專利名稱：通過共同給予前列腺素抑制劑增強(qiáng)抗體－細(xì)胞因子融合蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般而言涉及免疫綴合物，特別是可用于定向免疫治療和普遍性免疫刺激的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白。更具體地講，本發(fā)明涉及應(yīng)用減少免疫抑制性前列腺素的產(chǎn)生、分泌和活性的因子增強(qiáng)抗體-細(xì)胞因子融合蛋白介導(dǎo)的針對預(yù)定細(xì)胞類型(例如實(shí)體瘤中的細(xì)胞)的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
多年來已經(jīng)用抗體治療人類疾病，主要是提供針對病毒或細(xì)菌感染的被動免疫。然而最近，已經(jīng)用抗體和抗體綴合物作為抗腫瘤劑。在大多數(shù)腫瘤類型中難以證明抗腫瘤活性，除非臨床狀態(tài)是一種最小殘余的疾病(Reithmuller等，Lancet 94:1177-1183)，或當(dāng)所述腫瘤為循環(huán)中的抗體可及時(shí)，例如在B-淋巴瘤的情況下(Maloney等(1994)B1ood84:2457-2466)。對于抗體介導(dǎo)的治療干涉而言，實(shí)體瘤比最小殘余疾病狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移病灶頑固得多。
早期研究表明，可以通過將免疫刺激性細(xì)胞因子融合至抗體分子，增強(qiáng)用抗體對腫瘤的體內(nèi)治療。然而，抗體-細(xì)胞因子融合蛋白在破壞較大的實(shí)體瘤方面遠(yuǎn)不如對彌散性轉(zhuǎn)移病灶有效(Xiang等(1997)Cancer Reseach 57:4948-4955和Lode等(1998)B1ood 91:1706-1715)。
因此，本領(lǐng)域仍需要增強(qiáng)針對預(yù)定細(xì)胞類型(例如實(shí)體瘤中存在的細(xì)胞類型)的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的組合物和使用這類組合物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)如果將免疫綴合物與前列腺素抑制劑一起給予，當(dāng)將所述疫綴合物給予哺乳動物時(shí)，可能產(chǎn)生更有效的針對預(yù)定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這類組合物在預(yù)定細(xì)胞類型(諸如實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞類型)和病毒感染的細(xì)胞中介導(dǎo)免疫破壞方面特別有用。
一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對預(yù)定細(xì)胞類型的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答。該方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的抗體結(jié)合位點(diǎn)和一個能夠誘導(dǎo)這種針對預(yù)定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，和(ⅱ)前列腺素抑制劑，其量足以相對于僅用免疫綴合物而言增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述預(yù)定細(xì)胞類型可以是例如在實(shí)體瘤中、更優(yōu)選在較大的實(shí)體瘤(即大于約100mm3)中存在的癌細(xì)胞?；蛘?，所述預(yù)定細(xì)胞類型可以是病毒感染的細(xì)胞，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的細(xì)胞。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，可以將前列腺素抑制劑與所述免疫綴合物同時(shí)給予?；蛘?，所述前列腺素抑制劑可以在給予免疫綴合物之前給予。此外，設(shè)想免疫綴合物可以與多種不同的前列腺素抑制劑一起給予。或者，設(shè)想所述前列腺素抑制劑可以與多種不同的免疫綴合物一起給予。
另一方面，本發(fā)明提供用于在哺乳動物中誘導(dǎo)針對預(yù)定細(xì)胞類型的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物。所述組合物結(jié)合包含(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的抗體結(jié)合位點(diǎn)和一個能夠誘導(dǎo)這種針對所述預(yù)定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，和(ⅱ)前列腺素抑制劑，其量足以相對于僅用免疫綴合物而言增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫綴合物的抗體結(jié)合位點(diǎn)最好包含免疫球蛋白重鏈或其抗原結(jié)合片段。所述免疫球蛋白重鏈最好以氨基末端至羧基末端的方向包含能夠結(jié)合預(yù)定抗原的一個免疫球蛋白可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)1(CH1)結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)2(CH2)結(jié)構(gòu)域，可選地可以還包含一個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)3(CH3)結(jié)構(gòu)域。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫綴合物是包含通過一個多肽鍵融合至需細(xì)胞因子的免疫球蛋白重鏈或其抗原結(jié)合片段的融合蛋白。因此，有效的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結(jié)合位點(diǎn)，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、一個免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域(可選的CH3結(jié)構(gòu)域)，和(ⅱ)所述細(xì)胞因子。在Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immuno1.160:6195-6203和美國專利第5,650,150號中，詳細(xì)描述了制備和使用這類融合蛋白的方法。
免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(即CH1、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域)可以是天然產(chǎn)生的抗體中的與可變區(qū)正常相連的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?；蛘?，一個或多個所述免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以衍生自與用作可變區(qū)結(jié)構(gòu)域來源的抗體不同的抗體。換句話說，所述免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以衍生自不同的抗體，例如，衍生自不同物種的抗體。參見例如美國專利第4,816,567號。此外，所述免疫球蛋白可變區(qū)可以包含衍生自一個物種(例如人類)的構(gòu)架區(qū)(FR)序列和插入所述FR之間、衍生自第二個不同物種(例如小鼠)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。例如在美國專利第5,225,539號和第5,585,089號中公開了用于制備和使用這類嵌合免疫球蛋白可變區(qū)的方法。
基于抗體的免疫綴合物最好還包含免疫球蛋白輕鏈，所述輕鏈最好通過例如二硫鍵共價(jià)連接至所述免疫球蛋白重鏈。所連接的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)一起確定結(jié)合預(yù)定抗原的單一完整的結(jié)合位點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白包含兩個嵌合鏈，每個鏈包含融合至細(xì)胞因子的至少一部分免疫球蛋白重鏈。所述兩個嵌合鏈最好通過例如一個或多個鏈間二硫鍵共價(jià)連接。
本發(fā)明因此提供其中將抗體的所述抗原結(jié)合特異性和活性與細(xì)胞因子的有效生物活性結(jié)合的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白可以用來將所述細(xì)胞因子選擇性地體內(nèi)傳遞至靶細(xì)胞，使得所述細(xì)胞因子可以在所述靶細(xì)胞附近發(fā)揮局部的生物學(xué)效應(yīng)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合蛋白的抗體組分特異性地結(jié)合癌細(xì)胞上的抗原，結(jié)果所述融合蛋白發(fā)揮局部抗腫瘤活性。在一個替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述融合蛋白的抗體組分特異性地結(jié)合病毒感染的細(xì)胞，諸如HIV感染的細(xì)胞，結(jié)果所述融合蛋白發(fā)揮局部抗病毒活性。
可以加入本發(fā)明免疫綴合物中的優(yōu)選的細(xì)胞因子包括例如腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。優(yōu)選的腫瘤壞死因子包括例如組織壞死因子α(THFα)。優(yōu)選的白介素包括例如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)和白介素-18(IL-18)。優(yōu)選的集落刺激因子包括例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)。優(yōu)選的淋巴因子包括例如淋巴毒素(LT)。其它有用的細(xì)胞因子包括干擾素，包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，所有這些均具有免疫效應(yīng)以及不依賴于抗病毒活性的抗血管生成效應(yīng)。
能夠減少免疫抑制性前列腺素產(chǎn)生的幾種藥理學(xué)藥劑或生物藥劑是本領(lǐng)域已知的。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，前列腺素抑制劑包括環(huán)加氧酶(COX)抑制劑。非選擇性環(huán)加氧酶抑制劑的實(shí)例包括吲哚美辛、舒林酸、布洛芬和阿斯匹林。所述環(huán)加氧酶抑制劑更優(yōu)選為對COX-2形式具有特異性的選擇性抑制劑。COX-2選擇性抑制劑的實(shí)例包括臨床研制中的幾種化合物，諸如Celecoxib、MK-966和美洛昔康。在本發(fā)明中優(yōu)選后一類化合物，因?yàn)闆]有胃腸副作用應(yīng)該允許較高劑量給藥和更有效地抑制腫瘤細(xì)胞合成前列腺素。
在一個替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述前列腺素抑制劑是維生素A類。已經(jīng)表明維生素A類抑制表皮生長因子和佛波醇酯對COX-2的誘導(dǎo)。
在再一替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述前列腺素抑制劑為腫瘤血管生成的抑制劑?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的血管生成抑制劑包括例如endostatin、制管張素、對αvβ3整聯(lián)蛋白具有結(jié)合親和性的肽、對αvβ3整聯(lián)蛋白具有結(jié)合親和性的抗體或其片段、對表皮生長因子(EGF)受體具有結(jié)合親和性的肽、對EGF受體具有結(jié)合親和性的抗體或其片段、COX-2抑制劑、夫馬潔林和稱為AGM-1470的類似物、沙利度胺、抗血管生成細(xì)胞因子(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)和包含這種抗血管生成細(xì)胞因子的細(xì)胞因子融合蛋白。
也提供用于聯(lián)合所述前列腺素抑制劑給予免疫綴合物的劑量和給藥方法。
