專利名稱：聯(lián)合治療中的趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素來產(chǎn)生藥物組合物，用于治療或防止移植器官、組織或細胞的排斥。它還涉及同時、分別或依次使用所述藥物組合物的活性成分，用于上述特定治療。
具體說，它涉及用Met-RANTES和環(huán)孢菌素A來產(chǎn)生藥物組合物，用于治療腎臟同種異體移植物的移植排斥。
背景技術(shù)：
T細胞對外來(同種或異種)的蛋白質(zhì)或細胞或器官發(fā)動應答的機制已經(jīng)被很好的理解?？乖f呈細胞(APC)吸附在炎癥或損傷(可能由手術(shù)移植引起)的區(qū)域。外周T細胞的所有組成成分常常巡查組織中有無病原體的證據(jù)或外源(同種或異種)組織的存在。一旦識別了任何這些警報信號，APC吞沒該蛋白，將其消化并將其遞呈給宿主的免疫系統(tǒng)。
免疫系統(tǒng)配備良好，能迅速識別外源、疾病或發(fā)炎的組織，并迅速破壞它。這常常是組織、器官和細胞移植以及基因治療中主要的障礙。主要的問題通常和慢性免疫抑制、包圍或免疫隔離有關(guān)。慢性免疫抑制的不良副作用包括對機會性感染和腫瘤形成的易感性。
具體說，急性腎臟同種異體移植的排斥是由同種抗原-依賴性和非依賴性因素介導的，而且它的特征是主要由T淋巴細胞、單核細胞/巨噬細胞和偶然的嗜伊紅粒細胞構(gòu)成的單核細胞浸潤(Grne H.J.,1996,Valente J.F.等，1998,Bishop G.A.等，1986)。這些白細胞從外周循環(huán)中集中進入移植器官涉及在白細胞和內(nèi)皮細胞表面表達的一系列分子之間的復雜相互作用(Butcher E.C.,1991,Butcher E.C.等，1996,Springer T.A.,1994)。
在不存在持續(xù)的免疫抑制下，對長期接受移植組織的需要是人類醫(yī)學的一個長期目標。
已顯示趨化因子，一種結(jié)構(gòu)相關(guān)細胞因子的大超家族，能選擇性促進特異性白細胞效應亞群的迅速粘著、化學趨向和活化(Springer T.A.,1994,Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D等，1997)。
趨化因子的特征是一系列共享的結(jié)構(gòu)元件，包括用來確定C、C-C、C-X-C和C-X3-C趨化因子亞組的保守半胱氨酸殘基(其中X代表在前兩個鄰近氨基末端的半胱氨酸之間插入的氨基酸殘基)。趨化因子的所有各種生物作用看來是通過它們和7個跨膜(跨越C-蛋白偶聯(lián)受體)的大家族相互作用指導的(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.1998,Schlndorff D.等，1997)。特異性表達這些受體的細胞類型看來在顯著程度上控制著趨化因子作用的白細胞特異性(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D.等，1997)。
趨化因子RANTES(激活后調(diào)控，正常T細胞表達并分泌的)，一種C-C趨化因子亞家族的成員，是許多趨化因子受體，包括人的CCR1、CCR3、CCR5、CCR9和DARC(趨化因子的Duffy抗原受體)的配體(Nelson P.J.等，1998,Luster A.D.,1998,Schlndorff D.等，1997,Nibbs R.J.等，1997)。RANTES是一種T細胞。單核細胞、自然殺傷細胞、嗜鹼細胞和嗜伊紅粒細胞的強大趨化誘引劑(Nelson P.J.等，1998)。
認為RANTES等趨化因子在引起各種疾病過程的細胞滲出中起著中樞作用。例如，RANTES在體內(nèi)特征是單核細胞浸潤的疾病，包括遲發(fā)型超敏反應、壞死性腎小球腎炎、肺部炎癥疾病和腎臟異體移植排斥中表達(Schlndorff D.等，1997,Nelson P.J.等，1998,Devergne O.等，1994,Luckas N.W.等，1996,Lloyd C.M.等，1997,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。在對經(jīng)受急性細胞排斥的人腎臟的研究中，發(fā)現(xiàn)RANTES蛋白定位在單核細胞浸潤性細胞、腎小管上皮細胞和小管周圍毛細血管內(nèi)皮上(Pattison J等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。由于急性細胞排斥的特征是單核細胞/巨噬細胞、T淋巴細胞和偶而嗜伊紅粒細胞構(gòu)成的血管內(nèi)異常的間質(zhì)細胞浸潤，RANTES可能是急性排斥病理中的關(guān)鍵因素(Schlndorff D.等，1997,Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。
