專利名稱：通過熒光鑭系金屬螯合物檢測分析物的制作方法
相關(guān)申請案的對照本申請案為1998年3月11日提出申請的申請案序號09/037,960的部份后續(xù)申請。
有關(guān)聯(lián)邦監(jiān)督研究或發(fā)展的敘述不適宜。
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明是有關(guān)可用為指示劑分子以檢測介質(zhì)例如液體中分析物的存在或濃度的熒光性化合物，及達到此等檢測的方法。更具體地說，本發(fā)明是有關(guān)包含經(jīng)取代配體的熒光鑭系金屬螯合復(fù)合物及此等作為指示劑分子以檢測介質(zhì)，包括液體介質(zhì)例如生物液體中的分析物例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的存在或濃度的用途。
2、相關(guān)技藝的說明某些稀上金屬螯合物在用紫外光和不同形式的可見光(如，紫光或藍光)予以照射時會發(fā)散出可見光，該發(fā)散是以經(jīng)螯合的陽離子為其特性。某些鑭系離子，例如銪(Eu3+)，釤(Sm3+)，鋱(Tb3+)，及較佳程度者，鏑(Dy3+)，和釹(Nd3+)，展現(xiàn)出以該離子為特性的典型熒光，特別是在其螯合到適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)能量媒介有機配體之時。此等化合物的熒光性質(zhì)-長斯托克斯移動(Stokes shift)，窄譜帶型發(fā)散譜線，及異常的長熒光壽命-使它們成為熒光免疫檢定和時間解析熒光測定技術(shù)的引人注目候選物。
此等熒光性鑭系螯合物的主要發(fā)散譜線是由稱為高敏性躍遷的躍遷所形成的且于Eu3+是在613-615nm，于Tb3+是在545(和490)nm，于Sm3+是在590和643nm，而于Dy3+是在573nm。參看Hemmila,Application of Fluorescence in Immunoassays,140-42(1991)。亦參看Spectroscopy in Inorganic Chemistry,vol.2,255-85(Academic Press1971)。輻射典型地是被螯合物以該有機配體的特性波長吸收起來及以該金屬離子的特性線譜發(fā)散出來，是因為在配體至中心金屬離子有分子內(nèi)能量輸移之故。有機配體會吸收能量且從其單線基態(tài)，S0，提升或激發(fā)到其第一單線激發(fā)態(tài)，S1，的振動多線中的任一線，于該處其快速失去其過多的振動能量。于此點會有兩種可能性S1→S0躍遷所致松弛現(xiàn)象(配體熒光)或系統(tǒng)間交叉到三線態(tài)之一，T1。參看E.P.Diamandis et al.,Analytical Chemistry62:(22)1149A(1990)；亦參看Spectroscopy in Inorganic Chemistry,vol.2,255-85(Academic Press1971)。
熒光銪螯合物是已知會展現(xiàn)出大斯托克斯位移(～290nm)而在激發(fā)光譜與發(fā)散光譜之間沒有重疊者且在615nm有非常窄(10nm譜寬)發(fā)散光譜。此外，該螯合物所具長熒光壽命(可用微秒級次測量到而非傳統(tǒng)熒光團的在毫微秒級次才可測得的壽命)有助于濾掉噪音和具有低熒光壽命的其它干擾。長熒光壽命因而促成該螯合物對于微秒-時間解析性熒光測量，其更可減少所測得的背景信號。使用銪螯合劑的其它優(yōu)點包括銪螯合物不會被氧所驟熄(quenched)。
兩種銪(Eu)螯合物，Eu-二苯甲酰基甲基化物和Eu苯甲?；?，已使該等螯合物成為在雷射中的用途的引人注目候選物。參看H.Samuelson等人，(J.Chem.Physics 39(1):110-12(1963))。Samuelson等人，研究過上述兩種銪螯合物于固體和于溶液中的熒光和吸光現(xiàn)象。Samuelson等人比較過該等銪螯合物在各種條件下的熒光壽合與在其它化合物中的銪熒光壽命?；诖朔N比較，Samuelson等人，推測兩組銪化合物之間的壽命變異是銪螯合物中配體-Eu交互作用的結(jié)果。特別地，Samuelson等人測定出來自Eu-二苯甲?；谆锏母靼l(fā)散譜線顯示出480+/-50μs的熒光壽命，其明顯地大于在其它銪化合物中的熒光壽命。
Crosby等人，J.Chem.Physics 34:743(1961)先前已研究過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移在稀土金屬螯合物，包括銪二苯甲酰基甲基化物和銪苯甲?；矧衔?，的敏化離子發(fā)散中的角色。Whan等人，J.,Mol.Spectroscopy 8:315-27(1962)報導(dǎo)過來自一組鑭系金屬離子(Eu3+，Tb3+,Dy3+,和Sm3+)的螯合物的發(fā)散是由個別稀土金屬離子的特性亮光譜線所支配。Whan等人發(fā)現(xiàn)Eu3+和Tb3+的苯甲?；锖投郊柞；谆飪烧呓詾樘貏e亮的發(fā)散體且此等螯合物的亮譜線發(fā)現(xiàn)及低磷光產(chǎn)率顯示在此等螯合物內(nèi)的配體至Eu3+和Tb3+離子的分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移可以有效率地發(fā)生。Whan等人，于324頁。
N.Fillpescu等人，J.Physical Chem.68(11):3324(1964)報導(dǎo)銪和鋱β-二酮螯合物的熒光光譜于此等螯合物的有機配體部份中所含取代基改變時會經(jīng)調(diào)節(jié)。Filipescu等人討論過銪和鋱螯合物熒光譜線的相對強度，光譜分布，偏移和分裂相對于取代基本質(zhì)，其位置，分子組態(tài)，和整體分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性。Filipescu等人也發(fā)現(xiàn)離子的特性整體熒光強度決定于兩項因素1)在有機三譜線可取得的能量，及2)能量轉(zhuǎn)移到離子的效率。
Filipescu等人也發(fā)現(xiàn)上述兩項因素會依不同取代基而變異。例如，用電子給予體甲氧基在螯合物的間(meta)位取代銪二苯甲?；谆矧衔飼r經(jīng)發(fā)現(xiàn)可增強銪離子的熒光發(fā)散，而對位甲氧基取代則經(jīng)發(fā)現(xiàn)會減低銪熒光。此外，對于二-比對于--甲氧基取代二苯甲?；谆镉懈@著的效應(yīng)。相異者，對于經(jīng)硝基取代的銪二苯甲?；谆飫t有相反的效應(yīng)。接到對位或間位的電子吸取性硝基經(jīng)發(fā)現(xiàn)會減低銪的總離子發(fā)散。此外，該效應(yīng)對于二-取代比對一取代二苯甲?；谆锔鼮轱@著。