附圖簡述當(dāng)結(jié)合附圖一起閱讀時(shí)，根據(jù)以下優(yōu)選實(shí)施方案的描述，可以更全面地理解本發(fā)明前述的和其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)以及發(fā)明本身。


圖1是示意圖，表示可用于實(shí)施本發(fā)明的示例性免疫綴合物；圖2A和2B圖示通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析的人EpCAM在轉(zhuǎn)染的小鼠Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞中的表達(dá)。等數(shù)目的轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者僅用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的第二抗人Fc特異性抗體染色(A組)，或者首先用huKS-huIL2抗體融合蛋白染色，然后用FITC標(biāo)記的抗人Fc特異性抗體染色(B組)；圖3是一曲線圖，描述或者單獨(dú)給予的或者聯(lián)合第二抗體-細(xì)胞因子融合蛋白給予的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應(yīng)，其中所述細(xì)胞因子具有前列腺素抑制劑(抗血管生成)活性。在植入LLC細(xì)胞后13天開始5天的處理。用以下物質(zhì)處理小鼠磷酸緩沖鹽水(空心菱形)；單獨(dú)的15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(實(shí)心方形)；10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白(實(shí)心三角形)；和7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的組合(打叉)；圖4是一曲線圖，描述或者單獨(dú)給予的或者聯(lián)合endostatin融合蛋白給予的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應(yīng)。在用以下物質(zhì)處理的小鼠中監(jiān)測CT26/EpCAM皮下腫瘤的大小磷酸緩沖鹽水(實(shí)心菱形)、muFc-muEndo融合蛋白(實(shí)心方形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(空心菱形)以及muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的組合(打叉)；且圖5是一曲線圖，描述或者單獨(dú)給予的或者聯(lián)合吲哚美辛給予的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對皮下腫瘤的效應(yīng)。在用以下物質(zhì)處理的小鼠中監(jiān)測LLC-EpCAM皮下腫瘤的大小磷酸緩沖鹽水(實(shí)心菱形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(實(shí)心方形)、吲哚美辛(實(shí)心三角形)以及huKS-huγ4-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的組合(打叉)。
發(fā)明詳述研究已經(jīng)表明，大的實(shí)體瘤對于抗體介導(dǎo)的治療干涉以及對于免疫療法而言一般比彌散性轉(zhuǎn)移病灶頑固得多(Sulitzeanu等(1993)Adv.Cancer Res.60:247-267)。人們認(rèn)為，對基于抗體的療法反應(yīng)性低部分基于免疫抑制因子的產(chǎn)生。
盡管對腫瘤根除的機(jī)制尚未完全了解，但預(yù)期細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答可以導(dǎo)致破壞腫瘤細(xì)胞并提供免疫記憶。此外，預(yù)期在某些情況下，天然殺傷(NK)細(xì)胞在缺乏CTL的情況下負(fù)責(zé)根除腫瘤。所述不同的免疫應(yīng)答可以得自以下事實(shí)某些腫瘤產(chǎn)生不同類型或不同量的能夠負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的物質(zhì)。對于微轉(zhuǎn)移性病灶以外的、已經(jīng)達(dá)到臨界質(zhì)量并能夠以足以調(diào)節(jié)抗所述腫瘤的免疫應(yīng)答的水平產(chǎn)生并分泌免疫抑制性因子的實(shí)體瘤尤其如此。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過將免疫綴合物與前列腺素抑制劑一起給予，顯著增強(qiáng)由所述免疫綴合物引發(fā)的針對預(yù)定細(xì)胞類型的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答。聯(lián)合療法在介導(dǎo)對患病組織(諸如建立的腫瘤)的免疫破壞方面特別有效。盡管不希望受限于理論，但預(yù)期所述前列腺素抑制劑減少腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制劑的產(chǎn)生、分泌或活性，由此使得所述抗體-細(xì)胞因子免疫綴合物更有效地激活抗所述腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同樣，預(yù)期這種方法可用于治療某些其中相似的免疫抑制機(jī)制阻止有效的細(xì)胞免疫的病毒病，例如在HIV感染中。預(yù)期所述前列腺素抑制劑與所述抗體-細(xì)胞因子免疫綴合物協(xié)同作用，以介導(dǎo)對患病組織(諸如建立的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞)的免疫破壞。本發(fā)明也描述了用于制備和使用有用的免疫綴合物的方法以及用于測試當(dāng)將其與合適的前列腺素抑制劑聯(lián)合時(shí)其在臨床前體內(nèi)動物模型中的藥代動力學(xué)活性的測定。
本文所用的術(shù)語“殺細(xì)胞免疫應(yīng)答”應(yīng)理解為是指在哺乳動物中由本發(fā)明的免疫綴合物刺激的、或者殺傷哺乳動物中預(yù)定細(xì)胞類型或者降低其生存力的任何免疫應(yīng)答，在性質(zhì)上或?yàn)轶w液免疫應(yīng)答或?yàn)榧?xì)胞免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以包括一種或多種細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“免疫綴合物”應(yīng)理解為是指(ⅰ)抗體結(jié)合位點(diǎn)和(ⅱ)細(xì)胞因子的綴合物，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)對于癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞上的表面抗原具有結(jié)合特異性并能夠結(jié)合所述表面抗原，而所述細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)或刺激針對所述癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，所述免疫綴合物能夠選擇性地將所述細(xì)胞因子體內(nèi)傳遞至靶細(xì)胞，使得所述細(xì)胞因子可以介導(dǎo)針對所述靶細(xì)胞的局部免疫應(yīng)答。例如，如果所述免疫綴合物的抗體組分選擇性地結(jié)合癌細(xì)胞上的抗原，例如實(shí)體瘤(特別是大于約100mm3的較大的實(shí)體瘤)中的癌細(xì)胞，則所述免疫綴合物發(fā)揮局部抗癌活性?；蛘撸绻雒庖呔Y合物的抗體組分選擇性地結(jié)合病毒感染細(xì)胞上的抗原，諸如HIV感染的細(xì)胞，則所述免疫綴合物發(fā)揮局部抗病毒活性。
本文所用的術(shù)語“抗體結(jié)合位點(diǎn)”應(yīng)理解為是指免疫球蛋白重鏈的至少一部分，例如能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的免疫球蛋白可變區(qū)。所述抗體結(jié)合位點(diǎn)也最好包含免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，包括例如CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和可選的CH3結(jié)構(gòu)域。此外，所述免疫球蛋白重鏈可以或者共價(jià)或者非共價(jià)結(jié)合至免疫球蛋白輕鏈，例如免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和可選的輕鏈恒定區(qū)。因此，設(shè)想所述抗體結(jié)合位點(diǎn)可以包含能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的完整的抗體或其片段。
關(guān)于所述免疫綴合物，設(shè)想所述抗體片段可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法連接至細(xì)胞因子。例如，在融合蛋白構(gòu)成物中，抗體結(jié)合位點(diǎn)最好通過多肽鍵連接至細(xì)胞因子?；蛘撸贵w結(jié)合位點(diǎn)可以通過反應(yīng)基化學(xué)偶聯(lián)至細(xì)胞因子，所述反應(yīng)基例如為所述抗體結(jié)合位點(diǎn)和所述細(xì)胞因子內(nèi)存在的氨基酸側(cè)鏈中的巰基。
本文所用的術(shù)語“細(xì)胞因子”應(yīng)理解為是指能夠在哺乳動物中刺激或誘導(dǎo)針對預(yù)定細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞)的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何蛋白或肽、其類似物或功能片段。因此，設(shè)想可以將多種細(xì)胞因子摻入本發(fā)明的免疫綴合物中。有用的細(xì)胞因子包括例如腫瘤壞死因子、白介素、淋巴因子、集落刺激因子、干擾素，包括能夠刺激或誘導(dǎo)這類殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的其物種變異體、截短的類似物。有用的腫瘤壞死因子包括例如THFα。有用的淋巴因子包括例如LT。有用的集落刺激因子包括例如GM-CSF和M-CSF。有用的白介素包括例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。有用的干擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
編碼特定目的細(xì)胞因子的基因可以重新克隆、得自可利用的來源，或根據(jù)已知的核苷酸序列通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成來合成。例如，LT的DNA序列是已知的(參見例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361)，IL-2(參見例如Taniguchi等(1983)Nature 302:305-318)、GM-CSF(參見例如Gasson等(1984)Science 266:1339-1342)和TNFα(參見例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361)的序列也是已知的。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫綴合物為通過常規(guī)重組DNA方法產(chǎn)生的重組融合蛋白，即通過形成編碼所述嵌合免疫綴合物的核酸構(gòu)成物產(chǎn)生的重組融合蛋白。在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了重組抗體-細(xì)胞因子融合蛋白的構(gòu)建。參見例如Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203；和美國專利第5,650,150號。編碼本發(fā)明免疫綴合物的基因構(gòu)成物最好以5’至3’方向包含編碼一個疫球蛋白重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)段、編碼一個疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)段和編碼所述細(xì)胞因子的DNA。將所融合的基因裝配到或插入表達(dá)載體中，以轉(zhuǎn)染入合適的表達(dá)所融合基因的受體細(xì)胞中。雜種多肽鏈最好與一條免疫球蛋白輕鏈結(jié)合，使得所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)合，產(chǎn)生單一完整的結(jié)合預(yù)定抗原的位點(diǎn)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈例如通過鏈間二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)。此外，或者其中之一或兩者融合至細(xì)胞因子的兩條免疫球蛋白重鏈可以例如通過一個或多個鏈間二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)。