基于這些觀察，已提出了一個在腎臟異體移植排斥中RANTES作用的模型(Nelson P.J.等，1998,Pattison J等，1994,Wiedrmann C.J.等，1993)。在排斥早期，微血管內(nèi)皮變得發(fā)炎，血小板脫顆粒，釋放與內(nèi)皮表面結(jié)合的RANTES蛋白。發(fā)炎的腎小管和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生額外的趨化因子，包括RANTES。然后該聚集的表面結(jié)合趨化因子向循環(huán)性白細胞提供滾過內(nèi)皮表面的導向信號(Butcher E.C.等，1991,Butcher E.C.等，1996,Springer T.A.,1994,Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。白細胞識別該表面結(jié)合的蛋白，上調(diào)整聯(lián)蛋白，并牢固的粘著于內(nèi)皮表面，經(jīng)歷白細胞滲出和外滲。隨著白細胞活化，它們產(chǎn)生其它細胞因子和趨化因子，從而放大并傳播炎癥反應(Nelson P.J.等，1998,Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。
修飾RANTES蛋白的氨基末端可顯著改變其性能(Proudfoof等，1996,Gong J.H.等，1996,Simmons G.等，1997)。加入一個甲硫氨酸殘基將促效蛋白變成具有納摩爾效價的RANTES受體拮抗劑(Proudfoof A.E.等，1996)。該拮抗劑，Met-RANTES，在小鼠和大鼠中是生物活性的(Proudfoot未發(fā)表)，而且已顯示在小鼠的過敏性皮膚和類風濕性關(guān)節(jié)炎模型中能抑制炎癥，并部分抑制壞死性腎小球腎炎(TeixeiraM.M等，1997,Plater-Zyberk C.等，1997,LLoyd C.M等，1997)。
環(huán)孢菌素代表一組非極性環(huán)狀寡肽，具有免疫抑制劑活性，由真菌Tolypocladium inflatum Gams和其它半知菌產(chǎn)生。已鑒定了其主要成分環(huán)孢菌素A和幾種其它微量代謝產(chǎn)物，環(huán)孢菌素B到N。還已經(jīng)制備了許多合成的同類物。環(huán)孢菌素A是商業(yè)可購得的藥物，它獲得了廣泛的臨床應用，如作為器官移植程序中的免疫抑制劑。
環(huán)孢菌素A的主要問題是它的腎臟毒性(Martindale,1996)，特征是液體潴流，血清肌酐和尿素濃度提高，腎小球濾過率的下降，和鈉和鉀排泄減少。具體說，在腎臟異體移植中，接受者可能難于將移植排斥和腎臟毒性分開。
發(fā)明描述我們現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，用趨化因子受體拮抗劑和低劑量的環(huán)孢菌素組合處理，和單用環(huán)孢菌素處理比較，導致與移植排斥相關(guān)的炎癥活動降低。
具體說，我們已發(fā)現(xiàn)Met-RANTES減少了對脈管和腎小管的損傷，并導致腎臟異體移植中間質(zhì)排斥的顯著減弱。
因此，本發(fā)明的主要目的是聯(lián)合使用趨化因子的受體拮抗劑和環(huán)孢菌素來產(chǎn)生一種藥物組合物，以治療或預防移植器官、組織或細胞的排斥。趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素可以同時、分開或依次施用。
因此，本發(fā)明的另一個目的是通過同時、分別或依次施用有效量的趨化因子受體拮抗劑和有效量的環(huán)孢菌素，以及藥物學上可接受的賦形劑，治療或防止對移植器官、組織或細胞的排斥。
“有效量”指一定量的活性成分，它足以影響移植器官、組織或細胞排斥的過程和嚴重性，導致這些病理過程的減弱和緩和。有效量將視施藥途徑和病人的情況而定。
本發(fā)明的另一個目的是含有趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素，并存在一種或多種藥物學上可接受的賦形劑的藥物組合物，通過同時、分別或依次施用其活性成分，以治療或防止移植器官、組織或細胞的排斥。
就分開和依次使用兩種活性成分而言，本發(fā)明的藥物組合物將含有兩種不同的制劑，每一種含有兩種活性成分之-，和一種或多種藥物學上可接受的賦形劑。
“藥物學上可接受”指包括任何不干涉活性成分的生物活性效果，并對宿主無毒的載體。例如，對于胃腸道外施用，上述活性成分可以單劑形式配制在載體，如鹽水、葡萄糖溶液、血清清蛋白和Ringer’s溶液中。
除了藥物學上可接受的載體，本發(fā)明的組合物還可包含微量的添加劑，如穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖液和防腐劑。
這些活性成分的施用可以是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑。本發(fā)明也包括其它以達到各成分所需血液水平的施藥途徑。
本發(fā)明的組合治療適合于治療或防止任何移植器官、組織或細胞的排斥，但它特別適合腎臟移植，由于環(huán)孢菌素A的腎臟毒性。
術(shù)語“趨化因子受體拮抗劑”指任何對成熟的、全長的、天然存在趨化因子有拮抗劑作用，并優(yōu)選不顯示顯著的趨化誘引劑活性的分子。對于測量這些趨化誘引劑活性，可參見例如(Nelson P.J.等，1998)。
趨化因子受體拮抗劑優(yōu)選選自在國際專利申請WO 97/44462中報道的截短的RANTES分子，截短的MCP-3，國際專利申請WO98/06751中描述的RANTES和MIP-1α，歐洲專利申請?zhí)?7116863.8中描述的截短的RANTES和MCP-2，或WO96/17935中描述的N-末端延長的RANTES。Met-RANTES是特別優(yōu)選的。對于上述專利出版物，還參考了制備所述的趨化因子受體拮抗劑的方法。
