專利名稱：修飾蛋白的免疫原性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特別是出于治療用途以及診斷測(cè)試用途的尤其用于向人體給藥的蛋白。本發(fā)明特別提供了經(jīng)過修飾以便當(dāng)在體內(nèi)使用時(shí)比未修飾的相應(yīng)物具有更少免疫原性的蛋白。
本發(fā)明特別針對(duì)這樣的一種方法的臨床需求，通過該方法宿主對(duì)所給藥的蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的自然趨勢(shì)基本上下降或者消除?，F(xiàn)有幾個(gè)將蛋白分子給藥提供了治療收益的實(shí)例。但是，特別是當(dāng)需要多劑量的治療蛋白時(shí)，這種收益大大降低，這是因?yàn)槭荏w的免疫系統(tǒng)識(shí)別了新到的治療蛋白并且加速了它們的消除。
現(xiàn)有許多的治療蛋白，由于其在人體內(nèi)的免疫原性而剝奪了它們的治療用途。例如，當(dāng)把鼠的抗體向沒有進(jìn)行免疫抑制的病人給藥時(shí)，大多數(shù)病人通過產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)而對(duì)外源物質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。于是產(chǎn)生了兩個(gè)嚴(yán)重的后果。首先，在治療抗體或免疫綴合物有機(jī)會(huì)與腫瘤結(jié)合并發(fā)揮其功能之前，病人的抗鼠抗體會(huì)結(jié)合并清除這些物質(zhì)。其次，病人會(huì)對(duì)鼠抗體產(chǎn)生過敏敏感性，并且當(dāng)將來的任何時(shí)候暴露給鼠免疫球蛋白時(shí)會(huì)產(chǎn)生過敏性休克的危險(xiǎn)。
已經(jīng)采用了若干種技術(shù)來解決HAMA問題，并從而可以使治療單克隆抗體在人體中使用(參見例如WO-A-8909622，EP-A-0239400，EP-A-0438310，WO-A-9109967)?，F(xiàn)已將這些方法的共同方面引入治療抗體中，一般說來這些抗體都是來源于嚙齒類動(dòng)物的，其序列的顯著片段與在人抗體蛋白中存在的是相同的。這種改變通常還與在被認(rèn)為是對(duì)維持抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)至關(guān)重要的位置處特殊的單個(gè)氨基酸殘基的改變相結(jié)合。對(duì)抗體而言，該方法可能是由于在不同種的抗體分子之間非常高度的結(jié)構(gòu)(和功能)的保守性所致。但是對(duì)潛在的治療蛋白而言，當(dāng)在宿主物種(例如人)中不可能存在著所述治療蛋白的結(jié)構(gòu)同系物時(shí)，該方法就不可以采用。而且，這些方法已經(jīng)假定通常的人序列的引入將會(huì)使重新構(gòu)造的抗體具有非免疫原性。但是已知為了觸發(fā)T細(xì)胞的活化，在細(xì)胞內(nèi)部蛋白降解的過程中可以釋放出某些短肽序列(“T細(xì)胞表位”)，隨后可以由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子呈遞這些序列。對(duì)于由MHC-Ⅱ類呈遞的肽來說，這種T細(xì)胞的活化然后可以通過直接刺激B細(xì)胞產(chǎn)生這類抗體而產(chǎn)生抗體的應(yīng)答。以前的方法中沒有一種方法提出在最終的治療分子中消除或避免這類表位來作為降低或消除所述抗體對(duì)蛋白產(chǎn)生應(yīng)答的方式。以前的方法中也沒有一種方法考慮到消除由MHC-Ⅰ類呈遞的肽，它可以觸發(fā)導(dǎo)致殺死細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的應(yīng)答。這樣殺死細(xì)胞導(dǎo)致包括蛋白在內(nèi)的細(xì)胞成分的釋放，其本身又可以激活在蛋白加工和MHC呈遞中具有高度活性的特有細(xì)胞，并且由于這種激活還會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的釋放。結(jié)果，可以產(chǎn)生這樣的一種炎癥環(huán)境，它促進(jìn)了更為活躍地吸收和加工用于治療用途的蛋白，從而有助于對(duì)所述蛋白產(chǎn)生抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)。
以前已經(jīng)公開了從蛋白中除去T細(xì)胞表位(參見WO-A-9852976)，其中將這類潛在的T細(xì)胞表位定義為在蛋白序列中具有與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合能力的任何的肽。通過任何計(jì)算的或物理的方法來測(cè)量這類潛在的表位以確定MHC的結(jié)合。術(shù)語“T細(xì)胞表位”的含義為一種被T細(xì)胞受體所識(shí)別并且至少可以原則上導(dǎo)致這些T細(xì)胞活化的表位。但是通常了解到的是發(fā)現(xiàn)與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的某些肽可以保留在蛋白序列中，這是因?yàn)檫@類肽在生物體中被識(shí)別為是“自身的”，其中是將最終的蛋白向所述生物體內(nèi)給藥的。
實(shí)際上，引入到自身生物體中的可溶蛋白有時(shí)的確觸發(fā)免疫應(yīng)答，這導(dǎo)致形成了與所述可溶蛋白結(jié)合的宿主的抗體。一個(gè)例子為α2干擾素，盡管事實(shí)上該蛋白是內(nèi)源產(chǎn)生的，但仍有一定比例的病人對(duì)α2干擾素產(chǎn)生抗體。
本發(fā)明基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在自身蛋白中的MHC-結(jié)合肽可以在活的生物體內(nèi)觸發(fā)對(duì)那些所述蛋白的免疫應(yīng)答，即使當(dāng)特異性蛋白是內(nèi)源產(chǎn)生的也是如此。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)的可能的解釋為這類給藥蛋白的劑量比正常提供的可以活化T細(xì)胞的MHC-肽的生成要高出許多。另一方面，這類給藥蛋白所送入的生理環(huán)境為一種有利于以比通常遇到的(例如在炎癥狀況下)水平要高的水平有效地進(jìn)行抗原加工和肽-MHC生成的環(huán)境。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種使蛋白或蛋白的一部分對(duì)給定的物種具有非免疫原性或更少的免疫原性的方法，該方法包括(a)測(cè)定所述蛋白的至少部分氨基酸序列；(b)在所述氨基酸序列中鑒定出一個(gè)或多個(gè)潛在的針對(duì)T細(xì)胞的表位(“T細(xì)胞表位”)，其見于給定物種的內(nèi)源蛋白中；以及(c)修飾所述的氨基酸序列以便去除在步驟(b)中鑒定出的T細(xì)胞表位中的至少一個(gè)，從而當(dāng)暴露給給定物種的免疫系統(tǒng)時(shí)降低所述蛋白或其部分的免疫原性。
給定的物種通常為人類。在步驟(c)中，可以消除掉一個(gè)或多個(gè)實(shí)際的表位或潛在的表位。
因此，本發(fā)明提供了一種用于創(chuàng)制蛋白的改進(jìn)的方法，該蛋白觸發(fā)減少的或者不觸發(fā)免疫應(yīng)答，從而修飾了也在自身生物體的內(nèi)源蛋白中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)MHC結(jié)合肽以便減少或消除與MHC分子的結(jié)合。于是實(shí)際上，沒有作出有關(guān)生物體可以耐受肽的假設(shè)(除非可以得到表明耐受是原位存在的數(shù)據(jù))?？傊?，本發(fā)明涉及創(chuàng)制在活的生物體內(nèi)具有減少的或不具有免疫原性的蛋白分子，其中從所述的蛋白分子中去除了一個(gè)或多個(gè)與MHC分子結(jié)合的肽。因此，本發(fā)明是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)作出的改進(jìn)，現(xiàn)有技術(shù)是在假定生物體對(duì)自身蛋白或肽序列耐受的情況下，僅僅集中在從蛋白中去除潛在的T細(xì)胞表位。具體地講，本發(fā)明包括一系列人和非人的蛋白，其中所述的蛋白通過修飾序列中的一個(gè)或多個(gè)MHC結(jié)合肽而得以修飾。這類MHC結(jié)合肽可以包括與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的肽和／或與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的肽。
本發(fā)明如上所述的這一方面優(yōu)選為用這類肽對(duì)生物體獨(dú)立地免疫接種以誘導(dǎo)耐受性的另一種策略或者為將抵制結(jié)合或吸收的所述蛋白的類似物或片段向細(xì)胞(尤其是抗原呈遞細(xì)胞)給藥的另一種方法(例如通過消除所述蛋白中的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn))。以這種方式使生物體對(duì)肽產(chǎn)生耐受性(例如在將整個(gè)蛋白給藥之前使用從同源蛋白中鑒定出的MHC結(jié)合肽，它可以用來誘導(dǎo)宿主中的耐受性)將需要兩種治療分子，一種用于發(fā)揮主要的蛋白功能，而另一種則用于誘導(dǎo)耐受性，從調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)來看它將得不到支持。