Filipescu等人更發(fā)現(xiàn)銪對-苯基二苯甲?；谆锇l(fā)散出的強離子熒光顯示芳族系統(tǒng)的尺寸會增強轉(zhuǎn)移到銪離子的能量。此事實由經(jīng)萘基取代二酮所得發(fā)散結(jié)果獲得確定，其經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有比二苯甲?；谆矧衔飳嵸|(zhì)較高的離子發(fā)散。Filipescu等人，3328-29。
E.Diamandis等人，Analytical Chemistry 62(22):1149A(1990)述及如何使用銪螯合物作為熒光免疫檢定和DNA雜合檢定中的標(biāo)示物(label)。有關(guān)熒光檢定，該等作者述及銪螯合物可在各種檢定組態(tài)，包括競爭性或非競爭性檢定中用為免疫標(biāo)示物。
美國專利第4,374,120號(Soini等人)述及一種用熒光性鑭系元素螯合復(fù)合物作為標(biāo)記(marker)以檢測物質(zhì)的方法。美國專利第4,374,120號也述及使用β-二酮類作為增強性配體以促進某些鑭系元素螯合物，尤其是銪和鋱的螯合物的強熒光性質(zhì)。
Wallac(Turku,Finland)發(fā)展出一種鑭系金屬螯合物以取代輻射標(biāo)簽(tags)來進行免疫檢定，其具有下示構(gòu)造 Wallac分子經(jīng)發(fā)現(xiàn)在稀溶液中有非常有效的表現(xiàn)。參看，Hemmila,Applications of Fluorescence in Immunoassays,p.149(1991)。
在水溶液，例如生物流體中使用鑭系金屬螯合物需要某些條件。例如，已知者該等螯合物首先必須溶于水溶液中及，第二，避免被傾向于填補鑭系離子空配位部位的水分子所驟熄。不過，除了配體構(gòu)造外已有各種加成物或路易斯堿，例如膦類，氧化膦，或氮雜環(huán)，被用來在鑭系離子周圍形成”隔離層”(insulating sheet)，經(jīng)由阻止水分子穿透到復(fù)合物的內(nèi)層而增強熒光。例如，經(jīng)發(fā)展出用來熒光測定水系統(tǒng)中的鑭系元素的溶液(如，免疫檢定)即包括β-二酮和氧化三辛基膦(“TOPO”)作為加成物形成性增效劑，及一清潔劑(如，Tritonx100)其形成膠團(micelles)且?guī)椭芙馀湮粡?fù)合物。參看ApplicationsofFluorescence in Immunoassays,p.146-47。
鑭系金屬螯合復(fù)合物于先前尚未因為要利用獨特且特異性辨識元素特征來對分析物進行活性檢測的目的(例如用硼酸基檢測葡萄糖和其它順式二醇)而透過該螯合復(fù)合物中所含的一或多種配體予以研討或制成過。如上文討論，鑭系金屬螯合物主要是為了用為雷射染料，放射性同位素的替代標(biāo)示物，及為了接著于抗體上作為免疫檢定中的標(biāo)示物而研究過。鑭系金屬螯合物也被用于檢測四環(huán)素的定性分析程序中。
葡萄糖為活生物體不可缺少的有機化合物且于此等生物體的資訊傳遞，能量新陳代謝和構(gòu)造形成中有重要的作用。例如，葡萄糖，且更具體地說，D-葡萄糖對于構(gòu)成各種器官的各種細胞而言為重要的能源。葡萄糖是以肝糖形式貯存于肝中，其在需要消耗能量時即釋出到體液中。葡萄糖的產(chǎn)生和消費在正?；蚪】等说捏w液中有良好的平衡，保持體液中固定的葡萄糖濃度。因此，檢測血液或尿液中有次水平或超水平的葡萄糖可提供有用的資訊以診斷疾病例如糖尿病和腎功能不足。
使用酵素的葡萄糖感測器(例如，由Yellow Springs Instruments(YSI),Ohio制造)為最為熟知的檢測葡萄糖所用實用手段。此種技術(shù)包括用酵素(葡萄糖氧化酶)分解葡萄糖及用恰當(dāng)工具(例如電極)測量該分解所產(chǎn)生的過氧化氫量。雖則此種方法是頗為確定者，但源自活體的酵素，其品質(zhì)會隨時間而不可逆地變化且不能回收再使用。此外，因為葡萄糖在檢測反應(yīng)中是實際消耗掉者，所以葡萄糖感測器測量低水平葡萄糖的固有能力受到限制。
含硼酸化合物結(jié)合葡萄糖是熟知者。其機制據(jù)信是經(jīng)由葡萄糖上面的毗連羥基結(jié)合到硼酸部份體上的羥基而發(fā)生者，如下面所繪出者 糖類，包括葡萄糖，與苯基硼酸的復(fù)合是已知有一段長時間者且該交互作用的可逆性已被用為糖類層析分離的基礎(chǔ)。特別者，于1959年，Lorand和Edwards報導(dǎo)出苯硼酸與許多種飽和多元醇在水中締合的締合常數(shù)；其結(jié)合交互作用從非常弱(如，乙二醇為Kd=360mM)至中等強(如，葡萄糖，Kd=9.1mM)，參看，J.Yoon等人，Bioorganicand Medicinal Chemistry 1(4):267-71(1993)。
美國專利第5,503,770號(James等人)述及一種熒光性含硼酸化合物，其在結(jié)合到糖類，包括葡萄糖時會發(fā)散出高強度的熒光。該熒光性化合物的分子構(gòu)造包括一熒光團，至少一個苯基硼酸部份體及至少一個提供胺基的氮原子其中該氮原子是配置在該苯基硼酸部份體的附近以使其與該硼酸發(fā)生分子內(nèi)交互作用。此等交互作用由是促使該化合物在結(jié)合糖類時發(fā)散出熒光。美國專利第5,503,770號述及該化合物適合用來檢測糖類。亦參看T.James等人，J.Am.Chem.Soc.117(35):8982-87(1995)。
此外，使用含蒽硼酸化合物的熒光感測器來檢測血搪亦為現(xiàn)有技術(shù)中已知者。例如，J.Yoon等人，J.Am.Chem.Soc.114:5874-5875(1992)述及蒽硼酸可用為熒光性化學(xué)感測劑以發(fā)放糖類結(jié)合信號，包括對葡萄糖和果糖的結(jié)合。
本發(fā)明的一項目的為檢測介質(zhì)例如液體或氣體中分析物的存在或濃度，其包括測量鑭系金屬螯合混合物在該分析物透過分析物特定性辨識單元而結(jié)合到該螯合復(fù)合物所含一或多個螯合劑時所發(fā)散出的熒光的任何變化。
