曲線表明將這種兩親分子加到脂質(zhì)體中時所得到的結(jié)果觀察到了部分溶解作用，與Triton X-100相比相當于約30％溶解作用。
最后，用參比REF陽離子脂，即化合物(Ⅱ)的類似物但不含二硫橋，進行了同樣的試驗。觀察到脂質(zhì)體膜沒有任何溶解。
結(jié)論本實施例表明，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑在還原介質(zhì)中能夠產(chǎn)生具有去污劑作用-即能夠溶解膜-的兩親分子。這種性質(zhì)是極有利的，因為本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑能夠更大量地更容易地接近核酸，直到細胞室，這樣就能夠改善轉(zhuǎn)染效率(正如下面轉(zhuǎn)染實施例所表明的)。
實施例3本發(fā)明的產(chǎn)品用于遺傳物質(zhì)的體外轉(zhuǎn)染不論二硫橋插入轉(zhuǎn)移試劑結(jié)構(gòu)中的情況如何，這些試驗都說明了本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑能夠有效地轉(zhuǎn)染體外細胞。
A．使用的遺傳物質(zhì)使用的質(zhì)粒在專利WO97/10343中作過描述。這種結(jié)構(gòu)pCOR-pXL2774包括在人巨細胞病毒非常早熟基因[hCMV-IE]的啟動子控制下的熒光素酶編碼基因。
核酸溶液在生理鹽水(0.15M NaCl)中稀釋到20微克/毫升。
B．細胞轉(zhuǎn)染劑溶液(臨時制備)將本發(fā)明中描述的產(chǎn)品在水中制成溶液，濃度為40-160微摩爾，并與DNA溶液逐體積混合。最后鹽濃度是75毫摩爾。
C．轉(zhuǎn)染將細胞在24孔(2厘米2/孔)微培養(yǎng)板中在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，當它們處于指數(shù)生長期及50-70％匯合時進行轉(zhuǎn)染。
這些細胞每次用0.5毫升無血清蛋白的介質(zhì)洗滌兩次，接著在無血清的培養(yǎng)基中(在沒有血清的情況下轉(zhuǎn)染)或者在完全培養(yǎng)基中(在有血清的情況下轉(zhuǎn)染)繼續(xù)生長。往細胞中加入0.05毫升細胞轉(zhuǎn)染劑混合物(0.5微克DNA/孔)(3孔/載體-DNA條件)。在無血清轉(zhuǎn)染細胞時，在轉(zhuǎn)染后2小時后，生長培養(yǎng)基中補充適量的血清。
根據(jù)Promega試劑盒的使用說明(熒光素酶試驗系統(tǒng))，通過測定熒光素酶的表達，在轉(zhuǎn)染后48小時評價轉(zhuǎn)染效率。通過測定細胞溶胞產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)濃度，估算細胞轉(zhuǎn)染劑混合物的毒性。
D．結(jié)果a)通過還原二硫橋可一分為二的對稱轉(zhuǎn)移試劑化合物(Ⅵ)(圖3)為轉(zhuǎn)染細胞系HepG2，作為DNA載體使用本發(fā)明描述的這種產(chǎn)品，與參比REF陽離子脂類(在專利申請WO97/18185中作為化合物(6)描述的)進行比較。
對于這種類型的細胞，化合物(Ⅵ)毒性與參比REF陽離子脂類處于相同的數(shù)量級在沒有血清的情況下進行轉(zhuǎn)染，陽離子脂類劑量為160μM時，HepG2細胞的存活率為80％。
陽離子脂類/微克DNA之比為4-8納摩爾時，可獲得最大的轉(zhuǎn)染效率。對于HepG2細胞的轉(zhuǎn)染，使用化合物(Ⅵ)達到的轉(zhuǎn)基因表達高于使用參比REF陽離子脂類達到的轉(zhuǎn)基因表達(4倍)。
b)轉(zhuǎn)移試劑脂部分由兩個C18烷基鏈和一個通過二硫橋連接的第三種烷基鏈組成化合物(Ⅰ)和(Ⅳ)對于HeLa細胞和HepG2細胞，本發(fā)明描述的這兩種產(chǎn)品直到陽離子脂類劑量為160μM都沒有顯著的毒性。
與使用參比REF的陽離子脂類得到的轉(zhuǎn)基因表達相比，在C5[化合物(Ⅰ)]中引入第三個脂鏈在沒有血清蛋白質(zhì)的情況下得到的轉(zhuǎn)染結(jié)果具有相同的數(shù)量級。相反地，在同樣的轉(zhuǎn)染條件下，如果第三個脂鏈是在C12[化合物(Ⅳ)]中，對于HeLa細胞，轉(zhuǎn)基因表達增加約2倍，對于HepG2細胞，轉(zhuǎn)基因表達增加約9倍(參見圖4)。
此外，在血清蛋白質(zhì)存在下的轉(zhuǎn)染試驗中，證明了通過加入第三個烷基鏈，陽離子脂類親脂性增加的重要意義。在這種情況下，事實上血清蛋白質(zhì)的存在沒有任何顯著的抑制作用，這樣，可從中選擇體內(nèi)轉(zhuǎn)染的侯選者。
圖5和6以矩形圖表示化合物(Ⅰ)和(Ⅳ)的轉(zhuǎn)染效率。
c)轉(zhuǎn)移試劑脂部分由兩個C18烷基鏈組成，其中一個烷基鏈通過二硫橋連接化合物(Ⅱ)對于HepG2細胞(陽離子脂類劑量為160μM)，本發(fā)明描述的這種產(chǎn)品在所用的劑量下都沒有顯著的毒性。
