專利名稱：肽基－脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于治療多種疾病的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制劑，包含這些抑制劑的藥物組合物及其應(yīng)用方法。本發(fā)明進(jìn)一步描述了一個典型的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶，Pin1，與一底物類似物復(fù)合或與一Pin1活性抑制劑復(fù)合的三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也考慮了采用這些三維結(jié)構(gòu)以設(shè)計新抑制劑的合理藥物設(shè)計方法。
背景技術(shù)：
隨著所要抑制的酶的三維結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的出現(xiàn)，設(shè)計有效和特異的抑制劑的過程得到了改進(jìn)。通常一個酶的三維模型是通過建立一個純化酶的晶體形式，然后對該形式進(jìn)行X線衍射和分析而產(chǎn)生的。雖然這一程序提供了某些可用于設(shè)計抑制劑的有價值的信息，但仍然缺乏對其氨基酸殘基的了解，這些殘基對于它們與底物或底物類似物的相互作用是重要的。為解決這些缺陷，最近將酶與底物、底物類似物或已知的酶活性抑制劑進(jìn)行共結(jié)晶化，因此可以確定重要的相互作用(見，如，Mohammadi等，Science 276:955-960,1997；Lee等，Biochemistry36:13180-13186,1997；Brzozowski等，Nature 389:753-758,1997)。
肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)，或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，是一個在蛋白質(zhì)折疊、裝配和運輸中有重要作用的酶家族。它們作為催化劑促進(jìn)肽基-脯氨酰鍵的異構(gòu)化，該鍵能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能有重要的作用。PPIase分為三類，cyclophilins、FK-506結(jié)合蛋白(FKBPs)和Pin1/小小霉素類。雖然cyclophilins和FKBPs因其分別與免疫抑制分子環(huán)孢菌素和FK-506結(jié)合的能力而得以區(qū)分，而Pin1/小小霉素類則與這些免疫抑制劑均不結(jié)合，且其結(jié)構(gòu)與其他兩類無關(guān)。已知的Pin1/小小霉素類成員包括Pins 1-3(Lu等，Nature 380:544-547,1996)、Pin-L(Campbell等，Genomics 44:157-162,1997)、小小霉素(Rahfeld等，F(xiàn)EBS Letts352:180-184,1994)、dodo(Maleszka等，Proc Natl Acad Sci USA93:447-451,1996)和Ess1/Pft1(Hanes等，Yeast 5:55-72,1989；和Hani等，F(xiàn)EBS Letts 365:198-202,1995)。
最近的研究證明Pin1/小小霉素類物質(zhì)是細(xì)胞周期，特別是有絲分裂的基本調(diào)節(jié)者。Lu等，Nature 380:544-547,1996(引入作為參考)報道，在酵母或人細(xì)胞中去除Pin1/Ess1導(dǎo)致有絲分裂阻滯，進(jìn)而凋亡，表明此類酶在細(xì)胞分裂和增殖中具有重要的功能。
設(shè)計新的、高度特異性的抗有絲分裂劑是藥物工廠的重要需要。這種藥劑可作為有效的化療藥，用于治療以異常細(xì)胞增生為主要特征的各種疾病，包括癌癥和感染性疾病。在此公開的發(fā)明解決了這一問題和相關(guān)的需求，正如將在規(guī)范綜述和附加權(quán)利要求中所顯現(xiàn)的。
發(fā)明的簡要說明根據(jù)本發(fā)明，提供了抑制肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶，也稱PPIase的方法和化合物。尤其是，發(fā)明的化合物抑制PPIase的Pin1/小小霉素類成員的活性，該類成員在細(xì)胞周期，特別是有絲分裂期中呈現(xiàn)重要的功能。因此，本發(fā)明的化合物可被用在藥物組合物中，以治療以異常細(xì)胞增生為特征的疾病(如癌癥)和感染性疾病(如細(xì)菌感染、真菌感染)等。
在此還提供了Pin1，即一種特異的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶的三維晶體結(jié)構(gòu)，以及應(yīng)用此結(jié)構(gòu)設(shè)計Pin1活性的特異性抑制劑，及PPIase小小霉素亞家族其他成員抑制劑的方法。
插圖的簡要說明

圖1是Pin1晶體的帶狀圖示。
圖2是Pin1晶體與底物類似物H3N+-AlaPro-COO-結(jié)合的活性部位的特寫圖示。
發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明，提供了PPIase，特別是PPIase的Pin1/小小霉素亞家族成員的抑制劑。一般來說，本發(fā)明的抑制劑具有以下的結(jié)構(gòu)ⅠA-X-R(Ⅰ)
其中A是一個類似磷酸絲氨酸和/或磷酸蘇氨酸殘基空間結(jié)構(gòu)和電荷特性的基團(tuán)，X是一個間隔基(spacer)，和R是一個至少與被一個親水部分取代的四氫化吡咯環(huán)一樣疏水的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員很容易認(rèn)可的，多種間隔基可用在本發(fā)明的實施中，如間隔基X可選自 R可以是類似一個脯氨酰基空間結(jié)構(gòu)和電荷特性的多種環(huán)狀系統(tǒng)中的任何一個。因此，R可以是，如，環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜環(huán)芳基、取代的雜環(huán)芳基、等。
結(jié)構(gòu)Ⅰ的基團(tuán)A可同樣地選自類似一個磷酸絲氨酸和/或磷酸蘇氨酸殘基空間結(jié)構(gòu)和電荷特性的多種基團(tuán)。具有這些特性的合適基團(tuán)的例子包括基團(tuán)Ⅱ,Ⅲ，或Ⅳ，如下所示 其中Rx是一個具有分子量不超過大約250的有機(jī)基團(tuán)，Ra是H、鹵代或低級烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,其中每個Y均單獨地選自-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,或NH-CH(CF3)2,其中每個Rc分別是氫或低級烷基，每個Rd分別是氫、低級烷基、烷基羰基，和m=1或2，或Rz-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基，等，或Rb-取代Cy(het)-(Ⅳ)其中Cy(het)是一個5,6，或7元雜環(huán)，其中的雜環(huán)原子與結(jié)構(gòu)Ⅰ的X相連，Rb如上定義。