本發(fā)明的另一目的為提出一種分析物-特定性，含辨識單元的鑭系金屬螯合復(fù)合物作為指示劑分子以檢測介質(zhì)例如液體中所含分析物例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的存在或濃度。
發(fā)明概述本發(fā)明是有關(guān)一種用以檢測分析物存在或濃度的指示劑分子，其包括熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物其具有下式M(--Ch(-RX))Y其中M表鑭系金屬離子，Ch表螯合劑其包括一配體，較佳者一有機配體其可包括下列任何一者或多者β-二酮或其氮類似物，二羥基，含羧基雜環(huán)，烯醇，大二環(huán)穴狀配體(亦即，籠狀配體)，苯硼酸，或多胺基-多元竣酸。Ch的有機配體也可包括下列任何一者或多者含氮雜環(huán)，硫，和鍵聯(lián)的羧基。Ch的有機配體更可包括下列中任何一者或多者烷基或烯基，較佳者含有1至10個碳原子者，以及芳族，碳環(huán)族或雜環(huán)族部份體，包括芐基，萘基，蒽基，菲基，或四環(huán)基。再者，一或多種與M復(fù)合的螯合劑可相同或為不同螯合劑的混合物(所謂的“混合配體或三元螯合物”)。
R代表分析物特定性辨識單元，一或多個此等可結(jié)合到螯合復(fù)合物的一或多個配體，但不需要鍵聯(lián)到螯合復(fù)合物的每一配體。于本發(fā)明一較佳實施例中，R可為硼酸基或含硼酸基的化合物以檢測葡萄糖或其它順式二醇化合物。
X表分別接到一或多個螯合劑的辨識單元R的數(shù)目。X可為0至8的整數(shù)，且于本發(fā)明某些較佳實施例中，X=0至4或X=0至2。此外，分別接到一或多個螯合劑的辨識單元R的數(shù)目可相同或不同，其限制條件為對于一或多個螯合劑而言，X＞0。Y表與M復(fù)合的螯合劑數(shù)目，且可為1至4的整數(shù)。于本發(fā)明某些較佳實施例中，Y=1,Y=3或Y=4。
本發(fā)明也有關(guān)如上文所定義的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物。
本發(fā)明更有關(guān)利用上述指示劑分子和熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物檢測分析物的存在或濃度的方法。該方法包括下述諸步驟將樣品暴露于包括具有上文所定義式子的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物的指示劑分子，測量該鑭系金屬螯合復(fù)合物所發(fā)散的熒光的任何變化，及由是檢測出分析物的存在或濃度。
于本發(fā)明中，分析物的存在或濃度是經(jīng)由測量該鑭系金屬螯合復(fù)合物于該分析物透過一或多個分析物-特定性辨識單元結(jié)合到該螯合復(fù)合物所含一或多個螯合劑時所發(fā)散出來的熒光的任何變化而檢測的。具體地說，分析物，例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的存在或濃度是經(jīng)由觀察及/或測量分析物結(jié)合到螯合物所含分析物-特定性辨識單元-其用于檢測葡萄糖或其它順式二醇化合物時為含硼酸根辨識單元-時由該熒光性金屬離子發(fā)散出的熒光所具強度或壽命的變化(亦即，該熒光經(jīng)減弱，增強或其波長有偏移)而測定的。
本發(fā)明的優(yōu)點在于能夠利用以具有充分長度的熒光壽命(可在微秒而非毫微秒內(nèi)測得)以及具有長斯托克斯偏移的熒光性指示劑分子以分析物特定性方式檢測介質(zhì)例如液體或氣體中的分析物，例如葡萄糖或其它順式二醇化合物，由是可減低任何背景雜訊的影響以及可能減低分析物檢測敏感度的其它干擾，且不會被濃縮消光(concentrationquenched)。
附圖的簡略說明本發(fā)明指示劑分子的較佳實施例要參照附圖予以說明，其中

圖1顯示出本發(fā)明含硼酸銪螯合物(為清晰起見，只顯示出一配體)。
圖2也顯示出本發(fā)明含硼酸銪螯合物。
圖3顯示出在含有氧化三辛基膦(“TOPO”)的水溶液中的含多個含硼酸配體的銪螯合復(fù)合物。
圖4顯示出在含有本發(fā)明含硼酸銪螯合物的乙醇溶液中添加兒茶酚的影響。
圖5顯示出于含銪β-萘甲酰基三氟丙酮化物(Eu-bNTA)的乙醇溶液中添加兒茶酚的影響。
圖6-8顯示出用葡萄糖在甲醇中滴定Eu-NTA-硼酸酯的結(jié)果。
圖9顯示出用葡萄糖和果糖在甲醇中滴定銪二苯甲酰基甲烷(Eu(DBM))和Eu(硼酸化DBM)的比較。
圖10顯示出用葡萄糖在甲醇中滴定Eu-NTA硼酸酯的結(jié)果。
圖11顯示出用葡萄糖和果糖在甲醇中滴定Eu-DBM硼酸酯的結(jié)果。
圖12顯示出用葡萄糖和果糖在甲醇中滴定銪(噻吩甲?；?Theonyl)-4-苯甲酰基甲烷硼酸)的結(jié)果。
圖13顯示出用葡萄糖和果糖在甲醇中滴定Eu(苯甲?；?三氟甲基丙酮硼酸)的結(jié)果。
發(fā)明的詳細說明如上文所述者，于本發(fā)明中是經(jīng)由觀察及/或測量在透過熒光性指示劑分子中所含一或多個分析物-特定性辨識單元結(jié)合到分析物后該指示劑分子所發(fā)散的熒光所具強度或壽命的變化來測定分析物的存在或濃度。該熒光指示劑分子包括具有下式的鑭系金屬螯合復(fù)合物M(--Ch(-RX))Y其中M表鑭系金屬離子，Ch表螯合劑其包括一配體，較佳者一有機配體其可包括下列任何一者或多者β-二酮或其氮類似物，二羥基，含羧基雜環(huán)，烯醇，大二環(huán)穴狀配體(cryptand)(亦即籠狀配體)，苯硼酸，Cyclen(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的四脂族羧酸鹽或膦酸鹽)或多胺基-多元羧酸。Ch的有機配體也可包括下列任何一者或多者含氮雜環(huán)，硫，和鍵聯(lián)的羧基。
R表分析物特定性辨識單元，一或多個此等可結(jié)合到螯合復(fù)合物的一或多個配體，但不需要鍵聯(lián)到螯合復(fù)合物的每一配體。于本發(fā)明一較佳實施例中，R可為用以檢測葡萄糖或其它順式二醇或順式二醇作用性化合物的基。此等基包括硼酸基，亞砷酸基和鍺酸基，及含有此等基的化合物。代表性含硼酸化合物包括具有下列通式者(于每一構(gòu)造中，R’和R”各獨立地為稠合芳基，脂族基，第一，第二或第三胺；酰胺；羧基；酮；酯；醇；或醛；且Y和Z各獨立地為脂族基，烷氧基或芳基) 其中在右邊結(jié)構(gòu)中n為0,1或2；在左邊結(jié)構(gòu)中n為0或1； 其中n為1； 其中n為0或1； 其中n為2； 其中m為0-5且n為1或2；及