在本發(fā)明中可以使用鑒定(其中還包括術(shù)語“預(yù)測(cè)”)一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位的任何方法?？山邮艿姆椒梢允怯?jì)算的或物理的方法，并且包括測(cè)量MHC-肽復(fù)合體與T細(xì)胞受體的結(jié)合、測(cè)試在表達(dá)人MHC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠中潛在的T細(xì)胞表位、測(cè)試在用人的抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞代替其內(nèi)源細(xì)胞而重組的小鼠中潛在的T細(xì)胞表位、以及測(cè)試通過采用同源的抗原呈遞細(xì)胞在MHC分子上呈遞肽在體外對(duì)T細(xì)胞的刺激的潛在的T細(xì)胞表位。
除了鑒定氨基酸序列中在給定物種的內(nèi)源蛋白中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位外，本發(fā)明的方法另外可以涉及并且通常會(huì)涉及鑒定并消除在給定物種的內(nèi)源蛋白中未被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位，這是因?yàn)檫@類表位甚至更可能具有免疫原性。
本發(fā)明基于開發(fā)治療蛋白的一種新的觀念。事先已經(jīng)認(rèn)識(shí)到與外源T細(xì)胞依賴型蛋白一起，輔助T細(xì)胞表位對(duì)于對(duì)自身蛋白產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答來說是重要的。這類T細(xì)胞表位通過釋放出肽的蛋白的內(nèi)部加工起作用，其中所述的肽與MHC-Ⅱ類分子復(fù)合、然后在合適細(xì)胞的表面上呈遞，從而可能與位于T細(xì)胞上的受體結(jié)合。但是，非常難于預(yù)測(cè)蛋白中的肽將被適當(dāng)?shù)丶庸亩梢园l(fā)生MHC的結(jié)合，并且這也是許多加工過的肽不與MHC-Ⅱ類分子的所有同種異型變體結(jié)合的一個(gè)原因(MHC限制)。此外，在任何給定的活的生物體中，難于預(yù)測(cè)在MHC-Ⅱ類上呈遞的給定肽是否實(shí)際上觸發(fā)T細(xì)胞的應(yīng)答，這是因?yàn)門細(xì)胞可能已經(jīng)對(duì)這類表位產(chǎn)生了耐受性或者可能不具有T細(xì)胞受體的所有組成成分從而不與MHC-Ⅱ類-肽的復(fù)合體結(jié)合。由于這些復(fù)雜的因素，以前開發(fā)具有減少的或者缺乏免疫原性的蛋白是不現(xiàn)實(shí)的，這是因?yàn)樵陬A(yù)測(cè)實(shí)際的T細(xì)胞表位方面存在一定的難度。本發(fā)明主要采取了通過去除潛在的而非實(shí)際的T細(xì)胞表位(通常通過與MHC分子的結(jié)合來限定)來創(chuàng)制改進(jìn)的治療蛋白的新途徑，從而除了那些具有免疫原性的肽之外，還可以改變實(shí)際上沒有免疫原性的所述分子中的某些肽。對(duì)治療分子來說，在保留所述蛋白活性的同時(shí)，優(yōu)選除去所有潛在的T細(xì)胞表位。優(yōu)選地，這涉及明智地選擇能夠除去T細(xì)胞表位的氨基酸的取代，并且通常涉及測(cè)試一系列具有不同氨基酸取代的變體分子。
并非必須消除在內(nèi)源蛋白中發(fā)現(xiàn)的所有鑒定出的潛在T細(xì)胞表位。例如，一般說來對(duì)自身循環(huán)蛋白(如免疫球蛋白和其它的血清蛋白、如血清白蛋白)并不產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此有時(shí)可以忽略例如在給定物種(所述的物種通常為人)的種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列中發(fā)現(xiàn)的潛在T細(xì)胞表位。但是，可以將被認(rèn)為通常不能為免疫系統(tǒng)利用以獲得耐受性的表位鑒定為根據(jù)本發(fā)明的方法用于消除的潛在表位。這類例子包括含有胞內(nèi)蛋白(如核內(nèi)蛋白和整合膜蛋白)的那些表位的表位。
因此，本發(fā)明提供了已經(jīng)加以改變以降低其免疫原性的蛋白以及一種改變這類蛋白以降低其免疫原性的通用方法。本發(fā)明主要的原理為通過鑒定出潛在的T細(xì)胞表位并且為了消除這類潛在的表位在所述蛋白中其隨后的改變來改變蛋白。任選地，如果例如借助病人的抗血清可以鑒定出被宿主抗體識(shí)別的表位(“B細(xì)胞表位”)的話或者如果可以在不喪失非自身分子所有的所需活性的情況下將非自身蛋白中的表面殘基改變成對(duì)宿主生物體而言是內(nèi)源的相關(guān)自身蛋白的那些表面殘基的話，那么也可以除去這些表位。
在消除了一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位后，可以測(cè)試蛋白的所需活性。它可能保留了其全部的活性，或者它可能保留了一定比例的最初活性以便使之足以有用。在一些情況下，或者可以有利地或者至少以一種可以接受的方式來改變其活性?？梢詠G棄掉在修飾后完全缺乏有用功能的蛋白。
本發(fā)明的蛋白包括那些在人類中具有潛在的臨床用途或者在動(dòng)物中具有獸醫(yī)用途的蛋白，尤其是當(dāng)所述的用途涉及將蛋白多次給藥的情況。它們可以是非自身的或是自身的。本發(fā)明的蛋白包括具有有益的治療效果的酶活性的蛋白、用于在活的生物體內(nèi)將非活性藥物轉(zhuǎn)化為活性藥物的蛋白、用于接種疫苗從而某些免疫原性表位是不想要的蛋白、在活的生物體內(nèi)起到其它分子的載體作用的蛋白以及為了改變其它分子的生物分布與活的生物體內(nèi)的或者在活的生物體內(nèi)引入的其它分子結(jié)合的蛋白。其中，對(duì)在人體內(nèi)使用具有潛在益處的非自身蛋白的例子如下溶栓蛋白鏈激酶和葡萄球菌激酶；前體藥物激活酶，如天冬酰胺酶和羧肽酶G2；植物、真菌和細(xì)菌來源的毒素，如蓖麻毒蛋白、皂角苷、美洲商陸抗病毒蛋白、槲寄生凝集素、霍亂毒素、百日咳毒素、白喉毒素；細(xì)菌磷脂酶C(例如PE33，PE35，PE37，PE38，PE40)；核糖毒素，如α-八疊球菌(sarcin)、clavin、絲林霉素、局限曲菌素以及bryodin-1和bryodin-2。具有經(jīng)證實(shí)的和潛在的治療益處的其它突出的非自身分子包括鏈霉抗生物素蛋白、眼鏡蛇毒因子、胰島素、膠原、非自身抗體、非自身MHC分子和非自身T細(xì)胞受體分子。具有證實(shí)的和潛在的治療價(jià)值的自身蛋白包括IL-2、α和β干擾素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、組織纖溶酶原激活物(t-PA)、胰島素、因子Ⅷ、因子Ⅸ、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、垂體生長(zhǎng)激素和巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子(MGDF)以及通過重組方法生產(chǎn)的這些蛋白的衍生物。這類蛋白的其它例子包括來源于自身或非自身蛋白的重組分子或者由所述蛋白的單結(jié)構(gòu)域或多結(jié)構(gòu)域組成的重組分子、以及進(jìn)行了人工改造以改變或改進(jìn)功能或來源于上述任一分子之蛋白序列的重組蛋白。
在本發(fā)明的通用方法中，一種典型的方案包括下列步驟Ⅰ．測(cè)定蛋白或其部分(如果僅僅需要修飾一部分的話)的氨基酸序列；Ⅱ．通過任何方法鑒定所述蛋白氨基酸序列中潛在的T細(xì)胞表位，所述方法包括測(cè)定肽與MHC分子的結(jié)合、測(cè)定肽MHC復(fù)合體與來自接受所述治療蛋白的物種的T細(xì)胞受體的結(jié)合、采用帶有接受所述治療蛋白的物種之MHC分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物測(cè)試所述的蛋白或其肽部分、或者采用以來自接受所述治療蛋白的物種之免疫系統(tǒng)細(xì)胞重建的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試；Ⅲ．通過遺傳工程或其它用于產(chǎn)生修飾的蛋白的方法，改變所述的蛋白以去除一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位并產(chǎn)生用于測(cè)試的這樣一種改變的蛋白；Ⅳ．(任選)在步驟Ⅲ中，改變所述的蛋白以去除一個(gè)或多個(gè)潛在的B細(xì)胞表位；Ⅴ．為了鑒定已保留了其所有或部分的所需活性、但卻已喪失了一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的修飾的蛋白，測(cè)試除去了一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位(和任選的B細(xì)胞表位)的改變的蛋白。
將本文中潛在的T細(xì)胞表位定義為特異性的肽序列，該序列或者以適當(dāng)?shù)男逝cMHC-Ⅱ類分子(或其在非人的物種中的等同物)結(jié)合，或者以肽MHC復(fù)合體的形式與來自接受所述治療蛋白的物種的T細(xì)胞受體強(qiáng)烈地結(jié)合，或者從以前或其它的研究顯示出通過在MHC-Ⅱ類上的呈遞來刺激T細(xì)胞的能力。本發(fā)明的方法認(rèn)識(shí)到對(duì)外源蛋白產(chǎn)生有效的T細(xì)胞依賴型免疫應(yīng)答需要激活免疫系統(tǒng)的細(xì)胞臂。這樣的一種應(yīng)答需要通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)攝入治療(外源)蛋白。一旦在這類細(xì)胞內(nèi)部時(shí)，所述的蛋白便被加工，而且所述蛋白的片段與MHC-Ⅱ類分子形成復(fù)合體并且在細(xì)胞表面上呈遞出來。如果通過來自T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的結(jié)合識(shí)別這樣的一種復(fù)合體，在某些情況下這類細(xì)胞可以被激活以產(chǎn)生刺激細(xì)胞因子。細(xì)胞因子將會(huì)引起B(yǎng)細(xì)胞分化成完全抗體產(chǎn)生細(xì)胞。另外，這樣的T細(xì)胞應(yīng)答還會(huì)介導(dǎo)對(duì)病人的其它有害的作用，比如發(fā)炎和可能的過敏反應(yīng)。