環(huán)孢菌素選自環(huán)孢菌素A，其代謝產(chǎn)物或合成的同類物。優(yōu)選的是環(huán)孢菌素A。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選例包括組合使用Met-RANTES和環(huán)孢菌素A，以治療或預防腎臟同種異體移植的排斥。就此，本申請人已發(fā)現(xiàn)可能減少環(huán)孢菌素的有效劑量，而且考慮到已知和環(huán)孢菌素治療有關(guān)的劑量依賴性的腎臟毒性，這是一個極大的優(yōu)點。
已在大鼠的體內(nèi)實驗中顯示了上述作用。
現(xiàn)在，本發(fā)明將通過下列實施例描述，這些實施例不應以任何方式看成是對本發(fā)明的限制。實施例將參考附圖。
附圖描述

圖1測定了在用IL-1β(5ng/ml)刺激之前和之后12小時RANTES和微血管內(nèi)皮直接結(jié)合的能力。DMVEC在96孔板上生長，用改良的ELISA程序測定RANTES。
圖2a和b在生理流動下，Met-RANTES對MonoMac 6細胞在活化的微血管內(nèi)皮上牢固停滯、鋪展和轉(zhuǎn)移的影響。用IL-1β(5ng/ml)刺激DMVEC在Petri皿中生長至匯合，或放置不處理12小時，并預先用或不用RANTES(10ng/ml)預培育30分鐘。用或不用Met-RANTES(1微克/毫升)預處理MonoMac 6細胞30分鐘，并以穩(wěn)定流速1.5dyn/cm2灌流。(a)5分鐘后，計算多個視野中牢固粘附的單核細胞數(shù)，確定對DMVEC的牢固粘著，表示為細胞/平方毫米。(b)5分鐘后，在多個高倍視野中對經(jīng)歷鋪展或轉(zhuǎn)移的單核細胞計數(shù)，表示為初始牢固結(jié)合細胞的百分數(shù)。數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗的平均數(shù)±標準偏差。(注意結(jié)果在0.01-1微克/毫升的Met-RANTES范圍內(nèi)可重現(xiàn))。
實施例材料和方法所用細胞如前所述，在補充了10％FCS的RPMI1640中培養(yǎng)單核腫瘤細胞系MonoMac6(Ziegler-Heitbrock H.W.L.等，1988)。在24孔培養(yǎng)板(Costar)中常規(guī)培養(yǎng)細胞，測試培養(yǎng)液和血清的低LPS含量。從K.Degitz博士獲得了人新生兒包皮(forskin)的原代人皮膚微血管內(nèi)皮細胞(DMVEC)(Dermatology,LMU,Munich,Germany)。在補充了10％胎牛血清(Boehringer Mannheim,Germany)、1mg/ml醋酸氫化可的松(Sigma,Deisenhofen,Germany)、5×105M二丁酰腺苷一磷酸(Sigma,Deisenhofen,Germany)、2mM谷氨酰胺(Seromed,Berlin,Germany)、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、25mg/ml Amphtericin B(抗生素/抗霉素溶液，Gibco BRL,Eggenstein,Germany)的MCDB 131培養(yǎng)液(GibcoBRL,Eggenstein Germany)中，37℃,5％CO2下培養(yǎng)細胞。細胞在T75瓶，35毫米Petri皿(Costar,Corning,New York)或用0.5％明膠(Sigma,Deisenhofen,Germany)預包被的96孔平底培養(yǎng)板(Nunc,Wiesbaden,Germany)中生長。每2-3天換一次培養(yǎng)液。確定細胞特征，通過形態(tài)學外觀和免疫熒光流式細胞計數(shù)確定培養(yǎng)物的CD31表面表達的純度。
材料從Merck(Darmstadt,Germany)獲得了用于組織學研究的材料。Sigma(Munich,Germany)提供了化學和免疫學測定的材料。從Sigma(Munich,Germany)購得IL-1β和TNFα。先前已描述了重組RANTES和RANTES特異性單克隆抗體VL1的產(chǎn)生(Von Luettichau I.,1996)。如前所述，產(chǎn)生Met-RANTES并除去內(nèi)毒素，用于體內(nèi)研究(Proudfoof A.E.等，1996,Teixeira M.M等，1997,Plater-Zyberk C.等，1997,Lloyd C.M等，1997)。
動物和腎臟移植在所有實驗中使用近交雄性大鼠。Lewis(LEW,RT11)大鼠作為Fisher344(F344 RT11v1)或Brown Norway(BN RT1*)腎臟的接受者。動物購自CharlesRiver GmbH,Sulzfeld,Germany。大鼠重量在190-250gm(Lew和F344)和140-170gm(BN)，以校準輸尿管直徑。采用改良的原來由Fisher和Lee(Fisher B.等，1965)描述的技術(shù)進行移植。簡單說，用乙醚點滴麻醉劑麻醉動物，用5毫升冷的含或不含100微克Met-RANTES的0.9％NaCl(4℃)沖洗供體腎臟。整個取下腎臟和輸尿管，包括用5毫米主動脈鉗取下腎動脈和用3毫米腔靜脈塞片取下腎靜脈。將腎臟保存在4℃的0.9％NaCl中。
