專利名稱：一種來自唐德鏈霉菌的抗植物致病性真菌的抗真菌蛋白質(zhì)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子量約為10kDa的來源于唐德鏈霉菌(Streptomyces tendae)的抗來自子囊菌(Ascomycetes)科的植物致病性真菌的抗真菌蛋白質(zhì)(AFP)的用途。
抗真菌蛋白質(zhì)在前些時(shí)候曾經(jīng)被描述過，在植物中這類蛋白質(zhì)中的一些也被稱為PR蛋白質(zhì)(植物發(fā)病機(jī)理相關(guān)蛋白質(zhì))(Bol,J.F.&Linthorst,H.J.M.(1990)，植物病理學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Phytopathol.),28,113)。這些蛋白質(zhì)是植物在應(yīng)激反應(yīng)條件下形成的，例如在病毒或真菌感染的情況下，誘導(dǎo)出一種被稱為“誘導(dǎo)抵抗力”的植物的活性防御機(jī)制(Lindhorst,H.J.M.,(1991)植物科學(xué)評(píng)論綜述(Cri.Rev.Plant Sci.),10(2),123)。這些蛋白質(zhì)中有一些具有例如殼多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。
具有一種抗真菌活性的蛋白質(zhì)也已經(jīng)從微生物中檢測到，這些蛋白質(zhì)中有些也顯示了殼多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。而其它蛋白質(zhì)通過與真菌細(xì)胞壁的相互作用來發(fā)揮作用。
例如，已經(jīng)從唐德鏈霉菌中分離出一種大小約為10kDa的抗真菌蛋白質(zhì)(AFP)，其具有抗真菌種類如擬青霉(Paecilomycesvarriotii)、Byssoclamis nivea、軟毛青霉(Pencillium puberulum)和Eupenicillium terrum的活性。但是這種作用也只限于這些種類。其它種類，如肉色擬青霉(Paecilomyces carneus)、淡紫色擬青霉(Paecilomyces lilacenus)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)或棒形青霉(Penicillium claviforme)則不被抑制。另外，AFP的使用不具有商業(yè)價(jià)值也是因?yàn)樗岬降倪@些真菌種類不是植物致病性的。
因此本發(fā)明的目的就是要找到對(duì)植物致病性真菌有活性的一種抗真菌蛋白質(zhì)。
令人驚喜的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來源于唐德鏈霉菌的AFP具有抗來自子囊菌科的植物致病性真菌的活性。
所以本發(fā)明的主題就是一種分子量約為10kDa的來源于唐德鏈霉菌的抗來自子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是抗灰葡萄孢(Botrytiscinera)的抗真菌蛋白質(zhì)(AFP)的用途。
上述抗真菌蛋白質(zhì)包含一個(gè)典型的氨基末端信號(hào)序列，即在親水性N-末端之后跟著的是疏水性跨膜區(qū)，其引起胞外分泌。而且已知有兩種類型，即一種分子量約為9 860 Da的較短的類型和一種分子量約為10 300 Da的較長的類型。
既然AFP被唐德鏈霉菌分泌到培養(yǎng)基中，它就可以依本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法例如從唐德鏈霉菌培養(yǎng)基濾液中直接分離。作為一種可供選擇的方法，AFP可以通過遺傳工程生產(chǎn)，分離到的基因優(yōu)選地被克隆到所謂的多拷貝載體上，例如pIJ702(Hopwood,D.A.等。(1985)鏈霉菌遺傳操作實(shí)驗(yàn)指南，Norwich，英國)并且使用這一結(jié)構(gòu)來轉(zhuǎn)化適宜的菌株，例如非煙霉素產(chǎn)生菌的唐德鏈霉菌NP9。一種編碼AFP的核酸的例子示于SEQ ID NO.1中。這種優(yōu)選的轉(zhuǎn)化子在例如200ml培養(yǎng)液中生長7天大約可獲得6mg的AFP，相當(dāng)于30mg AFP/L。因此通過優(yōu)選的可控發(fā)酵用遺傳工程來生產(chǎn)AFP是尤其優(yōu)選的。
就根據(jù)這一發(fā)明的用途而言，AFP可以以例如與優(yōu)選的至少一種額外輔料一起的制劑形式直接應(yīng)用。為了這一目的，例如被真菌侵襲的或有被真菌侵襲危險(xiǎn)的植物可用所述制劑噴灑。制劑的AFP濃度通常是從大約10μg/ml到大約500mg/ml。象蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑例如甘油、蔗糖、鹽、溶劑或通常所知的來自農(nóng)作物保護(hù)領(lǐng)域的物質(zhì)可作為適宜的輔料。
能自身產(chǎn)生AFP的所謂的轉(zhuǎn)基因植物是可提供抗真菌感染保護(hù)的另一種可能性。