應(yīng)理解并非所有的肽序列都被送遞至正確的MHC-Ⅱ類細(xì)胞區(qū)室內(nèi)進(jìn)行MHC-Ⅱ類的結(jié)合或者從較大的細(xì)胞蛋白中適當(dāng)?shù)蒯尫懦鰜磉M(jìn)行隨后的MHC-Ⅱ類的結(jié)合。另外應(yīng)理解甚至由位于APC表面上的MHC-Ⅱ類呈遞的這類肽都可能不會(huì)引起T細(xì)胞的應(yīng)答，理由包括缺乏合適的T細(xì)胞的特異性、免疫系統(tǒng)對(duì)特殊肽序列的耐受性或者M(jìn)HC-肽復(fù)合體對(duì)T細(xì)胞受體低的親和力。
本發(fā)明提供了從治療蛋白中除去人(或其它給定物種)的潛在的T細(xì)胞表位，從而可以通過任何適當(dāng)?shù)姆绞椒治鲋委煹鞍椎囊患?jí)序列中MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在。例如，可以與MHC-結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，比如通過檢索萬維網(wǎng)中網(wǎng)址為http／／wehih．wehi．edu．a(chǎn)u／mhcpep(以前為wehil．wehi．edu．a(chǎn)u或wehi．wehi．edu．a(chǎn)u)的“基元”數(shù)據(jù)庫。另一方面，采用計(jì)算穿線法，比如那些由Altuvia等人設(shè)計(jì)的方法(《分子生物學(xué)雜志》249244-250(1995))，可以鑒定出MHC-Ⅱ類結(jié)合的肽?？梢圆捎妙愃频姆椒▉龛b定和除去與MHC-Ⅰ類結(jié)合的表位。
現(xiàn)已鑒定了潛在的給定物種(例如人)的T細(xì)胞表位，然后當(dāng)需要消除T細(xì)胞表位時(shí)，通過改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸來消除這些表位，這通常涉及改變T細(xì)胞表位自身當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。這可以涉及改變?cè)谒龅鞍滓患?jí)結(jié)構(gòu)上與所述表位相鄰的氨基酸或者改變?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上并不相鄰而在所述分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)上相鄰的氨基酸。通常設(shè)計(jì)的改變是氨基酸的取代，但在某些情況下氨基酸的缺失或添加也是合適的。在一些情況下，參照同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可以在治療蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的任何特殊的位置上選擇適當(dāng)?shù)陌被岬娜〈?。特殊的情況為同源基因的所有組成成分都存在(這例如與免疫球蛋白一樣)，或者治療蛋白的單一同源基因存在(這與實(shí)施例1中詳細(xì)描述的眼鏡蛇毒因子蛋白和人補(bǔ)體因子C3的情況相同)。但在其它的情況下，可能沒有治療蛋白的同源蛋白，這與一些潛在的治療劑的情況一樣(比如溶栓劑葡萄球菌激酶)。在這種情況下，可以在類似的大小和／或電荷的基礎(chǔ)上選擇氨基酸，或者更優(yōu)選地并且與計(jì)算機(jī)(in silico)制作蛋白質(zhì)模型技術(shù)結(jié)合或者參照所述的技術(shù)根據(jù)已有的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來選擇氨基酸。在一些情況下，可以進(jìn)行氨基酸的取代以防止蛋白的水解切割并從而抑制肽與MHC-Ⅱ類的結(jié)合。蛋白酶切割位點(diǎn)的例子包括那些由van Noort & van der Drift報(bào)道的位點(diǎn)(《生物化學(xué)雜志》26414159-14164(1989))以及由van Noort等人報(bào)道的位點(diǎn)(《歐洲免疫學(xué)雜志》21 1989-1996(1991))。已經(jīng)公開了防止蛋白酶消化的氨基酸的例子，例如Kropshofer等人在《免疫學(xué)雜志》151 4732-4742(1993)中鑒定出來的氨基酸。
在本發(fā)明的方法中，通常生產(chǎn)出許多改變的蛋白的變體并且測(cè)試保留的所需活性。若理想的情況是最大程度地從蛋白中除去潛在的T細(xì)胞表位，通常創(chuàng)制出一系列的變體，其中包括一些在分子中殘留著潛在的T細(xì)胞表位的變體。據(jù)認(rèn)為在某些蛋白分子中難于從根本上改變分子和保留全部的活性，因此明智地使用給變體制作分子模型并測(cè)試最大數(shù)量的變體是人們所希望的。對(duì)于制作分子模型而言，以晶體結(jié)構(gòu)或者由同源性或蛋白折疊預(yù)測(cè)建立的模型為起點(diǎn)，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的可商購的軟件包來制作蛋白結(jié)構(gòu)的模型。有關(guān)所述蛋白的某些部分的信息(與賦予所述分子活性有關(guān))將會(huì)協(xié)助制作變體的模型，以便能夠最好地選出改變的氨基酸，其中在保留活性的同時(shí)除去了潛在的T細(xì)胞表位(或任選的B細(xì)胞表位)。
在本發(fā)明的方法中(其中生產(chǎn)出許多改變的蛋白的變體并且測(cè)試了保留的所需活性)，理想的是擁有一種用于篩選大量變體的高效的方法。這樣的方法包括在諸如細(xì)菌這樣的細(xì)胞中表達(dá)基因變體并伴隨著迅速分離所述蛋白(例如采用抗所述蛋白保守區(qū)的抗體或者通過包含在蛋白序列中的蛋白純化標(biāo)記物)的體內(nèi)法。作為一種可供選擇的方法，在一些情況下可以使用諸如體外轉(zhuǎn)錄和翻譯這樣的體外法。當(dāng)?shù)鞍着c另一種分子結(jié)合時(shí)，為了挑選出保留了結(jié)合活性的變體，可以使用諸如噬菌體展示和核糖體展示這樣的展示法。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，通過重組DNA技術(shù)可以進(jìn)行具體的氨基酸的改變，從而采用已確定的方法通過重組宿主的表達(dá)可以制備出最終的分子。但是，在實(shí)施本發(fā)明時(shí)并不排除采用蛋白質(zhì)化學(xué)或任何其它分子改變的方法。雖然本發(fā)明提供了一種用于從蛋白分子中除去潛在的T細(xì)胞表位(和任選的B細(xì)胞表位)的方法，但該方法并不排除測(cè)試本發(fā)明中產(chǎn)生的變體分子實(shí)際的T細(xì)胞表位的活性，其中包括采用帶有接受所述治療蛋白的物種之MHC分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物測(cè)試所述的蛋白或其肽部分，或者采用以來自接受了所述治療蛋白的物種之免疫系統(tǒng)細(xì)胞重建的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試。
當(dāng)這樣的方法仍不是常規(guī)的方法時(shí)，可以進(jìn)行體外T細(xì)胞測(cè)定，從而所述的蛋白可以被加工并且通過針對(duì)同源T細(xì)胞的合適的抗原呈遞細(xì)胞(APC)在MHC-Ⅱ類上呈遞出來。通過簡(jiǎn)單的增殖測(cè)量(尤其是如果已經(jīng)輻射了APCs或者已經(jīng)以其它方式進(jìn)行了處理以防止增殖的話)或者通過測(cè)量特異性細(xì)胞因子的釋放可以測(cè)出T細(xì)胞的應(yīng)答。為了解釋不同的MHC-Ⅱ類的同種異型，通常需要進(jìn)行一系列的體內(nèi)測(cè)定以便在很寬的范圍內(nèi)測(cè)試T細(xì)胞表位。另一方面，可以使用以人(或所需物種)的MHC-Ⅱ類分子裝配的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來測(cè)試T細(xì)胞表位，尤其是其中已經(jīng)除去了宿主MHC-Ⅱ類的所有組成成分的情況下以及尤其是在APC／T細(xì)胞的相互作用中一種或多種其它宿主的輔助分子也已被諸如T細(xì)胞上的CD4這樣的人(或所需的物種)的分子置換的情況下。
再一方面，本發(fā)明提供了由如上所述的方法得到的分子。這類分子對(duì)于治療或預(yù)防疾病或病癥來說可能是有用的。本發(fā)明還延伸到這類分子在體內(nèi)和體外診斷中的用途以及用于人或獸醫(yī)的用途。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征是對(duì)彼此方面而言在細(xì)節(jié)上作必要的修改。
通過下面的實(shí)施例來說明、但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例參照了下列附圖

圖1顯示出成熟的眼鏡蛇毒因子的蛋白序列；圖2顯示出改變的眼鏡蛇毒因子鏈的蛋白序列；圖3顯示出改變的眼鏡蛇毒因子鏈的蛋白序列；圖4顯示出改變的眼鏡蛇毒因子鏈的蛋白序列；圖5顯示出來自似馬鏈球菌的鏈激酶的蛋白序列；圖6顯示出改變的鏈激酶分子的蛋白序列；圖7顯示出成熟的葡萄球菌激酶的蛋白序列；圖8顯示出改變的葡萄球菌激酶分子的蛋白序列；圖9顯示出野生型bryodin 1的蛋白序列；
圖10顯示出改變的bryodin 1分子的蛋白序列；圖11顯示出成熟的人干擾素2的蛋白序列；并且圖12顯示出改變的人干擾素2分子的蛋白序列。
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，分析了眼鏡蛇毒因子(CVF)蛋白中潛在的MHC結(jié)合基元的存在并且公開了一種用于從所述分子中除去許多所述基元的方法。