在上述的部分Ⅱ中，有機(jī)基團(tuán)Rx可以是多種取代基中的任何一個，所述取代基如烷基、取代的烷基、環(huán)烷基或取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基或取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基或取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)或取代的雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基或取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基，或Ry-Q-其中Ry是烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的雜芳基，和Q是-C(O)-NH-,-C(O)-O-,-C(O)-，或-O-。
特別是，當(dāng)A是上面的結(jié)構(gòu)Ⅱ時，Rx可以是氨基酸殘基(如，一個亮氨酸基部分、脯氨?；糠值?，也可以是 在上面的Ⅲ部分中，Rz的具體實例包括 其中Ra和Rb如上定義，或Ⅲ部分可以是(Rb,)Cy-其中Cy是環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)、芳基或雜芳基，和Rb，是-(CRc2)0-4-CHmY3-m,其中每個Y分別為-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、-NH-CH(CF3)2，每個Rc分別為氫或低級烷基，每個Rd分別為氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2。
目前打算用于本發(fā)明實施的優(yōu)選的化合物包括以下部分A:-(CH2)2COOH；-(CH2)3COOH；-CH2CH(COOH)2；-(CH2)2CH(COOH)2；-(CH2)2CF3；-(CH2)3CF3；-CH2CH(CF3)2；-(CH2)2CH(CF3)2；-CH2COH(CF3)2；-(CH2)2COH(CF3)2；-CHCH3OPO3H2；-CHCH3NHPO3H2；-CHCH3CH2PO3H2；-CH2OPO3H2；-(CH2)2OPO3H2；-CH2NHPO3H2；-(CH2)2NHPO3H2；-(CH2)2PO3H2；或-(CH2)3PO3H2； R吡咯基，吡啶基，苯基或戊烷基。
在此所用的“烷基”是指具有高達(dá)12個碳原子的直鏈或支鏈烴基基團(tuán)，“取代的烷基”包括進(jìn)一步含有一個或多個取代基團(tuán)的烷基基團(tuán)，該取代基選自羥基、烷氧基(低級烷基的烷氧基)、巰基(mecapto)(低級烷基的巰基)、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、芳氧基、取代的芳氧基、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、硝酮、氨基、酰氨基、-C(O)H、?；?、氧?；?oxyacyl)、羧基、氨基甲酸鹽、磺酰基、磺胺、硫?；?，等。
在此所用的“鏈烯基”是指含有2到12個碳原子，而且含有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈烴基，“取代的鏈烯基”包括進(jìn)一步含有上述一個或多個取代基的鏈烯基。
在此所用的“炔基”是指含有2到12個碳原子，而且含有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈烴基團(tuán)，“取代的炔基”包括進(jìn)一步含有如上所述的一個或多個取代基的炔基。
在此所用的“環(huán)烷基”是指含有大約3到13個碳原子的含環(huán)的環(huán)基基團(tuán)，“取代的環(huán)烷基”是指進(jìn)一步含有上面列出的一個或多個取代基團(tuán)的環(huán)烷基。
在此所用的“雜環(huán)”是指具有3到14個碳原子的、含有一個或多個雜原子(如，N,O,S，等)作為環(huán)結(jié)構(gòu)一部分的環(huán)狀(即含環(huán))基團(tuán)，“取代的雜環(huán)”是指進(jìn)一步含有一個或多個上面列出的取代基團(tuán)的雜環(huán)基。
在此所用的“芳基”是指有6到14個碳原子的芳香基，“取代的芳基”是指進(jìn)一步含有一個或多個上面列出的取代基團(tuán)的芳基。
在此所用的“雜芳基”是指含有一個或多個雜原子(如，N,O,S，或類似原子)作為其結(jié)構(gòu)一部分、并含有3到14個碳原子的芳香基團(tuán)，“取代的雜芳基”是指進(jìn)一步含有一個或多個上面列出的取代基的雜芳基。
本發(fā)明的另一個方面包括使用PPIase活性物抑制劑的治療方法。已知PPIase的Pin1/小小霉素類酶對有絲分裂是很重要的。這種酶已在細(xì)菌、真菌、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中得到確認(rèn)。因此本發(fā)明的化合物可以用于治療涉及有絲分裂或細(xì)胞增殖的大量疾病。
計劃采用本發(fā)明的化合物和在此公開的方法治療的細(xì)胞增殖性疾病包括以有害的、不適當(dāng)?shù)幕虿皇芸刂频募?xì)胞生長為特征的疾病。特殊的實例包括癌癥、纖維變性疾病、非腫瘤性生長如良性前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、銀屑病等。根據(jù)本發(fā)明考慮治療的癌癥包括，實體腫瘤和造血系統(tǒng)癌癥如白血病和淋巴瘤。
采用本發(fā)明化合物和方法可以治療的實體腫瘤包括癌、肉瘤、骨瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤等。預(yù)期治療的特殊癌癥包括乳癌、腦癌、肺癌(非小細(xì)胞和小細(xì)胞)、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、頭頸部癌等。
纖維變性疾病一般是以非癌癥性纖維母細(xì)胞的異常過度增生為特征的。實例包括纖維肌瘤、纖維化(囊性纖維化、肝纖維化、特發(fā)性肺纖維化、心包纖維化等)、心臟纖維瘤、纖維肌性增生、心瓣膜術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化、纖維肌炎，等。
另外本發(fā)明化合物還可以用于抑制病原生物的有絲分裂，因此可用于治療感染性疾病。通過在此公開的方法可治療的特殊感染性疾病包括細(xì)菌感染和真菌感染。
預(yù)期采用本發(fā)明化合物和方法治療的細(xì)菌感染包括由革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染，包括由葡萄球菌、梭狀芽胞桿菌、鏈球菌、腸球菌、雙球菌、嗜血桿菌、奈瑟氏菌、丹毒絲菌(Erysipelothricosis)、李斯特桿菌、芽胞桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、埃希氏桿菌、克雷白桿菌、腸桿菌、沙雷菌、變形桿菌、摩根氏菌、普羅威登斯菌、耶爾森菌、Camphylobacter、分支桿菌，等引起的感染。由這些生物體引起的感染可導(dǎo)致多種疾病，包括肺炎、腹瀉和痢疾、炭疽、風(fēng)濕熱、中毒性休克綜合征、乳突炎、腦膜炎、淋病、傷寒熱、腸胃炎、布氏桿菌病、霍亂、黑死病、破傷風(fēng)、結(jié)核、萊姆氏病，等。
