專利名稱：糖轉(zhuǎn)運蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有糖轉(zhuǎn)運活性的蛋白質(zhì)及編碼所說的蛋白質(zhì)的DNA。
背景技術(shù)：
葡萄糖作為顱神經(jīng)組織中的主要能源，雖具有低達180的分子量，但因其為極性分子而不能迅速通過細胞膜。因此，葡萄糖要通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，即以細胞膜的形式特異性存在的轉(zhuǎn)運糖的蛋白質(zhì)才能摻入細胞中。
目前，已知有兩種類型的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，即針對葡萄糖濃度梯度主動轉(zhuǎn)運葡萄糖的能量依賴性Na+/葡萄糖同向轉(zhuǎn)運型，和以只依賴于細胞內(nèi)和細胞外葡萄糖濃度差異進行轉(zhuǎn)運的易化擴散轉(zhuǎn)運型。一般認為易化擴散轉(zhuǎn)運型在顱神經(jīng)組織中執(zhí)行主要作用，已報導(dǎo)了存在于血內(nèi)皮細胞中并參予血腦屏障中糖轉(zhuǎn)運的GLUT1(生物化學(xué)雜志，263,15245(1998))，和被認為通過血腦屏障向神經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運葡萄糖的GLUT3(生物化學(xué)雜志，265,18035(1990))。
例如，有下列一些表明神經(jīng)病變與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能和表達異常之間關(guān)系的報導(dǎo)GLUT1部分缺乏引起驚厥和心理發(fā)生遲滯(N.Engl.J.Med.,325,703(1991))；帕金森氏病病例提示有GLUT3功能異常的可能性(Ann.Neurol.,32,S88(1992))；和腫瘤組織的血管內(nèi)GLUT3的表達顯著加速(癌癥研究,52,3972(1992))。
發(fā)明的公開本發(fā)明人認真地研究了由已經(jīng)在人腦組織中特異性表達的基因所編碼的蛋白質(zhì)，因而在分離新的蛋白質(zhì)(以下稱為HUCEP-8)和編碼該蛋白質(zhì)的基因(以下稱為hucep-8)上獲得了成功。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種HUCEP-8可將單糖如葡萄糖轉(zhuǎn)運到細胞中，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了(1)(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的新的蛋白質(zhì)HUCEP-8，或(b)在具有經(jīng)在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一個或多個氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖轉(zhuǎn)運活性的蛋白質(zhì)；(2)編碼(1)中所述任一蛋白質(zhì)的基因；(3)(c)具有如SEQ ID NO:2所示之堿基序列的DNA，或(d)在嚴格條件下與SEQ ID NO:2的DNA雜交，并編碼具有糖轉(zhuǎn)運活性之蛋白質(zhì)的DNA；(4)其特征在于使用(1)中所述的蛋白質(zhì)篩選能夠增強或抑制糖轉(zhuǎn)運活性之化合物的方法；(5)其特征在于使用(2)或(3)中所述的基因篩選能夠增強或抑制糖轉(zhuǎn)運活性之化合物的方法；(6)篩選能夠加速或抑制(2)或(3)中所述基因的轉(zhuǎn)錄之化合物的方法；(7)篩選能夠加速或抑制(1)中所述任一蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運之化合物的方法；(8)通過實施(4)、(5)、(6)或(7)中所述的篩選方法得到的化合物或其鹽；以及(9)抗(1)中所述之蛋白質(zhì)的抗體。
附圖的簡要說明

圖1中，序列-1代表從大腦皮層cDNA庫得到的重組體中有高出現(xiàn)率的DNA片段，并且序列-2至5各代表用于克隆涉及序列-1之DNA片段的寡核苷酸。圖2顯示涉及序列-1的DNA片段。圖3和4顯示含有基因hucep-8之DNA片段的堿基序列。圖5顯示重組載體pCRhucep-8的構(gòu)建。圖6顯示重組載體pREhucep-8的構(gòu)建。圖7顯示免疫印跡分析的結(jié)果。圖8顯示葡萄糖攝入試驗的結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳方式可作為含有hucep-8基因的cDNA片段，從衍生于人大腦皮層的cDNA庫中分離所說的基因。本發(fā)明人使用的cDNA庫是使用購自Clontech公司的人大腦皮層mRNA制備的，但同樣也可以使用購自Stratagene公司的人大層皮層mRNA制備cDNA。
可按照Okubo等人(Okubo等人，Nature Genet.,2,173(1992))所述的分析基因表達頻率的方法，區(qū)分上述cDNA庫中被認為在人腦組織內(nèi)有可特異表達之基因的cDNA。具體地說，使用人大腦皮層mRNA作為模板，并使用將oligo(dT)結(jié)合到用適當(dāng)?shù)南拗菩悦搁_環(huán)的載體質(zhì)粒的一端，然后再用限制性酶MboⅠ和Bam HⅠ切割而得到的引物，以合成cDNA。因為所說的載體是使用dam甲基化酶陽性大腸桿菌作為宿主制備的，所以載體的MboⅠ識別序列，即“GATC”的A殘基已受到甲基化處理。因此，MboⅠ只切割新合成的cDNA部分。因為所說的載體只在已結(jié)合oligo(dT)之末端以外的末端附近有一個Bam HⅠ切割位點，所以該酶在這一個位點上切割所說的載體。如果新合成的cDNA部分中存在有Bam HⅠ識別序列，該位點上也將發(fā)生酶切割。因為Bam HⅠ和MboⅠ產(chǎn)生同樣具有堿基序列“GATC”的粘性末端，所以可在用兩種酶切割后，用DNA連接酶處理以使質(zhì)粒閉環(huán)。