在左腎臟主動脈下方，用8-0不可吸收的單根尼龍縫線端側(cè)吻合手術(shù)將供體腎臟移植到受體動物的腹部主動脈和下腔靜脈上。用11-0不可吸收單根尼龍縫線進行對端輸尿管縫合。供體腎臟的總?cè)毖獣r間在30-40分鐘之間變化。同時死亡時肉眼檢查和用光學顯微鏡觀察腎積水。從實驗組中除去所有具有腎積水的動物。在移植時，總是除去接受者的左腎。在Fisher到Lewis移植中，保留右腎，以獲得對Met-RANTES作用的內(nèi)部對照。在Brown Norway到Lewis移植中，在移植時進行雙側(cè)腎切除。
實驗組實驗組如下組1:Fisher 344腎臟移入具有一個內(nèi)源腎臟的Lewis大鼠。
組1a用Met-RANTES200微克/日，7天(n=9)組1b不用Met-RANTES，7日(n=9)組2:Brown Norway腎臟移入雙側(cè)腎切除的Lewis大鼠中，每日給予CyA2.5mg/kg體重。
組2a用Met-RANTES,50微克/日，12日(n=4)。
組2b不用Met-RANTES,12日(n=4)。
將環(huán)孢菌素A(Cya)(Sandoz,Basel,Switzerland慷慨提供)溶于橄欖油中，并以2.5mg/kg體重每日皮下施藥12日，移植后4小時開始。將Met-RANTES溶于水，并調(diào)節(jié)到0.9％氯化鈉，每日一次靜脈內(nèi)注射Fisher到Lewis200微克，Brown Norway到Lewis移植實驗中50微克劑量每日注射一次。
血清分析在處死時，從主動脈取血，用自動化血清分析儀分析肌酐、尿素、葡萄糖和膽紅素。這對Fisher到Lewis模型不提供腎臟功能的信息，因為該移植動物有一只內(nèi)源腎臟，但這些測量在Brown Norway到Lewis移植模型中是相關(guān)的。
組織學在深度麻醉下，取出器官(肺、肝、腎臟和脾臟)?？焖傥善鞴俚难?，稱重，然后按組織學、免疫組織化學，或原位雜交的需要處理。將各器官切成1毫米的切片，用含有4％甲醛的pH7.35的磷酸緩沖鹽(PBS)(PBS:99mMNaH2PO4xH2O,108mM NaH2PO4x2H2O和248mMNaCl)中浸沒固定24小時，或用甲醇固定8小時并用石蠟包埋，或凍在液氮中，儲藏在-80℃，直到用于免疫組織化學。在用高碘酸-Schiff或Goldner-Elastica染色的3微米切片上用光學顯微鏡觀察。
免疫組織化學對甲醇固定、石蠟包埋的組織(3微米)使用單克隆抗體ED1(Serotech/Camon,Wiesbaden,Germany)，來顯示單核細胞/巨噬細胞。為了檢測細胞毒性T淋巴細胞上表達的CD8抗原，在用冰冷的丙酮固定5分鐘后，對冷凍切片使用單克隆小鼠抗體(Serotech/Camon,Wiesbaden,Germany)。使用了堿性磷酸酶抗-堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)(Dako,Hamburg,Germany)。對于每個測試切片刪去第一或第二抗體的對照呈陰性。
形態(tài)測量血管損傷評分按顯示無損傷(0)、輕微(1)、中度(2)和嚴重(3)的損傷程度，評估了具有內(nèi)皮損傷、血栓和內(nèi)皮炎的腎小球前輸入血管，并在整個腎臟切片，包括皮質(zhì)、外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)中評估。程度特異性的血管損傷指標被定義成在整個腎臟切片中發(fā)生各種損傷程度的血管百分數(shù)?？傃軗p傷評分計算為具有各種程度血管損傷的所有血管之和，其中具有程度1的血管數(shù)乘以1，程度2的乘以2，程度3的乘以3(Stojanovic T等，1996)。腎小管炎癥評分按在20個皮質(zhì)和外髓質(zhì)切條中的高能場(HPF)中所判斷的，腎小管損傷分為不存在(0)、輕微(1)、中度(2)和嚴重(3)?？偰I小管損傷評分如總脈管損傷評分所述計算，間質(zhì)炎癥評分單核細胞的間質(zhì)浸潤程度被判斷為不存在(0)、輕微(1)、中度(2)和嚴重(3)，而總評分計算按總血管損傷評分所述的那樣。腎小球毛細管攀內(nèi)單核細胞/巨噬細胞和T細胞的數(shù)目計算為一個腎臟切片中所有腎小球中各細胞數(shù)的平均值。
原位雜交體外轉(zhuǎn)錄大鼠RANTES的cDNA克隆，產(chǎn)生了單鏈的RNA探針(Dr.H.Sprenger,Marburg,Germany)。用Trans-Probe-T試劑盒(Pharmacia,Freiburg,Germany)和異羥基洋地黃毒甙元標記的尿苷三磷酸(Boehriger,Mannheim,Germany)進行了體外轉(zhuǎn)錄。用BamHⅠ切開載體(pBluescriptKS(+)Stratagene,Heidelberg,Germany)，并用T3-RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，得到反義探針和有義探針，用EcoRⅠ切開該質(zhì)粒，然后用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。除去石蠟后，用含20微克/毫升的蛋白酶K(Boehringer)的PBS消化腎臟切片16分鐘。然后在4％甲醛中固定切片5分鐘，并乙酸化(含0.25％乙酸酐的0.1M三乙醇胺，10分鐘)。為了與異羥基洋地黃毒甙元標記的mRNA原位雜交，使用了下列雜交緩沖液5x標準檸檬酸鹽水(SSC)、50％甲酰胺、50微克/毫升tRNA、50微克/毫升肝素和0.1％十二烷基磺酸鈉。