圖1顯示示例性免疫綴合物10的示意圖。在該實(shí)施方案中，細(xì)胞因子分子2和4為連接至抗體重鏈14和16的CH3區(qū)10和12的羧基末端6和8。VL區(qū)26和28顯示以典型的IgG構(gòu)型與VH區(qū)18和20配對，由此在免疫綴合物10的氨基末端提供抗原結(jié)合位點(diǎn)30和32，并在免疫綴合物10的羧基末端提供2個細(xì)胞因子受體結(jié)合位點(diǎn)40和42。當(dāng)然，在更廣泛的意義上，所述免疫綴合物不必如所述一樣配對，或兩條免疫球蛋白重鏈中僅一條需要融合至細(xì)胞因子分子。
本發(fā)明的免疫綴合物根據(jù)其結(jié)構(gòu)的兩個方面可以被認(rèn)為是嵌合的。首先，所述免疫綴合物是嵌合的，因?yàn)樗B接至給定細(xì)胞因子的具有抗原結(jié)合特異性的一條免疫球蛋白重鏈。其次，本發(fā)明的免疫綴合物在以下意義上是嵌合的它包含一個免疫球蛋白可變區(qū)(V)和一個免疫球蛋白恒定區(qū)(C)，它們均得自不同的抗體，使得所產(chǎn)生的蛋白為V/C嵌合體。例如，所述可變區(qū)和恒定區(qū)可以得自天然產(chǎn)生的可分離自不同物種的抗體分子。參見例如美國專利第4,816,567號。也包括這樣的構(gòu)成物其中所述免疫球蛋白可變區(qū)中任一個或兩個包含得自不同物種的構(gòu)架區(qū)(FR)序列和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。這類構(gòu)成物公開于例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美國專利第5,225,539號和第5,585,089號。而且，設(shè)想可以通過從文庫(例如噬菌體呈現(xiàn)文庫)篩選以所需親和性結(jié)合預(yù)定抗原的可變區(qū)序列，來衍生所述可變區(qū)序列。用于制備和篩選噬菌體呈現(xiàn)文庫的方法公開于例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
所述免疫綴合物的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以選自5類免疫球蛋白，即IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)、IgG(Igγ)和IgM(Igμ)。然而，最好是得自IgG類的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。此外，設(shè)想所述免疫球蛋白重鏈可以得自本領(lǐng)域內(nèi)稱為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任何一個IgG抗體亞類。正如所知的，每個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包括4個或5個結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域按順序名為CH1-鉸鏈區(qū)-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在于IgM中，IgM沒有鉸鏈區(qū)。在各類免疫球蛋白中所述重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列具有交叉同源性，例如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域同源，與IgM和IgE的CH3結(jié)構(gòu)域同源。所述免疫球蛋白輕鏈可以具有或者κ或者λ恒定鏈。這些免疫球蛋白區(qū)的序列和序列對比是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Kabat等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”美國健康和人類服務(wù)部，第三版1983，第四版1987,Huck等(1986)Nuc.Acids Res.14:1779-1789)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可變區(qū)得自對預(yù)定細(xì)胞表面抗原(與患病細(xì)胞諸如癌細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞有關(guān)的抗原)特異性的抗體，而所述恒定區(qū)包含來自與所述可變區(qū)來源的抗體相同或不同的抗體的CH1和CH2(和可選的CH3)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明實(shí)施中，所述免疫綴合物的抗體部分最好在計(jì)劃的受體中無免疫原性或免疫原性弱。因此，所述抗體部分最好盡可能地得自與計(jì)劃的受體相同的物種。例如，如果所述免疫綴合物將給予人類，則所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域最好來自人類。參見例如美國專利第4,816,567號。此外，當(dāng)所述免疫球蛋白可變區(qū)序列得自非計(jì)劃受體的物種時(shí)，例如當(dāng)所述可變區(qū)序列來源于鼠而計(jì)劃受體為人類時(shí)，則所述可變區(qū)最好包含人FR序列與插入所述FR序列之間的鼠CDR序列，以產(chǎn)生對預(yù)定抗原具有特異性、但在計(jì)劃宿主中的免疫反應(yīng)性最小的嵌合可變區(qū)。這類嵌合可變區(qū)的設(shè)計(jì)和合成公開于例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美國專利第5,225,539號和第5,585,089號。Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中已經(jīng)描述了人源化抗體-細(xì)胞因子融合蛋白KS-1/4抗EpCAM抗體-IL-12融合蛋白的克隆和表達(dá)及其根除建立的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移癌的能力。
編碼所述細(xì)胞因子的基因或者直接或者通過接頭(例如通過編碼(Gly4-Ser)3接頭的DNA)符合讀框地連接至編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因(例如CH2或CH3外顯子)的3’端。在某些實(shí)施方案中，所述接頭可以包含編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核苷酸序列。該位點(diǎn)當(dāng)插入免疫球蛋白恒定區(qū)和細(xì)胞因子之間時(shí)，可以用來保證于靶位點(diǎn)蛋白水解釋放所述細(xì)胞因子。例如，眾所周知，血纖溶酶和胰蛋白酶于蛋白酶可及的位點(diǎn)在賴氨酸和精氨酸之后切割。許多其它位點(diǎn)專一性內(nèi)切蛋白酶和它們切割的氨基酸序列是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的蛋白水解切割位點(diǎn)和與這類切割位點(diǎn)反應(yīng)的蛋白水解酶公開于美國專利第5,541,087號和第5,726,044號。
所述核酸構(gòu)成物可選地可以包括所述可變區(qū)編碼基因的內(nèi)源啟動子和增強(qiáng)子，以調(diào)節(jié)所述嵌合免疫球蛋白鏈的表達(dá)。例如，可變區(qū)編碼基因可以作為DNA片段獲得，包含前導(dǎo)肽、輕鏈的VJ基因(功能性重排的可變(V)區(qū)與連接(J)區(qū)段)或重鏈的VDJ基因、以及這些基因的內(nèi)源啟動子和增強(qiáng)子?；蛘撸幋a所述可變區(qū)的基因可以與內(nèi)源調(diào)節(jié)元件分開獲得，并用于提供這些元件的表達(dá)載體中。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆方法，從產(chǎn)生所需抗體的細(xì)胞獲得可變區(qū)基因。使用合適的DNA探針，諸如含有J區(qū)DNA序列和下游序列的DNA區(qū)段，可以根據(jù)特定的功能重排的可變區(qū)篩選基因組文庫。通過對所克隆基因測序并將該序列與相應(yīng)的全長的、正確剪接的mRNA序列進(jìn)行比較，完成正確克隆的鑒定和證實(shí)。
靶抗原可以是腫瘤細(xì)胞、癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或另一患病細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原。編碼合適可變區(qū)的基因一般可以得自產(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞系。例如，通過本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞雜交技術(shù)(參見例如美國專利第4,196,265號)，可以獲得產(chǎn)生對腫瘤相關(guān)抗原或病毒抗原特異性的免疫球蛋白的淋巴瘤細(xì)胞系。這些產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞系提供功能性重排形式可變區(qū)基因來源。所述可變區(qū)基因通常來源于鼠，因?yàn)樵撌笙到y(tǒng)使其產(chǎn)生種類繁多的所需特異性的免疫球蛋白。此外，通過根據(jù)以所需親和性結(jié)合預(yù)定抗原的可變區(qū)序列篩選文庫(例如噬菌體呈現(xiàn)文庫)，可以衍生可變區(qū)序列。制備和篩選噬菌體呈現(xiàn)文庫的方法公開于例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
將編碼含功能活性可變區(qū)的基因的DNA片段連接至含所需恒定區(qū)編碼基因的DNA片段(或其部分)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)的基因克隆技術(shù)，從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞獲得免疫球蛋白恒定區(qū)(重鏈和輕鏈)。已經(jīng)克隆了兩類人類輕鏈(κ和λ)和5類人重鏈(α、δ、ε、γ和μ)的基因，因此，容易由這些克隆獲得的人類來源的恒定區(qū)。
將編碼雜交免疫球蛋白重鏈的融合基因裝配或插入到用于引入受體細(xì)胞的表達(dá)載體中。將基因構(gòu)成物引入質(zhì)粒載體可以通過標(biāo)準(zhǔn)基因剪接方法完成。所述嵌合免疫球蛋白重鏈可以與相應(yīng)的免疫球蛋白輕鏈在相同的細(xì)胞中共同表達(dá)，使得可以同時(shí)表達(dá)和裝配完整的免疫球蛋白。為此，所述重鏈和輕鏈構(gòu)成物可以置于相同或分開的載體中。
受體細(xì)胞系一般為淋巴細(xì)胞。優(yōu)選的受體細(xì)胞為骨髓瘤(或雜交瘤)。骨髓瘤可以合成、裝配和分泌由轉(zhuǎn)染基因編碼的且為糖基化蛋白的免疫球蛋白。特別優(yōu)選的受體或宿主細(xì)胞包括Sp2/0骨髓瘤(它通常不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白)和小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)，所述細(xì)胞僅產(chǎn)生由所轉(zhuǎn)染基因構(gòu)成物編碼的免疫球蛋白?？梢栽谂囵B(yǎng)物中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的骨髓瘤，或在小鼠腹膜中培養(yǎng)，在這種情況下可以從腹水中回收分泌的免疫綴合物。其它淋巴細(xì)胞諸如B淋巴細(xì)胞可以用作受體細(xì)胞。
有幾種方法用于用含編碼所述嵌合免疫球蛋白鏈的核酸構(gòu)成物的載體轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞。例如，可以將載體通過球芽融合引入淋巴細(xì)胞(參見例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。其它有用的方法包括電穿孔或磷酸鈣沉淀(參見例如Sambrook等編輯(1989)“MolecularCloningA Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Press)。