在本發(fā)明所采用的方法中，使用如此制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌以構(gòu)建cDNA庫。因此，該文庫含有各mRNA均從3’末端的poly(A)位點延伸到5’末端上第一次出現(xiàn)堿基序列GATC之位點的區(qū)域。從所說的cDNA庫中隨機選擇適當(dāng)數(shù)目的重組體，從各重組體中提取cDNA并測定其完整堿基序列。所說的方法使之有可能通過計數(shù)具有按上述方法確定的特異性堿基序列的cDNA片段，將在隨機選擇的重組體中證實的器官特異性基因和高表達頻率基因與其它基因區(qū)分開。在所說的方法中，可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法(例如MolecularCloning,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lb.Press,1989和為本領(lǐng)域技術(shù)人員介紹標準方法的其它手冊中所述的方法，以下稱為常規(guī)方法)，從重組體中提取cDNA并測定cDNA堿基序列。
在區(qū)分高表達頻率基因的方法中，隨機選擇的重組體總數(shù)一般為數(shù)十個至數(shù)千個，但必要時也可處理更大數(shù)目的重組體。本發(fā)明人通過實施上述方法確定了770個重組體中所有cDNA片段的序列，并從這些cDNA片段中選擇出具有出現(xiàn)頻率如具有2/770或更多同樣堿基序列之cDNA的cDNA片段，以作為具有在人腦中特異性表達之基因的DNA片段的侯選片段。
如前所述，上述各個cDNA片段只含有mRNA之3’末端區(qū)域的一部分。因此，本發(fā)明人基于有關(guān)所說區(qū)域(下稱3’片段)的堿基序列的信息得到了全長度cDNA。
使用購自Clontech公司的人大腦皮層cDNA庫作為模板，并使用具有上述3’片段中之堿基序列的適當(dāng)長度的合成寡核苷酸，和具有載體中的序列的實質(zhì)上同樣長度的合成寡核苷酸作為引物，采用PCR方法得到了全長度cDNA。結(jié)果，能擴增約1.9kb的DNA片段。在這種情況下，也可使用購自Stratagene公司的人大腦皮層cDNA庫作為模板。也可使用購自Clontech或Stratagene公司的人大腦皮層mRNA作為模板，借助Clontech或Gibco公司的5’RACE試劑盒進行擴增。此外，也可使用上述3’片段，按照常規(guī)方法經(jīng)集落雜交或噬斑雜交篩選上述人大腦皮層cDNA庫，以進行擴增。
將按照上述方法擴增的各cDNA片段插入到得自Novagen的pT7Blue T-載體中，并用常規(guī)方法測定cDNA片段的整個堿基序列。在這種情況下，各cDNA片段獨自得到了兩個重組體DNA克隆，并測定了cDNA片段的堿基序列，從而進一步證實了堿基序列。
可用Northern雜交技術(shù)證實所說的cDNA序列的器官特異性出現(xiàn)的頻率，從而證實被認為存在于按上述方法選擇之任何cDNA片段中的基因在腦組織中的特異性表達。具體地說，用瓊脂糖凝膠電泳法分級分離從各種人體器官中提取的和購自Clontech或Stratagene公司的各mRNA并轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后使用按上述方法選擇的cDNA片段作為探針，以常規(guī)方法進行雜交。本發(fā)明人研究了所說的cDNA堿基序列出現(xiàn)的器官特異性。結(jié)果觀察到，雖然所說的cDNA堿基序列在某種程度上也出現(xiàn)在腦以外的其它器官和細胞中，但證明與其它器官和細胞相比，所說的cDNA堿基序列在大腦皮層中的出現(xiàn)是特異的。
這一事實強有力地表明，所說的cDNA堿基序列中存在有人腦中特異性表達的，并且對于維持正常腦功能必不可少的所需基因。
按照一般所用的方法，包括使用計算機程序分析堿基序列，可證實堿基序列中蛋白質(zhì)編碼區(qū)域(ORF，開放讀框)的存在。相信所說的cDNA堿基序列中存在所需的基因，本發(fā)明人利用計算機發(fā)現(xiàn)了所說堿基序列中的ORF，并將該基因定名為“基因hucep-8”(人大腦蛋白質(zhì)的縮寫)，將由所說的基因編碼的蛋白質(zhì)稱為“HUCEP-8”。
基因hucep-8包括SEQ ID NO:2中所示的1560個堿基對(bp)。使用該基因hucep-8，可利用適當(dāng)?shù)乃拗?載體系統(tǒng)，以常規(guī)基因重組技術(shù)制備重組基因。作為一種適用的載體，例如可使用衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒(如pBR322、pUC118等)、衍生于枯草桿菌的質(zhì)粒(如pUB110、pC194等)、衍生于酵母的質(zhì)粒(如pSH19等)、噬菌體及動物病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒和痘病毒)。在重組中，可使用適當(dāng)合成的DNA接頭加入翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子。另外，可將適當(dāng)?shù)谋磉_啟動子連接到所說基因的上游，以表達該基因?？筛鶕?jù)宿主的不同適當(dāng)?shù)剡x擇所用的啟動子。例如，當(dāng)宿主是大腸桿菌時，可使用T7啟動子、lac啟動子、trp啟動子、λPL啟動子等。當(dāng)宿主是桿菌屬的細菌時，可使用SPO型啟動子等。當(dāng)宿主是酵母時，可使用PHO5啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。當(dāng)宿主是動物細胞時，可使用衍生于SV40的啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子等。
所說的基因可以表達為與另一種蛋白質(zhì)(如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、蛋白A等)的融合蛋白質(zhì)。可使用適當(dāng)?shù)牡鞍酌?如凝血酶、腸激酶等)切掉如此由表達得到的融合的HUCEP-8。
作為可用于由表達得到HUCEP-8的宿主，可以利用各種大腸桿菌菌株、埃希桿菌屬細菌、各種枯草桿菌菌株、芽孢桿菌屬細菌、酵母如釀酒酵母的各種菌株，以及動物細胞如COS-7細胞、CHO細胞等。
作為使用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，可采用常規(guī)方法或針對不同的宿主細胞常規(guī)采用的相應(yīng)方法。