預(yù)期用本發(fā)明化合物和方法治療的真菌感染包括全身性真菌感染、皮膚癬病和生殖-尿道真菌感染。全身性真菌感染包括由組織胞漿菌、球孢子菌、隱球菌、芽生菌(blastocyces)、巴西類球孢子菌、念珠菌、曲霉菌、奴卡氏菌、孢子絲菌、酒曲菌、犁頭霉菌、毛霉菌、單孢枝霉菌、瓶霉菌、鼻孢子蟲屬，等引起的感染。皮膚真菌感染包括由小孢子菌屬、毛癬菌、表皮癬菌、念珠菌、糠秕癬菌屬，等引起的感染。生殖-尿道真菌病包括由念珠菌、隱球菌、曲霉菌、zygomycodoides，等引起的感染。這些生物的感染可以引起許多疾病，如癬、鵝口瘡、圣華金河熱或球孢子菌病(山谷熱)、Gilcrist氏病，等。這些感染在免疫系統(tǒng)抑制的病人如器官移植受者和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病人中可特別嚴(yán)重，甚至致命。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的化合物可被用作殺蟲劑。本發(fā)明的化合物可阻止昆蟲細(xì)胞的有絲分裂，因此可被用于控制多種蟲害的生長和增殖。本發(fā)明的這個方面在農(nóng)業(yè)中具有重要的用途，如在田地中、在農(nóng)作物的儲存中等。另外，本發(fā)明的化合物可用于控制人居住地的昆蟲數(shù)量，如家庭、辦公室等。
如這里所述的選作治療用途的特定發(fā)明化合物可單獨或以藥物組合物給予患者，在藥物組合物中，發(fā)明的化合物與合適的載體或賦形劑混合。在對患者的治療中，給予有效治療劑量(即活性組合物)的該化合物。有效治療劑量是指產(chǎn)生癥狀改善或延長患者生存時間的活性組合物的量。
一個化合物的毒性和治療效應(yīng)可以通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序，在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏写_定。細(xì)胞培養(yǎng)實驗和動物研究可用來確定LD50(半數(shù)致死量)和ED50(半數(shù)有效量)。毒性和治療效應(yīng)的劑量比例是治療指數(shù)，可表述為LD50/ED50的比值。具有較大治療指數(shù)的化合物是首選的。從這些細(xì)胞培養(yǎng)實驗和動物實驗中獲得的數(shù)據(jù)可用來形成適用于人的劑量范圍。這些化合物的劑量優(yōu)選在包括ED50而很少或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可在此范圍內(nèi)根據(jù)多種因素而變化，如所用的劑量形式、采用的給藥途徑、患者的狀況等。
對在本發(fā)明方法中應(yīng)用的任何化合物，治療的有效劑量最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中通過確定IC50(即，達(dá)到PPIase活性最大抑制一半的檢測物質(zhì)的濃度)來估計。然后可以在動物模型中形成一個劑量，以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50的循環(huán)血漿濃度范圍。此信息可用來更準(zhǔn)確的確定人的可用劑量。血漿中的水平可通過如HPLC以測定。實際的劑型、給藥途徑和劑量可由每個醫(yī)生視病人的狀況選擇(見Fingl等1975在“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第一章pl)。
應(yīng)該注意的是，主治醫(yī)生應(yīng)當(dāng)根據(jù)毒性、器官功能障礙等知道何時和怎樣中止、中斷或調(diào)整給藥。相反的，如果臨床反應(yīng)不夠(排除毒性)，主治醫(yī)生應(yīng)當(dāng)知道如何調(diào)整治療到更高的水平。在目的疾病的處理中，給藥劑量的程度，將根據(jù)要治療情況的嚴(yán)重性、給藥途徑等而變化。例如，情況的嚴(yán)重性可部分通過標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)后評價方法被估計。此外，劑量和可能的劑量使用頻率也將根據(jù)年齡、體重和每個病人的反應(yīng)而變化。一般，劑量將在大約1-10mg/kg體重間。給予兒童大約1mg到大約50mg，給予成人大約25mg到大約1000mg。與上述相似的程序可被用于獸藥。
根據(jù)所要處理的特殊狀況，這些藥物可制成全身或局部制劑和用藥。制劑和用藥的技術(shù)可見于“Remington’s藥物科學(xué)”1990，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,PA。合適的給藥途徑包括口服、直腸、經(jīng)皮、陰道、經(jīng)粘膜或腸道給藥；胃腸外給藥，包括肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射，只列出了一些。
為注射用，本發(fā)明的化合物可配在水溶液中，優(yōu)選在生理相容的緩沖液中，如Hank’溶液、林格氏液、或生理鹽水緩沖液。為經(jīng)粘膜給藥，劑型中采用適合所要穿透的屏障的滲透劑。這些滲透劑一般為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知。
應(yīng)用藥學(xué)可接受的載體，以將在此公開的化合物制成適合全身應(yīng)用的制劑，在本發(fā)明的范疇內(nèi)。經(jīng)過選擇正確的載體和合適的制造方法，本發(fā)明的組合物，特別是那些制成溶液的制劑，可經(jīng)胃腸外給藥，如經(jīng)過靜脈注射。采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的藥學(xué)可接受的載體，化合物可以容易地制成適合口服的劑型。這些載體能夠使本發(fā)明的化合物制成片劑、丸劑、膠囊劑、糖衣片、液體、凝膠、糖漿、混懸液、懸液等，以供治療的患者口服。
試圖細(xì)胞內(nèi)給藥的藥物可采用本領(lǐng)域普通人員已知的技術(shù)給藥。如，這些藥物可以包被在脂質(zhì)體中，然后如上所述給藥。脂質(zhì)體是具有水內(nèi)心的球形脂質(zhì)雙層體。在脂質(zhì)體形成時，存在于水溶液中的所有分子摻入到水內(nèi)心中。脂質(zhì)體的內(nèi)容物可被保護(hù)以避免外部微環(huán)境的破壞，而且因脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，可被有效地運輸?shù)郊?xì)胞漿內(nèi)。涉及脂質(zhì)體的輸送系統(tǒng)可見于國際專利出版物第WO91/02805號和國際專利出版物第WO91/19501號，以及美國專利第4,880,635 Janoff等。這些出版物和專利提供了對脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)技術(shù)的有用的描述，并在此全部作為參考。
預(yù)期在本發(fā)明中應(yīng)用的藥學(xué)組合物包括其中含有效量活性成分的組合物，以達(dá)到所需的目的。確定有效的劑量是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員能力所及的，特別是根據(jù)在此公開的細(xì)節(jié)。
除了活性成分，這些藥物組合物可含有合適的藥學(xué)可接受的賦形劑和輔劑，輔劑可促進(jìn)活性化合物成為可藥用制劑的過程。
本發(fā)明的藥物組合物可以其本身已知的方式制備，如通過常規(guī)的混合、溶解、?；?、制備糖衣、研磨、乳化、密封、截留、凍干過程等。
胃腸外給藥的藥物劑型包括以水溶解形式的活性化合物的水溶液。另外，活性成分的懸液可以制備成適合的油性注射懸液。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油，如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸液可含有增加懸液粘度的化合物，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、葡聚糖等。可選擇的是，懸液也可含有合適的穩(wěn)定劑或可以增加化合物溶解性的試劑，以可能制備高濃度的溶液。