其中n為0或1，且硼酸和胺兩取代基是以配對方式配置在位置1和10,3和4,6和7,7和8或9和10。某些特殊的含硼酸根化合物包括
除了葡萄糖以外的順式二醇分析物化合物的例子包括其它糖例如果糖及甘油。兒茶酚(鄰-二羥基苯)和兒茶酚胺，包括激素例如多巴胺，腎上腺素和正腎上腺素，其含有相鄰(鄰位)羥基而就此等與硼酸酯辨識單元的反應(yīng)性擬似順式二醇。
鑭系金屬離子M可為銪(Eu3+)，釤(Sm3+)，鋱(Tb3+)，鏑(Dy3+)或釹(Nd3+)，較佳者為銪(Eu3+)或鋱(Tb3+)離子。
螯合劑Ch所含配體也可為有機配體，包括下列中任何一者或多者烷基或烯基，較佳者含有1至10個碳原子者，以及芳族，碳環(huán)族或雜環(huán)族部份體，包括芐基，萘基，蒽基，菲基，或四環(huán)基。該配體也可以包括下列基-CF3和-C2F5，只要該配體更包括于需要時可讓分析物-特定性辨識單元結(jié)合的部份體即可。此外，螯合復(fù)合物的任何配體可為無機者以取代有機者。
X表分別接到一或多個螯合劑的辨識單元R的數(shù)目。X可為0至8的整數(shù)，且于本發(fā)明某些較佳實施例中，X=0至4或X=0至2。此外，分別接到一或多個螯合劑的辨識單元R的數(shù)目可相同或不同，其限制條件為對于一或多個螯合劑而言，X＞0。Y表與M復(fù)合的螯合劑數(shù)目，且可為1至4的整數(shù)。于本發(fā)明某些較佳實施例中，Y=1,Y=3或Y=4。
于本發(fā)明某些實施例中，該鑭系金屬螯合復(fù)合物可包括不同螯合劑的混合物，其中一或多個該螯合劑不含分析物-特定性元件R。使用此等亦稱為三元配體螯合劑的混合配體螯合劑的優(yōu)點，包括某些有機配體，例如多胺基多羧酸，比其它配體例如β-二酮，更可溶于水中。所以，于至少一本發(fā)明實施例中，鑭系金屬螯合復(fù)合物可包括，第一，一或多個含有一或多個分析物-特定性辨識單元的β-二酮，與第二，一或多種其它配體例如多胺基-多羧酸，其可促進螯合復(fù)合物的水溶性。
于本發(fā)明其它實施例中，螯合復(fù)合物所含一或多個螯合劑可更包括-NHz或-OH基，或任何其它取代基可使螯合復(fù)合物共價接著于鏈聯(lián)物(Linker)或聚合物例如聚賴氨酸，或其它固體載體。
為了達到從復(fù)合物所含吸光部份到鑭系金屬離子的能量轉(zhuǎn)移，該吸光部份的三重線態(tài)能量較佳者要高于約230千焦耳/摩爾。較佳的吸光部份包括菲啶(258千焦耳/摩爾)，補骨脂內(nèi)脂(psoralen)(262千焦耳/摩爾)，吩噁嗪(261千焦耳/摩爾)；菲(258千焦耳/摩爾)，三亞苯(280千焦耳/摩爾)，二苯甲酮(287千焦耳/摩爾)，咔唑(293千焦耳/摩爾)和香豆素(258千焦耳/摩爾)。
本發(fā)明鑭系金屬螯合復(fù)合物的熒光會經(jīng)由將分析物透過一或多個辨識單元R結(jié)合到螯合復(fù)合物所含一或多個螯合劑而以分析物-特定性方式受到調(diào)制。
本發(fā)明熒光性指示劑分子可用來檢測與此等具反應(yīng)性的多種不同的可能化學(xué)分析物，因而可經(jīng)由分析物-特定性辨識單元R以特定方式予以檢測?？捎帽景l(fā)明檢測的較佳分析物為下列分析物葡萄糖，果糖和其它順式二醇化合物。不過，依辨識單元的選擇，本發(fā)明指示劑分子也可用來檢測許多種其它的分析物。下示分子具有一辨識單元使其可用為pH指示劑(參見Lippitsch等人，Sensore and Actutors B38-39(1997)96-102) 此外，下面所示為含有可用來結(jié)合鋅分析物的辨識單元的許多可能化合物中的一者(參看，例如，Huston等人，JACS1988,110,4460) 如所示的鋅結(jié)合可增加該指示劑分子，及類似此含有一類似辨識單元的其它者的熒光。此外，下面所示為含有可用來檢測鉀分析物的辨識單元的許多可能化合物中的一者(參看，例如，Sousa等人，ACSSymposium Series 538,1992,pp.10-24) 于該化合物中，鉀離子是經(jīng)配位于冠醚部份體內(nèi)，促成立體組態(tài)變化使得該分子的苯胺部份折回到菲啶部份上，導(dǎo)致熒光的消光。
使用本發(fā)明指示劑分子可檢測的化學(xué)分析物可呈各種不同的固體，氣體和液體形式存在著。此外，可在多種介質(zhì)，包括液體和氣體介質(zhì)中使用本發(fā)明指示劑分子來檢測分析物。
對于本發(fā)明熒光性化合物可存在許多可能的用途，包括作為指示劑分子用于能量，醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)諸領(lǐng)域中。例如，該熒光化合物可用為指示劑分子以檢測在血液或尿液中的次水平或超水平葡萄糖，因而提供有用的資訊供診斷如糖尿病和腎功能不足等疾病所用。用于人類治療應(yīng)用的醫(yī)/藥葡萄糖生產(chǎn)需要加以監(jiān)測和控制。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)中的可能用途包括檢測分析物例如葡萄糖在大豆和其它農(nóng)產(chǎn)品中的水平。對于如釀酒葡萄等高價值產(chǎn)品的關(guān)鍵收獲決定中必須仔細地監(jiān)測葡萄糖。由于葡萄糖為發(fā)酵程序中最貴的碳源和進料，因此用于最佳反應(yīng)器進料速率控制的葡萄糖監(jiān)測在動力醇生產(chǎn)中具有重要性。反應(yīng)器混合和葡萄糖濃度控制也對無酒精飲料和發(fā)酵飲料的生產(chǎn)中的品質(zhì)控制具關(guān)鍵性，因該生產(chǎn)在國際上都是消耗掉最大量的葡萄糖和可發(fā)酵(順式二醇)糖之故。
技藝中也有多種已知的檢測技術(shù)可利用本發(fā)明熒光化合物。例如，本發(fā)明熒光化合物可用于熒光感測裝置中(如，美國專利第5,517,313號)或可結(jié)合到聚合物材料例如試紙上供肉眼檢查所用。該后述技術(shù)可促成，例如，以類似于用石蕊試紙條測定pH的方式進行葡萄糖測量。本文所述及的熒光分子也可以用為單純的試劑供標(biāo)準(zhǔn)臺面分析儀器所用例如分光熒光計或臨床分析儀如Shimadzu,Hitachi,Jasco,Beckman和其它者所制者。此等分子也可以提供分析物特定性化學(xué)/光學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)供以光纖為基的感測器和分析熒光計所用，例如Ocean Optics(弗羅里達州克利爾沃特)，或Oriel Optics所制者。