56℃雜交16小時后，用4xSSC和2xSSC 37℃洗滌載玻片10分鐘，然后22℃在0.55xSSC中洗滌30分鐘，在0.1SSC中洗滌15分鐘。按照廠商說明書(Boehringer,Mannheim,Germany)進行抗異羥基洋地黃毒甙元抗體培育和堿性磷酸酶反應，采用氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸作為顯色劑(Stojanovic T等，1996,Simon等，1995)。
如前所述(Simon M等，1995)中從整個大鼠腎臟中分離出總RNA。用商品RPA試劑盒(PharMingen,San Diego,California，探針rCK-1)進行RNase保護實驗。該試劑盒能同時測定大鼠的mRNA種類IL-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFN-γ和持家基因GAPDH和L32，對每次測定使用了20微克總RNA。在預制凝膠(QuickpointTM快速核酸分離系統(tǒng)，按廠商推薦使用，Novex,San Diego,California)上走保護的樣品。用Molecular Dynamics Storm 840 Phosphorimager定量特異性條帶的強度，對L32基因表達標準化，并取分析的三只動物的平均值。
體外結(jié)合試驗DMVEC在包被的96孔平底培養(yǎng)板上生長至匯合。不處理，或用各種濃度的IL-1β(0.1-5ng/ml)處理得到的單層內(nèi)皮12小時。RANTES結(jié)合試驗是前述程序(Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)的改良。25℃在DMVEC生長培養(yǎng)液(無補充)中預培育偶聯(lián)有抗-人-RANTES單克隆抗體VL1的辣根過氧化物酶(HRP)(0.1微克)和過量的重組人RANTES(20微克/毫升)30分鐘。然后加入趨化因子-抗體復合物，并用來分析微血管內(nèi)皮的相對趨化因子結(jié)合能力。用未補充的生長培養(yǎng)液(25℃)溫和洗滌內(nèi)皮單層1次，并加入趨化因子-抗體復合物，25℃培育30分鐘。然后用不含血清的培養(yǎng)液25℃洗滌孔4次。HRP反應進行5分鐘或更短。用ELISA平板閱讀儀測定平板在406納米處的光密度。結(jié)果證明內(nèi)皮細胞活化后，發(fā)炎的微血管內(nèi)皮對RANTES蛋白的結(jié)合能力的改變。所有實驗進行4次，顯示的結(jié)果是三個獨立實驗的代表。
熒光激活細胞分選(FACS)分析基本如所述(Weber C等，1995)進行皮膚微血管細胞(DMVEC)的流式細胞計數(shù)分析。簡單說，用胰蛋白酶消化經(jīng)IL-1β(5ng/ml)刺激12小時或未處理的匯合DMVEC，與IL飽和濃度的ICAM-1 mAb RR1/1(Dr.R.Rothlein慷慨贈與)、E-選擇素mAb、VCAM-1 mAb(都是Serotec)、或同型抗原對照在冰上反應30分鐘，用異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG(Boehringer Mannheim)染色，并在FACScan(Becton Dickinson)中分析。糾正非特異性結(jié)合后，數(shù)據(jù)表達成通道中的特異性平均對數(shù)熒光強度(sMFI)。
在生理流動條件下，單核細胞在微血管內(nèi)皮上聚集的體外模式系統(tǒng)基本如所述(Weber C等，1997,Kukerti S.等，1997,Piali L等，1998)，在層流試驗中研究了單核細胞和DMVEC的相互作用。簡單說，DNVEC在35毫米Petri培養(yǎng)皿中生長至匯合，并用IL-1β(5ng/ml)刺激12小時或不處理。將平板收集在平行壁流通室中，并安放在具有20X和40X的相差物鏡的OlympusIMT-2倒置顯微鏡的載物臺上。如報道(Ziegler-Heitbrock H.W.L.等，1988,Weber C等，1993)培養(yǎng)單核細胞(MonoMac 6細胞)，并以106/毫升重懸浮在含有10mM Hepes/pH7.4和0.5％HAS的試驗緩沖液(HBSS)中。在試驗前不久，加入1mM Mg2+和1mM Ca2+。在試驗過程中，將細胞懸液保存在37℃的加熱區(qū)中，并以1.5dyn/cm2速度灌流入流通室中5分鐘、對于抑制實驗，將單核細胞與不同濃度(0.01-1微克/毫升)的Met-RANTES在冰上預培育30分鐘。在多個視野中(至少每實驗5個)通過分析用長集成JVC 3CCD攝像機和JVC SR L900E錄像機記錄的影象，定量測定5分鐘后牢固粘附的細胞數(shù)，并表示為細胞數(shù)/平方毫米。所分析的粘附類型限于初級，即，單核細胞和內(nèi)皮直接作用。作為牢固停滯的反相測量值，在5分鐘間隔的最后30秒內(nèi)測定了以降低的速度在內(nèi)皮上滾動的細胞數(shù)，并評估為視野中所有相互作用的百分數(shù)。5分鐘間隔后鋪展或轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)在高能場中如所述(Luscinskas F.W.等，1994)測定，并表示為牢固粘附的細胞百分數(shù)。