另外，本發(fā)明人使用pREP10(可得自Invitrogen)作為表達載體，對基因hucep-8進行重組，以制備用于在培養(yǎng)的動物細胞中將所說的基因表達為HUCEP-8的載體pREhucep-8。借助Gibco公司的LIPOFECTAMINE試劑，使用pREhucep-8轉(zhuǎn)化CHO細胞，以制備轉(zhuǎn)化體CHO/pREhucep-8。根據(jù)所用載體中存在的選擇性標志，或給出或刪除的適當(dāng)標志的存在與否來分離被轉(zhuǎn)化的細胞。在本發(fā)明人所實施的用pREhucep-8轉(zhuǎn)化CHO細胞的情況下，可利用抗潮霉素B抗性作為指示來區(qū)分并分離轉(zhuǎn)化體。
可用下文實施例中所述的Northern雜交法證實所需基因在按上述方法得到的轉(zhuǎn)化細胞中的表達。在與其中導(dǎo)入了pREP10的COS細胞相比，用pREhucep-8轉(zhuǎn)化的COS細胞增加了葡萄糖攝入量。此外，證明在SK-N-SH細胞(培養(yǎng)的人成神經(jīng)細胞瘤細胞)中，由于細胞死亡而使hucep-8的表達程度降低。
本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)HUCEP-8是一種包括如SEQ ID NO:1中所示之520個氨基酸殘基，分子量為55657道爾頓的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)存在于氨基酸序列上第118至134個殘基Leu Gly Tyr Pro Ala Asp ArgPhe Gly Arg Arg Gly Ile Val Leu Leu Thr和第355至371個殘基LeuGly Val Thr Val Asp Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser是典型存在于GLUT家族(Nature.325:641)中的氨基酸序列基元。
本發(fā)明不僅包括如SEQ ID NO:2所示的DNA堿基序列，而且還包括與所說的DNA雜交并編碼具有糖轉(zhuǎn)運活性之生理活性蛋白質(zhì)的DNA。
也就是說，本發(fā)明包括下列一些DNA變體，無論它們與如SEQ IDNO:2所示的DNA堿基序列有什么不同，只要該DNA變體在嚴格條件下與基因hucep-8雜交，并且編碼具有糖轉(zhuǎn)運活性的生理活性蛋白質(zhì)即可以諸如引入位點特異性突變、用誘變劑處理以造成隨機誘變、用限制性酶切割以造成DNA片段的突變、缺失或連接等各種人工處理，引起基因hucep-8全長度堿基序列的部分DNA堿基序列改變所得到的DNA變體。
有這種可能性人染色體上可能存在其堿基序列稍微不同于如SEQ ID NO:2所示之DNA堿基序列的，不依賴基因hucep-8的基因。本發(fā)明也包括這樣一個如上述人工變體的基因，條件是該基因所編碼的蛋白質(zhì)是具有糖轉(zhuǎn)運活性的生理活性蛋白質(zhì)。
只要所得到的變體與基因hucep-8的DNA堿基序列有90％或更高的同源性，上述DNA突變的程度都是允許的。與基因hucep-8雜交的程度可以是在例如下述常規(guī)條件下與基因hucep-8進行Southern雜交當(dāng)使用DIG DNA標記試劑盒(批號為1175033，可購自Boehringer-Mannheim公司)標記探針時，于32℃在Dig Easy Hyb溶液(批號為1603558，可購自Boehringer-Mannheim公司)進行雜交，并于50℃在0.5xSSC溶液(含有0.1％[w/v]SDS)中洗膜(1xSSC溶液是含有0.15M NaCl和0.015M檸檬酸鈉的緩沖溶液)。
本發(fā)明還包括由突變基因編碼的并具有糖轉(zhuǎn)運活性的生理活性蛋白質(zhì)，其中所說的突變基因與上述基因hucep-8有高度同源性。
也就是說，本發(fā)明包括具有在新的蛋白質(zhì)HUCEP-8之氨基酸序列中缺失、取代或加入一個或多個氨基酸所形成的氨基酸序列的變體，只要這些變體是具有糖轉(zhuǎn)運活性的蛋白質(zhì)即可。
構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈在疏水性、帶電性、大小等方面有所不同。從經(jīng)驗或物理化學(xué)測定結(jié)果已經(jīng)知道，氨基酸間的幾種相互關(guān)系能夠令人滿意地維持整個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(也稱為立體結(jié)構(gòu))，即在某種意義上這些關(guān)系對三維結(jié)構(gòu)沒有實質(zhì)性影響。例如，就氨基酸殘基的取代來說，可以包括下列組合甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)；Gly和丙氨酸(Ala)或纈氨酸(Val)；亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和蘇氨酸(Thr)、Thr和絲氨酸(Ser)或Ala、賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。
因此可以說，本發(fā)明包括具有經(jīng)在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的取代、插入或缺失等所形成之氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，只要變異能令人滿意地保留HUCEP-8蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并且變體蛋白質(zhì)具有如HUCEP-8的糖轉(zhuǎn)運活性即可。只要所得到的變體與如SEQID NO:1所示的氨基酸序列有90％或更高的同源性，任何程度的變異都是允許的。
本發(fā)明還提供了篩選增強或抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)之糖轉(zhuǎn)運活性的化合物的方法，所說方法的特征在于使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)HUCEP-8。具體地說，所說的方法是一種篩選糖轉(zhuǎn)運活性增強劑和糖轉(zhuǎn)運活性抑制劑的方法，其包括將試驗化合物與含有人糖轉(zhuǎn)運蛋白HUCEP-8的細胞或其細胞膜部分接觸時所達到的糖轉(zhuǎn)運活性，與不發(fā)生這種接觸時所達到的糖轉(zhuǎn)運活性相比較。