于本發(fā)明一較佳實施例中，有多種可能的螯合劑，其一或多者可與鑭系金屬離子復(fù)合，且其可包括接有一或多個作為分析物-特定性辨識基R的硼酸基的有機配體，其例子為下文所示者。
A．β-二酮類本發(fā)明鑭系金屬螯合復(fù)合物的螯合劑Ch可為以β-二酮為基的配體，其例子有下面所提出者。
B．巨雙環(huán)穴狀配體(籠型配體)于本發(fā)明其它實施例中的螯合劑Ch可為巨雙環(huán)隱藏配體(或籠型配體)，其一例子為具有下面所示形式者 于本發(fā)明另一實施例中的螯合劑Ch可為具有下示構(gòu)造的大雙環(huán)穴狀配體。 C．氮雜環(huán)和羧酸根配位配體本發(fā)明鑭系金屬螯合復(fù)合物所含螯合劑Ch的實例也包括下列氮雜環(huán)和羧酸根配位配體。
某些本發(fā)明最佳熒光性，含硼酸根辨識單元的鑭系金屬螯合劑包括下列銪螯合劑(為清晰起見，只示出具有一配體者)，其具有下列構(gòu)造 (銪-對-硼酸化二苯甲?；淄?Ⅱ) (銪二-對-硼酸化二苯甲?；淄?Ⅲ) (銪苯甲?；煲一淄?2-硼酸(Ⅳ)于本發(fā)明一較佳實施例中，是在熒光性銪(四)β-萘甲?；宜?Eu-bNTA)螯合劑上接著對葡萄糖或其它順式二醇化合物具有分析物-特定性的含硼酸辨識單元。該螯合劑的有機配體部份是已知可在鑭系金屬離子(如，銪)周圍形成殼，如下所示者 此外，也為已知者，不同的溶劑可影響鑭系金屬離子的熒光衰減時間(如，水可消減銪離子的熒光)。因此也研究用分析物-特定性辨識單元(如含硼酸辨識單元)改質(zhì)外殼所含有機配體是否可微擾銪離子所具衰減時間到任何可察覺程度，因此乃合成且試驗下面的銪螯合物，銪(四)萘甲酰基三氟甲烷(Eu-bNTA)硼酸。 Eu-bNTA硼酸經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有約340nm的激發(fā)波長和約613nm，與其它銪螯合物所具者相同的發(fā)散波長。
用以檢測順式二醇包括葡萄糖的其它較佳化合物包括下面所列者
如圖4-5中所示者，本發(fā)明優(yōu)點以藉由測量兒茶酚(鄰-二羥基苯)對Eu-bNTA在乙醇溶液中所具熒光強度和壽命的影響的較佳實施例予以證實。圖5顯示出在添加兒茶酚于含Eu-bNTA的乙醇溶液中之后所檢測與測量到的熒光強度變化。不具有含硼酸根辨識單元的Eu-bNTA所具熒光壽命為362微秒±1微秒，而Eu-bNTA硼酸的熒光壽命則減少到270微秒±4微米。于將Eu-bNTA硼酸暴露于兒茶酚之后。該分子的熒光壽命更減短到209微秒±15微秒。
此外也在水中測量兒茶酚對Eu-bNTA硼酸所具熒光強度和壽命的影響且顯示可消去螯合物所含銪離子的熒光。之后加入三辛基膦(“TOPO”)以保護位于銪螯合復(fù)合物內(nèi)殼上的配位部位免于水的消光效應(yīng)。圖3繪出添加TOPO到含Eu-bNTA硼酸的水溶液中的情形。
Eu-NTA硼酸也能夠檢驗甲醇中所含的葡萄糖。具體地說，是在甲醇中用Eu-NTA硼酸進行葡萄糖滴定。葡萄糖滴定所得數(shù)據(jù)示于圖6-8中，圖6繪出相對于遞增葡萄糖濃度的Eu-NTA硼酸滴定。圖7繪出在圖6中所示低范圍數(shù)據(jù)點的擴展圖。圖7所示結(jié)果證實Eu-NTA硼酸鹽可檢測到頗低于約4.7mMol正常生理水平的濃度的葡萄糖。如圖7數(shù)據(jù)標(biāo)繪所示者，可在低于約0.5mMol生理范圍內(nèi)鑒另葡萄糖濃度差。雖然于圖7中因為在.001mMol葡萄糖以下的數(shù)據(jù)點密切相近之故而不能顯示出Eu-bNTA所具對葡萄糖濃度變化的低端敏感度，圖8則以葡萄糖濃度相對于I/Io的半對數(shù)標(biāo)繪圖標(biāo)繪出圖7中的低范圍。
圖9顯示出用葡萄糖和果糖分別在甲醇中滴定銪二苯甲?；淄?Eu-(DBM))和Eu(硼酸化DBM)所得結(jié)果。具體地說，葡萄糖和果糖的濃度變異為.0005,.005,.05,1,5,10和20mM。圖9中對葡萄糖B和果糖B的數(shù)據(jù)標(biāo)繪圖代表Eu(硼酸化DBM)的葡萄糖滴定與果糖滴定。從圖9的結(jié)果可以輕易看出在暴露于約0.01mM以上的葡萄糖和果糖濃度時，硼酸化銪二苯甲?；淄榈臒晒鈴姸燃疵黠@地增加，而未經(jīng)硼酸化的Eu(DBM)所具熒光強度在添加葡萄糖和果糖時都沒有任何可察覺程度的變化。沒有特定性辨識單元(如，硼酸根)時，鑭系金屬螯合復(fù)合物即對葡萄糖，果糖或其它順式二醇化合物的存在沒有反應(yīng)。因此，有了分析物-特定性辨識單元，于此例中為一硼酸根，本發(fā)明鑭系金屬螯合復(fù)合物即對葡萄糖，果糖和其它順式二醇化合物的存在具敏感性，因而可用來檢測此等和其它分析物的存在或濃度。
圖10-13進一步證實本發(fā)明鑭系金屬螯合復(fù)合物檢測樣品中葡萄糖及/或果糖的存在或濃度的能力。
如上文所述者，本發(fā)明熒光指示劑分子可用于許多不同類型的熒光感測器之中。該等熒光指示劑分子可用于感測器中以檢測樣品例如液體樣品，包括生物液體，且更具體地說人類流體中的分析物例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的存在或濃度。例如，可將本發(fā)明熒光指示劑分子分散在可讓葡萄糖或其它順式二醇化合物穿透的聚合物基質(zhì)內(nèi)。然后經(jīng)由測量指示劑分子于透過一或多個含硼酸根辨識單元結(jié)合到葡萄糖或其它順式二醇化合物后發(fā)散出的熒光所具強度或壽命的變化即可測定介質(zhì)例如液體介質(zhì)中的葡萄糖或其它順式二醇的存在或濃度。
美國專利第5,517,313號-其揭示內(nèi)容并于本文作為參考-述及一種熒光感測裝置于其中可以使用本發(fā)明熒光指示劑分子測定液體介質(zhì)中的分析物例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的存在或濃度。該感測裝置包括一成層的含熒光指示劑分子基質(zhì)行列(后文稱為“熒光基質(zhì)”)，一高通濾光器及一光電檢測器。于此裝置中，于指示劑材料內(nèi)至少部份配置著一光源，較佳者發(fā)光二極體(“LED”)，使得來自光源的入射光可促使指示劑分子發(fā)出熒光。高通濾光器使發(fā)散光到達該光電檢測器，同時濾掉來自光源的散射入射光。
在美國專利第5,517,313號中所述裝置中所采用的指示劑分子所發(fā)熒光是經(jīng)分析物例如葡萄糖或其它順式二醇化合物的局部存在而受到調(diào)制，如衰減或增強。