統(tǒng)計分析給出ms roman+/-SEM值。用Mann-Whithney U-Wilcoxon秩次和檢驗進行統(tǒng)計分析。小于0.05的p值認為顯示兩組之間有顯著性差異。
結(jié)果Fisher344(F344 RT11v1)腎臟移到Lewis(LEW,RT11)的同種移植在不存在免疫抑制下，將Fisher(344)大鼠腎臟移植到Lewis大鼠中導致手術(shù)后7天特征性的單核細胞浸潤和組織損傷。組織學檢測顯示，腎小球前動脈和腎小管間質(zhì)內(nèi)膜有局部單核細胞浸潤。該間質(zhì)中單核細胞浸潤的主要成分包括單核細胞/巨噬細胞。對動脈、小動脈、腎小管的損傷程度，和單核細胞的間質(zhì)浸潤程度，使用前面描述的、基于半定量形態(tài)測量(見材料和方法)的程序評級分為不存在(0)、輕微(1)、中度(2)、嚴重(3)。
通過每日每只動物靜脈內(nèi)注射Met-RANTES200微克，處理移植的動物，來檢測Met-RANTES對該過程的作用。在移植手術(shù)中，血管吻合術(shù)后1小時內(nèi)第一次注射Met-RANTES。在實驗過程中，不再施給額外的免疫抑制劑。光學顯微鏡和免疫組織學顯示Met-RANTES處理對內(nèi)源腎臟沒有明顯作用。
器官移植排斥中，一般移植的器官由于炎癥而重量增加。表1總結(jié)的結(jié)果顯示，用Met-RANTES處理的動物相對于未處理動物在移植器官重量上有統(tǒng)計學上顯著的下降。該結(jié)果還提示，腎小球T細胞和單核細胞浸潤降低，然而考慮該降低無統(tǒng)計學顯著性(Mann-Whitney U-Wilcoxon秩次和檢驗)。表2總結(jié)了Met-RANTES治療最深的影響。數(shù)據(jù)證明，Met-RANTES處理的動物，與未處理動物所見比較，血管損傷和腎小管排斥評分顯著降低。雖然關(guān)于間質(zhì)排斥評分的總趨勢顯示在Met-RANTES處理的動物中明顯降低，這不能認為有統(tǒng)計學顯著性(Mann-Whithney U-Wilcoxon評級總和試驗)。
檢查了組織切片和免疫組織化學染色，來評估Met-RANTES對排斥過程的作用。移植后7天，取下腎臟，并如材料和方法中所述進行制備。
在未處理的腎臟中觀察到動脈腔和壁中存在單核細胞造成的血管損傷。相反，Met-RANTES處理的動物未顯示血管排斥。未處理動物的間質(zhì)區(qū)顯示了在間質(zhì)和腎小管中許多染色深的單核細胞浸潤。相反，Met-RANTES處理的動物顯示減少的單核細胞浸潤，較少腎小管損傷和發(fā)育良好的近端小管的紅色刷狀緣。
原位雜交定位大鼠RANTES mRNA在原位雜交研究中，使用取自排斥性Fisher大鼠腎臟的組織切片，來證明RANTES mRNA在排斥腎臟中的細胞特異性表達。結(jié)果和先前描述的人腎臟異體移植排斥過程中RANTES的表達相似(Pattison J等，Wiedermann C.J.等，1993,Von Luettichau L.,1996)。見到了浸潤性單核細胞和腎小管的強烈表達和一些內(nèi)皮細胞有限但可鑒定的表達。
Met-RANTES處理的動物如RNase保護試驗測定的那樣，顯示促炎細胞因子mRNA表達的下降促炎細胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-6、TNFβ、TNFα和IFNγ表達的增加是腎臟移植排斥的特征(Nickerson P.等，1997,SchmouderR.L.等，1995,Strom T.B.等，1996,Castro M.D.等，1998)。這些細胞因子的表達是正在進行的炎癥過程的指標。我們使用定量RNase保護試驗，檢測了Met-RANTES移植的Fisher大鼠腎臟中對一系列細胞因子表達的影響。從正常的對照腎臟、未處理的移植腎臟和Met-RANTES處理的移植腎臟中分離出整個器官RNA樣品。對比內(nèi)部標準品L32和GAPDH測定了代表細胞因子IL-1α、IL-1β、TNFβ、TNFα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFNγ的mRNA水平。結(jié)果顯示，移植后7天，未處理的腎臟上調(diào)了編碼IL-1α(24倍)、TNFβ(3.2倍)和IFNγ(1.7)的mRNA，在IL-1β(8.4倍)和TNFα(4.6倍)中可見最顯著的增加。在該時間點(移植后7日)在腎臟中未檢測到表達IL-2、IL-4或IL-5的mRNA。相應的用Met-RANTES處理的動物相對于未處理動物顯示IL-1α(25％)、IL-1β(48％)、TNFβ(34％)、TNFα(24％)和IFNγ(24％)的平均表達減少。
Brown Norway大鼠腎臟移植到Lewis大鼠中Met-RANTES聯(lián)合低劑量環(huán)孢菌素A(CyA)的效果然后我們將該試驗擴展到測定是否Met-RANTES能在腎臟移植排斥中補充低劑量CyA處理的效果。對于該程序，我們選擇了能產(chǎn)生更劇烈排斥現(xiàn)象(即Brown Norway腎臟移植到Lewis大鼠中)的腎臟移植模型。在移植時進行雙側(cè)腎切除。每日皮下施用2.5mg/kg體重水平的CyA，這在先前該模型中顯示不能顯著阻止腎臟排斥(Grne未發(fā)表的結(jié)果(Stojanovic T等，1996))。最后，為了更好的檢測任何協(xié)同作用，在這些實驗中使用了每日每只動物50微克的減少劑量的Met-RANTES?？偨Y(jié)于表3的這些結(jié)果顯示，血管和腎小管損傷對Met-RANTES/低劑量-CyA處理的動物，與僅用低劑量-CyA處理的動物比較，有統(tǒng)計學上的顯著降低。另外，可見間質(zhì)區(qū)單核細胞浸潤的顯著減少。功能性測定(其中血清肌酐在Met-RANTES處理的動物中相對于未處理的對照有減少(0.98±0.12對1.42+0.17mg％,(n=3)))肯定了這些組織學觀察。