可以使用能夠用作本發(fā)明之蛋白質(zhì)底物的任何一種底物。一般優(yōu)選使用，例如放射性核素(如14C)標記的葡萄糖。試驗化合物包括，例如肽、蛋白質(zhì)、非肽化合物、合成的化合物及發(fā)酵產(chǎn)物。這樣的化合物可以是新的化合物或者是眾所周知的化合物?？梢园凑帐熘姆椒ㄈ鏔rost等人(生物化學(xué)雜志，260,2646(1985))所述的方法測定本發(fā)明之蛋白質(zhì)的糖轉(zhuǎn)運活性。
使用本發(fā)明的上述篩選方法得到的化合物或其鹽是從上述試驗化合物中篩選出來的化合物或其鹽，并且這些化合物或其鹽可以是新的化合物或已知的化合物。例如，與不接觸試驗化合物時所達到的糖轉(zhuǎn)運活性相比，當(dāng)這種活性增強30％或更高(優(yōu)選50％或更高)時，即可選擇該試驗化合物作為能夠增強本發(fā)明之蛋白質(zhì)的糖轉(zhuǎn)運活性的物質(zhì)。另一方面，與不接觸試驗化合物時所達到的糖轉(zhuǎn)運活性相比，當(dāng)這種活性降低約30％或更低(優(yōu)選50％或更低)時，即可選擇該化合物作為能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)之糖轉(zhuǎn)運活性的物質(zhì)。
工業(yè)實用性根據(jù)HUCEP-8具有糖轉(zhuǎn)運活性這一事實推測，基因hucep-8的異常表達或HUCEP-8的功能異常可嚴重妨礙腦神經(jīng)功能的維持。
因此，可利用HUCEP-8來開發(fā)，例如，能夠增強或抑制糖轉(zhuǎn)運活性的化合物，并且這種化合物可望成為新的腦神經(jīng)疾病治療劑。
以下借助實施例詳細解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限制。
實施例1基因hucep-8的克隆1)對維持大腦正常功能必要的基因之部分堿基序列的測定使用大腦皮層mRNA(Clontech)作為模板，按照Okubo等人(Okubo等人Nature Genet.,2,173(1992))所述的方法制備大腦皮層cDNA庫。
然后從所說的庫中隨機選擇770個重組體，按照常規(guī)方法(Molecular Cloning,2nd.ed.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989；下同)提取重組體DNA并測定在各重組體DNA之cDNA部分的3’側(cè)的堿基序列。使用PE Applied Biosystems公司制造的DNA序列儀(ABIPRISM377)和可從該公司獲得的反應(yīng)試劑盒進行測序。
分析770個重組體中各DNA片段的出現(xiàn)頻率，發(fā)現(xiàn)具有圖1中所示堿基序列(堿基序列-1)的基因的出現(xiàn)頻率為2/770。
2)含有堿基序列-1的cDNA片段的擴增首先，使用PE Applied Biosystems公司生產(chǎn)的DNA合成儀(ABI380B)合成具有互補于堿基序列-1之一部分的堿基序列的寡核苷酸(圖1；堿基序列-2)。然后按上述同樣方法合成具有如接近λ噬菌體克隆載體(λDR2)之cDNA插入位點的同樣堿基序列的寡核苷酸(堿基序列-3)。使用以λDR2作為克隆載體制得的人大腦皮層5’-STRETCH cDNA庫(可得自Clontech Laboratories)作為模板，并使用具有堿基序列-2的寡核苷酸和具有堿基序列-3的寡核苷酸作為引物，進行PCR反應(yīng)。在該反應(yīng)中，使用了得自TAKARA SHUZO有限公司的試劑盒(TAKARA LA PCR試劑盒Ver.2)和TAKARASHUZO有限公司生產(chǎn)的PCR熱循環(huán)儀MP。
液體反應(yīng)組合物cDNA庫(108pfu/ml) 5μl10x PCR緩沖溶液5μl2.5mM dNTP 1μl10μM寡核苷酸(堿基序列-2) 2μl10μM寡核苷酸(堿基序列-3) 2μl
水 34.5μlLA DNA聚合酶0.5μl總計50μl反應(yīng)條件液體反應(yīng)組合物于95℃保持2分鐘，95℃反應(yīng)20秒，以-1℃/2秒的速率冷卻至58℃，并于58℃保持1分鐘，然后于72℃保持4分鐘。該循環(huán)重復(fù)35次，以擴增所需的堿基序列。
按上述方法(圖2)特異地擴增具有部分堿基序列-1的DNA片段(約1.9kb)。
3)亞克隆到載體中以進行堿基序列測定按照常規(guī)方法進行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度1％)以分級分離步驟2)中擴散的DNA。用溴乙錠染凝膠并用紫外光照射，切下含有所需條帶的部分凝膠。
從這部分瓊脂糖凝膠中提取DNA片段，并使用GenecleanⅡ試劑盒(購自Bio101)純化之。
按下述方法將純化的DNA片段亞克隆到用于堿基序列測定的載體pT7 BlueT-載體(得自Novagen)中。使用購自TAKARA SHUZO有限公司的試劑盒(TAKARA DNA連接試劑盒Ver.2)，使連接溶液于16℃反應(yīng)1.5小時。
使用上述反應(yīng)溶液，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株DH5。
將轉(zhuǎn)化體接種到含有50μg/ml氨芐青霉素(Amp)、40μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)和100μM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB瓊脂培養(yǎng)板上，并于37℃培養(yǎng)過夜。
將所得到的白色菌落接種到10ml含有50μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，并于37℃培養(yǎng)過夜，然后離心收集細胞并使用QIAprepSpin Plasmid Miniprep試劑盒(得自Qiagen)純化重組DNA。如此構(gòu)建的重組DNA稱為pThucep-8。
4)DNA片段堿基序列的測定使用PE Applied Biosystems生產(chǎn)的DNA序列儀以二脫氧鏈終止法測定堿基序列?；谒鶞y知的堿基序列，合成寡核苷酸，并用引物行走方法確定整個堿基序列。測定兩股DNA的堿基序列。所說克隆之cDNA的堿基序列如圖3和圖4中所示。根據(jù)所說的堿基序列含有互補于堿基序列-2之堿基序列的上游部分這一事實，證實已克隆了所需的基因(人大腦蛋白質(zhì)-8,hucep-8)。
