專利名稱：多結(jié)構(gòu)域糖蛋白激素及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地，涉及天然形式通常為異二聚體的某些糖蛋白激素的修飾形式。本發(fā)明涉及絨毛膜促性腺激素(CG)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體生成素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的多結(jié)構(gòu)域復(fù)合物，其中共價連接于一種β—亞基的α—亞基可與另一種β—亞基結(jié)合或可共價連接于兩個β—亞基。這些多結(jié)構(gòu)域糖蛋白激素能夠提供兩種或多種效應(yīng)或功能，或者能夠象天然激素的促效劑和/或拮抗劑起作用。
背景技術(shù)：
在人體中，四種重要的糖蛋白激素(LH、FSH、TSH和CG)是具有相同α亞基和不同β亞基的異(源)二聚體。這些激素中的三種實際上也幾乎存在于所有其它的脊椎動物中；而CG目前僅見于靈長類以及懷孕母馬的胎盤和尿中。
PCT申請WO90/09800(1990年9月7日出版，在此引用作為參考)描述了這些激素的許多修飾形式。一種重要的修飾是用人絨毛膜促性腺激素或其變異體的羧基端肽(carboxy terminal peptide，CTP)對β亞基進(jìn)行C端延伸。也描述了這些激素的其他突變蛋白。CTP是從人絨毛膜促性腺激素β亞基的112-118位中任一位置延伸至145位的氨基酸序列。該PCT申請描述了通過保守性氨基酸置換而獲得的CTP延伸變異體，這不破壞CTP的改變該激素清除特性的能力。此外，PCT專利申請WO94/24148(1994年10月27日公布，在此引用作為參考)描述了通過在C末端以外的位置延伸或插入CTP而修飾這些激素，而且CTP片段比從112-118位延伸至145位的序列更短。
FSH的CTP-延伸型β亞基在申請人的兩篇文章中也有描述LaPolt，P.S.等人；Endocrinoloy(1992)1312514-2520和Fares，F(xiàn).A.等人，Proc Natl Acad SciUSA(1992)894304-4308。這兩篇文章在此引用作為參考。
人絨毛膜促性腺激素的晶體結(jié)構(gòu)已發(fā)表在幾乎同時出版的兩篇文章中。一篇是Lapthorn，A.J.等人，Nature(1994)369455-461，另一篇是wu，H.等人，Structure (1994)2545-558。這些文章的結(jié)果總結(jié)于Patel，D.J.Nature(1994)369438-439中。
PCT申請WO91/16922(1991年11月14日公布)描述了糖蛋白激素的多種嵌合形式及其他修飾形式。一般而言，該文獻(xiàn)著重于分別涉及各種α或β鏈的α亞基或β亞基的嵌合物。該申請中簡單地列出而沒有給出其他說明的一個構(gòu)建物，將基本上整個人絨毛膜促性腺激素的β鏈與α亞基前體蛋白(即含有該亞基的分泌信號序列)融合在一起。
另外兩個公布的PCT申請描述了這些糖蛋白激素的單鏈形式，其中α和β亞基被共價相連，形成如下通式的化合物β(接頭)nα或α(接頭)nβ式中n為0或1，而α和β為這些激素的各亞基。Moyle，W.R.，PCT申請WO95/22340(1995年8月24日公布)；以及本發(fā)明人的申請WO96/05224(1996年2月22日公布)。這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容也在此引用作為參考。
上述這些激素的單鏈形式，其中胱氨酸橋連(bridge)被去除的數(shù)目，公開于美國申請No.08/933,693(1997年9月19日申請)。該申請在此引用作為參考。
如本申請人在復(fù)制研究協(xié)會(Society foe the Study of Reproduction)摘要193,1996所公開的，已發(fā)現(xiàn)糖蛋白激素單鏈形式的α—亞基(即CGβ—α)非共價連接于FSHβ亞基。
最近，如本申請人在內(nèi)分泌協(xié)會摘要OR28—3,1998所公開的，已發(fā)現(xiàn)單鏈糖蛋白激素的α—亞基(即FSHβ—α)與GCβ亞基形成非共價連接。
目前已發(fā)現(xiàn)，通過將另一種β—亞基共價連接于單鏈激素或?qū)⒘硪环Nβ—亞基非共價連接于單鏈激素的栓住的(tethered)α—亞基，從而模擬天然激素的特性和/或控制激素比例，可能采用這些糖蛋白激素，它們有更強的促效劑和/或拮抗劑活性，和/或它們是多功能的。本文公開了這些不同作用的糖蛋白激素以及它們在治療疾病中的用途，如治療多囊卵巢病、不育癥和卵巢過度刺激癥。