于美國專利第5,517,313號所述感測器中，含指示劑分子的材料是分析物可穿透者。如此，分析物可從周圍試驗介質(zhì)擴散到材料內(nèi)，由是影響指示劑分子所發(fā)散出的熒光。該光源，含指示劑分子的材料，高通濾光器及光電檢測器是經(jīng)組裝成使指示劑分子所發(fā)散的熒光有至少一部份射到光電檢測器，產(chǎn)生出顯示出周圍介質(zhì)中的分析物所具濃度的電信號。
根據(jù)使用本發(fā)明熒光指示劑分子的另一可能實施例，也在申請中的美國專利申請第08/855,234,08/855,235和08/855,236號中述及熒光感測裝置，一此等全部都并于本文作為參考。
本發(fā)明熒光指示劑分子可由諳于此技者不必經(jīng)過份量實驗而使用已知的反應(yīng)機制和藥劑，包括與下文所述通用程序相一致的反應(yīng)機制，即可制得。
硼酸化銪四β-二酮復(fù)合物的制備1、將可得自Frontier Scientific(猶他州洛根)的萘-1-硼酸溶于甲苯內(nèi)。
2、該硼酸必須先經(jīng)由與2,2-二甲基-1,3-丙二醇(AldrichChemical Company)反應(yīng)同時使用迪安-斯達克塌分水器共沸脫除水予以保護(封蓋)住而得2,2-二甲基丙烷-1,3-二基1-萘基硼酸酯，如下所示者 3、然后將經(jīng)封蓋的硼酸經(jīng)由將該硼酸與乙酸酐和三氯化鋁在無水二硫化碳中反應(yīng)進行氟瑞德-克賴福特乙?；枰怎；频?,2-二甲基內(nèi)烷-1,3-二基5-乙?；?1-萘基硼酸酯，典型地可得約70％產(chǎn)率的反應(yīng)產(chǎn)物，其呈現(xiàn)為粘稠液體，如下面所示者 4、之后經(jīng)由使用甲氧化鈉作為縮合劑(于無水乙醚中)在(3)與三氟乙酸乙酯(Aldrich)之間進行克萊森縮合反應(yīng)形成β-二酮且去封蓋，如下所示者 5、接著可以用制備型氧化矽凝膠TLC同時用二氯甲烷洗提純化出中間產(chǎn)物(4),5-萘甲?；?三氟丙酮硼酸。于至少一制備中，從板上收取第三譜帶洗提物(Rf=0.70-0.85)且用質(zhì)子NMR在400MHz予以分析。NMR光譜展現(xiàn)出β-二酮的烯醇形式的特性樣式，特別顯示出在δ6.69(單線)和δ15.28(寬胖單線)處的譜峰。
6、最后經(jīng)由用該β-二酮(4)與三氯化銪六水合物(Aldrich)和六氫吡啶在無水乙醇中反應(yīng)制成含有硼酸根作為分析物-特定性辨識單元的銪四指示劑復(fù)合物，如下所示者 然后將該溶液加熱到70℃3小時。加熱后，所得溶液在用手特長波UV光源照射時顯示出特性橘紅色發(fā)激光。此外，用Shimadzu熒光計進行熒光掃描時顯示出340nm的尖峰激發(fā)波長及613nm的銪復(fù)合物特性尖峰發(fā)散波長。
下面繪出可用來制備本發(fā)明化合物的其它合成程序。
有關(guān)上文所繪諸合成程序緒部份的其它細部，可參看下列文章，此等的內(nèi)容皆并于本文作為參考1．Walls,L.P.,JCS,(1934),104-1092．Reese,C.B.,JCS,(1958),895-9013．Muth,C.W.et,al.,J.Medicinal Chem,(1973),Vol16,No.3,19734．Badger,G.M.,et.al.,J.C.S.,(1951),3207-32115．Ishiyama,T.,et.al.,J.Org.Chem.(1995),60,7508-75106．Forrester,A.R.,et.al.,J.C.S.Perkin I,612-6157．Petterson,R.C.,et.al.,J.Org.Chem.,(1974),Vol.39,No.13,1841-18458．Nagarajan,K.,et.al.,Indian Journal of Chemistry, Vol.11,Feb.1974,112-1149．Hollingsworth,B.L.,et.al.,J.Chem.Soc.,(1961),3771-377310．Finkelstein,J.,et.al.,J.Amer.Chem.Soc.,(1951),Vol73,302-30411．Parker,D.,et.al.,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,(1997)1777-7812．Slille,J.K.,Angew,Chem.Int.Ed.Engl.,(1986),Vol25,508-52413．Sherry,A.D.,et.al.,Inorganica Chimica Acta, (1987),Vol.139,137-139
14．Bansal,N.,et.al.,J.Magnetic resonance Imaging,(1992)Vol.2,385-39115．Sherry,A.D.,et.al.,J.Magnetic Resonance,(1988),Vol.76,528-533本發(fā)明要用下列實施例予以示范說明以對其進一步了解。
實施例Ⅰ用Eu(4-二苯甲?；淄榕鹚?檢測葡萄糖和果糖將25微升的6.5mM Eu(4-二苯甲?；淄榕鹚?/PyCl加到525微升甲醇中并予以回轉(zhuǎn)混合。從甲醇中的儲液(4μM,400μM,4mM和40mM)，對兩種糖分別制備濃度為0.5μM,5μM,50μM,1mM,5mM,10mM,和20mM的葡萄糖和果糖樣品。其結(jié)果示于圖9中，在Eu螯合復(fù)合物經(jīng)于所需的365nm激發(fā)波長后對每一個別葡萄糖和果糖樣品，監(jiān)測Eu螯合復(fù)合物在613nm的熒光發(fā)散強度。
實施例Ⅱ銪四-5-萘甲?；?三氟丙酮硼酸的合成Ⅰ.2,2-二甲基丙烷-1,3-二基-1-萘基硼酸酯(1)的制備前體的硼酸根是根據(jù)下列程序予以保護住以在銪螯合復(fù)合物的合成中避免由隨后反應(yīng)條件所引起的任何潛在不良影響將萘-1-硼酸(15.2克，0.0884摩爾)與2,2-二甲基-1,3-丙二醇(10.0克，0.0960摩爾，1.1當(dāng)量)置于甲苯(200毫升)中回流同時用迪安-斯達克塌分水器共沸脫水28小時。之后經(jīng)由單純的蒸餾蒸掉甲苯，接著于加熱下以抽氣機減壓蒸餾至到達約80℃溫度為止。然后在真空(0.5mm)加熱到高達60℃下脫除未反應(yīng)的2,2-二甲基-1,3-丙二醇。得到白色固體(20.94克，99％純度)的2,2-二甲基丙烷-1,3-二基-1-萘基硼酸酯。