對于沒有血清蛋白質(zhì)情況下的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)基因表達水平比參比REF的陽離子脂類的高達3倍(參見圖7)。
此外，在血清蛋白質(zhì)存在下，轉(zhuǎn)染有明顯改善(達4倍)。因此，非常驚奇地注意到，沒有因血清存在而有任何抑制作用。
圖8以矩形圖表示化合物(Ⅱ)的轉(zhuǎn)染效率。
d)轉(zhuǎn)移試劑脂部分含有一個通過二硫橋連接的類固醇衍生鏈化合物(Ⅴ)(圖9)對于HeLa細胞和HepG2細胞(陽離子脂類劑量為160μM)，本發(fā)明描述的這種化合物在所用的劑量下都沒有顯著的毒性。
膽固醇代替烷基鏈的連接使轉(zhuǎn)基因表達非常顯著地增加，此外，在這種情況下，在血清存在下未觀察到任何抑制作用，這樣使這種產(chǎn)品很有希望用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
結(jié)論在表中和圖3-9中以矩形圖表示的結(jié)果證明-在陽離子脂類型轉(zhuǎn)移試劑中引入一個或多個二硫橋不影響這些DNA轉(zhuǎn)染劑的體外能力，而相反地可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的提高，-本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑在使用的劑量下沒有毒性，-最后，本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑親脂性增加至少能夠部分地克服因血清而引起的轉(zhuǎn)染抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種核酸轉(zhuǎn)移試劑，其含有至少一個能夠以非-共價鍵方式與核酸結(jié)合的陽離子親水區(qū)域，和至少一個親脂區(qū)域，這些區(qū)域彼此通過一個“間隔臂”連接起來，還含有至少一個二硫橋，其處于還原后引起親脂區(qū)域部分降解的位置，或處于還原后引起轉(zhuǎn)移試劑為對稱時所述轉(zhuǎn)移試劑一分為二的位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于陽離子親水區(qū)域是多胺或多氨基胍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于親脂區(qū)域由至少一個脂肪脂族鏈和一個或多個脂族鏈、一個或多個類固醇衍生物、自然或合成的脂，和/或選擇性地它們的組合構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于親脂區(qū)域由至少兩個脂肪脂族鏈構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于親脂區(qū)域由一個脂肪脂族鏈和一個類固醇衍生物構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于脂肪脂族鏈是10-22碳原子的直鏈或支鏈烴基，其選擇性地為飽和的和/或含氟的。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于類固醇衍生物選自膽甾醇、膽酸和膽甾烯基胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所謂“間隔臂”選自酰胺、氨基甲酸酯、酯、醚基團和/或芳環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于它含有一個或多個二硫橋。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于它含有二硫橋，其位于還原后可引起脂肪脂族鏈喪失的位置。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于它含有二硫橋，其位于還原后可引起親脂區(qū)域中存在的類固醇衍生鏈喪失的位置。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于它選自如下NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)4CH3]-N[(CH2)17CH3]2(Ⅰ)NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys[S-S-(CH2)17CH3]-NH(CH2)17CH3(Ⅱ)NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-(CH2)11CH3]-NH(CH2)17CH3(Ⅲ)NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-(CH2)11CH3]-N[(CH2)17CH3]2(Ⅳ)NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCys-[S-S-膽甾醇]-NH(CH2)17CH3(Ⅴ)[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COCyNH(CH2)17CH3]2(Ⅵ)。