CVF是眼鏡蛇毒中無毒性的補(bǔ)體-激活糖蛋白。成熟的CVF蛋白由α，β和γ這三個(gè)多肽鏈組成，它是由分子量約為150kDa的前原蛋白經(jīng)翻譯后加工產(chǎn)生的(Fritzinger D．C．等人《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》9112775-12779(1994))。α和β鏈都通過單一的二硫鍵與γ鏈相連。另外，α鏈和γ鏈兩者都具有單一的鏈內(nèi)二硫鍵，而β鏈具有復(fù)雜排布的六個(gè)進(jìn)一步的內(nèi)部二硫鍵。成熟蛋白具有四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，其中僅僅使用了三個(gè)這樣的位點(diǎn)(Vogel，C．W & Muller-Eberhard《免疫學(xué)雜志》18 125-133(1984))。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，減少了免疫原性或改變了形式的治療蛋白是通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的。對(duì)本實(shí)施例來說，理解到單是重組生產(chǎn)成熟的CVF蛋白的權(quán)宜之計(jì)就可能導(dǎo)致所述蛋白免疫原性極大的減少。這一斷言起源于這樣的知識(shí)，即由將從眼鏡蛇的毒液純化的CVF給藥而產(chǎn)生的免疫原性的程度是由抗體對(duì)在哺乳動(dòng)物蛋白中未遇到的特殊模式的糖基化作用的應(yīng)答產(chǎn)生的(Gowda，D．C等人《免疫學(xué)雜志》152 2977-2986(1994))。另外理解到由CVF的重組生產(chǎn)產(chǎn)生的(例如在哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)細(xì)胞系統(tǒng)中)去糖基化的并且還有唾液酸化的(sialylated)CVF與天然的成熟CVF具有相等功能的活性(Gowda，D．C等人(1994)出處同上)。
在人體內(nèi)，CVF觸發(fā)補(bǔ)體激活的替代(備解素)途徑。CVF與因子B形成雙分子復(fù)合體，其中因子B被因子D切割成Bb，而Bb仍然與CVF結(jié)合以生成C3／C5轉(zhuǎn)化酶CVF，Bb。該復(fù)合體在功能上和結(jié)構(gòu)上都與在激活替代途徑的過程中生成的人C3／C5轉(zhuǎn)化酶類似。CVF的臨床重要性在于與天然的C3／C5轉(zhuǎn)化酶相比CVF，Bb復(fù)合體的穩(wěn)定性相對(duì)要高(與90秒的t1／2相比，其t1／2為7小時(shí))，特別是CVF，Bb不能被破壞的能力并因而由因子H和I進(jìn)行減量調(diào)節(jié)(Gowda，D．C等人(1994)出處同上)。因此，CVF給藥最終的結(jié)果是通過連續(xù)有效的和不加以控制的補(bǔ)體激活導(dǎo)致人血清中補(bǔ)體的減少。
已經(jīng)把這種特性加以利用作為體內(nèi)和體外去補(bǔ)體作用的研究工具(Cochrane C．G等人《免疫學(xué)雜志》105 55(1970))，并且也已經(jīng)利用這種特性以與腫瘤靶向單克隆抗體形成綴合物的方式來選擇性地清除腫瘤細(xì)胞(Vogel，C．-W．& Muller-Eberhard H．J．《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》78 7707(1981))。作為一種潛在的治療劑，為了減少經(jīng)歷了器官異體移植的病人血漿中的補(bǔ)體或者減少針對(duì)癌癥病人體內(nèi)補(bǔ)體的定向激活在第二代抗體綴合物構(gòu)建中的補(bǔ)體，可以得到非免疫原性的CVF將具有非常重要的意義。
用于鑒定眼鏡蛇毒因子中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的方法從GenBank數(shù)據(jù)庫中鑒定出CVF的序列。自始至終使用登記號(hào)為U09969的序列。獨(dú)立地鑒定和分析成熟的α，β和γ鏈的蛋白序列(圖1)中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在。通過與位于萬維網(wǎng)中網(wǎng)址為http／／wehih．wehi．edu．a(chǎn)u／mhcpep／的MHC結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較進(jìn)行分析。
對(duì)α鏈的“檢索”結(jié)果表明存在著638個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出525個(gè)配對(duì)序列。在對(duì)自身循環(huán)蛋白(如免疫球蛋白)通常并不產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)上，不再考慮這些表位。這意味著在免疫球蛋白(以及的確是大多數(shù)的人的蛋白)的結(jié)構(gòu)中存在著對(duì)潛在T細(xì)胞表位的免疫耐受性。由非自身蛋白(如CVF)呈遞的與免疫球蛋白中存在的基元相同或類似的表位也可能被耐受并且實(shí)際上可以在去免疫的過程中保留下來。
在減去人免疫球蛋白的種系基元后，獨(dú)立地分析α鏈中剩余的113個(gè)潛在表位與非免疫球蛋白序列的相似性。實(shí)際上，在人的表達(dá)蛋白的共有序列檢索中采用每個(gè)潛在表位的預(yù)測(cè)的錨定殘基。使用可商購的軟件(DNAstar Madison，WI，美國(guó))查詢SwissProt和GenBank翻譯序列數(shù)據(jù)庫。不再考慮在已知的人循環(huán)蛋白中鑒定出的表位，從而使其在CVF的α鏈中保持不變。由CVF α鏈中第332-338位上(從成熟α鏈的第一個(gè)氨基酸開始編號(hào))的序列FKPGMPY給出了這樣一個(gè)排除的潛在表位的例子。該序列代表針對(duì)HLA-DRQB1*0301的預(yù)測(cè)的共有結(jié)合基元，其中錨定殘基下加有下劃線。采用共有序列FxxxMxY進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫檢索在對(duì)應(yīng)于人血清生物素酶(SwissProt的登記號(hào)為#A54362)的SwissProt數(shù)據(jù)庫的人蛋白亞型中僅僅鑒定出單一的記錄。由CVFα鏈中第501-509位上的序列YYQVGNNEI提供了這樣一種表位的例子，其中發(fā)現(xiàn)該表位與被認(rèn)為是在普通循環(huán)之中的人的蛋白不匹配。該序列代表針對(duì)HLA-DRB1*0101呈遞的潛在表位。共有序列的檢索僅僅鑒定出含有該基元的四種人的蛋白，其中有三種是分化組織(如大腦)的核內(nèi)蛋白，而第四種為整合膜蛋白。可以將這些蛋白視為通常不能為免疫系統(tǒng)利用以獲得耐受性，因而根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定其為用于消除的潛在表位。類似地，在α鏈中鑒定出其它潛在的HLA-DR1結(jié)合基元。其中使用了第81-89位上的肽序列YVVVOVTGP。該基元在相同的數(shù)據(jù)庫組中鑒定出單一的人核內(nèi)蛋白DNA聚合酶α(GenBank的登記號(hào)為# M64481)，因而也通過本發(fā)明的方法進(jìn)行鑒定以用于修飾。在這些過程之后，認(rèn)為α鏈中共有15個(gè)潛在的表位要通過氨基酸的取代除去。
對(duì)β鏈的“檢索”結(jié)果表明存在著366個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出281個(gè)配對(duì)序列并且不再予以考慮。在采用人血清蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行第二輪的減除后(如上所述)，認(rèn)為有18個(gè)潛在的表位要除去。
對(duì)γ鏈的“檢索”結(jié)果表明存在著267個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出219個(gè)配對(duì)序列并且不再予以考慮。在采用人血清蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行第二輪的減除后(如上所述)，認(rèn)為有9個(gè)潛在的表位要除去。
這些過程最終的結(jié)果是在CVF分子中鑒定出了那些應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改變以消除潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的殘基。挑選出預(yù)測(cè)的結(jié)合基元中單個(gè)的氨基酸以便改變。為了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情況下在任何給定的位點(diǎn)處都選擇保守的氨基酸取代。在許多情況下，參照已出版的人補(bǔ)體因子3(C3)的序列(GenBank的登記號(hào)為#K02765)取代單個(gè)的氨基酸、甚至短的肽鏈(＜5個(gè)連續(xù)的殘基)，其中所述出版的序列呈現(xiàn)出與CVF之間具有高度同源性的區(qū)域，其中包括同一性的區(qū)域。在兩個(gè)實(shí)例中，通過插入其它的氨基酸從β鏈中消除了潛在的表位。參照人C3蛋白選出氨基酸。
匯集了改變的CVF的α鏈、β鏈和γ鏈的序列(圖2-4)，并且如前所述通過數(shù)據(jù)庫比較進(jìn)一步進(jìn)行分析以驗(yàn)證成功地消除了潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。