所說的cDNA含有編碼包括520個氨基酸殘基之蛋白質(zhì)(HUCEP-8)的翻譯區(qū)(開放讀框，ORF)。
實施例2hucep-8基因在CHO細胞中的表達及其功能分析1)表達載體pREhucep-8的構(gòu)建基于圖3和圖4中所示的堿基序列，使用DNA合成儀(ABI 380B,PE Applied Biosystems公司制造)分別合成了具有堿基序列-4和堿基序列-5的寡核苷酸。
使用上述重組DNA pThucep-8作為模板，并以具有堿基序列-4和堿基序列-5的寡核苷酸作為引物，于下述反應(yīng)條件下進行了PCR反應(yīng)。在該反應(yīng)中，使用了購自Stratagene公司的Pfu DNA聚合酶和TAKARA SHUZO有限公司生產(chǎn)的PCR熱循環(huán)儀MP。
液體反應(yīng)組合物pThucep-8(1μg/ml) 1μl10x PCR緩沖溶液 5μl2.5mM dNTP 8μl10μM寡核苷酸(堿基序列-4)2μl10μM寡核苷酸(堿基序列-5)2μl水 31μlPfu DNA聚合酶1μl總計 50μl反應(yīng)條件液體反應(yīng)組合物于94℃保持1分鐘，以-1℃/2秒的速率冷卻至53℃，并于53℃保持1分鐘，然后于72℃保持3分鐘。該循環(huán)重復(fù)30次，然后將反應(yīng)溶液于72℃保持10分鐘，以擴增所需的堿基序列。
以瓊脂糖凝膠電泳法分級分離按上述方法擴增的DNA片段，以純化1.56kb DNA片段(片段1)。將各片段1與已開環(huán)的載體peR-Blunt(購自Invitrogen)混合，并于實施例1中步驟3)所述的條件下進行了連接和大腸桿菌K12菌株DH5的轉(zhuǎn)化。然后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體并離心收集其細胞，此后從細胞中純化重組DNA。如此構(gòu)建的重組DNA中，有些已插入了片段1，從而使HUCEP-8的起始密碼子可能定位于pCR-Blunt的XhoⅠ切割位點側(cè)，并且終止密碼子可能定位于HindⅢ切割位點側(cè)，為此將此重組DNA定名為pCRhucep-8(圖5)。
用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ(均購自TAKARA SHUZO有限公司)切割重組DNA pCRhucep-8，然后以瓊脂糖凝膠電泳法分級分離裂解產(chǎn)物，以純化約1.6kb的DNA片段(片段2)。用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ(均購自TAKARA SHUZO有限公司)切割衍生于動物細胞的表達載體pREP10(可得自Invitrogen公司)，并純化如此得到的開環(huán)載體(片段3)。
將片段2與片段3混合并在實施例1中所述的條件下進行連接和大腸桿菌K12菌株DH5的轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體并離心收集其細胞，然后從細胞中純化重組DNA。將如此構(gòu)建的重組DNA定名為pREhucep-8(圖6)。
2)導(dǎo)入CHO細胞并制備穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體在直徑60mm的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CHO細胞。使用含有10％胎牛血清、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM(可購自Gibco公司，以下稱為生長培養(yǎng)基)作為培養(yǎng)基，在5％CO2存在下于37℃進行培養(yǎng)。
在細胞上鋪敷LIPOFECTAMINE試劑(可購自Gibco)并培養(yǎng)3小時。然后換成生長培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24小時。將細胞分散于胰蛋白酶溶液中，然后將細胞懸液分成兩等份，分別倒入兩個直徑100mm的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
除去培養(yǎng)基后，換成含有潮霉素B(可購自Calbiochem；終濃度為400μg/ml)的生長培養(yǎng)基。每隔3天用新鮮培養(yǎng)基替換含潮霉素B的生長培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2周。當(dāng)肉眼確實看到細胞集落時，使用不銹鋼杯分離出5個集落。使用5個按上述方法只在CHO細胞中導(dǎo)入pREP10后分離的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體作為參比轉(zhuǎn)化體。
3)基因表達的確認使用直徑為100mm的塑料平皿，在含有潮霉素B(終濃度為400μg/ml)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的各轉(zhuǎn)化體。當(dāng)細胞密度相當(dāng)于80％連片生長時，除去培養(yǎng)基，然后加入PBS并用細胞刮棒回收細胞。離心沉降細胞后，除去上清液并使用mRNA提取試劑盒(可購自Pharmacia Biotec)從細胞中純化mRNA。按照常規(guī)方法，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分級分離2μg mRNA并轉(zhuǎn)印跡到濾膜(Hybond-N+,Amersham公司生產(chǎn))上，進行Northern雜交。使用相當(dāng)于hucep-8并已用DIG(洋地黃毒苷)標記的cDNA片段作為探針。接著按照試劑盒使用手冊中所述的方法使用DIG寡核苷酸加尾試劑盒(可購自Boehringer-Mannheim)進行標記。在具有下列組成的溶液中于51℃雜交5小時(給出的濃度均為終濃度)5x SSC1％封閉緩沖液0.1％N-月桂酰肌氨酸鈉0.02％SDS50μg/ml polyA1pmol/ml DIG-標記的合成DNA雜交完成后，于51℃相繼用2x SSC,0.1％SDS,0.5x SSC和0.1％SDS洗膜。