由于單核細胞滲入血管腔空隙的減少代表了Met-RANTES處理在兩種移植模型中的突出特征，我們開始研究該作用的可能機制。在RANTES在腎臟移植排斥中作用的模型中，推測RANTES蛋白(由激活的血小板釋放或由局部發(fā)炎組織所分泌)在發(fā)炎的內(nèi)皮上聚集，在該處它可能支持單核細胞聚集(Nelson P.J.等，1998,Pattison J等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)。為了研究RANTES和微血管內(nèi)皮的直接結(jié)合，我們采用了先前用來檢測組織切片中內(nèi)皮表面結(jié)合RANTES的試驗(Pattison J.等，1994,Wiedermann C.J.等，1993)的改進方法，檢測了激活的皮膚微血管內(nèi)皮(DMVEC)匯集RANTES蛋白質(zhì)的能力。將對RANTES特異性的HRP-偶聯(lián)的mAb與過量的RANTES蛋白一起培養(yǎng)，將產(chǎn)生的復合物加到在96孔平底培養(yǎng)板中生長的、休眠的或IL-1β激活的微血管內(nèi)皮中。用ELISA樣方法，以單用mAb為對照測定了DMVEC結(jié)合抗原-mAb復合物的能力。雖然微血管內(nèi)皮在不經(jīng)預刺激的情況下能結(jié)合一些RANTES蛋白，但該結(jié)合在用促炎細胞因子IL-1α預刺激后大大增加(圖1)。而對未受刺激或激活的內(nèi)皮的非復合物性mAb的背景染色是可以忽略的。
為了進一步確定微血管內(nèi)皮的炎癥性激活，在DMVEC上用先前建立的流式細胞計數(shù)程序(Weber C.等，1995)測定了與單核細胞粘附有關(guān)的分子，即E-選擇素和Ig超家族成員ICAM-1和VCAM-1的表面表達。分析揭示，休眠DMVEC表達了組成型的ICAM-1表面水平，然而幾乎檢測不到VCAM-1或E-選擇素(表4)。用IL-1激活DMVEC12小時導致ICAM-1表達的上調(diào)，和VCAM-1及E-選擇素表面表達(表4)的顯著誘導。
Met-RANTES阻止單核細胞對發(fā)炎的微血管內(nèi)皮的牢固粘附，但不影響隨后的白細胞滲出活動在嘗試獲得對Met-RANTES作用可能機制的理解中，我們研究了阻斷RANTES受體是否可抑制單核細胞在微血管內(nèi)皮上的停滯和白細胞滲出。為此，我們使用了能顯示粘附特征和成熟單核細胞整合素，并表達幾種趨化因子受體，包括CCR1單核細胞系MonoMac 6細胞，(Erl W等，1995)。DMVEC在Petri培養(yǎng)皿上生長至匯合，不刺激或用IL-1β(5ng/ml)激活12小時。然后在平行流動室中測試微血管內(nèi)皮，其中MonoMac 6細胞以1.5dyn/cm2的剪切速率灌流通過該室。在這樣的生理流動條件下，MonoMac 6細胞經(jīng)過短期的滾動，可將一部分細胞的吸附輕易的轉(zhuǎn)化成抗剪切力的停滯。聚集5分鐘后，測定已牢固吸附在內(nèi)皮上的MonoMac 6細胞數(shù)(圖2(a))。
少數(shù)單核細胞牢固吸附在未受刺激的微血管內(nèi)皮上，而內(nèi)皮細胞預先接觸RANTES蛋白質(zhì)不顯示顯著的作用。用IL-1β預刺激微血管內(nèi)皮導致單核細胞抗剪切力的吸附增加。mAb的抑制確證了先前的發(fā)現(xiàn)，即該過程是由單核細胞α4和β2整合素介導的，它們分別與激活內(nèi)皮上表達的ICAM-1和VCAM-1相互作用(Kukerti S.等，1997,Luscinskas F.W.等，1994)。與直接結(jié)合試驗中RANTES的固定化一致，IL-1β激活的微血管內(nèi)皮預先接觸RANTES蛋白在5分鐘內(nèi)顯著增強了單核細胞的牢固停滯和聚集(圖2a)。值得注意的是，單核細胞與各種濃度(0.01-1微克/毫升)的Met-RANTES一起預培育，完全阻止了RANTES-介導的單核細胞在IL-1β激活的DMVEC上抗剪切力的吸附(圖2a，數(shù)據(jù)未顯示)，相似的，預先接觸RANTES后在激活的微血管內(nèi)皮上滾動的單核細胞組分(它可用作牢固停滯的反相量度)減少，但可用Met-RANTES恢復，表明與激活的內(nèi)皮的起始作用數(shù)未受影響。牢固停滯后，一組單核細胞經(jīng)歷了形狀改變或鋪展，一些最終遷移到內(nèi)皮細胞之間或之下。然而，RANTES或Met-RANTES不改變鋪展或轉(zhuǎn)移(圖2b)，暗示涉及其它信號。因此，這些結(jié)果表明Met-RANTES可能在腎臟移植排斥過程中通過阻止單核細胞停留于發(fā)炎微血管內(nèi)皮，而減少單核細胞的聚集。
表格表1將Fisher大鼠腎臟移植到Lewis大鼠中。計算腎小球毛細管攀中的單核細胞/巨噬細胞和T細胞數(shù)，表示為一張腎臟切片中腎小球中各種細胞數(shù)目的平均數(shù)。