其它有用的產(chǎn)生免疫綴合物的方法包括制備編碼所述構(gòu)成物的RNA序列并使其在合適的體內(nèi)或體外表達(dá)系統(tǒng)中翻譯。考慮到，用于合成編碼抗體-細(xì)胞因子融合蛋白的基因、將基因引入宿主細(xì)胞、在宿主中表達(dá)所述基因和收獲所產(chǎn)生的融合蛋白的重組DNA方法是本領(lǐng)域眾所周知并且已有大量文獻(xiàn)記載。具體的方案例如描述于Sambrook等編輯(1989)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”Cold SpringHarbor Press。
應(yīng)該理解，采用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，可以產(chǎn)生化學(xué)偶聯(lián)的免疫綴合物。例如，可以利用所述抗體或抗體片段和所述細(xì)胞因子中的化學(xué)反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈，將所述抗體或其片段化學(xué)偶聯(lián)至所述細(xì)胞因子。所述氨基酸側(cè)鏈可以通過例如二硫鍵或通過同或異雙功能交聯(lián)試劑共價(jià)連接，所述交聯(lián)試劑例如為N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、間馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酸酯、間馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺基酯和1,4-二[3’-(2’-吡啶硫基)丙酰氨基]丁烷，所有這些均可在商業(yè)上得自Pierce,Rockford,IL。
腫瘤細(xì)胞分泌多種免疫抑制性因子。這些因子包括前列腺素(PG)，例如PGE2，即一種已知的IL-10(細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制劑)的誘導(dǎo)物和IL-12(細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的刺激物)的強(qiáng)有力的抑制劑。環(huán)加氧酶由花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素。該酶有兩種已知形式，在本領(lǐng)域稱為COX-1和COX-2。COX-1在許多細(xì)胞類型中表達(dá)，而COX-2由包括免疫刺激在內(nèi)的各種刺激誘導(dǎo)。許多包括阿斯匹林和非類固醇抗炎藥(NSAIDS)在內(nèi)的常用疼痛緩解藥抑制這兩種形式的酶。已經(jīng)將COX-2的抑制與抗炎化合物的有益效應(yīng)相聯(lián)系，而已經(jīng)將COX-1的抑制與胃腸道的毒性副作用相聯(lián)系。最近出現(xiàn)的選擇性COX-2抑制劑在其鑒別并抑制前列腺素而無胃腸毒性的能力方面顯示出有很大前途。此外，這些COX-2抑制劑已經(jīng)用于闡述COX-2在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制性前列腺素方面的作用。其它研究提示，在上皮來源的癌細(xì)胞的增生和/或存活中誘導(dǎo)COX-2。
由于炎性反應(yīng)而產(chǎn)生前列腺素并且前列腺素同時(shí)為免疫抑制性的，這一事實(shí)提示用于在所述應(yīng)答末期負(fù)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的潛在的反饋機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞的情況下，在無炎性反應(yīng)的情況下產(chǎn)生所述終產(chǎn)物抑制劑以在宿主中有意誘導(dǎo)免疫抑制。因此設(shè)想，由于在細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫刺激之前存在大量的抑制劑，因此建立的腫瘤的微環(huán)境可能是用抗體-細(xì)胞因子融合蛋白引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的困難之處。
本發(fā)明部分基于這樣一個發(fā)現(xiàn)抗體-細(xì)胞因子融合蛋白的抗腫瘤活性可以通過同時(shí)給予前列腺素抑制劑而顯著增強(qiáng)。設(shè)想所述前列腺素抑制劑減低腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制的程度，以使得抗體-細(xì)胞因子融合蛋白更有效地激活細(xì)胞免疫應(yīng)答。
應(yīng)該理解，本文所用的術(shù)語“前列腺素抑制劑”是指能夠抑制或者在其它情況下減少環(huán)加氧酶的產(chǎn)生或活性、或能夠用作血管生成抑制劑的任何分子。
前列腺素抑制劑包括例如環(huán)加氧酶抑制劑，尤其是對COX-2形式具有特異性的環(huán)加氧酶抑制劑。非選擇性環(huán)加氧酶抑制劑的實(shí)例包括吲哚美辛、舒林酸、布洛芬和阿斯匹林。COX-2選擇性抑制劑的實(shí)例包括臨床研制中的幾種化合物，諸如Celecoxib(Searle)、MK-966(Merck)和美洛昔康(Boehringer Ingelheim)。在本發(fā)明中優(yōu)選后一類化合物，因?yàn)槲改c副作用的發(fā)生率降低使得可以較大劑量給藥和更有效地抑制腫瘤細(xì)胞合成前列腺素。也已經(jīng)表明維生素A類抑制表皮生長因子和佛波醇酯對COX-2的誘導(dǎo)(參見例如Mestre等，(1997)Cancer Res.57:2890-2895)。
設(shè)想多種測定例如基于分離的酶的測定、基于細(xì)胞的測定或抗炎測定，可以用來鑒定可用于實(shí)施本發(fā)明的環(huán)加氧酶抑制劑(參見例如美國專利第5,886,178號和第5,543,297號)。例如，可以用按Barnett等(1994)Biochem.Biopfhys.Acta 1209:130-139中所述制備、并如美國專利第5,886,178中所述使用的部分純化的COX-Ⅰ和COX-Ⅱ酶，分析假定的環(huán)加氧酶抑制劑的活性。簡而言之，將COX-Ⅰ和COX-Ⅱ酶在含10％甘油的緩沖液中稀釋，通過與2mM苯酚一起溫育5分鐘，然后再與1μM高鐵血紅素一起溫育5分鐘進(jìn)行重建。通過加入14C花生四烯酸起始反應(yīng)。通過加入2M HCl終止反應(yīng)，終產(chǎn)物在C18Sep-Pak色譜柱上分級分離(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)。氧合產(chǎn)物在乙腈/水/乙酸(50∶50∶0.1(v/v))中洗脫，并通過閃爍計(jì)數(shù)器對放射性計(jì)數(shù)。
前列腺素抑制劑也包括腫瘤血管生成抑制劑，血管生成是與COX-2表達(dá)和前列腺素合成密切相關(guān)的過程(參見例如Majima等(1997)Jpn J.Pharmacol.75:105-114。應(yīng)該理解，本文所用的術(shù)語“血管生成抑制劑”是指減少或抑制哺乳動物中新血管形成的任何分子。在癌癥治療方面，所述血管生成抑制劑減少或抑制腫瘤內(nèi)或腫瘤上的新血管形成，最好是減少或抑制實(shí)體瘤中或?qū)嶓w瘤上新血管的形成。設(shè)想可以采用多種本領(lǐng)域熟知的測定，鑒定有用的血管生成抑制劑。這類測定包括例如牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生測定、雞尿囊絨膜(CAM)測定或小鼠角膜測定。然而，最好是CAM測定(參見例如O’Reilly等(1994)Cell79:315-328和O’Reilly等(1997)Cell 88:277-285)。簡而言之，從受精3天的白色的卵中取出具有完整卵黃的胚并將其置于培養(yǎng)皿中。于37℃、3％CO2下培育3天后，將含有假定血管生成抑制劑的甲基纖維素圓片置于各個胚的尿囊絨膜上。培育約48小時(shí)后，在顯微鏡下觀察尿囊絨膜中抑制帶的證據(jù)。
許多血管生成抑制劑是本領(lǐng)域熟知的并有大量的記載?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的血管生成抑制劑的實(shí)例包括例如血管生成的蛋白/肽抑制劑，諸如制管張素，即血纖溶酶原的一種蛋白水解片段(O’Reilly等(1994)Cell 79:315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5,885,795號)；endostatin，即膠原蛋白ⅩⅧ的一種蛋白水解片段(O’Reilly等(1997)Cell 88:277-285和美國專利第5,854,205號)；含RGD三肽序列并能夠結(jié)合αvβ3整聯(lián)蛋白的肽(Brooks等(1994)Cell 79:1157-1164)；和某些抗體及其抗原結(jié)合片段以及與腫瘤血管上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的αvβ3整聯(lián)蛋白(Brooks等，見上文)或EGF受體(Ciardello等(1996)J.Natl.Cancer Inst.88 1770-1776)相互作用的肽。其它血管生成抑制劑的實(shí)例包括COX-2抑制劑(Masferrer等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)；夫馬潔林和類似物，諸如AGM-1470(Inger等(1990)Nature 348:555-557)；和其它小分子，諸如沙利度胺(D’Amato等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4082-4085)。然后，目前最好使用endostatin和制管張素。
也已經(jīng)報(bào)道了幾種細(xì)胞因子、包括其物種變異體及其截短的類似物具有抗血管生成活性，因此可用于實(shí)施本發(fā)明。實(shí)例包括IL-12，據(jù)報(bào)道通過依賴于IFN-γ的機(jī)制起作用(Voest等(1995)J.Natl.Canc.Inst.87:581-586)；和IFN-γ自身，它誘導(dǎo)一種具有血管抑制活性的趨化因子(IP-10)(Arenberg等(1996)J.Exp.Med.184:981-992)。因此，IL-12、IFN-γ和IP-10代表于同一抑制途徑不同點(diǎn)的血管生成抑制劑。已經(jīng)表明其它干擾素、尤其是IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合其它抑制劑時(shí)是血管抑制性的(Brem等(1993)J.Pediatr.Surg.28:1253-1257)。干擾素IFN-α、IFN-β和IFN-γ均具有免疫學(xué)效應(yīng)以及不依賴于其抗病毒活性的抗血管生成特性。據(jù)報(bào)道另一細(xì)胞因子GM-CSF通過誘導(dǎo)制管張素抑制血管生成(Kumar等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)。
應(yīng)該理解，如本文所用的，如果對于所述抗原或受體的結(jié)合親和性大于105M-1，更優(yōu)選大于107M-1，則所述免疫綴合物的抗體部分特異性地結(jié)合預(yù)定抗原，細(xì)胞因子特異性地結(jié)合所述細(xì)胞因子的受體，或前列腺素抑制劑特異性地結(jié)合所述抑制劑的受體。本文所用的術(shù)語制管張素、endostatin、TNF、IL、GM-CSF、M-CSF、LT和IFN不僅是指完整的蛋白，也是指其生物活性片段和/或類似物。生物活性片段是指具有完整蛋白生物活性的至少30％、更優(yōu)選至少70％、最優(yōu)選至少90％的完整蛋白部分。類似物是指所述完整蛋白的物種變異體和等位基因變異體、或具有所述完整蛋白生物活性的至少30％、更優(yōu)選至少70％、最優(yōu)選至少90％的氨基酸取代體、插入體或缺失體。
前列腺素抑制劑可以與所述免疫綴合物同時(shí)給予，或分別通過不同的給藥途徑給予。本發(fā)明的化合物可以通過與特定分子相匹配的任何途徑給予。因此，合適時(shí)，可以口服或胃腸外給予，包括靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥途徑。