洗滌后，按照試劑盒使用手冊中所述的方法，使用DIG發(fā)光檢測試劑盒處理膜。使用HyperfilmTM-ECL(購自Amersham)膠片檢測信號。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hucep-8基因在其中已導(dǎo)入了pREhucep-8的CHO細胞中的表達水平，比在其中導(dǎo)入了pREP10的CHO細胞中的表達水平高。
實施例3:hucep-8基因在COS細胞中的表達及其功能分析1)將pREhucep8導(dǎo)入COS細胞并制備穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體將COS細胞培養(yǎng)在直徑60mm的塑料培養(yǎng)皿中。使用含有10％胎牛血清、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(可購自Gibco；以下稱為生長培養(yǎng)基)，于5％CO2存在下37℃進行培養(yǎng)。
當(dāng)細胞密度達到50％時，在細胞上鋪敷含有實施例2的1)中構(gòu)建的pREhucep-8的LIPOFECTAMINE試劑(可購自Gibco)，并培養(yǎng)24小時。然后，更換成生長培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24小時。將細胞分散于胰蛋白酶溶液中之后，將細胞懸液分成兩等份，分別倒入兩個直徑100mm的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
除去培養(yǎng)基后，換成含有潮霉素B(可購自Calbiochem公司；終濃度400μg/ml)的生長培養(yǎng)基。每隔3天換一次新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2周。當(dāng)肉眼可看到細胞集落時；使用不銹鋼杯分離5個集落。使用在COS細胞中按同樣方法只導(dǎo)入pREP10作為載體后分離的5個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體作為參比轉(zhuǎn)化體。
2)與hucep-8基因產(chǎn)物有特異反應(yīng)性的抗體，抗-HUCEP-8的制備合成相當(dāng)于hucep-8基因產(chǎn)物C末端側(cè)上14個殘基的寡核苷酸，然后按照常規(guī)方法使之交聯(lián)結(jié)合到KLH上，并用如此得到的產(chǎn)物免疫兔。在42天內(nèi)反復(fù)免疫4次后，于第52天從所說的兔體內(nèi)制備血清，并用蛋白A柱層析法純化IgG組分。然后，使用帶有固相化寡肽(如用作抗原的同樣寡肽)的樹脂，以親合柱層析法從所說的IgG組分中純化與所說的寡肽有特異反應(yīng)性的抗體，并定名為抗-HUCEP-8。上述所有操作均按常規(guī)方法進行。
3)基因表達的確認在直徑100mm的塑料培養(yǎng)皿中，使用含有潮霉素B(終濃度400μg/ml)的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)各個分離的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)細胞密度相當(dāng)于80％連片生長時，除去培養(yǎng)基并加入PBS，然后用細胞刮棒回收細胞。離心沉降細胞后，棄去上清液。向殘留物中加入勻漿緩沖液(5mMHEPES緩沖液(pH8)，0.32M蔗糖)并反復(fù)吹吸使細胞分散。用超聲細胞破碎儀(Taitec公司生產(chǎn))破碎細胞，然后離心除去未破碎的細胞。
除去未破碎的細胞后，將上清液(超聲溶胞產(chǎn)物部分)于4℃下以100,000xg離心1小時，以分級分離成上清液(胞漿部分)和沉淀物。將沉淀物部分懸浮于勻漿緩沖液中并經(jīng)超聲處理分散之(膜部分)。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑(可購自Pierce)測定各部分中的蛋白質(zhì)含量。
以常規(guī)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分級分離各部分中的各50μg蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)印跡到PVDF膜(可購自Bio-Rad)上。于4℃下用Blockace(可購自Dai Nippon藥物公司)將膜封閉過夜，然后于室溫下與抗-HUCEP-8抗體(用10％Blockace/PBS稀釋1,000倍)溫育2小時。用TPBS(含有0.1％Tween 20的PBS)洗膜5次，每次5分鐘，然后在室溫下與連接有過氧化物酶的驢抗兔IgG(購自Amersham)一起溫育1小時。用TPBS洗如此處理的膜共5次，每次5分鐘，然后再用ECL檢測試劑(購自Amersham)處理。使用HyperfilmTM-ECL(購自Amersham)膠片檢測信號。
結(jié)果，可在其中導(dǎo)入了pREhucep-8之COS細胞的膜部分中檢測到與抗-HUCEP-8反應(yīng)的帶。在其中導(dǎo)入了pREP10之COS細胞的超聲溶胞產(chǎn)物、胞漿部分及膜部分中均不能檢測到這樣的帶。該帶的分子量約為50kDa，其不同于根據(jù)hucep-8基因產(chǎn)物的氨基酸序列(圖7)估算的分子量(55.7kDa)。但如眾所周知，糖轉(zhuǎn)運蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中有較高的遷移率，以致其表觀分子量低于其真實分子量(生物化學(xué)雜志，267,467(1992))。
4)葡萄糖攝入能力的證實將其中已導(dǎo)入了pREhucep-8的和其中已導(dǎo)入了載體pREP10的兩組COS細胞各自懸浮于含有2％胎牛血清、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM(購自Gibco；葡萄糖濃度1g/l)中，以每孔2×104個細胞的密度接種于96孔CytostarT(Amersham制造)中，然后于5％CO2存在下37℃培養(yǎng)過夜。除去培養(yǎng)基后，各孔內(nèi)加入50μl含有5％BSA但不含葡萄糖和酚紅的DMEM，然后37℃培養(yǎng)3小時。以0.1μCi/50μl/孔的量加入14C標記的2-脫氧葡萄糖(購自Daiichi PureChemical有限公司)，于37℃溫育20分鐘，然后以100μl/孔的量加入1mM非放射標記的葡萄糖以終止放射標記的2-脫氧葡萄糖的攝入，并用Micro Beta液體閃爍計數(shù)器(Wallac生產(chǎn))測量細胞的葡萄糖攝入能力。