13.組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求1-12中限定的轉(zhuǎn)移試劑和至少一種核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于核酸是脫氧核糖核酸或核糖核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于核酸是化學(xué)方法修飾的核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于核酸是反義核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于核酸含有有治療意義的基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任一項所述的組合物，其特征在于它還含有由一種或多種中性脂類構(gòu)成的添加劑，這些脂選自合成的或天然的、在生理條件下為兩性的或沒有離子電荷的脂類。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于一種或多種中性脂類是膽甾醇或下述類型的具有兩個脂肪鏈的脂類二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、油酰基棕櫚?；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂?；?、二棕櫚?；?、二膽甾烯基-、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、糖基二酰基甘油、腦苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于它還含有一種添加劑，其添加劑是或含有全部或部分地由組蛋白、核仁素和/或魚精蛋白衍生的化合物，或所述的化合物全部或部分地由連續(xù)或非連續(xù)重復(fù)的肽基元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)組成，基元數(shù)是2-10。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于它還結(jié)合有轉(zhuǎn)移試劑的靶向元件。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于所述的靶向元件選自抗細胞表面分子的抗體，膜受體的配位體如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸或任何其他的生長因子、細胞因子或維生素，修飾或未修飾的凝集素，具有RGD基元的蛋白質(zhì)，含有串聯(lián)RGD基元的環(huán)狀或非環(huán)狀的肽，聚賴氨酸肽以及天然或合成的配體肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于它還含有至少一種poloxamer，聚氧乙烯醇、聚氧乙烯壬基苯基醚或具有樹狀芐基聚醚端的聚乙二醇類型的非離子表面活性劑。
24.如根據(jù)權(quán)利要求1-12限定的轉(zhuǎn)移試劑在細胞中轉(zhuǎn)移核酸的用途。
25.向細胞中核酸轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如權(quán)利要求1-12限定的轉(zhuǎn)移試劑接觸，以生成核酸/轉(zhuǎn)移試劑復(fù)合物，如果必要，讓該轉(zhuǎn)染劑與一種或多種用于核酸轉(zhuǎn)染的其他已知的試劑和/或與一種或多種添加劑預(yù)先進行接觸，(2)讓細胞與(1)生成的復(fù)合物接觸。
26.上述權(quán)利要求中限定的組合物的制備方法，其特征在于讓核酸與如權(quán)利要求1-12限定的轉(zhuǎn)移試劑接觸，以生成核酸/轉(zhuǎn)移試劑復(fù)合物，如果必要，讓該轉(zhuǎn)染劑與一種或多種用于核酸轉(zhuǎn)染的其他已知的試劑和/或與一種或多種添加劑預(yù)先進行接觸。
27.疾病的治療方法，該方法包括在體內(nèi)、離體或在體外給予上述權(quán)利要求中限定的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細胞中轉(zhuǎn)移核酸用的新試劑。更具體地,這種試劑的特征在于它含有一個或多個對還原條件敏感的二硫橋。本發(fā)明還涉及含有這樣一種試劑的組合物,以及它們在不同類型細胞中體外、體內(nèi)或離體轉(zhuǎn)移目的核酸的應(yīng)用。
文檔編號C07C323/60GK1289371SQ9980246
公開日2001年3月28日 申請日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月30日
發(fā)明者G·比克, C·杜伯特萊特, B·皮塔德, D·舍爾曼 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司