用于口服使用的藥學(xué)制劑可通過混合活性化合物與固體賦形劑獲得，可選擇地碾磨所得到的混合物，如果需要，加入合適的輔劑后，對顆粒的混合物進(jìn)行加工以制成片劑或糖衣片核心。
特別地，合適的賦形劑是，填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等；纖維素制劑，如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、土豆淀粉、明膠、黃芪樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等，以及它們?nèi)魏蝺煞N或兩種以上的混合物。如果需要，可以加入分裂劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或它們的鹽類，如海藻酸鈉等。
糖衣片核心包以合適的被衣。為此目的，可使用濃縮的糖溶液，可選擇的包括阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羰乙烯膠、聚乙烯甘油、二氧化鈦、紫膠漆溶液、合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物，等。染料或色素可以加入片劑或糖衣片被衣中，以區(qū)別或定特征于不同組合的活性化合物劑量。
可用于口服的藥物制劑包括由明膠制成的推-拉式膠囊，以及由明膠和增塑劑，如甘油或山梨醇，制成的軟的封口的膠囊。推-拉式膠囊可含有活性組合物，混合以填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，和任意的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙烯乙二醇。另外，可加入穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的另一個方面包括Pin1結(jié)晶(單獨或與肽基底物類似物AlaPro的復(fù)合體)，描述這個晶體的等位圖和使用它們來設(shè)計PPIase活性物抑制劑的方法。Pin1晶體的產(chǎn)生在下面的實例中進(jìn)行詳述。得到的Pin1晶體每個不對稱單位中含有一個Pin1分子，并屬于間隔基團(tuán)P43212。主要存在兩種晶體形式；Ⅰ:a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90°；和Ⅱ:a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90°。晶體的等位圖顯示于圖1和圖2。
采用晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)設(shè)計酶活性抑制劑的方法在本領(lǐng)域中為人熟知。因此，在此提供的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可被用于設(shè)計新或改良酶抑制劑。如，Pin1的等位圖可疊加在其他可獲得的有抑制劑與其結(jié)合的類似酶的等位圖上，以便得出這些和相關(guān)抑制劑可能與Pin1結(jié)合的方式?？蛇x擇的是，在合理藥物設(shè)計的實踐中使用的計算機(jī)程序可用來確定化合物，這些化合物可再現(xiàn)類似在Pin1與共結(jié)晶化底物類似物之間的相互作用。而且，對結(jié)合位點相互作用的本質(zhì)的詳細(xì)了解使得對化合物進(jìn)行修飾，以改變或改善溶解性、藥物動力學(xué)等等，而不影響結(jié)合活性成為可能。
計算機(jī)程序是廣泛應(yīng)用的，使得能夠利用在此提供的晶體結(jié)構(gòu)信息執(zhí)行所必需的活動以設(shè)計化合物。實例包括，但不限于，列于下面的計算機(jī)程序Catalyst DatabasesTM-一個可訪問化學(xué)數(shù)據(jù)庫如BioByte Master File,Derwent WDI和ACD的信息檢索程序；Catalyst/HYPOTM-產(chǎn)生化合物的模型并假設(shè)以用候選藥物結(jié)構(gòu)解釋活性變量；LudiTM-通過鑒定和匹配互補極性和疏水基團(tuán)將分子安裝到蛋白質(zhì)的活性位點上；LeapfrogTM-用一個創(chuàng)生計算法(genetic algorithm)采用使用者控制的下參數(shù)“生長”新的配體。
根據(jù)本發(fā)明，在Pin1底物相互作用和催化活性中重要的分子特征已被確定，這些特征已被引入本公開的化合物中。結(jié)構(gòu)分析表明由Pin1殘基Phe-134、Met-130和Leu-122組成的一個疏水小袋形成了底物脯氨酸疏水環(huán)側(cè)鏈的結(jié)合位點，經(jīng)歷催化異構(gòu)的肽基-脯氨酰鍵被Pin1殘基Cys-113、His-59、His157和Ser-154的側(cè)鏈所圍繞。后面這些殘基對稱地分布在鍵的旋轉(zhuǎn)軸周圍，并在異構(gòu)過程中與底物建立了構(gòu)象特異的相互作用。在其他的作用中，這些相互作用在圍繞肽基鍵的羰基碳進(jìn)行旋轉(zhuǎn)的過程中，幫助形成和穩(wěn)定一個四面體的中間體。
最后，Pin1殘基Lys-63、Arg-68和Arg-69在酶的活性部位的入口處形成一個基本的簇(cluster)。在活性位點的這些簇的空間接近于結(jié)合的二肽，表明這個陰離子識別位點優(yōu)先地與底物上脯氨酸的酸性殘基N末端結(jié)合。實際上，在AlaPro二肽的Ala上構(gòu)型的一個谷氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸側(cè)鏈將其各自的陰離子基重疊到在復(fù)雜的晶體結(jié)構(gòu)中結(jié)合的硫酸鹽離子上。
這些酶底物相互作用被用于選擇性設(shè)計PPIase抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)中。因此設(shè)計的本發(fā)明的化合物被包括四個基本特征1)與脯氨酸具有類似的疏水性，2)通過包含帶電荷的酸性基團(tuán)或三氟甲基基團(tuán)代替優(yōu)選的磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸，以維持酶的特異性，3)模擬在異構(gòu)過程中由脯氨酰環(huán)氮設(shè)定的四面體狀態(tài)，和4)維持旋轉(zhuǎn)肽鍵的羰基部分的旋轉(zhuǎn)性。
脯氨酰肽鍵的旋轉(zhuǎn)性和幾何結(jié)構(gòu)已在本發(fā)明化合物中以幾種方式進(jìn)行了模擬。首先，為羰基取代一個次級乙醇在此部位引入了一個四面體的中心，并將化合物的羥基基團(tuán)定位到結(jié)合在酶活性部位His-59或His-157上的有效氫。第二種方法利用了Cys-113假定反應(yīng)性和His-157質(zhì)子提供能力的優(yōu)勢。不象肽鍵有限的旋轉(zhuǎn)，在此部位引入酮部分使得酮部分在酶的活性部位自由旋轉(zhuǎn)。假定Cys-113和His-157側(cè)鏈的定位靠近酮碳原子，有可能形成可反轉(zhuǎn)的半酮縮硫醇，導(dǎo)致酶活性的穩(wěn)定抑制。第三種方式應(yīng)用了四面體模擬物，如磺胺、磷酸酯、和磷酸酰胺類似物，以代替羰基部分。
現(xiàn)在，本發(fā)明將參照下列非限制性的實例進(jìn)行詳述。
實例1-合成的方法本領(lǐng)域的專業(yè)人員認(rèn)識到多種合成技術(shù)可以用來制備發(fā)明的化合物。如，醚可以通過采用合適的還原劑還原酯而成，還原劑如三氟化硼-三乙醚絡(luò)合物或鋰鋁氫化物；可選擇的是，醚可以通過用雷內(nèi)鎳還原硫代羰基酯而成；酯可通過縮合?；u化物和醇類而制成；醛可通過采用合適的氧化劑氧化醇類制成，氧化劑如Cu(Ⅰ)Cl加1,10-二氮雜菲；酮可通過用合適的Grignard試劑與Weinreb酰胺反應(yīng)制備而成；等。