結(jié)果可見，其中已導(dǎo)入了pREhucep-8的COS細胞比其中已導(dǎo)入了載體pREP10的COS細胞有明顯較高的葡萄糖攝入能力(圖8)。
序列表<110>TAISHO藥物有限公司<129>糖轉(zhuǎn)運蛋白<139>P485<150>JP 10-187235<151>1998-07-02<160>2<210>1<211>520<212>PRT<213>Homo sapience<400>1Met Ala Ser Asp Pro Ile Phe Thr Leu Ala Pro Pro Leu His Cys5 10 15His Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Asn Ala Ser Gly Trp Glu Gln Pro20 25 30Pro Asn Ala Ser Gly Val Ser Val Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ala35 40 45Ser Ala Ala Ser Arg Val Ala Thr Ser Thr Asp Pro Ser Cys Ser50 55 60Gly Phe Ala Pro Pro Asp Phe Asn His Cys Leu Lys Asp Trp Asp65 70 75Tyr Asn Gly Leu Pro Val Leu Thr Thr Asn Ala Ile Gly Gln Trp80 85 90Asp Leu Val Cys Asp Leu Gly Trp Gln Val Ile Leu Glu Gln Ile95 100 105Leu Phe Ile Leu Gly Phe Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Leu Gly Tyr110 115 120Pro Ala Asp Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Val Leu Leu Thr Leu125 130 135Gly Leu Val Gly Pro Cys Gly Val Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ser140 145 150Ser Thr Gly Val Met Ala Leu Arg Phe Leu Leu Gly Phe Leu Leu155 160 165Ala Gly Val Asp Leu Gly Val Tyr Leu Met Arg Leu Glu Leu Cys170 175 180Asp Pro Thr Gln Arg Leu Arg Val Ala Leu Ala Gly Glu Leu Val185 190 195Gly Val Gly Gly His Phe Leu Phe Leu Gly Leu Ala Leu Val Ser200 205 210Lys Asp Trp Arg Phe Leu Gln Arg Met Ile Thr Ala Pro Cys Ile215 220 225Leu Phe Leu Phe Tyr Gly Trp Pro Gly Leu Phe Leu Glu Ser Ala230 235 240Arg Trp Leu Ile Val Lys Arg Gln Ile Glu Glu Ala Gln Ser Val245 250 255Leu Arg Ile Leu Ala Glu Arg Asn Arg Pro His Gly Gln Met Leu260 265 270Gly Glu Glu Ala Gln Glu Ala Leu Gln Asp Leu Glu Asn Thr Cys275 280 285Pro Leu Pro Ala Thr Ser Ser Phe Ser Phe Ala Ser Leu Leu Asn290 295 300Tyr Arg Asn Ile Trp Lys Asn Leu Leu Ile Leu Gly Phe Thr Asn305 310 315Phe Ile Ala His Ala Ile Arg His Cys Tyr Gln Pro Val Gly Gly320 325 330Gly Gly Ser Pro Ser Asp Phe Tyr Leu Cys Ser Leu Leu Ala Ser335 340 345Gly Thr Ala Ala Leu Ala Cys Val Phe Leu Gly Val Thr Val Asp350 355 360Arg Phe Gly Arg Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser Met Thr Leu Thr365 370 375Gly Ile Ala Ser Leu Val Leu Leu Gly Leu Trp Asp Tyr Leu Asn380 385 390Glu Ala Ala Ile Thr Thr Phe Ser Val Leu Gly Leu Phe Ser Ser395 400 405Gln Ala Ala Ala Ile Leu Ser Thr Leu Leu Ala Ala Glu Val Ile410 415 420Pro Thr Thr Val Arg Gly Arg Gly Leu Gly Leu Ile Met Ala Leu425 430 435Gly Ala Leu Gly Gly Leu Ser Gly Pro Ala Gln Arg Leu His Met440 445 450Gly His Gly Ala Phe Leu Gln His Val Val Leu Ala Ala Cys Ala455 460 465Leu Leu Cys Ile Leu Ser Ile Met Leu Leu Pro Glu Thr Lys Arg470 475 480Lys Leu Leu Pro Glu Val Leu Arg Asp Gly Glu Leu Cys Arg Arg485 490 495Pro Ser Leu Leu Arg Gln Pro Pro Pro Thr Arg Cys Asp His