可以將本發(fā)明的組合物通過任何合適的方法直接(例如局部如通過注射、植入或體表給予組織部位)或系統(tǒng)(例如胃腸外或口服)提供給動物。當(dāng)所述組合物待胃腸外提供時(shí)，諸如通過靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)眼、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)頰、直腸、陰道、眶內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)或通過氣霧劑給予，所述組合物最好包含部分水性或生理上相容的流體懸浮液或溶液。因此，所述載體或溶媒是生理上可接受的，使得除將所需組合物傳遞至患者外，它不會另外不利地影響患者的電解質(zhì)和/體積平衡。所述藥物的所述流體介質(zhì)因此可以包含通常的生理鹽水(例如9.85％NaCl水溶液，0.15M,pH7-7.4)。
每次給予的免疫綴合物的優(yōu)選劑量范圍為0.1mg/m2-100mg/m2，更優(yōu)選為1mg/m2-20mg/m2，最優(yōu)選為2mg/m2-6mg/m2。前列腺素抑制劑的優(yōu)選劑量一般將取決于所用的前列腺素抑制劑的類型，然而，可以用常規(guī)試驗(yàn)確定最適劑量。免疫綴合物和/或前列腺素抑制劑的給予可以通過定期大劑量注射，或從外部儲器(例如從靜脈內(nèi)袋)或內(nèi)部(例如從可生物消化的植入物)通過連續(xù)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予。此外，設(shè)想了本發(fā)明的免疫綴合物也可以與多種不同的前列腺素抑制劑一起給予計(jì)劃的受體。然而，設(shè)想了免疫綴合物和前列腺素抑制劑的最佳組合、給藥模式、劑量可以通過常規(guī)試驗(yàn)確定，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平之內(nèi)。
可以用多種方法，評估采用抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和前列腺素抑制劑的聯(lián)合療法對免疫應(yīng)答的效力。例如，技術(shù)人員可以實(shí)施例1描述的動物模型或其它合適的動物模型來測試哪種前列腺素抑制劑、或前列腺素抑制劑的組合在與免疫綴合物(例如抗體-IL-2融合蛋白)協(xié)同作用以增強(qiáng)對建立的腫瘤的免疫破壞方面最有效。所述前列腺素抑制劑或前列腺素抑制劑的組合可以在免疫綴合物治療之前或同時(shí)給予，通過測定體積可以方便地監(jiān)測對腫瘤的效應(yīng)。此外，當(dāng)鑒定出新的前列腺素抑制劑時(shí)，技術(shù)人員將能夠使用本文所述的方法來評估這些新抑制劑增強(qiáng)或在其它情況下改變抗體-細(xì)胞因子融合蛋白抗癌活性的潛力。
或者，在治療后，可以切下腫瘤，將其切片并通過標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法染色，或通過特異性的免疫組織試劑染色，以評價(jià)所述聯(lián)合療法對免疫應(yīng)答的效應(yīng)。例如，用蘇木精和曙紅的簡單染色可能揭示出為細(xì)胞免疫應(yīng)答的指標(biāo)的淋巴細(xì)胞浸潤到實(shí)體瘤中的差異。此外，用針對特定免疫細(xì)胞類別的抗體將切片免疫染色，可以揭示出所誘導(dǎo)的應(yīng)答的性質(zhì)。例如，結(jié)合CD45(一種通常的白細(xì)胞標(biāo)記)、CD4和CD8(用于T細(xì)胞亞類鑒定)和NK1.1(NK細(xì)胞上的一種標(biāo)記)的抗體可以用來評估由本發(fā)明免疫綴合物介導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型。
或者，通過例如在Lode等(1998)Blood 91:1706-1715中描述的常規(guī)的細(xì)胞亞群排除研究，可以評估由所述免疫綴合物介導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型。排除抗體的實(shí)例包括與T細(xì)胞標(biāo)記CD4和CD8反應(yīng)的抗體，以及結(jié)合NK標(biāo)記NK1.1以及脫唾液酸(asialo)GM的抗體。簡而言之，在開始相當(dāng)高的劑量(例如約0.5mg/小鼠的劑量)進(jìn)行抗體-細(xì)胞因子處理之前，給所述哺乳動物注射這些抗體，以每周1次的間隔給予，此后直至試驗(yàn)完成。該技術(shù)可以鑒定引發(fā)所觀察的哺乳動物的免疫應(yīng)答所需的細(xì)胞類型。
在另一途徑中，將從已經(jīng)用聯(lián)合療法處理的動物中分離的脾細(xì)胞的細(xì)胞毒活性與其它處理組的細(xì)胞毒性活性相比。通過用在大多數(shù)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊中找到的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)機(jī)械切碎回收的、無菌的脾，制備脾細(xì)胞培養(yǎng)物。參見例如Coligan等(編輯)(1988)“Current Protocols inImmunology”John Wiley & Sons,Inc。然后在合適的含有血清、抗生素和低濃度IL-2(約10U/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)基(例如得自GIBCO的DMEM)中培養(yǎng)所產(chǎn)生的細(xì)胞。例如，為了比較NK活性，3天的培養(yǎng)物通常是最適的，而為了比較T細(xì)胞細(xì)胞毒活性，5天的培養(yǎng)物通常是最適的。通過用51Cr放射標(biāo)記腫瘤靶細(xì)胞(例如LLC)30分鐘，可以測定細(xì)胞毒性活性。在去除過量的放射標(biāo)記后，將標(biāo)記細(xì)胞與不同濃度的培養(yǎng)脾細(xì)胞混合4小時(shí)。溫育結(jié)束時(shí)，用γ計(jì)數(shù)器測量來自所述細(xì)胞的51Cr，然后將其用來定量由所述免疫細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解的程度。以該方式測定常規(guī)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(或CTL)活性。
通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
用含編碼人EpCAM抗原(由KS1/4抗體識別，如Vurki等(1984)Cancer Res.44:681中描述)、并由巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子(Immunogen,Carlsbad,CA)驅(qū)動的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞。通過PCR，從由人前列腺癌細(xì)胞LnCAP制備的cDNA克隆所述KS抗原(KSA或EpCAM)。正向引物具有核苷酸序列5’TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(SEQ ID NO:1)，其中ATG為翻譯起始密碼子，而反向引物具有核苷酸序列5’CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT(SEQ ID NO:2)，其中TTA為翻譯終止的反密碼子。EpCAM cDNA克隆入反轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCS(Clontech,Palo Alto,CA)中，并按照已建立的方案(Ausubel等(編輯)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley & Sons)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡而言之，通過磷酸鈣共沉淀法，用pLNCX-EpCAM轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系PA317(ATCC CRL 9078)，含有所述病毒的條件培養(yǎng)基用來轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞。將G418(Sigma Chemical Co.)加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞至1mg/ml，以選擇穩(wěn)定的克隆。通過免疫染色和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析，鑒定表達(dá)人EpCAM抗原的克隆(LLC-Ep)。
如圖1描述，首先用hu-KS-IL2抗體融合蛋白(參見以下實(shí)施例2)染色、然后用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人Fc特異性抗體(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)染色的LLC-Ep克隆，表現(xiàn)出相當(dāng)均一的人EpCAM表達(dá)水平。在這些克隆中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于單獨(dú)用FITC標(biāo)記的抗人Fc特異性抗體染色的克隆所觀察到的水平。
為了表明人細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)不增加LLC-Ep細(xì)胞的免疫原性，給C57B1/6小鼠皮下注射不同數(shù)目的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)所有小鼠在注射5×105細(xì)胞后均快速產(chǎn)生進(jìn)行性腫瘤，其生長動力學(xué)與用親代LLC細(xì)胞系觀察的大致相同。所有動物均為垂死的，將其處死以避免不必要的受苦。實(shí)施例2．抗體-細(xì)胞因子融合蛋白或抗體-血管生成抑制劑融合蛋白的制備在以下實(shí)施例中討論多種抗體-細(xì)胞因子融合蛋白。具體地說，實(shí)施例3公開了人源化KS-鼠γ2a-鼠IL2(huKS-muγ2a-muIL2)和人源化KS-鼠γ2a-鼠IL12(huKS-muγ2a-muIL12)融合蛋白的應(yīng)用。實(shí)施例4公開了人源化KS-人γ4-人IL2(huKS-huγ4-huIL2)和鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白的應(yīng)用。最后，實(shí)施例5公開了人源化KS-人huγ1-人IL2(huKS-huγ1-huIL2)融合蛋白與吲哚美辛的應(yīng)用。下面討論這些融合蛋白的構(gòu)建。huKS-huγ1-huIL2基本上按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203和美國專利第5,650,150號描述的方法，制備并表達(dá)編碼huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的基因。簡而言之，用Jones等(1986)Nature 321:522-525中公開的方法，制備小鼠KS1/4抗體的人源化可變區(qū)(Varki等，(1984)Cancer Res.44:681-687)的模型，所述公開的方法涉及將每個KS1/4可變區(qū)的CDR插入人可變區(qū)具有最高程度同源性的共有框架序列中。用運(yùn)行BioSym軟件的Silicon Graphics Indigo工作站的分子模擬證實(shí)所述CDR的形狀得到保持。然后反向翻譯所述蛋白的序列，通過連接重疊的寡核苷酸構(gòu)建基因。
基本上按照Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，將產(chǎn)生的可變區(qū)插入含有人κ輕鏈和人Cγ1重鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，只是用CMV啟動子/增強(qiáng)子取代所述金屬硫蛋白啟動子和免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子，以表達(dá)兩條鏈。按Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，制備IL-2的成熟序列融合至人重鏈的羧基末端的融合體，只是所述IL-2基因的3’非翻譯區(qū)得自SV40 poly(A)區(qū)。