*表明在測試的組之間有顯著性(p＜0.05)差異。
表2將Fisher腎臟移植到Lewis大鼠中。對Met-RANTES在血管損傷、和間質(zhì)單核細胞浸潤的組織學和免疫組織學分析的總結(jié)
*表明在測試的組之間有顯著性(p＜0.05)差異。
表3將Brown-Norway大鼠腎臟移植到Lewis大鼠中。對存在低劑量CyA時，Met-RANTES對血管和腎小管損傷、和間質(zhì)單核細胞浸潤作用的組織學分析的總結(jié)
*表明在測試的組之間有顯著性(p＜0.05)差異。
表4IL-1β對人微血管內(nèi)皮細胞中粘附分子表面表達的影響。DMVEC用IL-1β(5ng/ml)激活或留著不處理(對照)12小時，并與ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素或同種型對照mAb反應。用FACS在3個獨立試驗中分析表面蛋白質(zhì)的表達，在收集通道中非特異性結(jié)合后，作為特異性平均熒光密度(sMFI)給出。
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權(quán)利要求
1．一種趨化因子受體拮抗劑的用途，其特征在于，將該趨化因子與一種環(huán)孢菌素聯(lián)合，產(chǎn)生一種藥物組合物，用于治療或預防移植器官、組織或細胞的排斥。
2．如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，同時、分開或依次使用該趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素。
3．如上述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，該趨化因子受體拮抗劑是一種氨基末端截短的趨化因子。
4．如權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于，該趨化因子受體拮抗劑是一種氨基末端延伸的RANTES。
5．如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，該趨化因子受體拮抗劑是Met-RANTES。
6．如上述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述環(huán)孢菌素選自環(huán)孢菌素A和它的代謝物或合成的同類物。
7．如上述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述環(huán)孢菌素是環(huán)孢菌素A。
8．如上述任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，該用途是用于治療或防止腎臟同種異體移植。
9．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有一種趨化因子受體拮抗劑和一種環(huán)孢菌素，并存在一種或多種藥物學上可接受的賦形劑，該藥物組合物用于治療或防止移植器官、組織或細胞的排斥。
10．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有一種趨化因子受體拮抗劑和一種環(huán)孢菌素，并存在一種或多種藥物學上可接受的賦形劑，以同時、分別或依次使用所述組合物的活性成分，來治療或防止移植器官、組織或細胞的排斥。
11．如權(quán)利要求9或10所述的藥物組合物，其特征在于，所述趨化因子受體拮抗劑是一種氨基末端截短的趨化因子。
12．如權(quán)利要求9或10所述的藥物組合物，其特征在于，所述趨化因子受體拮抗劑是一種氨基末端延伸的RANTES。
13．如權(quán)利要求9或10所述的藥物組合物，其特征在于，該趨化因子受體拮抗劑是Met-RANTES。
14．如權(quán)利要求9到13任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述環(huán)孢菌素選自環(huán)孢菌素A和它的代謝物或合成的同類物。
15．如權(quán)利要求10到14任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述環(huán)孢菌素是環(huán)孢菌素A。
16．如權(quán)利要求9到15任一項所述的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物是用于治療或防止腎臟同種異體移植。
全文摘要
本文公開了采用趨化因子受體拮抗劑和環(huán)孢菌素產(chǎn)生一種藥物組合物,來治療或預防對移植器官、組織或細胞的排斥。還公開并要求了同時、分別或依次使用其活性成分,用于上述特定治療的所述藥物組合物。具體說,實驗性顯示了用Met－RANTES和環(huán)孢菌素A產(chǎn)生藥物組合物,用于治療腎臟同種異體移植排斥。
文檔編號C07K14/52GK1319021SQ99811125
公開日2001年10月24日 申請日期1999年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者H·J·格羅納, P·J·納爾遜, A·普勞德富特, T·N·C·韋爾斯 申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司