如其他的合成三氟甲基-取代化合物的實例，可容易地通過縮合一個氟化酮(如，全氟代丙酮)與胺，然后用一種合適的還原劑(如，硼氫化鈉)還原得到的中間產(chǎn)物制備而成。
磷酸化的化合物可容易地通過用(tBuO)2PN(iPr)2加四唑處理醇或胺，然后使用合適的氧化劑，如rBu-OOH氧化得到的磷酸酯，最后用合適的酸，如三氟乙酸水解而制成。
實例2-Pin1活性抑制劑的體外實驗本實例描述了三個可用于鑒定Pin1/小小霉素類酶活性的抑制劑的體外實驗。
第一個實驗采用從Heitman等(方法A Comparison to Methods inEnzymology 5:176-187,1993)和Kofron等(Biochemistry30:6127-6134,1991)的改進(jìn)的方法，檢測是否所檢驗的物質(zhì)可以增強(qiáng)或抑制Pin1催化四肽底物異構(gòu)作用的活性。
簡單地說，在進(jìn)行實驗前立即將純化的Pin1(見下面的實例4)稀釋在實驗緩沖液(50mM琥珀酸/二-Tris丙烷，pH7.5,100mM NaCl)中。900μl含有Pin1(終濃度為36mM)的雞尾酒和20μM底物(琥珀酰-AlaGluProPhe-(p)-硝基苯胺，15μM(Bachem,Inc)Ala-磷酸化Ser-ProPhe-(p)-硝基苯胺(nitroanilide))和在合適稀釋劑，如水、磷酸緩沖鹽水(PBS)或二甲亞砜(DMSO)，中稀釋的待檢測物質(zhì)在3.6℃下在分光光度計中平衡。加入冷卻的糜蛋白酶(Sigma)溶液(100μl,1mM水溶液)，混合5秒，測定395nm處p-硝基苯胺的吸收度10分鐘。含有待檢測物質(zhì)的實驗混合物的相對吸收曲線與沒有待檢測物質(zhì)的對照組和有抑制劑量(100～500μM)磷酸酯的對照組進(jìn)行比較。
第二個實驗測定被檢測物質(zhì)調(diào)節(jié)酵母有絲分裂的能力。這個實驗描述于Lu等，Nature 380:544-547,1996中。簡單說，一個單倍體essI-酵母菌株通過基因工程在Gall啟動子控制下表達(dá)Pin1。此菌株在含有半乳糖的培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中正常生長，但在含有葡萄糖的培養(yǎng)基(抑制培養(yǎng)基)中不生長，顯示功能性Pin1對持續(xù)生長的絕對需要。在合適稀釋劑中稀釋的被檢測物質(zhì)以不同的濃度加入到生長在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的細(xì)胞中。對照細(xì)胞不加入被檢測物質(zhì)。經(jīng)過一些時間后，檢測細(xì)胞的總數(shù)量。相比對照細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量的減少表明被檢測物質(zhì)可能是Pin1抑制劑。
第三個實驗測定被檢測物質(zhì)抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂中生長的能力。實驗采用轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，因此可以預(yù)測一種物質(zhì)能用于治療哺乳動物中細(xì)胞增殖異常，如癌癥，的能力。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員認(rèn)識到，存在相似的廣為人知的實驗，以預(yù)測一種物質(zhì)能被用作抗細(xì)菌劑或抗真菌劑的能力。
簡單說，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3(ATCC HTB77)，生長至融合(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM),20％FBS,2mM丙酮酸鈉，4mM谷氨酰胺，20mM HEPES，非必需氨基酸)，胰酶消化，然后用PBS沖洗，并重新懸浮在DMEM 10％FBS,1mM丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES和非必需氨基酸中(實驗培養(yǎng)基)。細(xì)胞然后懸浮在加0.8％SeaPlaque瓊脂糖的實驗培養(yǎng)基中，被檢測物質(zhì)在合適的稀釋劑中稀釋到不同的濃度。混合物置于一個有蓋培養(yǎng)皿，或預(yù)鋪一層加0.8％瓊脂糖實驗培養(yǎng)基底層的多孔塑料板的孔中。將細(xì)胞在100％濕度、10％CO2孵箱中孵育2-3周，之后計數(shù)大于60微米的集落數(shù)。與未加入被檢測物質(zhì)的細(xì)胞相比，集落數(shù)目減少表示被檢測物質(zhì)是Pin1抑制劑。
實例3-Pin1活性抑制劑的體內(nèi)實驗下面的實例描述了評價一個被檢測物質(zhì)抑制Pin1活性能力的體內(nèi)實驗。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)認(rèn)識到，其他適合于特殊疾病的體內(nèi)實驗可被用來做進(jìn)一步的評價。
腫瘤在無胸腺小鼠(如Balb/c,nu/nu)中生長為異種移植物的能力，為研究人類腫瘤對治療的生物學(xué)反應(yīng)提供了一種的有用的體內(nèi)模型。許多種腫瘤已經(jīng)成功地移植入無胸腺小鼠中(例如見Rygaard和PovlsenActa Pathol.Microbial.Scan.77:758-760,1969；Ward等，Int J Cancer49:616-623,1991)。簡單說，腫瘤細(xì)胞皮下種植到5到6周的Balb/c nu/nu無胸腺雌鼠后腰。在合適媒介中的被檢測物質(zhì)以定期的劑量對動物給藥(口服，靜脈，腹膜內(nèi)等等)。腫瘤細(xì)胞的生長隨時間進(jìn)行測量，并與沒有接受任何被檢測物質(zhì)或僅接受媒介的動物進(jìn)行比較。與對照動物相比，腫瘤大小減小提示該物質(zhì)可以用作治療細(xì)胞增殖性疾病的治療藥物。
實例4-Pin1晶體的制備和應(yīng)用下面的實例描述了Pin1晶體的形成，說明了使用這些獲得的信息設(shè)計Pin1/小小霉素類酶的抑制劑的方法。(也見Ranganathan等，Cell89:875-886,1997，在此以整體進(jìn)行參考)。
N-末端His6標(biāo)記的Pin1(Lu等，1996，前述)在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，在光密度為1.2(600nm)時，經(jīng)過以0.4mMIPTG在極好的肉湯中誘導(dǎo)4小時后，在22℃下的表達(dá)。細(xì)胞離心成團(tuán)狀，在冰上重新懸浮在25mM Tris-HCL(PH8.0),500mM NaCl,10mM咪唑，10mMβ-巰基乙醇，和1％(v/v)吐溫20中(超聲緩沖液)。在4℃進(jìn)行超聲破碎作用后，可溶解的上清加載于Ni-NTA(Quiagen)柱上，并用去掉吐溫20的超聲緩沖液沖洗。His6-Pin被15倍床體積的去掉吐溫20的超聲緩沖液洗脫出，并加入250mM咪唑。洗脫出的His6-Pin1在50mMTris-HCl(PH8.0),150mM NaCl,5mMMgCl2,2.5mM CaCl2,1mM DTT,和10％(v/v)甘油4℃透析12小時的過程中用凝血酶(Sigma)消化，用苯甲脒-瓊脂糖柱(Pharmacia)去除凝血酶，通過用10mMHEPES-Na+(PH7.5),100mM NaCl，和1mM DTT平衡的Superdex7516/60柱(Pharmacia)上凝膠過濾而分餾。含有Pin1的餾分用Centricon-10(Amicon)濃縮為20mg/ml并儲存在-80℃。