通過將所產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NS/0骨髓瘤細(xì)胞系，用含0.1μM氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養(yǎng)基，表達(dá)所述IL-2融合蛋白。簡而言之，為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，通過電穿孔將質(zhì)粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。NS/0細(xì)胞在補(bǔ)充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用PBS洗滌約5×106細(xì)胞，再懸浮于0.5ml PBS中。然后在Gene Pulser Cuvette(0.4cm電極間距，BioRad)中將10μg線性化質(zhì)粒DNA與所述細(xì)胞一起在冰上孵育10分鐘。用Gene Pulser(BioRad,Hercules,CA)，設(shè)定0.25V和500μF進(jìn)行電穿孔。讓細(xì)胞在冰上恢復(fù)10分鐘，此后將其再懸浮于生長培養(yǎng)基中，然后鋪到2個96孔板上。通過在100nM氨甲蝶呤存在下，通過生長選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，所述氨甲蝶呤在轉(zhuǎn)染后2天加入。每3天飼喂細(xì)胞一次，再飼喂3次，在2-3周內(nèi)出現(xiàn)MTX抗性克隆。
用合適的抗體，通過Fc或細(xì)胞因子ELISA鑒定表達(dá)克隆(參見例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。按生產(chǎn)商的說明，通過結(jié)合、然后從A蛋白Sepharose(Pharmacia)洗脫，純化所產(chǎn)生的融合蛋白。huKS-huγ4-huIL2基本上按照1999年2月24日申請的U.S.S.N09/256,156(該申請要求1998年2月25日申請的U.S.S.N 60/075,887的優(yōu)先權(quán))所述，構(gòu)建并表達(dá)編碼huKS.huγ4.huIL2融合蛋白的基因。
簡而言之，通過從huKS-huγ1-huIL2表達(dá)載體中去除免疫球蛋白恒定區(qū)Cγ1基因片段，并用來自人Cγ4基因的相應(yīng)序列取代，制備如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的Igγ4形式。人重鏈恒定區(qū)Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的序列和序列對比公開于Huck等(1986)Nuc.AcidsRes.14:1779-1789。
通過用HindⅢ和XhoⅠ消化原始的含Cγ1質(zhì)粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化大的7.8kb片段，完成Cγ1和Cγ4片段的交換。含所述Cγ4的第二質(zhì)粒用HindⅢ和NsiⅠ消化，并純化1.75kb片段。含有融合至人Cγ1基因羧基末端的人IL-2 cDNA和SV40 poly A位點(diǎn)的第三質(zhì)粒用XhoⅠ和NsiⅠ消化，并純化小的470bp片段。以大致等摩爾的量連接所有三種片段，連接產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，通過在含氨芐青霉素的平板上生長選擇菌落。通過得自分離轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA制備物的限制分析，并用FspⅠ消化來區(qū)別Cγ1(無FspⅠ)和Cγ4(一個位點(diǎn))基因插入片段，鑒定正確裝配的重組質(zhì)粒。
將含有Cγ4-IL2重鏈取代的最終載體通過電穿孔(0.25V和500μF)引入NS/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，并通過在含氨甲蝶呤(0.1μM)的培養(yǎng)基中生長選擇轉(zhuǎn)染子。鑒定、擴(kuò)增表達(dá)高水平huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的細(xì)胞克隆，并用A蛋白Sepharose色譜從培養(yǎng)上清液中純化所述融合蛋白。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定Cγ4融合蛋白的純度和完整性。在T細(xì)胞增生測定(Gillis等(1978)J.Immunol.120:2027-2032)中測量IL-2活性，發(fā)現(xiàn)與γ1構(gòu)成物的活性相同。huKS-muγ2a-muIL2通過用相應(yīng)的鼠序列取代如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的人抗體恒定區(qū)和人IL-2，構(gòu)建編碼huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白的基因。具體地說，用融合至編碼鼠IL-2的DNA的鼠Cγ2a cDNA片段取代人Cγ1-IL2 DNA。簡而言之，用重疊寡核苷酸引物，通過進(jìn)行重疊PCR，將huKS的V區(qū)符合讀框地融合至鼠γ2a cDNA，所述引物為(有義)5’CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC(SEQ ID NO:3)；(反義)5’GG GGC TGT TGT TTTGGC TGA GGA GAC GGT GACTGA CG(SEQ IDNO:4)；(有義)5’C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG(SEQ ID NO:5)；和(反義)5’CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C(SEQ ID NO:6)。
設(shè)計(jì)SEQ ID NO:3和4的寡核苷酸，以雜交至huKS的所述VH結(jié)構(gòu)域和鼠γ2a恒定區(qū)cDNA的接點(diǎn)(斜體)。在第一輪PCR中，有兩個單獨(dú)的反應(yīng)。在一個反應(yīng)中，huKS VHDNA用作模板，采用SEQ IDNO:4和5的寡核苷酸。SEQ ID NO:5的引物在編碼huKS VH的成熟氨基末端的序列上游引入一個AflⅡ(CTTAAG)限制位點(diǎn)(粗體)。在另一反應(yīng)中，鼠γ2a cDNA用作模板，使用寡核苷酸SEQ ID NO:3和6。SEO ID NO:6的引物雜交至編碼γ2a C末端周圍區(qū)域的cNDA，并引入一個XmaⅠ(CCCGGG)限制位點(diǎn)，以隨后連接至muIL2 cDNA?；旌系米赃@兩個反應(yīng)的PCR產(chǎn)物，并采用SEQ ID NO:5和6的寡核苷酸進(jìn)行第二輪的PCR?？寺∷a(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，在序列證實(shí)后，將編碼huKS的VH和鼠γ2a恒定區(qū)的AflⅡ-XmaⅠ片段用來在AflⅡ位點(diǎn)連接至編碼信號肽的DNA并在XmaⅠ位點(diǎn)連接至編碼muIL2 cDNA。
用SEO ID NO:7和8中敘述的寡核苷酸，從鼠外周血單核細(xì)胞的mRNA克隆鼠IL2cDNA，所述寡核苷酸為(有義)5’GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC(SEQ ID NO.7)；和(反義)5’CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(SEQ ID NO.8)。
SEQ ID NO:7的引物改變于XmaⅠ限制位點(diǎn)(CCCGGG)連接至muγ2a的muIL2(粗體的序列)。SEQ ID NO:8的引物在緊接翻譯終止密碼子(反義序列中的粗體)之后引入一個XhoⅠ限制位點(diǎn)(CTCGAG)。
同樣，通過重疊PCR將huKS的輕鏈可變區(qū)(VL)連接至muκcDNA序列。所用的重疊寡核苷酸包括(有義)5’G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G(SEQ ID NO.9)；(反義)(有義)(反義)5’GCAGC ATCAGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC(SEQ ID NO.10)；5’C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (SEQ ID NO.11)；和5’CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC(SEQ ID NO.12)。
所述寡核苷酸用來雜交至huKS的VL和鼠κcDNA恒定區(qū)的接點(diǎn)(斜體)。在第一輪PCR中，有兩個單獨(dú)的反應(yīng)。在一個反應(yīng)中，huKSDNA的VL用作模板，采用SEQ ID NO:10和11中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在編碼huKS VL的成熟氨基末端的序列上游引入一個AflⅡ(CTTAAG)限制位點(diǎn)。在另一個反應(yīng)中，用鼠κcDNA作為模板，采用SEQ ID NO:9和12中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在翻譯終止密碼子(反義引物中的粗體)后引入一個XhoⅠ限制位點(diǎn)。
混合得自這兩個反應(yīng)的PCR反應(yīng)，并采用SEQ ID NO:11和12中提出的寡核苷酸引物進(jìn)行第二輪PCR?？寺∷a(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，在證實(shí)序列后，將編碼huKS的VL和鼠κ恒定區(qū)的AflⅡ-XhoⅠ片段在AflⅡ位點(diǎn)連接至編碼信號肽的DNA。
用鼠重鏈序列和輕鏈序列取代pdHL7中的人序列。將產(chǎn)生的包含dhfr選擇標(biāo)記基因的抗體表達(dá)載體進(jìn)行電穿孔(0.25V和500μF)進(jìn)鼠NS/0骨髓瘤細(xì)胞中，并通過在含0.1μM氨甲蝶呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而選擇克隆。采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測試抗氨甲蝶呤的轉(zhuǎn)染克隆中抗體決定簇的分泌。按照生產(chǎn)商的說明，通過A蛋白Sepharose色譜純化所述融合蛋白。huKS-muγ2a-muIL12基本上按照1997年12月8日申請的U.S.S.N.08/986,997和Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，構(gòu)建和表達(dá)編碼huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的基因。簡而言之，通過將鼠p35IL-12亞單位cDNA融合至先前制備的huKS-muγ2a重鏈編碼區(qū)，完成這一步驟。然后將所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)染入NS/0骨髓瘤細(xì)胞系中，所述細(xì)胞系用p40IL-12亞單位預(yù)先轉(zhuǎn)染并能夠表達(dá)p40 IL-12亞單位。換句話說，單獨(dú)用p40轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，選擇穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞，然后用其作為含p35融合蛋白轉(zhuǎn)染的受體(即順序轉(zhuǎn)染(sequential transfection))。
從用伴刀豆凝集素A(5μg/ml，在培養(yǎng)基中3天)激活的脾細(xì)胞制備的mRNA，通過PCR分離鼠p35和p40IL-12亞單位。所述PCR引物用于分離編碼p35的核酸序列，同時(shí)將p35 cDNA修改為XmaⅠ-XhoⅠ限制片段，所述引物包括5’CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO:13)；和5’CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NO:14)。
用于分離編碼p40的核酸序列的PCR引物包括5’TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NO:15)；和5’CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(SEQ ID NO:16)。
按照所述(Gillies等J.Immunol.Methods 125:191)構(gòu)建質(zhì)粒載體(pdHL7-huKS-muγ2a-p35)，它含有dhfr選擇標(biāo)記基因、一個編碼人源化KS抗體輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位和一個編碼融合至鼠IL-12的p35亞單位的鼠重鏈的轉(zhuǎn)錄單位。通過將修改的p35亞單位cDNA的XmaⅠ至XhoⅠ片段連接至先前制備的鼠γ2a基因CH3外顯子末端的單一XmaⅠ位點(diǎn)，完成融合。H鏈和L鏈轉(zhuǎn)錄單位均于5’端包含一個巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(取代原始參比序列中金屬硫蛋白啟動子)，于3’端包含一個聚腺苷酸化位點(diǎn)。