用于構(gòu)建改變的CVF分子的方法使 用PCR引 物 CVF1for；5’ATAAGAATGCGGCCGCATGGAGAGGATGGCTCTCT 和 CVF1rev；5’ATAAGAATGCGGCCGCTATCATTGATTCTTCTGAAC，由λgt11眼鏡蛇毒腺cDNA文庫(Fritzinger DC等人，出處同上)擴(kuò)增出4985bp的片段。使用對(duì)長(zhǎng)距離PCR優(yōu)化的高度保真的聚合酶混合物(高級(jí)PCR試劑盒，Clontech，Basingstoke，英國(guó))以及由供應(yīng)商建議的條件，在總文庫DNA制劑上進(jìn)行PCR。采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(Sambrook JFritsch E．F．& Maniatis T．編輯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約州，美國(guó)(1989))，將PCR產(chǎn)物NotI限制片段的形式克隆到pcDNA3．1(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。使用可商購的試劑系統(tǒng)以及由供應(yīng)商提供的說明(Amersham，Little Chalfont，英國(guó))證實(shí)該基因序列與數(shù)據(jù)庫的記錄是相同的。使用合成的寡核苷酸和“快速-改變”方法以及來自Stratagene(劍橋，英國(guó))的試劑進(jìn)行定點(diǎn)誘變。通過測(cè)序驗(yàn)證突變(去免疫)型式的基因。通過電穿孔將突變的CVF基因轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。采用G418選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體，并采用C消耗測(cè)定(Gowda D．C等人(1994)出處同上；Cochrane C．G．等人(1970)出處同上)選出分泌活性CVF的克隆。擴(kuò)張表達(dá)克隆，并采用連續(xù)的柱層析和如上所述的方法(Vogel C-W等人《免疫學(xué)方法雜志》73203-220(1984))從培養(yǎng)上清液中純化重組蛋白。
實(shí)施例2本發(fā)明詳細(xì)地描述了一種方法，通過該方法可以鑒定出非自身蛋白中潛在的具有免疫原性的表位，而且本發(fā)明提供了一種方法，通過該方法可以消除這類表位。據(jù)理解現(xiàn)有許多經(jīng)證實(shí)的治療蛋白，由于它們?cè)谌水?dāng)中的免疫原性，因而剝奪了它們的治療用途。在本實(shí)施例中，分析了治療蛋白鏈激酶中潛在的MHC結(jié)合基元的存在并且公開了一種用于從該分子中除去許多所述基元的方法。
鏈激酶(SK)是一種分子量約為47kDa的單鏈蛋白，它是由β-溶血鏈球菌的某些菌株產(chǎn)生的(HuangT．T．等人《分子生物學(xué)》2 197-205(1989))。該蛋白本身不具有酶活性，但是由于它能夠有效地結(jié)合人的纖溶酶原、增強(qiáng)對(duì)纖溶酶的活化并從而促進(jìn)血塊中血纖蛋白絲的溶解，因此具有相當(dāng)?shù)呐R床重要性。幾項(xiàng)研究已經(jīng)表明SK在治療冠狀動(dòng)脈血栓形成、改善存活能力(ISIS-2合作小組《柳葉刀雜志》2 349-360(1988))以及在心肌梗死后保持左心室功能(ISAM研究小組《英國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)雜志》314 1465-1471(1986)；Kennedy J．W．等人《循環(huán)》77345-352(1988))方面是一種有效的溶栓劑。盡管SK具有毫無疑問的治療價(jià)值，但是由于它在人當(dāng)中具有免疫原性，因此該蛋白的非自身來源是不利的。在病人中產(chǎn)生中和抗體通常將該蛋白限制到單一的用途。
用于鑒定鏈激酶中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的方法從GenBank數(shù)據(jù)庫中鑒定出鏈激酶的序列。自始至終使用登記號(hào)為S46536的序列(圖5)。通過與位于萬維網(wǎng)中網(wǎng)址為http／／wehih．wehi．edu．a(chǎn)u／mhcpep／的MHC結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較，分析所述序列中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在。
“檢索”過程的結(jié)果表明存在著395個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出283個(gè)配對(duì)序列。在對(duì)自身循環(huán)蛋白(如免疫球蛋白)通常并不產(chǎn)生免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)上，不再考慮這些表位。這意味著在免疫球蛋白(以及的確是大多數(shù)的人的蛋白)的結(jié)構(gòu)中存在著對(duì)潛在T細(xì)胞表位的免疫耐受性。由非自身蛋白(如SK)呈遞的與免疫球蛋白中存在的基元相同或類似的表位也可能被耐受并且實(shí)際上可以在去免疫的過程中保留下來。
在減去人免疫球蛋白的種系基元后，獨(dú)立地分析剩余的112個(gè)潛在表位與非免疫球蛋白序列的相似性。實(shí)際上，在人的表達(dá)蛋白的共有序列檢索中采用每個(gè)潛在表位的預(yù)測(cè)的錨定殘基。使用可商購的軟件(DNAstar Madison，WI，美國(guó))查詢SwissProt和GenBank翻譯序列數(shù)據(jù)庫。不再考慮在已知的人循環(huán)蛋白中鑒定出的表位，從而使其在SK分子中保持不變。由SK蛋白中第79-87位上的序列LLKAIQEQL給出了這樣一個(gè)排除的潛在表位的例子。該序列代表針對(duì)HLA-DR1*0101的預(yù)測(cè)的共有結(jié)合基元，其中錨定殘基下加有下劃線。采用共有序列LxxAxxxxL進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫檢索在包括血清白蛋白(SwissProt的登記號(hào)為P02768)的SwissProt數(shù)據(jù)庫的人蛋白亞型中鑒定出大于4000條的記錄。由SK蛋白中第299-305位上的序列YVDVNTN提供了這樣一種表位的例子，其中發(fā)現(xiàn)該表位與被認(rèn)為是在普通循環(huán)之中的人的蛋白不匹配。該序列代表針對(duì)HLA-DR4*0401呈遞的潛在表位。共有序列的檢索鑒定出含有該基元的少于50種人的蛋白，其中許多是分化組織(如大腦)的胞內(nèi)蛋白?？梢詫⑦@些蛋白視為通常不能為免疫系統(tǒng)利用以獲得耐受性，因而根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定其為用于消除的潛在表位。類似地，在SK蛋白第76-83位上的SK肽序列KADLLKAI中鑒定出其它潛在的HLA-DR1*0101結(jié)合基元。該基元在相同的數(shù)據(jù)庫組中鑒定出少于150種的人的蛋白，并且也通過本發(fā)明的方法進(jìn)行鑒定以用于修飾。
這些過程最終的結(jié)果是在SK分子中鑒定出了那些應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改變以消除潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的殘基。挑選出預(yù)測(cè)的結(jié)合基元中單個(gè)的氨基酸以便改變。為了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情況下在任何給定的位點(diǎn)處都選擇保守的氨基酸取代。匯集了一種新的(去免疫的)SK序列(圖6)，并且如前所述通過數(shù)據(jù)庫比較進(jìn)一步進(jìn)行分析以驗(yàn)證成功地消除了潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。
用于構(gòu)建去免疫的SK分子的方法使用PCR引物SK1(5’-ggaattcatgattgctggacctgagtggctg)和SK2(5’-tggatccttatttgtcgttagggtatc)擴(kuò)增來自似馬鏈球菌C組菌株(ATCC的登記入冊(cè)號(hào)為9542)的野生型SK基因。采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(Sambrook JFritsch E．F．& Maniatis T．編輯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約州，美國(guó)(1989))，將得到的1233bp片段以BamHI-EcoRI限制片段的形式克隆到pUC19中。使用可商購的試劑系統(tǒng)以及由供應(yīng)商提供的說明(Amersham，LittleChalfont，英國(guó))證實(shí)該基因序列與數(shù)據(jù)庫的記錄是相同的。使用合成的寡核苷酸和“快速-改變”方法以及來自英國(guó)Stratagene有限公司的試劑進(jìn)行定點(diǎn)誘變。通過測(cè)序驗(yàn)證突變(去免疫)型式的基因。將突變的SK基因以EcoRI-BamHI片段的形式亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pEKG-3(EstradaM．P．等人《生物／技術(shù)》10 1138-1142(1992))中，從而表達(dá)去免疫的SK。根據(jù)Rodriguez等人的方法(RodriguezP．等人《生物技術(shù)》7 638-641(1992))，采用纖溶酶原親和柱純化重組蛋白。采用酪蛋白／纖溶酶原平板技術(shù)以及如Estrada等人(Estrada等人，出處同上)所述的體外血塊溶解測(cè)定來評(píng)價(jià)纖維蛋白溶解的活性。
實(shí)施例3在本實(shí)施例中，分析了葡萄球菌激酶中潛在的MHC結(jié)合基元的存在并且公開了一種用于從該分子中除去許多所述基元的方法。