通過混合5μl濃縮的Pin1(20mg/ml)與5μl由2.00-2.50M硫酸銨、100mMHEPES-Na+(pH7.5)、1％(v/v)PEG400(Sigma)和1mM二硫蘇糖醇(DTT)(穩(wěn)定劑)組成的儲存液，晶體在4℃，懸浮的液滴中生長。穩(wěn)定的晶體在100°K氮氣的氣流中冷凍。晶體每個對稱單位含有一個Pin1分子，并屬于間隔基團(tuán)P43212。主要存在兩種晶體形式；Ⅰ:a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90°；和Ⅱ:a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90°。Pin1和AlaPro二肽(APⅡ)的復(fù)合體通過將Ⅱ型晶體浸入40％(v/v)PEG400,50mM HEPES-Na+(PH7.5),50mM+H3N-AlaPro-COO-(Sigma)中4℃48小時獲得。一個單一位點的TAMM(四(3-羥基-2-丁酮)甲烷，Strem Chemical,Inc)衍生物通過將Pin1晶體浸入以TAMM飽和的穩(wěn)定劑(去除DTT)中4℃12小時獲得。5位點PIP(二-μ-idodobis(乙二胺)-二鉑(Ⅱ)硝酸鹽，Strem Chemical Inc.)衍生物通過將Pin1晶體浸入添加10mMPIP的穩(wěn)定劑(去除DTT)中4℃48小時獲得。
晶體形式Ⅰ的天然(NatⅠ,2.05)和衍生物(2.5)數(shù)據(jù)在MacScience圖象底片檢測儀，DIP2020K(MacScience Corp.)上，用雙重聚焦Pt/Ni-涂布的透鏡和從MacScience M18XHF發(fā)生器上以4.5kW(50kV×90mA)運行產(chǎn)生的CuKαX線進(jìn)行收集。晶體形式Ⅱ(APⅡ)的Pin1與AlaPro二肽復(fù)合體的數(shù)據(jù)在Stanford同步加速器放射研究室，beamline 7-1(λ=1.08)經(jīng)MAR圖象底片系統(tǒng)收集。數(shù)據(jù)用DENZO(Otwinowski，在數(shù)據(jù)收集和處理Data Collection andProcessing,pp55-62,1993)處理，并用SCALEPACK(Otwinowski，上面的)進(jìn)行分級。TAMM衍生物的單一水銀結(jié)合位點定位在同形差異Patterson圖上，并用ML-PHARE進(jìn)行加工。采用DM(Cowtan,Newsletteron Protein Crystallography 31:34-38,1994)來進(jìn)行溶劑補償、直方圖的匹配、并采用Sayr’s方程以改善和將相位擴(kuò)展到2.05的分辨率。模型的構(gòu)建是用O(Jones等，Acta Crystallography A47:110-119,1991)進(jìn)行，結(jié)構(gòu)采用X-PLOR(Brunger,X-PLOR 3.1版X-線結(jié)晶學(xué)和NMR的系統(tǒng)(New Haven,Conn.:Dept.of Mol.Biophysics and Biochem.andHoward Hughes Med.Inst.,Yale University,1992))加工。初始的天然模型(NatⅠ，殘基6-39,45-163)在使用6.0到2.05分辨率之間的所有數(shù)據(jù)(無sigma截止)部分解決構(gòu)型(加入60個水分子)后進(jìn)行加工。隨后，Pin1:AlaPro復(fù)合體(APⅡ)采用NatⅠ模型作為在X-PLOR中剛性體加工的起始點來解決。在定位和模仿的退火加工后，208個水分子，2個PEGs分子，1個硫酸鹽離子和一個順式AlaPro二肽被構(gòu)型，并用X-PLOR采用在6.0到1.35分辨率之間的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行加工。結(jié)晶學(xué)的數(shù)據(jù)在表1中進(jìn)行總結(jié)。
表1．結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)的總結(jié)數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計
用不規(guī)則散點統(tǒng)計的多種同形替代
精確統(tǒng)計
aRsym=3h｜Ih-<Ih>｜/3hIh，其中<Ih>是對其對稱和Friedel等價物的反射h的平均強(qiáng)度bFriedel對未被合并。因此，單一和測定的反射數(shù)目反映了這種非等價性。
c相能=3｜Fhc‖/3‖F(xiàn)po｜exp(iφc)+Fhc｜-｜Fpho‖，其中Fhc=重-原子結(jié)構(gòu)因子，并且｜Fpo｜和｜Fpho｜分別是蛋白質(zhì)和重原子衍生物觀察到的振幅，φc是實驗相。
d指標(biāo)數(shù)=｜P(φ)exp(iφ)dφ/｜P(φ)dφ，其中P是φ,pase角的概率分布。
eR因子=3h(｜Fo(h)-Fc(h)｜)/3hFo(h)，其中Fo(h)和Fc(h)分別是反射h的觀察和計算的結(jié)構(gòu)因子振幅。自由R因子是以類似的方式為從未用于求精的5％數(shù)據(jù)計算的。R因子是以剩余95％的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行計算的。兩種值均是用無sigma截止計算的。
為了確定潛在的蛋白-蛋白相互作用的表面，第ⅰ個殘基的有關(guān)保存的、暴露于溶劑的疏水性程度定量測定為參數(shù)aⅰ，定義如下aⅰ=(守恒指數(shù))ⅰ(片斷的溶劑可達(dá)到性)ⅰ(疏水指數(shù))ⅰ。
因為其作為蛋白-蛋白相互作用表面的功能必要性，經(jīng)常維持溶劑暴露的疏水片段的突出。對于來自序列的每一個Pin1殘基的片斷，根據(jù)其來源于酵母、Ess1的功能同源性，指定保留指數(shù)，這里指數(shù)取0為不保留，0.5為化學(xué)保留和1為同等。對于每個殘基的溶劑可進(jìn)入的表面區(qū)域采用CCP4程序RESAREA(Collaborative ComputationalProject,Number4 (1994) Acta Cryst.D5°,760-763,“CCP4Suite蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)的程序”)計算，并除以總表面積以給出片斷溶劑進(jìn)入性。疏水指數(shù)是在內(nèi)部與表面(P/Po)發(fā)現(xiàn)一個給定殘基的可能性的比例，并計算為 其中自由能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以使 (Miller 等，J.Mol Biol.196:641-656,1987；Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，NY:W.H.Freemean and Co.1993)。aⅰ的值繪在一個彩色刻度上并采用GRASP(Nicholls等，Proteins 11:281-296,1991)顯示在一個代表Pin1分子的表面上。