構(gòu)建相似的載體(pNC-p40)以表達(dá)游離的p40亞單位，所述載體包含一個選擇標(biāo)記基因(新霉素抗性基因)、但仍使用CMV啟動子用于轉(zhuǎn)錄。在這種情況下的編碼區(qū)包括p40亞單位的天然前導(dǎo)序列，以正確地轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與所述融合蛋白一起裝配。將質(zhì)粒pNC-p40電穿孔到細(xì)胞中，將細(xì)胞鋪平板，并在含G418的培養(yǎng)基中選擇。在這種情況下，通過ELISA測試來自抗藥性克隆的培養(yǎng)上清液的p40亞單位的產(chǎn)生。
按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，將pdHL7-huKS-muγ2a-p35表達(dá)載體電穿孔到已經(jīng)表達(dá)鼠p40的NS/0細(xì)胞系中。通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法，測試抗氨甲蝶呤的轉(zhuǎn)染克隆的抗體決定簇和鼠IL-12的分泌。按照生產(chǎn)商的說明，通過結(jié)合至A蛋白Sepharose柱，并從該柱洗脫，純化所產(chǎn)生的蛋白。muFc-muEndo基本上按照1998年8月25日申請的U.S.S.N.60/097,883所述，構(gòu)建和表達(dá)編碼muFc-muEndo融合蛋白的基因。
簡而言之，將鼠endostatin和鼠Fc作為muFc-muEndostatin融合蛋白表達(dá)。用PCR改變endostatin基因以在pdCs-muFc(D4K)載體中表達(dá)(Lo等(1998)Protein Engineering 11:495-500)，該載體含有一個腸激酶識別位點(diǎn)Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.268:23311-23317)。正向引物為5’-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C(SEO ID NO:17)，其中在AAGCTT(HindⅢ位點(diǎn))之后接編碼endostatinN末端的序列(粗體)。反向引物為5’-CCC CTC GAG CTA TTT GGAGAA AGA GGT C(SEQ ID NO:18)，該引物用來將翻譯終止密碼子(反密碼子，CTA)緊接endostatin C末端后放置，此后為一個XhoⅠ位點(diǎn)(CTCGAG)。
將PCR產(chǎn)物克隆并測序，將編碼endostatin的HindⅢ-XhoⅠ片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體中。用抗muFc ELISA選擇穩(wěn)定的表達(dá)muFc(D4K)-muEndo的NS/0克隆并對其分析。表達(dá)所產(chǎn)生的融合蛋白，并通過A蛋白Sepharose色譜純化所述融合蛋白。實(shí)施例3．采用KS-IL2和KS-IL12融合蛋白的聯(lián)合療法用于治療LLC-Ep腫瘤.
已知IL-12通過依賴于IFN-γ的機(jī)制抑制血管生成(Voest等，J.NatlCanc.Inst.87:581-586)，所述機(jī)制進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)COX-2活性、另一PG的產(chǎn)生和IL-10的誘導(dǎo)。為了確定將IL-12給予所述腫瘤微環(huán)境是否可以用來克服PG的免疫抑制效應(yīng)，以及是否可以使定向(targeted)IL-2激活對所述腫瘤的細(xì)胞免疫破壞，將用huKS-muγ2a-muIL2和huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的組合處理的效應(yīng)與僅用各個融合蛋白處理的效應(yīng)進(jìn)行比較。
在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的LLC-Ep細(xì)胞(5×105/小鼠)。約2周后，將具有范圍為150-400mm3的可觸知腫瘤的動物分為4組，各組之間腫瘤大小的分布相同。對動物如下處理在組1中，動物僅接受PBS(對照組)；在組2中，動物僅接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白；在組3中，動物僅接受huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白；在組4中，動物接受huKS-muγ2a-muIL2和huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白。通過測量體積監(jiān)測腫瘤生長，直至對照組的動物瀕死并將其無痛致死。用測徑規(guī)測量腫瘤體積，并按以下公式計(jì)算V=4π/3(0.5L×0.5W×0.5H)，其中L為腫瘤長度，W為腫瘤寬度，而H為腫瘤高度。
圖3概述了結(jié)果。用PBS處理的小鼠用空心菱形表示，用15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白處理的小鼠用實(shí)心方形表示，用10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白處理的小鼠由實(shí)心三角形表示，而用7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的組合處理的小鼠用打叉表示。
如圖3所示，用huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(15μg連續(xù)5天)處理不延遲或減少LLC-Ep腫瘤的生長(實(shí)心方形)。在單獨(dú)用10μghuKS-muγ2a-muIL12融合蛋白/劑連續(xù)5天處理的小鼠中觀察到僅略有抗腫瘤效應(yīng)(實(shí)心三角形)。這提示，IL-12的效應(yīng)不足以觸發(fā)足夠的免疫應(yīng)答以顯著減慢腫瘤的生長。然而，當(dāng)以每種融合蛋白各一半原始量(分別為7.5μg huKS-muγ2a-muIL2和5μg huKS-muγ2a-muIL12)將這兩種融合蛋白組合時(shí)，觀察到顯著的生長延遲(打叉)，提示在這兩種融合蛋白之間有協(xié)同作用。盡管這種觀察到的協(xié)同作用的機(jī)制是未知的，但它可能部分歸因于克服腫瘤產(chǎn)生的前列腺素對IL-10的誘導(dǎo)。實(shí)施例4．抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和endostatin的聯(lián)合療法。
IL-2和IL-12抗體融合蛋白的組合表現(xiàn)出顯著的抗大腫瘤的腫瘤活性，而用抗體-IL-2融合蛋白和前列腺素抑制劑可能可以得到相似的結(jié)果。
將表達(dá)人EpCAM的小鼠CT26癌細(xì)胞皮下注射BALB/c小鼠已剃毛的背部(2×106細(xì)胞/注射)。當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到100-200mm3(約7-14天)時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組4只。組1每日接受0.2ml PBS的靜脈注射。組2每日接受muFc-muEndostatin(320μg/小鼠)的PBS溶液的靜脈注射。組3僅接受huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(10μg/小鼠)的PBS溶液的靜脈注射，注射5天。組4接受PBS中的huKS-huγ4-huIL2(10μg/小鼠)和muFc-Endo(320μg/小鼠)靜脈注射5天，此后每天接受PBS中的muFc-Endo(320μg/小鼠)靜脈注射。按實(shí)施例3所述測量腫瘤體積。
圖4總結(jié)了結(jié)果。用PBS處理的小鼠用實(shí)心菱形表示，用muFc-muEndo融合蛋白處理的小鼠用實(shí)心方形表示，用huKS-huγ4-huIL2融合蛋白處理的小鼠由實(shí)心菱形表示，而用muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的組合處理的小鼠用打叉表示。
圖4表明，所述抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和所述前列腺素蛋白muFc-muEndo的組合優(yōu)于這兩種因子本身中任一種。處理19天后，huKS-huγ4-huIL2和muFc-muEndo聯(lián)合療法的T/C比(處理組的平均腫瘤大小/對照組的平均腫瘤大小)為0.25，這與huKS-huγ4-huIL2的T/C為0.31以及muFc-muEndo的T/C為0.42相比，有顯著提高。實(shí)施例5．抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和吲哚美辛的聯(lián)合療法。
在該實(shí)驗(yàn)中，用IL-2融合蛋白和一種COX-2抑制劑-吲哚美辛處理小鼠。在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射LLC-Ep細(xì)胞(2×106/注射)。當(dāng)腫瘤達(dá)到600-1200mm3時(shí)處死小鼠。用聚烯吡酮碘和乙醇清潔覆蓋腫瘤的皮膚，切下腫瘤并棄去壞死組織。通過使活腫瘤組織通過篩網(wǎng)，然后通過一系列連續(xù)變小的22-30號低溫針，制備腫瘤細(xì)胞在磷酸緩沖鹽水中的懸浮液。調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度為1×107細(xì)胞/ml，并置于冰上。然后在C57B1/6小鼠背部近中線皮下注射0.1ml新鮮在再懸浮的細(xì)胞(1×106細(xì)胞/小鼠)。
當(dāng)腫瘤的大小達(dá)到100-200mm3(約7-14天)時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。組1每日接受0.2ml PBS的靜脈注射。組2每日接受PBS中的huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)靜脈注射共5天。組3在整個處理期間在飲用水中口服接受吲哚美辛(20μg/ml，或每日消費(fèi)約60-70μg吲哚美辛/小鼠)。組4每日接受huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)的靜脈注射共5天，在整個處理期間在飲用水中口服吲哚美辛(20ug/ml)。按實(shí)施例3所述測量腫瘤體積。
圖5展示了結(jié)果。用PBS處理的小鼠用實(shí)心菱形表示，用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白處理的小鼠用實(shí)心方形表示，用吲哚美辛處理的小鼠由實(shí)心三角形表示，而用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的組合處理的小鼠用打叉表示。
圖5表明，抗體-細(xì)胞因子融合蛋白和所述抗血管生成化學(xué)化合物吲哚美辛的組合由優(yōu)于這兩種因子本身中的任一種。處理22天后，huKS-huγ4-huIL2和吲哚美辛聯(lián)合療法的T/C比為0.40，這與huKS-huγ4-huIL2的T/C為0.61以及吲哚美辛的T/C為0.60相比，有顯著提高。
等同方案在不違背本發(fā)明的精神和基本特征的情況下，本發(fā)明可以具體體現(xiàn)為其中具體形式。因此，上述實(shí)施方案在所有方面應(yīng)被認(rèn)為是說明性的，而不限制本文所述的發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書指明，而不是由前述說明書指明，在所述權(quán)利要求書等同方案意義和范圍內(nèi)的所有變化均包括在本發(fā)明內(nèi)。
通過引用而結(jié)合上文公開的每個專利文獻(xiàn)和科學(xué)出版物均通過引用結(jié)合到本文中。