來自金黃色葡萄球菌的葡萄球菌激酶已經(jīng)被認(rèn)可并且其特征在于纖維蛋白原溶解的特性。事先已經(jīng)生產(chǎn)出重組形式的蛋白，并且體外和體內(nèi)研究已經(jīng)表明該蛋白對(duì)于溶解血栓的治療具有良好的前景(Sako，T．《歐洲生物化學(xué)雜志》149 557-563(1985)；Schlott，B．等人《生物技術(shù)》12 185-189(1994)；Collen，D．等人《循環(huán)》94197-462(1996))。但是，由于該蛋白在人當(dāng)中表現(xiàn)出的免疫原性，因此已經(jīng)限制了臨床上在人中的使用(Collen，D．等人《循環(huán)》95 463-472(1997))。作為一種用于溶解血栓治療的潛在藥劑，可以得到非免疫原性的葡萄球菌激酶將具有非常重要的意義。
成熟的葡萄球菌激酶由137個(gè)氨基酸的單一多肽鏈組成，其分子量約為15．4kDa(Silence K．等人《生物化學(xué)雜志》270 27192-27198(1995))。
用于鑒定葡萄球菌激酶中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的方法自始至終使用如Collen等人(Collen，D等人(1996)出處同上)在表1中給出的葡萄球菌激酶的序列(sakSTAR)。分析成熟的葡萄球菌激酶的蛋白序列(圖7)中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在。通過與位于萬維網(wǎng)中網(wǎng)址為http／／Wehih．wehi．edu．a(chǎn)u／mhcpep／的MHC結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較進(jìn)行分析。
“檢索”過程的結(jié)果表明存在著128個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出91個(gè)配對(duì)序列。這些表位不再予以考慮。由非自身蛋白(如葡萄球菌激酶)呈遞的與免疫球蛋白中存在的基元相同或類似的表位有可能被耐受并且實(shí)際上可以在去免疫的過程中保留下來。
在減去人免疫球蛋白的種系基元后，獨(dú)立地分析剩余的37個(gè)潛在表位與非免疫球蛋白序列的相似性。實(shí)際上，在人的表達(dá)蛋白的共有序列檢索中采用每個(gè)潛在表位的預(yù)測(cè)的錨定殘基。使用可商購的軟件(DNAstar Madison，WI，美國(guó))查詢SwissProt和GenBank翻譯序列數(shù)據(jù)庫。不再考慮在已知的人循環(huán)蛋白中鑒定出的表位，從而使其在所述蛋白中保持不變。
這些過程最終的結(jié)果是在葡萄球菌激酶分子中鑒定出了那些應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改變以消除潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的殘基。挑選出預(yù)測(cè)的結(jié)合基元中單個(gè)的氨基酸以便改變。為了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情況下在任何給定的位點(diǎn)處都選擇保守的氨基酸取代。
匯集了一種改變了的葡萄球菌激酶的序列(圖8)，并且如前所述通過數(shù)據(jù)庫比較進(jìn)一步進(jìn)行分析以驗(yàn)證成功地消除了潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。
用于構(gòu)建改變的葡萄球菌激酶分子的方法根據(jù)Genosys生物技術(shù)有限公司(劍橋，英國(guó))的合約合成出野生型葡萄球菌激酶的基因。采用長(zhǎng)的(80個(gè)基體)重疊的合成引物以及由Collen，D等人(Collen，D．等人(1996)出處同上)給出的序列通過PCR構(gòu)建基因。將合成的基因以453 bp的EcoRI-HindⅢ限制片段的形式克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pMEX(MoBiTec，Gottingen，德國(guó))中。使用可商購的試劑系統(tǒng)以及由供應(yīng)商提供的說明(Amersham，Little Chalfont，英國(guó))證實(shí)該基因序列與數(shù)據(jù)庫的記錄是相同的。采用定點(diǎn)誘變pMEX中的野生型基因來改造改變了(減少了免疫原性的)型式的基因。使用短的(18個(gè)基體)合成寡核苷酸和“快速-改變”方法以及來自Stratagene(劍橋，英國(guó))的試劑來創(chuàng)制變體基因。所有變體基因序列都通過DNA測(cè)序來驗(yàn)證。
通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將突變的葡萄球菌激酶基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株TG1中。選出單個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆，并采用血纖蛋白平板測(cè)定(Astrup，T．等人《Arch．Biochem．Biophys．》40346-351(1952)；Collen，D．等人《纖維蛋白溶解作用》6203-213(1992))選出分泌活性葡萄球菌激酶的克隆。培養(yǎng)最佳的表達(dá)克隆，并采用連續(xù)的柱層析和如前所述的方法(Collen，D．等人(1992)出處同上；Schlott等人，出處同上)從培養(yǎng)上清液中純化重組蛋白。
實(shí)施例4
在本實(shí)施例中，分析了bryodin 1中潛在的MHC結(jié)合基元的存在并且公開了一種用于從該分子中除去許多所述基元的方法。
近來已經(jīng)從葫蘆科植物的一個(gè)成員Bryonia dionia中克隆出bryodin 1蛋白的基因(Gawlak，S．等人《生物化學(xué)》36 3095-3103(1997))。Bryodin 1是一種1型核糖體失活蛋白。采用重組形式的蛋白進(jìn)行的研究已經(jīng)表明bryodin 1對(duì)于癌癥和其它疾病的免疫毒素治療具有良好的前景(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)。但是，由于該蛋白在人當(dāng)中具有免疫原性，因此與其它免疫毒素一樣，有可能剝奪該蛋白在臨床上在人當(dāng)中的使用。作為一種基于免疫毒素治療中游在的成分，可以得到非免疫原性的bryodin將具有非常重要的意義。
成熟的bryodin蛋白由267個(gè)氨基酸的單一多肽鏈組成，其分子量約為29kDa。在圖9中顯示出野生型序列。
用于鑒定bryodin 1中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的方法自始至終使用如Gawlak等人(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)給出的bryodin 1蛋白的序列。分析成熟的bryodin 1的蛋白序列(圖9)中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在。通過與位于萬維網(wǎng)中網(wǎng)址為http／／wehih．wehi．edu．a(chǎn)u／mhcpep／的MHC結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的比較進(jìn)行分析。
“檢索”過程的結(jié)果表明存在著315個(gè)潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。其中，在人種系免疫球蛋白可變區(qū)蛋白序列的數(shù)據(jù)庫中鑒定出259個(gè)配對(duì)序列。這些表位不再予以考慮。
在減去人免疫球蛋白的種系基元后，獨(dú)立地分析剩余的56個(gè)潛在表位與非免疫球蛋白序列的相似性。在人的表達(dá)蛋白的共有序列檢索中采用每個(gè)潛在表位的預(yù)測(cè)的錨定殘基。使用可商購的軟件(DNAstarMadison，WI，美國(guó))查詢SwissProt和GenBank翻譯序列數(shù)據(jù)庫。不再考慮在已知的人循環(huán)蛋白中鑒定出的表位，從而使其在所述蛋白中保持不變。
這些過程最終的結(jié)果是在bryodin 1分子中鑒定出了那些應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改變以消除潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的殘基。對(duì)bryodin 1蛋白來說，鑒定出13個(gè)潛在的表位要從該分子中除去。挑選出預(yù)測(cè)的結(jié)合基元中單個(gè)的氨基酸以便改變。為了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情況下在任何給定的位點(diǎn)處都選擇保守的氨基酸取代。
匯集了一種改變的bryodin 1的序列(圖10)，并且如前所述通過數(shù)據(jù)庫比較進(jìn)一步進(jìn)行分析以驗(yàn)證成功地消除了潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元。