為進(jìn)一步確定關(guān)鍵結(jié)合位點的相互作用，采用PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)引入位點的直接突變體并通過自動測序儀進(jìn)行鑒定。相應(yīng)的蛋白如上所述進(jìn)行表達(dá)和純化。PPIase的活性通過由Heitman等，方法酶學(xué)方法的比較5:176-187,1993和Kofron等，(1991)上面的，改良的方法進(jìn)行測定。純化的Pin1在進(jìn)行動力學(xué)測定前立即用實驗緩沖液(在指定PH值下的50mM琥珀酸/二-Tris丙烷，100mM NaCl)稀釋。900μl含有Pin1和15-20μM底物的混合物在3.6℃在分光光度計上進(jìn)行平衡。加入冷的糜蛋白酶(Sigma)溶液(100μl,1mM水溶液)，混合5秒，在2-10分鐘內(nèi)，每6秒測定P-硝基苯胺的吸收度(在395nm處)?？偟奈斩仍讷@取數(shù)據(jù)前立即調(diào)零，底物濃度調(diào)整到保留在儀器的線性范圍之內(nèi)。數(shù)據(jù)采用Excel7.0(Microsoft Corp.)和Origin4.1(Microcal Software)共同進(jìn)行脫機(jī)分析。每根曲線的PPIase速率限制的部分很好的符合1-aebt的單指數(shù)衰減函數(shù)，其中a和b是自由參數(shù)。通過標(biāo)準(zhǔn)的x2分析可計算出吻合良好性。為進(jìn)行無機(jī)磷酸抑制實驗，加入1M儲存液為指定濃度的磷酸鈉緩沖液(PH7.0)。底物肽來自Bachem公司。
從這些實驗中獲得的數(shù)據(jù)用來構(gòu)建一個Pin1底物結(jié)合的3維模型，并闡明Pin1特異性和活性的相互作用關(guān)鍵部位。這些信息反過來可用于抑制劑的設(shè)計。
盡管前面所述已經(jīng)引用了本發(fā)明的特定實施方案，被本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所認(rèn)同的是對這些實施方案所作的改變并不脫離本發(fā)明的基本原則和精神，以及所附權(quán)利要求所確定的范圍。
權(quán)利要求
1．一種抑制肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶活性的方法，所述的方法包括用有效劑量的具有下面結(jié)構(gòu)的化合物與異構(gòu)酶接觸A-X-R(Ⅰ)其中A是類似一個磷酸絲氨酸和/或磷酸蘇氨酸殘基的空間和電荷特性的基團(tuán)，X是一個間隔基團(tuán)，和R是一個至少象由一個親水部分取代的四氫化吡咯環(huán)一樣疏水的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶是小小霉素/Pin1類的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一部分。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中被調(diào)節(jié)的細(xì)胞周期部分是有絲分裂。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶是哺乳動物的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶是Pin1。
7．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)Ⅰ的化合物類似四面體中間物，該中間物涉及Pin1介導(dǎo)的肽基-脯氨酰異構(gòu)作用。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)Ⅰ中的A是具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)Ⅱ 其中Rx是一個分子量不超過大約250的有機(jī)基團(tuán)，Ra是H、鹵素或低級烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每個Y分別是-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,-NH-CH(CF3)2,每個Rc分別是氫或低級烷基，每個Rd分別是氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中Rx是烷基、取代烷基、環(huán)烷基或取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基或取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基或取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)或取代的雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基或取代的芳基、雜芳基或或取代的雜芳基，或Ry-Q-其中Ry是烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、取代的或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的雜芳基，和Q是-C(O)-NH-,-C(O)-O-,-C(O)-，或-O-。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中Rx是一個氨基酸殘基。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的氨基酸殘基是一個亮氨酸基部分，或脯氨?；糠?。
12．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中Rx是
13．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)Ⅰ中的A是具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)ⅢR2-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、單一或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的雜芳基。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中Rz是 其中Ra是H，鹵素或低級烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每個Y分別是-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、NH-CH(CF3)2，每個Rc分別是氫或低級烷基，每個Rd分別是氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中Rz是(Rb,)Cy-其中Cy是環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、單或多不飽和雜環(huán)、芳基或雜芳基，和Rb，是-(CRc2)0-4-CHmY3-m，其中每個Y分別為-ORd、-COORc、-CF3、、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、-NH-CH(CF3)2，每個Rc分別為氫或低級烷基，每個Rd分別為氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2。
16．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)構(gòu)Ⅰ中的A是具有以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)ⅣRb-取代Cy(het)-(Ⅳ)其中Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每個Y分別是-ORd、-COORc、-CF3、-P(O)(ORc)2、-OP(O)(ORc)2、-NH-P(O)(ORc)2、NH-CH(CF3)2,每個Rc分別是氫或低級烷基，每個Rd分別是氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2，和Cy(het)是一個5、6、或7元雜環(huán)，其中的雜環(huán)原子與結(jié)構(gòu)Ⅰ的X相連。