Val500 505 510Pro Leu Leu Ala Thr Pro Asn Pro Aha Leu515 520<210>2<211>1560<212>DNA<213>Homo sapience<400>2atggcctcgg accccatctt cacgctggcg cccccgctgc attgccacta cggggccttc60ccccctaatg cctctggttg ggagcagcct cccaatgcca gcggcgtcag cgtcgccagc 120gctgccctag cagccagcgc cgccagccgt gtcgccacca gtaccgaccc ctcgtgcagc 180ggcttcgccc cgccggactt caaccattgc ctcaaggatt gggactataa tggccttcct 240gtgctcacca ccaacgccat cggccagtgg gatctggtgt gtgacctggg ctggcaggtg 300atcctggagc agatcctctt catcttgggc tttgcctccg gctacctgtt cctgggttac 360cccgcagaca gatttggccg tcgcgggatt gtgctgctga ccttggggct ggtgggcccc 420tgtggagtag gaggggctgc tgcaggctcc tccacaggcg tcatggccct ccgattcctc 480ttgggctttc tgcttgccgg tgttgacctg ggtgtctacc tgatgcgcct ggagctgtgc 540gacccaaccc agaggcttcg ggtggccctg gcaggggagt tggtgggggt gggagggcac 600ttcctgttcc tgggcctggc ccttgtctct aaggattggc gattcctaca gcgaatgatc 660accgctccct gcatcctctt cctgttttat ggctggcctg gtttgttcct ggagtccgca 720cggtggctga tagtgaagcg gcagattgag gaggctcagt ctgtgctgag gatcctggct 780gagcgaaacc ggccccatgg gcagatgctg ggggaggagg cccaggaggc cctgcaggac 840ctggagaata cctgccctct ccctgcaaca tcctcctttt cctttgcttc cctcctcaac 900taccgcaaca tctggaaaaa tctgcttatc ctgggcttca ccaacttcat tgcccatgcc 960attcgccact gctaccagcc tgtgggagga ggagggagcc catcggactt ctacctgtgc 1020tctctgctgg ccagcggcac cgcagccctg gcctgtgtct tcctgggggt caccgtggac 1080cgatttggcc gccggggcat ccttcttctc tccatgaccc ttaccggcat tgcttccctg 1140gtcctgctgg gcctgtggga ttatctgaac gaggctgcca tcaccacttt ctctgtcctt 1200gggctcttct cctcccaagc tgccgccatc ctcagcaccc tccttgctgc tgaggtcatc 1260cccaccactg tccggggccg tggcctgggc ctgatcatgg ctctaggggc gcttggagga 1320ctgagcggcc cggcccagcg cctccacatg ggccatggag ccttcctgca gcacgtggtg 1380ctggcggcct gcgccctcct ctgcattctc agcattatgc tgctgccgga gaccaagcgc 1440aagctcctgc ccgaggtgct ccgggacggg gagctgtgtc gccggccttc cctgctgcgg 1500cagccacccc ctacccgctg tgaccacgtc ccgctgcttg ccacccccaa ccctgccctc 1560
權(quán)利要求
1．下列(a)或(b)項的蛋白質(zhì)(a)具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中缺失、取代或加入一個或多個氨基酸所形成的氨基酸序列，并具有糖轉(zhuǎn)運活性的蛋白質(zhì)。
2．編碼根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因。
3．包括下述(c)或(d)的基因(c)具有如SEQ ID NO:2所示堿基序列的DNA；(d)在嚴格條件下與SEQ ID NO:2的DNA雜交，并編碼具有糖轉(zhuǎn)運活性之蛋白質(zhì)的DNA。
4．篩選能夠增強或抑制糖轉(zhuǎn)運活性的化合物或其鹽的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)。
5．篩選能夠提高或抑制糖轉(zhuǎn)運活性的化合物或其鹽的方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求2或3的基因。
6．篩選能夠加速或抑制根據(jù)權(quán)利要求2或3的基因的轉(zhuǎn)錄之化合物的方法。
7．篩選能夠加速或抑制根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運之化合物的方法。
8．通過實施權(quán)利要求4至7中任一項的篩選方法得到的化合物或其鹽。
9．抗根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的抗體。
全文摘要
可通過從衍生于人大腦皮層的cDNA庫中克隆得到編碼具有糖轉(zhuǎn)運活性之新的蛋白質(zhì)HUCEP－8的基因hucep－8。
文檔編號C07K14/435GK1313865SQ9980995
公開日2001年9月19日 申請日期1999年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月2日
發(fā)明者吉本真, 矢崎圓, 松本佳代, 高山喜好, 釣谷克樹 申請人:大正制藥株式會社