因此另一個(gè)實(shí)施方案是按照發(fā)明的AFP的用途，在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生AFP。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選的是遺傳工程化的玉米，棉花，馬鈴薯，香蕉，芥屬(Arabidopsis)，木薯(casava)，煙草，油籽油菜(canola)，馬鈴薯，甜菜，谷類如小麥、大麥、或燕麥，草莓，蔬菜如卷心菜，豆科植物如豌豆或黃豆，番茄，萵苣或甜瓜。
為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，編碼AFP的核酸可以以如裸露DNA、病毒DNA或RNA，或以質(zhì)粒DNA的形式被引入植物細(xì)胞。一種編碼AFP核酸的一個(gè)例子示于SEQ ID NO.1中。但是本發(fā)明也涵蓋了由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID No1的氨基酸序列不同的但編碼相同AFP氨基酸的序列。而且本發(fā)明也包括了SEQ ID NO.1中核酸的那些突變體和變異體，所述核酸的突變體和變異體編碼對(duì)子囊菌科尤其是對(duì)灰葡萄孢有活性的一種AFP蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)例如，包括AFP蛋白質(zhì)與其它外源蛋白質(zhì)形成的融合蛋白，或帶有N端缺失甲硫氨酸的一種AFP蛋白質(zhì)。其它變異體的例子是在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO.1的核酸雜交的核酸。嚴(yán)格雜交條件的確定可參照Sambrook,J.等的分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989。隨后轉(zhuǎn)基因植物從被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生。優(yōu)選地，通過重組土壤細(xì)菌，電穿孔，微粒轟擊和/或聚乙二醇這些方法將編碼AFP的核酸導(dǎo)入植物細(xì)胞。例如，Klee,H.等((1997)植物生理學(xué)年度綜述(Annu.Rev.PlantPhysiol.)38,467或EP-B2-0122791)描述了在雙子葉植物細(xì)胞中用重組根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進(jìn)行感染。Ishida,Y.等(1996)(自然雜志生物技術(shù)分冊(cè)(Nature Biotech.)14,745針對(duì)玉米(Zea mays L.)描述了在單子葉植物中用重組根癌土壤桿菌進(jìn)行的感染。為此目的使用的土壤細(xì)菌具有一種T-DNA，其中已被插入了AFP表達(dá)基因和如果適當(dāng)?shù)脑挘粋€(gè)適宜的啟動(dòng)子，例如一種植物菜豆蛋白啟動(dòng)子(例如，見，EP-B2-0122791)或一種病毒35S啟動(dòng)子(例如，見，Ishida,Y.等(1996)，上文)。T-DNA可以通過例如將重組土壤細(xì)菌與目的植物的未成熟胚共培養(yǎng)的方法轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中(例如，見，Ishida,Y.等(1996)，上文)。為了挑選出被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，最好使用T-DNA構(gòu)建體，在植物細(xì)胞中其能夠從將要表達(dá)的AFP基因中表達(dá)一種抗性基因。例如編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶的基因就是一種適宜的基因(例如，見，Ishida,Y.等(1996)，上文)。這樣成功地轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以通過相應(yīng)的抗生素膦絲菌素來挑選。來自被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物再生已為大家所知。(例如，見，Sagi等。(1995)，自然雜志生物技術(shù)分冊(cè)，13,481-485,Ishida,Y.等(1996)，上文，或Schopke等。(1996)，自然雜志生物技術(shù)分冊(cè)，14,731-735)。
除了使用根癌土壤桿菌作為轉(zhuǎn)化手段外，其它轉(zhuǎn)化方法也是眾所周知的和適合的，例如，電穿孔，微粒轟擊，或使用聚乙二醇(例如，見，Potrykos,(1991)植物生理學(xué)分子生物學(xué)年度綜述，(Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Biol.,42,205；Estruch,J.J.等。(1997)自然雜志生物技術(shù)分冊(cè)，15,137-141或Dingermann,T.(1995)BIOforum,18,252)。例如木薯(Schopke等。(1996)上文)或香蕉(Sagi等。(1995)上文)通過用包被DNA的顆粒轟擊植物細(xì)胞已被轉(zhuǎn)化。也是在這一方法中，把將要被表達(dá)的AFP基因克隆到一個(gè)適宜的載體上，這一載體上最好有一抗性基因以容許隨后對(duì)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行挑選。例如，重組載體優(yōu)選應(yīng)用于鎢粒子，由其轟擊胚胎發(fā)生細(xì)胞懸液(例如，見，Sagi等。(1995)，上文)。如此處理過的細(xì)胞懸液隨后用一種適宜的抗生素(如膦絲菌素)來挑選被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)基因植物如上文已經(jīng)描述過的例子那樣由此再生。