17．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中X選自
18．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的R是環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R是一個5-7元的環(huán)。
20．一種具有以下結(jié)構(gòu)的化合物A-X-R(Ⅰ)其中A是類似一個磷酸絲氨酸和/或磷酸蘇氨酸殘基的空間和電荷特性的基團(tuán)，X是一個間隔基團(tuán)，和R是一個至少象由一個親水部分取代的四氫化吡咯環(huán)一樣疏水的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的化合物，其中結(jié)構(gòu)Ⅰ中的A選自如下的基團(tuán)Ⅱ，Ⅲ或Ⅳ 其中Rx是一個分子量不超過大約250的有機(jī)基團(tuán)，Ra是H、鹵素或低級烷基，和Rb是-(CRc2)1-4-CHmY3-m,，其中每個Y分別是-ORd,-COORc,-CF3,-P(O)(ORc)2,-OP(O)(ORc)2,-NH-P(O)(ORc)2,-NH-CH(CF3)2,每個Rc分別是氫或低級烷基，每個Rd分別是氫、低級烷基或烷基羰基，和m=1或2，或R2-NH-(Ⅲ)其中Rz是烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基、取代的環(huán)鏈烯基、環(huán)鏈二烯基、取代的環(huán)鏈二烯基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、單一或多不飽和雜環(huán)或取代的單或多不飽和雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的雜芳基，或Rb-取代的Cy(het)-(Ⅳ)其中Cy(het)是一個5、6、或7元的雜環(huán)，其中的雜環(huán)原子與結(jié)構(gòu)Ⅰ的X相連，和Rb如上定義，X選自 R是環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的雜芳基。
22．一種藥學(xué)組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求20的化合物和一種藥學(xué)可接受的載體。
23．一種治療患病狀態(tài)的生物體的方法，所述的方法包括給予所述的生物體有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求22的組合物。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的患病狀態(tài)是真菌疾病。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的真菌疾病是婦產(chǎn)科感染或皮膚科的感染。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的感染真菌是酵母。
27．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的患病狀態(tài)是細(xì)菌感染。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述的細(xì)菌感染是大腸桿菌感染或鏈球菌感染。
29．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的患病狀態(tài)是細(xì)胞增殖性疾病。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的細(xì)胞增殖性疾病是腫瘤細(xì)胞增殖性疾病或非腫瘤細(xì)胞增殖性疾病。
31．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞增殖性疾病是實體腫瘤、淋巴瘤或白血病。
32．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的非腫瘤細(xì)胞增殖性疾病是纖維化。
33．根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的非腫瘤細(xì)胞增殖性疾病是良性的前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位癥或牛皮癬。
34．一種組合物，該組合物包含晶體形式的Pin1。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，還包括Pin1的底物、底物類似物或抑制劑。
36．根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，該組合物由如圖1中列出的X射線等位圖描述。
37．根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，其中所述的晶體有單斜晶的間隔基團(tuán)P43212，其單位晶格尺寸Ⅰ∶a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90；或Ⅱ∶a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90。
38．根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，由如圖2中列出的X射線等位圖描述。
39．根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，其中所述的晶體有一個單斜晶的間隔基團(tuán)P43212,其單位晶格尺寸Ⅰ∶a=b=47.6,c=134.9,α=β=γ=90；或Ⅱ∶a=b=49.0,c=137.8,α=β=γ=90。
40．一個鑒定肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶抑制劑的方法，所述的方法包括a)確定在肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶和其底物或底物類似物之間相互作用的點；b)選擇與所述的肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶有相似相互作用的化合物；和c)檢測所選擇的化合物抑制肽基-脯氨酰異構(gòu)酶活性的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽基－脯氨酰異構(gòu)酶(PPIase)活性抑制劑和含有這種抑制劑的藥物組合物。這些化合物可用于治療以異常細(xì)胞增生為特征的疾病。特別是這里所公開的化合物可抑制肽基－脯氨酰異構(gòu)酶的Pinl/小小霉素族成員的活性。這些化合物是根據(jù)高分辨率X線得到的人Pinl酶晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計的。
文檔編號C07F9/00GK1311671SQ99809376
公開日2001年9月5日 申請日期1999年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月9日
發(fā)明者J·P·諾埃爾, T·R·享特 申請人:索爾克生物學(xué)研究所