用于構(gòu)建改變的bryodin 1分子的方法根據(jù)Genosys生物技術(shù)有限公司(劍橋，英國(guó))的合約合成出野生型bryodin 1的基因。采用長(zhǎng)的(80個(gè)基體)重疊的合成引物以及由Gawlak等人(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)給出的序列通過PCR構(gòu)建基因。將合成的基因以843 bp的NcoI-EcoRI限制片段的形式克隆到修飾型的細(xì)菌表達(dá)載體pET22b+(Novagen，Madison，美國(guó))中。修飾該載體以除去pelB前導(dǎo)序列，其中事先已表明該前導(dǎo)序列阻礙了bryodin 1蛋白的有效表達(dá)(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)。通過用XbaI和NcoI消化進(jìn)行修飾，以除去包括pelB前導(dǎo)序列在內(nèi)的107bp的DNA。通過使接頭分子與載體中的XbaI／NcoI游離端相連，在該載體中重建包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列和NcoI位點(diǎn)在內(nèi)的非pelB序列的元件。接頭是通過使下列互補(bǔ)寡核苷酸退火形成的Llf(5’-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcc)和Llr(5’-ccatggatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattt)。
寡核苷酸具有Genosys生物技術(shù)有限公司(劍橋，英國(guó))提供的磷酸化末端。限制酶切消化、DNA純化和連接反應(yīng)等都是采用標(biāo)準(zhǔn)的方法以及由試劑供應(yīng)商建議的條件進(jìn)行的。采用定點(diǎn)誘變修飾的pET22b載體中的野生型基因來改造改變了(減少了免疫原性的)型式的基因。使用短的(18個(gè)基體)合成寡核苷酸和“快速-改變”方法以及來自Stratagene(劍橋，英國(guó))的試劑來創(chuàng)割變體基因。所有變體基因序列都通過DNA測(cè)序來驗(yàn)證。
通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將野生型和突變的bryodin 1基因變體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株TG1中。針對(duì)每種基因選出單個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆，并且將該克隆用于序列分析。對(duì)表達(dá)來說，將bryodin 1的基因轉(zhuǎn)化到從ATCC獲得的大腸桿菌菌株BL21(λDE3)中。采用如前所述的方法(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)純化重組的bryodin 1和變體bryodin 1蛋白。在從內(nèi)含體中重折疊粗蛋白后，采用如前所述的CM-Sepharose層析(Gawlak，S．等人(1997)出處同上)獲得了純度大于95％的純化的bryodin 1和變體。采用無細(xì)胞的蛋白合成抑制測(cè)定并根據(jù)Siegall等人的方法(Siegall，C．B．等人《生物綴合物化學(xué)》5 423-429(1994))評(píng)價(jià)重組蛋白的活性。
實(shí)施例5在本實(shí)施例中，分析了人干擾素α2蛋白中潛在的MHC結(jié)合基元的存在并且公開了一種用于從該分子中除去許多所述基元的方法。
干擾素α2(INA2)是一種由活化巨噬細(xì)胞表達(dá)的重要的糖蛋白細(xì)胞因子。該蛋白具有抗病毒活性并在與表達(dá)細(xì)胞中的干擾素α受體結(jié)合時(shí)刺激產(chǎn)生至少兩種酶一種蛋白激酶和一種寡腺苷酸合成酶。成熟的INA2蛋白是由165個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，它是通過從氨基末端切下23個(gè)氨基酸的信號(hào)序列在翻譯后加工188個(gè)氨基酸的前體蛋白而產(chǎn)生的。
所述蛋白作為廣譜的抗病毒劑、抗增殖劑和免疫調(diào)制劑具有非常重要的臨床意義。在人的多種癌癥和病毒適應(yīng)征的治療中已經(jīng)使用了重組的INA2及其它制劑(參閱Sen，G．G．與Lengyel P．《生物化學(xué)雜志》267 5017-5020(1992))。盡管對(duì)許多病人來說它具有非常顯著的治療益處，但是已經(jīng)證明在某些病人中對(duì)該療法產(chǎn)生了抵抗力，并且已經(jīng)表明這種抵抗力的一種重要的機(jī)理為在接受治療的病人血清中生成了可檢測(cè)到的中和抗體(Quesada，J．R．等人《臨床腫瘤學(xué)雜志》31522-1528(1985)；Stein R．G．等人《英國(guó)新醫(yī)學(xué)雜志》3181409-1413(1988)；Russo，D．等人《Br．J．Haem．》94 300-305(1996)；Brooks M．G．等人《Gut》30 1116-1122(1989))。在這些病人中對(duì)治療用干擾素產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，盡管事實(shí)是在人體內(nèi)內(nèi)源產(chǎn)生了至少在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相同的分子。在本實(shí)施例中，提供了在人體內(nèi)具有降低了潛在免疫原性的干擾素α2分子。
用于鑒定人干擾素α2中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的方法從GenBank數(shù)據(jù)庫中鑒定出INF2的序列。自始至終使用登記號(hào)為P01563的序列。鑒定成熟的INF2蛋白的蛋白序列，并且分析不包括頭23個(gè)氨基酸信號(hào)肽的序列中潛在的MHC-Ⅱ類結(jié)合基元的存在(圖11)。使用MPT 1．0版軟件(Biovation，Aberdeen，英國(guó))通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。該軟件包根據(jù)WO-A-9859244中公開的方法進(jìn)行“肽穿線(peptide threading)”。該軟件能夠提供潛在的肽與18種不同的MHC-Ⅱ類DR等位基因結(jié)合的指數(shù)，其中所述的DR等位基因包括在人群中現(xiàn)存的96％以上的HLA-DR的同種異型。
針對(duì)INF2進(jìn)行的“肽穿線”過程的結(jié)果表明總共存在著18個(gè)獨(dú)立的潛在的表位。將這些表位定位到重疊表位的5個(gè)特有的簇，其中包含殘基7-40(簇1)、殘基45-70(簇2)、殘基79-103(簇3)、殘基108-132(簇4)和殘基140-163(簇5)。5個(gè)簇中的每一個(gè)分別含有5，3，4，3和3個(gè)潛在的表位。
為了按優(yōu)先順序排列用于除去的表位，然后根據(jù)所述分子中公知的結(jié)構(gòu)-功能特征給表位簇定位。由制作同源性模型(Murgolo N．J．等人《蛋白結(jié)構(gòu)、功能與遺傳學(xué)》17 62-74(1993))、定點(diǎn)誘變(Tymms，M．J．等人《抗病毒研究》12 37-48(1989)；MeInnes B．等人《干擾素研究雜志》9 305-314(1989))、雜種嵌合分子(Ra，N．B．K．等人《生物化學(xué)雜志》263 8943-8952(1988)；Shafferman，A．等人《生物化學(xué)雜志》262 6227-6237(1987))、缺失突變體(Wetzel，R．等人《干擾素》紐約學(xué)術(shù)出版社，第819-823頁(1982))以及血清學(xué)定位研究(Lydon N．B．等人《生物化學(xué)》24 4131-4141(1985)；Trotta P．P．等人《干擾素系統(tǒng)》Dianzani F & Rossi G．B編輯，紐約，Raven出版社，1985，第231-235頁)得到的INF2的證據(jù)表明簇1和簇2中的表位是最優(yōu)先要除去的目標(biāo)。參照Murgolo等人(Murgolo N．J．等人(1993)出處同上)的結(jié)構(gòu)模型，以5個(gè)潛在的表位為特征的簇1包括INF2分子的在功能上重要的螺旋A和AB表面環(huán)區(qū)域。該區(qū)域?qū)τ诳共《净钚詠碚f是重要的并且參與了與人INF2受體結(jié)構(gòu)的結(jié)合。最為突出的是已經(jīng)將針對(duì)中和抗體的表位定位到該區(qū)域，具體地講為螺旋A結(jié)構(gòu)元件的殘基10-11(Lydon N．B．等人(1985)出處同上)。
在該基礎(chǔ)上，通過用蘇氨酸取代第15位上的亮氨酸(L15T，其中使用了單字母密碼)消除在第7-19和第13-25位上的簇1表位。采用MPT 1．0版程序包在計(jì)算機(jī)中(in silico)交互地進(jìn)行這一步驟。類似地，通過F27Y取代消除第28-41位上的簇1表位。這一在后的取代伴隨著具有將針對(duì)第22-34位上的重疊表位的潛在結(jié)合等位基因的數(shù)量由13減小到11的作用。
簇2表位從AB環(huán)穿過螺旋B區(qū)延伸至BC環(huán)狀域。已經(jīng)表明中和抗體在BC環(huán)上結(jié)合(Lydon N．B．等人(1985)出處同上；Trotta P．P．等人(1985)出處同上)，因而第58-70位上的簇2表位也是要除去的目標(biāo)。取代N65L通過消除包含第61-77位的3個(gè)重疊表位而降低了該區(qū)域中潛在的免疫原性，其中一致預(yù)測(cè)所述的表位結(jié)合5個(gè)不同的MHCDR等位基因。另外，這一取代也將位于表位58-70的不同的結(jié)合等位基因的數(shù)量由5減小到3。
將其它表位簇(例如3-5)或者定位到所述分子的隱蔽區(qū)或者定位到不參與受體結(jié)合的表面區(qū)，從而提供抗體應(yīng)答大量是非中和的所對(duì)應(yīng)的抗原部位。
采用上述方法，匯集了含有從起始序列進(jìn)行了3處取代的改變的INF2蛋白序列并且將該序列描繪于圖12中。就人的MHC-Ⅱ類呈遞而言，預(yù)測(cè)該序列顯然具有更低的免疫原性。免疫原性減少的區(qū)域集中在所述分子中這樣的區(qū)域，在該區(qū)域中已經(jīng)表明發(fā)生了所述蛋白的抗體介導(dǎo)的中和作用，而它具有限制作為一種治療實(shí)體的該分子的臨床功效的潛力。