本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)就在于AFP對(duì)來源于子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是對(duì)灰葡萄孢具有活性，所述灰葡萄孢對(duì)一種或多種農(nóng)作物保護(hù)劑已經(jīng)產(chǎn)生抗性。
下面的實(shí)施例和附圖
意在不加任何限制的情況下詳細(xì)地描述本發(fā)明。序列說明SEQ ID NO.1列出了來源于唐德鏈霉菌的編碼一種抗真菌(233)蛋白質(zhì)(AFP)的核酸序列。實(shí)施例用100ml上面描述過的預(yù)培養(yǎng)物接種10L生產(chǎn)培養(yǎng)基(103g/L蔗糖，20g胰化黃豆液體培養(yǎng)基(Oxoid,Wesel),10g/L MgCl2和10g/L酵母提取物，100μl desmophen,pH7.5)。使用的發(fā)酵罐是Biostat E(Braun,Melsungen)。發(fā)酵在28℃、700rpm和0.5vvm通氣量的條件下進(jìn)行4天。遂即停止發(fā)酵并在4℃條件下3000rpm離心收集上清。隨后以冷凍干燥法干燥。可以直接使用粉末。如果在抑制圈測試中使用15μl的凍干物(100mg/ml)對(duì)抗灰葡萄孢，能檢測到1.7cm的抗灰葡萄孢的抑制圈和2.3cm的抗抗灰葡萄孢ZF 3629的抑制圈。
序列表<110>Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG<120>來自唐德鏈霉菌的抗植物致病性真菌的抗真菌蛋白質(zhì)的用途<130>98F122<140>尚無參考文獻(xiàn)<141>尚無申請(qǐng)日<150>DE-19848517.4<151>1998-10-21<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>387<212>DNA<213>唐德鏈霉菌<220>CDS<223>編碼一種抗真菌蛋白質(zhì)<400>1atgaagcttt ccgtgcgccg ttcgctcggt gtcgcaacag tcgccgccgc cgcactggcc 60gccacggtgg tgcccgccgc ggcggccacc acctctccca ccacggcttc cgccatcggc 120ccgaccatca accgtacgga ctgtaacgag aacagctacc tcgaaatcca caacaacgag 180ggccgcgaca ctctgtgctt cgccaacgcc ggaacgatgc ccgtcgccat ctacggggtg 240aactgggtcg agtccggaaa caacgtcgtc accctgcagt tccagcggaa tctgagtgat 300ccgaggctgg aaaccatcac cctccagaag tggggctcgt ggaacccggg ccacatccac 360gagatccttt ccatcaggat ctactga 38權(quán)利要求
1．一種分子量約為10kDa的來源于唐德鏈霉菌的抗來自子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是抗灰葡萄孢的抗真菌蛋白質(zhì)(AFP)的用途。
2．如權(quán)利要求1的用途，其中AFP優(yōu)選與至少一種輔料一起以制劑的形式使用。
3．如權(quán)利要求1的用途，其中AFP在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生。
4．如權(quán)利要求3的用途，其中轉(zhuǎn)基因植物選自玉米，棉花，馬鈴薯，香蕉，芥屬，木薯，煙草，油籽油菜(canola)，馬鈴薯，甜菜，谷類，草莓，蔬菜，豆科植物，番茄，萵苣或甜瓜。
5．如權(quán)利要求4的用途，其中谷類選自小麥、大麥或燕麥，所用蔬菜為卷心菜，或豆科植物選自豌豆或黃豆。
6．如權(quán)利要求3-5中任一個(gè)的用途，其中轉(zhuǎn)基因植物包含如SEQ IDNO.1中要求的那樣的核酸，SEQ ID NO.1是權(quán)利要求的一部分。
7．如權(quán)利要求1-6中任一個(gè)的用途，其中所述的植物致病性真菌對(duì)一種或多種農(nóng)作物保護(hù)劑有抗性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分子量約為10kDa的來源于唐德鏈霉菌的抗來自子囊菌科的植物致病性真菌的抗真菌蛋白質(zhì)(AFP)的用途。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1324214SQ99812433
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期1999年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月21日
發(fā)明者T·紐曼 申請(qǐng)人:阿溫提斯研究技術(shù)兩合公司