序列表<110>Gillies,Stephen D<120>通過共同給予前列腺素抑制劑增強(qiáng)抗體-細(xì)胞因子融合蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答<130>LEX-004PC<140><141><150>60/082,166<151>1998-04-17<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<220><221>misc_特征<222>(12)...(14)<223>翻譯起始密碼子<400>1tctagagcag catggcgccc ccgc24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<220><221>misc_特征<222>(7)...(9)<223>翻譯終止反密碼子<400>2ctcgagttat gcattgagtt ccct 24<210>3<211>35100393.01<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>3ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc 35<210>4<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>4ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg37<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>5cttaagccag atccagttgg tgcag 25<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>6cccggggtcc gggagaagct cttagtc27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>7ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>8ccctcgagtt attgagggct tgttg25<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>9ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg32<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>10gcagcattag cccgttttat ttccagcttg gtcc 34<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>11cttaagcgag atcgtgctga cccag25<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>12ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc 29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>13ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg28<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>14ctcgagtcag gcggagctca gatagc 26<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>15tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 28<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>16ctcgagctag gatcggaccc tgcag25<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>17ccccaagctt catactcatc aggactttc 29<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>18cccctcgagc tatttggaga aagaggtc28
權(quán)利要求
1．在哺乳動物中誘導(dǎo)針對預(yù)定細(xì)胞類型的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的抗體結(jié)合位點(diǎn)和一個能夠誘導(dǎo)針對所述預(yù)定細(xì)胞類型的所述免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，和(ⅱ)前列腺素抑制劑，其量足以相對于僅用免疫綴合物而言而增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述預(yù)定細(xì)胞類型為癌細(xì)胞。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述預(yù)定細(xì)胞類型為病毒感染的細(xì)胞。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述前列腺素抑制劑與所述免疫綴合物一起共同給予。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述前列腺素抑制劑在給予所述免疫綴合物之前給予。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區(qū)、一個CH1結(jié)構(gòu)域和一個CH2結(jié)構(gòu)域。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含連接至所述CH2結(jié)構(gòu)域羧基末端的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
8．權(quán)利要求l的方法，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結(jié)合位點(diǎn)，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、一個免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，和(ⅱ)所述細(xì)胞因子。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含插入所述CH2結(jié)構(gòu)域和所述細(xì)胞因子之間的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
10．權(quán)利要求l的方法，其中所述免疫綴合物的所述細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
11．權(quán)利要求1的方法，其中所述前列腺素抑制劑選自環(huán)加氧酶抑制劑、維生素A類化合物、細(xì)胞因子和腫瘤血管生成的抑制劑。
12．在哺乳動物中誘導(dǎo)針對癌細(xì)胞的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結(jié)合所述癌細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)和一個能夠誘導(dǎo)針對所述腫瘤細(xì)胞的所述免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，和(ⅱ)環(huán)加氧酶抑制劑，其量足以相對于僅用免疫綴合物而言而增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述環(huán)加氧酶抑制劑與所述免疫綴合物一起共同給予。
14．權(quán)利要求12的方法，其中所述環(huán)加氧酶抑制劑在給予所述免疫綴合物之前給予。
15．權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區(qū)、一個CH1結(jié)構(gòu)域和一個CH2結(jié)構(gòu)域。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含連接至所述CH2結(jié)構(gòu)域羧基末端的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
17．權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含(ⅰ)抗體結(jié)合位點(diǎn)，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、一個免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，和(ⅱ)所述細(xì)胞因子。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含插入所述CH2結(jié)構(gòu)域和所述細(xì)胞因子之間的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
19．權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫綴合物的所述細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
20．在哺乳動物中誘導(dǎo)針對預(yù)定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答的組合物。所述組合物結(jié)合包含(ⅰ)免疫綴合物，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型的抗體結(jié)合位點(diǎn)和一個能夠在所述哺乳動物中誘導(dǎo)針對所述預(yù)定細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，和(ⅱ)前列腺素抑制劑，其量足以相對于僅用免疫綴合物而言而增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答。
21．權(quán)利要求20的組合物，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)以氨基末端至羧基末端的方向包含一個免疫球蛋白可變區(qū)、一個CH1結(jié)構(gòu)域和一個CH2結(jié)構(gòu)域。
22．權(quán)利要求21的組合物，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含連接至所述CH2結(jié)構(gòu)域羧基末端的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
23．權(quán)利要求20的組合物，其中所述免疫綴合物為一種融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方向包含(ⅰ)抗體結(jié)合位點(diǎn)，包含一個能夠結(jié)合預(yù)定細(xì)胞類型上的細(xì)胞表面抗原的免疫球蛋白可變區(qū)、一個免疫球蛋白CH1結(jié)構(gòu)域、一個免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域，和(ⅱ)所述細(xì)胞因子。
24．權(quán)利要求23的組合物，其中所述抗體結(jié)合位點(diǎn)還包含插入所述CH2結(jié)構(gòu)域和所述細(xì)胞因子之間的一個CH3結(jié)構(gòu)域。
25．權(quán)利要求20的組合物，其中所述免疫綴合物的所述細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
26．權(quán)利要求20的組合物，其中所述前列腺素抑制劑選自環(huán)加氧酶抑制劑、維生素A類化合物、細(xì)胞因子和腫瘤血管生成的抑制劑。
27．權(quán)利要求20的組合物，其中所述預(yù)定細(xì)胞類型為癌細(xì)胞。
全文摘要
公開了在哺乳動物中增強(qiáng)針對預(yù)定細(xì)胞類型的殺細(xì)胞免疫應(yīng)答的組合物和方法。所述方法和組合物依賴于抗體—細(xì)胞因子免疫綴合物和前列腺素抑制劑的組合。一旦給予所述哺乳動物后;由于通過所述前列腺素抑制劑的免疫增強(qiáng)作用,所述免疫綴合物誘導(dǎo)的針對所述預(yù)定細(xì)胞類型(例如癌細(xì)胞)的免疫應(yīng)答大于僅用所述免疫綴合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述方法和組合物在殺傷哺乳動物中的實(shí)體瘤或病毒感染細(xì)胞方面特別有用。
文檔編號C07K19/00GK1305387SQ99807250
公開日2001年7月25日 申請日期1999年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月17日
發(fā)明者S·D·吉利斯 申請人:利思進(jìn)藥品公司