用于構(gòu)建改變的干擾素α2分子的方法根據(jù)Genosys生物技術(shù)有限公司(劍橋，英國(guó))的合約合成出野生型INA2的基因。采用長(zhǎng)的(80個(gè)基體)重疊的合成DNA引物以及由GenBank中登記號(hào)為M29883給出的序列通過PCR構(gòu)建基因。將合成的基因以520 bp的EcoRI-HindⅢ限制片段的形式克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pMEX8(MoBiTec，Gottingen，德國(guó))中。使用可商購的試劑系統(tǒng)以及由供應(yīng)商提供的說明(Amersham，Little Chalfont，英國(guó))證實(shí)該基因序列與想要的基因是相同的。
通過定點(diǎn)誘變pMEX8中的野生型基因來構(gòu)建改變了(減少了免疫原性的)型式的蛋白。使用商購得到的短的(18個(gè)基體)合成寡核苷酸(Genosys，劍橋，英國(guó))和“快速-改變(quick-change)”方法以及來自Stratagene(劍橋，英國(guó))的試劑進(jìn)行誘變。在定點(diǎn)誘變后，如前所述驗(yàn)證所選出的克隆的DNA序列。
對(duì)于重組的野生型和重組的變體INA2蛋白的表達(dá)來說，采用標(biāo)準(zhǔn)的步驟(Sambrook JFritisch E．F．& Maniatis T．(1989)出處同上)將pMEX8-INA2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JA221中?；旧先缜八?Grosfeld，H．等人《生物技術(shù)方法中的進(jìn)步4》Mizrahi A．& Van Wezel A．L．編輯，第59-78頁，Alan R．Liss Inc，紐約(1985))但要作一些較小的改進(jìn)來制備重組INA2。簡(jiǎn)單地說，在高速離心后，通過飽和度為60％的硫酸銨濃縮上清液，然后將其在用PBS外加0．5 M NaCl平衡的2．7×68cm Sephadex G-75柱中層析。以1min／ml的流速收集級(jí)分(8ml)。使用如前所述的免疫親和柱進(jìn)一步純化收集的級(jí)分(Grosfeld，H．等人(1985)出處同上)。采用SDS-PAGE分析測(cè)定純化的蛋白，并且采用如前所述的生物測(cè)定(Shafferman，A．等人《生物化學(xué)雜志》262 6227-6237(1987))來測(cè)定其功能活性(抗病毒活性)。
權(quán)利要求
1．一種使蛋白或蛋白的一部分對(duì)給定的物種具有非免疫原性或者較少的免疫原性的方法，該方法包括(a)測(cè)定所述蛋白的至少部分氨基酸序列；(b)在所述氨基酸序列中鑒定出一個(gè)或多個(gè)潛在的針對(duì)T細(xì)胞的表位(“T細(xì)胞表位”)，其中所述的表位是在所述給定物種的內(nèi)源蛋白中發(fā)現(xiàn)的；以及(c)修飾所述的氨基酸序列以便去除在步驟(b)中鑒定出的T細(xì)胞表位中的至少一個(gè)，從而當(dāng)暴露給所述給定物種的免疫系統(tǒng)時(shí)，降低所述蛋白或其部分的免疫原性。
2．一種如權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法，其中所述的給定物種為人。
3．一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的氨基酸序列是通過修飾與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的肽來修飾的。
4．一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的氨基酸序列是通過修飾與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的肽來修飾的。
5．一種如權(quán)利要求1-4之任一要求保護(hù)的方法，其中所述的T細(xì)胞表位是通過計(jì)算鑒定出來的。
6．一種如權(quán)利要求1-5之任一要求保護(hù)的方法，該方法還包括鑒定并消除在所述給定物種的內(nèi)源蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位。
7．一種如權(quán)利要求1-6之任一要求保護(hù)的方法，其中將被認(rèn)為通常不能為所述免疫系統(tǒng)利用以獲得耐受性的表位鑒定為要消除的潛在表位。
8．一種如權(quán)利要求7要求保護(hù)的方法，其中將胞內(nèi)蛋白的表位鑒定為要消除的潛在表位。
9．一種如權(quán)利要求1-8之任一要求保護(hù)的方法，其中將一個(gè)或多個(gè)B細(xì)胞表位也鑒定為要消除的潛在表位。
10．一種如權(quán)利要求1-9之任一要求保護(hù)的方法，其中所述的蛋白是非自身的。
11．一種如權(quán)利要求1-9之任一要求保護(hù)的方法，其中所述的蛋白是自身的。
12．一種如權(quán)利要求1-11之任一要求保護(hù)的方法，其中所述的蛋白為具有有益的治療效果的酶活性的蛋白；用于在活的生物體內(nèi)將非活性藥物轉(zhuǎn)化為活性藥物的蛋白；用于接種疫苗從而一個(gè)或多個(gè)免疫原性表位是不想要的蛋白；在所述活的生物體內(nèi)起到其它分子的載體作用的蛋白；或者，為了改變其它分子的生物分布與活的生物體內(nèi)的或者在活的生物體內(nèi)引入的所述其它分子結(jié)合的蛋白。
13．一種如權(quán)利要求1-12之任一要求保護(hù)的方法，其中測(cè)試所述蛋白所需的活性。
14．一種如權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法，該方法包括Ⅰ．測(cè)定所述蛋白或其部分(如果僅僅需要修飾一部分的話)的氨基酸序列；Ⅱ．通過任何方法鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的T細(xì)胞表位，所述方法包括測(cè)定肽與MHC分子的結(jié)合、測(cè)定肽MHC復(fù)合體與來自接受所述治療蛋白的物種的T細(xì)胞受體的結(jié)合、采用帶有接受所述治療蛋白的物種之MHC分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物測(cè)試所述的蛋白或其肽部分、或者采用以來自接受所述治療蛋白的物種之免疫系統(tǒng)細(xì)胞重建的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試；Ⅲ．通過遺傳工程或其它用于產(chǎn)生修飾的蛋白的方法，改變所述的蛋白以去除一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位并產(chǎn)生用于測(cè)試的這樣一種改變的蛋白；Ⅳ．(任選地)在步驟Ⅲ中，改變所述的蛋白以去除一個(gè)或多個(gè)潛在的B細(xì)胞表位；Ⅴ．為了鑒定已保留了其所有或部分的所需活性、但卻已喪失了一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的修飾的蛋白，測(cè)試除去了一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位(和任選的B細(xì)胞表位)的改變的蛋白。
15．一種如權(quán)利要求1-14之任一要求保護(hù)的方法，其中T細(xì)胞表位是通過改變所述表位自身當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來消除的。
16．一種如權(quán)利要求15要求保護(hù)的方法，其中所述的改變?yōu)榘被岬娜〈?br> 17．一種如權(quán)利要求16要求保護(hù)的方法，其中所述氨基酸的取代是參照同源蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行的。
18．一種如權(quán)利要求16要求保護(hù)的方法，其中所述氨基酸的取代是在相似的大小和／或電荷的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
19．一種如權(quán)利要求16要求保護(hù)的方法，其中所述氨基酸的取代是參照計(jì)算機(jī)制作蛋白質(zhì)模型技術(shù)進(jìn)行的。
20．一種如權(quán)利要求13要求保護(hù)的方法，其中采用高效的方法篩選大量的修飾的蛋白。
21．一種由權(quán)利要求1-20之任一要求保護(hù)的方法得到的分子。
22．一種如權(quán)利要求21要求保護(hù)的分子，所述的分子用于藥物或診斷中。
23．如權(quán)利要求21要求保護(hù)的分子在制備治療劑或診斷劑中的用途。
全文摘要
已知通過鑒定出一個(gè)或多個(gè)潛在的T細(xì)胞表位并通過氨基酸修飾來消除這些表位,可以使蛋白或其部分對(duì)人或其它物種具有非免疫原性或者更少的免疫原性。按照常規(guī),如果構(gòu)成這類表位的肽是以內(nèi)源的人的蛋白存在的話,那么某些表位可以保留在蛋白序列中,這是因?yàn)樗鼈儽蛔R(shí)別為是“自身的”。但是,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)即使是自身表位也會(huì)引起免疫反應(yīng)。本發(fā)明例如通過重組DNA技術(shù)提供了消除這些表位的方法,以便使它們對(duì)于向人體給藥而言(例如出于治療或診斷的目的)更為有用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1294596SQ9980440
公開日2001年5月9日 申請(qǐng)日期1999年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月8日
發(fā)明者F·J·卡爾, F·S·愛迪艾爾, A·A·哈姆利頓, G·卡特爾 申請(qǐng)人:拜奧威神有限公司