該產(chǎn)物經(jīng)1HNMR(CDCl3，400MHz)驗證過。Ⅱ．氟瑞德-克賴福特乙?；?,2-二甲基丙烷-1,3二基-5-乙酰基-1-萘甲基硼酸酯(2)的制備根據(jù)下述程序?qū)⒁阴；鶎?dǎo)到前體所具芳族構(gòu)造內(nèi)以形成二酮將2,2-二甲基丙烷-1,3-二基-1-萘基硼酸酯(1)(21.0克，0.0878摩爾)溶在150毫升無水二硫化碳中同時在置于冰水浴中的250毫升圓底燒瓶內(nèi)攪拌。于兩小時期間加入分成數(shù)份的三氯化鋁(28.7克，0.215摩爾)。然于一小時期間攪拌混合物并使其慢慢溫到室溫?？煽吹匠练e在燒瓶內(nèi)的黏滯深色半固體。將該混合物再置于冰水浴內(nèi)冷卻，其后在燒瓶上加裝回流冷凝器。于2小時期間加入乙酸酐(8.93克，0.0875摩爾)。然后將混合物熱到40℃以起始反應(yīng)。于乙酸酐添加期間，需要偶合攪動反應(yīng)混合物(經(jīng)由手回轉(zhuǎn))以控制可能在反應(yīng)中發(fā)生的任何放熱反應(yīng)。
于使反應(yīng)混合物置于室溫下2小時之后，再于一小時期間將混合物慢慢加熱到50℃。可觀察到于反應(yīng)混合物形成深色固體。
之后使用800毫升冰水，15毫升濃氯化氫和250毫升二氯甲烷一起將反應(yīng)混合物分解和萃取成清楚的兩層。收集底部有機層，以硫酸鈉脫水，并在高達80℃下減壓蒸發(fā)三小時而成半固體形式，產(chǎn)率78％的19.39克二甲基丙烷-1,3-二基-5-乙?；?萘基硼酸酯(2)。Ⅲ．克萊森縮合5-萘甲?；?三氟丙酮硼酸(3)的制備形成β-二酮配體，如下所述用氫化鈉混合物與2毫升甲醇(0.313克，0.01302摩爾)在10毫升無水乙醚中反應(yīng)。所得溶液于高達100℃的減壓下干燥二小時而得固體形式的甲氧化鈉。之后用45毫升無水乙醚處理該甲氧化鈉且在冰水浴中冷卻。接著加入三氯乙酸乙酯(1.763克，0.0124摩爾)，10分鐘后，于另一10分鐘期間滴加二甲基丙烷-1,3-二基-5-乙?；?1-萘基硼酸酯(2)(3.50克，0.0124摩爾)/20毫升無水乙醚溶液。在室溫下攪拌混合物30分再加熱回流70小時。將混合物置于冰水浴中攪拌之下，加入25毫升水和8毫升10％氯化氬以使水層酸化到pH1。其后在燒瓶內(nèi)呈現(xiàn)出清楚的兩層。
之后收集頂部乙醚層，以硫酸鈉脫水，及在高達60℃下減壓蒸發(fā)一小時而得到呈黑色液體形式(4.36克)的β-二酮。用制備型氧化硅凝膠TLC以二氯甲烷洗提純化所得β-二酮。從TLC板收取第三帶(Rf=0.70-0.85)而得25％產(chǎn)率的5-萘甲?；?三氟丙酮硼酸(3)(1.20克)。
該產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)子NMR(400MHz)光譜驗證為具有β-二酮的烯醇形式特性樣式，具有于δ6.69(單線)和δ15.28(寬胖三重線)的譜峰。Ⅳ．螯合/復(fù)合銪(β-二酮硼酸)四復(fù)合物(4)的形成其后依下文所述制造作為熒光指示劑分子所用的鑭系金屬螯合復(fù)合物將三氯化銪六水合物(0.7毫克，0.0019毫摩爾)/0.5毫升無水乙醇溶液加到5-萘甲酰基-三氟丙酮硼酸(3)(2.2毫克，.0058毫摩爾)和六氫吡啶(130毫克)在0.5毫升無水乙醇中的溶液內(nèi)。于2小時期間將此混合物慢慢加熱到70℃并在該溫度下再保持3小時以形成銪四復(fù)合物(4)。
所得溶液在用手持長波紫外光源照射下展現(xiàn)出特性橘紅色發(fā)散光，此外，用Shimadzu熒光計測量所得熒光光譜顯示出340nm尖峰激發(fā)波長及613nm銪螯合復(fù)合物特性發(fā)散樣式。
本發(fā)明已就某些較佳實施例予以說明過。諳于此技者皆承認可作出修飾和改良而不遠離本發(fā)明旨意與范圍。
權(quán)利要求
1.一種用以檢測分析物存在或濃度的指示劑分子，其包括具有下式的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物M(--Ch(-RX))Y其中M代表鑭系金屬離子；Ch為包括一配體的螯合劑；R為分析物-特定性辨識單元且X表結(jié)合到每一螯合劑的辨識單元R的數(shù)目；X=0至4，且Y=1至4且該辨識單元R的數(shù)目可相同或相異，其限制條件為對于一或多個螯合劑，X＞0；且其中是經(jīng)由測量在該分析物通過該辨識單元結(jié)合到該復(fù)合物所含一或多個螯合劑時該鑭系金屬螯合復(fù)合物所發(fā)散的熒光的任何變化而檢測該分析物的存在或濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指示劑分子，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物所含M為銪離子或鋱離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的指示劑分子，其中該一或多個螯合劑所含配體為包括下列任何一或多者的有機配體β-二酮或其氮類似物，二羥基，羧基配位雜環(huán)，烯醇，大雙環(huán)穴狀配體，多胺基多羧酸，苯膦酸，含1至10個碳原子的烷基或烯基芳族部份體，碳環(huán)部份體與雜環(huán)部份體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的指示劑分子，其中該一或多個螯合劑所含配體包括選自β-二酮和1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的四脂族羧酸鹽或膦酸鹽所成組合中的部份體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的指示劑分子，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物所含辨識單元R為硼酸基且該分析物為葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指示劑分子，其中該一或多個螯合劑還包括一取代基以將該螯合復(fù)合物接著到一固體載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的指示劑分子，其中該將該螯合復(fù)合物接著到一固體載體所用的取代基為-NH2基或-OH基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指示劑分子，其中該辨識單元是選自下列物質(zhì) 其中在右邊結(jié)構(gòu)中n為0,1，或2；而在左邊結(jié)構(gòu)中n為0或1； 其中n為1； 其中n為0或1； 其中n為2； 其中m為0-5且n為1或2；及 其中n為0或1；且該硼酸和胺基取代基是以呈配對形式配置于位置1和10,3和4,6和7,7和8，或9和10且對所有構(gòu)造，于可用時，R’和R”獨立地各為稠合芳基；脂族基；第一，第二或第三胺基；酰胺；羧基；酮；酯；醇；或醛；且Y和Z獨立地各為脂族基，烷氧基或芳基；及此等的衍生物。
9.一種熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其是用以檢測分析物的存在或濃度且其具有下式M(--Ch(-RX))Y其中M為鑭系金屬離子；Ch為包括一配體的螯合劑；R為分析物-特定性辨識單元且X表結(jié)合到每一螯合劑的辨識單元R的數(shù)目；X=0至4，且Y=1至4；且該辨識單元R的數(shù)目可相同或相異，其限制條件為對于一或多個螯合劑，X＞0；且其中是經(jīng)由測量在該分析物透過該辨識單元結(jié)合到該復(fù)合物所含一或多個螯合劑時該鑭系金屬螯合復(fù)合物所發(fā)散的熒光的任何變化而檢測該分析物的存在或濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其中該M為銪離子或鋱離子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其中該一或多個螯合劑所含配體為包括下列任何一或多者的有機配體β-二酮或其氮類似物，二羥基，羧基配位雜環(huán)，烯醇，大雙環(huán)穴狀配體，多胺基多羧酸，苯膦酸，含1至10個碳原子的烷基或烯基芳族部份體，碳環(huán)部份體與雜環(huán)部份體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其中該一或多個螯合劑所含配體包括β-二酮或1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的四脂族羧酸鹽或膦酸鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物所含辨識單元為硼酸基且該分析物為葡萄糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物，其中該辨識單元是選自下列物質(zhì) 其中在右邊結(jié)構(gòu)中n為0,1，或2；而在左邊結(jié)構(gòu)中n為0或1； 其中n為0或1； 其中m為0-5且n為1或2；及 其中n為0或1；且該硼酸和胺基取代基是以呈配對形式配置于位置1和10,3和4,6和7,7和8，或9和10；且對所有構(gòu)造，于可用時，R’和R”獨立地各為稠合芳基；脂族基；第一，第二或第三胺基；酰胺；羧基；酮；酯；醇；或醛；且Y和Z獨立地各為脂族基，烷氧基或芳基；及此等的衍生物。
15.一種檢測樣品中分析物的存在或濃度的方法，其包括下列諸步驟(a)將樣品暴露于一指示劑分子其包括具有下式的熒光性鑭系金屬螯合復(fù)合物M(--Ch(-RX))Y其中M為鑭系金屬離子；Ch為包括一配體的螯合劑；R為分析物-特定性辨識單元且X代表結(jié)合到每一螯合劑的辨識單元R的數(shù)目；X=0至4，且Y=1至4；且該辨識單元R的數(shù)目可相同或相異，其限制條件為對于一或多個螯合劑，X＞0；(b)測量在該分析物透過該分析物特定性辨識單元結(jié)合到該復(fù)合物所含一或多個螯合劑時，該鑭系金屬螯合復(fù)合物所發(fā)散的熒光的任何變化，藉而檢測該分析物的存在或濃度。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物所含M為銪離子或鋱離子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物的一或多個螯合劑所含配體為包括下列任何一或多者的有機配體β-二酮或其氮類似物，二羥基，羧基配位雜環(huán)，烯醇，大雙環(huán)穴狀配體，多胺基多羧酸，苯膦酸，含1至10個碳原子的烷基或烯基芳族部份體，碳環(huán)部份體與雜環(huán)部份體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該一或多個螯合劑所含配體包括β-二酮或1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的四脂族羧酸鹽或膦酸鹽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該鑭系金屬螯合復(fù)合物所含辨識單元R為硼酸基且該分析物為葡萄糖。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該辨識單元是選自下列物質(zhì) 其中在右邊結(jié)構(gòu)中n為0,1，或2；而在左邊結(jié)構(gòu)中n為0或1； 其中n為1； 其中n為0或1； 其中n為2； 其中m為0-5且n為1或2；及 其中n為0或1；且該硼酸和胺基取代基是以呈配對形式配置于位置1和10,3和4,6和7,7和8，或9和10；且對所有構(gòu)造，于可用時，R’和R”獨立地各為稠合芳基；脂族基；第一，第二或第三胺基；酰胺；羧基；酮；酯；醇；或醛；且Y和Z獨立地各為脂族基，烷氧基或芳基；及此等的衍生物。
全文摘要
測定樣品中分析物的存在或濃度所用的組合物和方法,其包括將該樣品暴露于包括熒光鑭系金屬螯合復(fù)合物的指示劑分子。樣品中分析物的存在或濃度是經(jīng)由觀察及/或測量分析物結(jié)合到該復(fù)合物中所含一或多個辨識元素時由該鑭系金屬螯合復(fù)合物發(fā)散出的熒光強度變化而測定的。該熒光指示劑分子可用于各種類型的熒光感測裝置中且可用于各種領(lǐng)域,包括能源,醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)之中。
文檔編號C07F5/02GK1300368SQ99805986
公開日2001年6月20日 申請日期1999年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月11日
發(fā)明者埃德溫·F·厄爾曼, 亞歷山大·V·尼古拉奇克, 喬治·Y·丹尼洛夫, 戴維·帕克, 阿瑟·E·科爾文, 阿里斯托爾·G·卡利弗雷滕諾斯 申請人:醫(yī)藥及科學(xué)傳感器公司