本發(fā)明公開的內(nèi)容本發(fā)明提供不同作用的糖蛋白激素，它們含有共價連接于β—亞基的α—亞基而形成一種單鏈激素，和另一個β—亞基，它共價連接于該單鏈激素或非共價連接于該單鏈激素的栓住的α—亞基。本發(fā)明的化合物可以是糖基化的或部分糖基化的或非糖基化的，且存在于天然糖蛋白激素或其變異體中融合的α和β鏈可任選地通過接頭部分而連接。特別優(yōu)選的接頭包括羧基端肽(CTP)單元，它或者是完整的單元或者是其一部分所構(gòu)成的變異體。
如果β亞基是相同的，含有非共價連接的β亞基的化合物可作為促效劑或拮抗劑起作用，但其活性程度將隨時間而變化?；钚缘倪@種變異是由于共價連接的和非共價連接的β亞基間循環(huán)半衰期的差異造成的。非共價連接的β亞基的循環(huán)半衰期固有地比共價連接于α亞基的β亞基的短。這是因為在生理環(huán)境的一段時間中復(fù)合物的分解；而分子的共價連接部分保留了有效的藥物功能。
例如，在復(fù)合物循環(huán)半衰期過程中，包含一個共價連接于α亞基的FSHβ亞基(且該α亞基非共價連接于另一個FSHβ亞基)的化合物將具有較高的活性。但當(dāng)更短半衰期的非系鏈的FSHβ亞基耗盡后，化合物的活性將降低。
包含一個共價連接于α亞基(其非共價連接于CGβ亞基)的FSHβ亞基的化合物表現(xiàn)出較長的FSH活性的循環(huán)半衰期和較短的CG活性循環(huán)半衰期。在較短循環(huán)半衰期中，F(xiàn)SHβ和CGβ亞基二者將作用于它們各自的受體。在較長半衰期中，只有共價連接于α亞基的FSHβ亞基具有活性。
在所有情況中，如果β亞基是不同的，化合物是雙功能的，可作為促效劑和/或拮抗劑。需要指出的是，增加或減少一種成分相對于另一種成分的促效劑活性，可得到不同比例的活性。例如，采用具有提高的促效劑活性的FSH亞基和/或具有減低的促效劑活性的LH亞基，可提高FSH/LH(活性)的比例。
本發(fā)明一方面的內(nèi)容涉及對需要激素調(diào)節(jié)的對象提供不同的糖蛋白激素活性的方法。
糖蛋白激素“活性”指發(fā)揮相應(yīng)的天然激素的促效劑或拮抗劑(具有相同或不同生物半衰期)作用的能力。所以，“兩種不同糖蛋白激素的活性”指不同的各β亞基以一種或多種方式賦予該化合物的活性。一種可以是促效劑，另一種是拮抗劑；一種可以修飾以提供增強的活性；一種可以修飾以提供減低的活性；一種可相應(yīng)于LH的活性，而另一種相應(yīng)于FSH的活性；一種具有長循環(huán)半衰期；而另一種循環(huán)半衰期較短。所以，在式(1)—(5)的化合物中提供不同的天然β亞基或提供這些β亞基的變異體，可得到各種各樣不同的糖蛋白激素活性。
另一方面，本發(fā)明涉及一種糖基化或非糖基化的下式蛋白質(zhì)β1-(接頭1)m-α-(接頭2)n-β2(1)；β1-(接頭1)m-β2-(接頭2)n-α(2)；α-(接頭1)m-β1-(接頭2)n-β2(3)；β2≈α-(接頭)m-β1(4)；或β1-(接頭)m-α≈β2(5)式中，各β1和β2具有脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或是所述氨基酸序列的變異體(其中所述變異體在本文中已有定義)?！唉痢敝讣棺祫游锾堑鞍准に卅羴喕蚱渥儺愺w；“接頭”指共價相連的部分，它以合適的距離將β1和β2亞基與α亞基，以及將β1和β2亞基相互間隔開。“≈”指非共價連接。各m和n獨立地為0或1。
在所有上述例子中，本發(fā)明的化合物保留了構(gòu)象，因此在化合物中包含整個亞基是不必要的。因此，本發(fā)明包括上式(1)—(5)的化合物，它含有α和/或β亞基的片段，其中這些形式保留了含完整亞基的對應(yīng)形式所表現(xiàn)出的生物活性。
需要指出的是，可進(jìn)一步修飾式(1)—(5)的化合物，使它們含有其他共價連接的β亞基。所以，式(2)或(3)的化合物可與其他β亞基非共價連接；式(4)或(5)的化合物在共價鏈中可含有其他β亞基。另外，也可用其他非共價結(jié)合，如β—β二聚體與α，或α—α二聚體與β的結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的組合物的方法，涉及含有本發(fā)明式(1)—(5)化合物的藥物組合物，以及涉及其應(yīng)用的方法。對這些組合物的特異性抗體也包括在本發(fā)明中。
實施本發(fā)明的方式人體中的四種“糖蛋白”激素構(gòu)成了一個包括人絨毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH)和促甲狀腺激素(TSH)的家族。如此處所用，在人和其他脊椎動物中，“糖蛋白激素”指該家族的所有成員。所有這些天然激素都是由α亞基和β亞基構(gòu)成的異二聚體，其中對于某一物種而言在該組中的α亞基氨基酸序列是相同的，而β亞基因視家族成員的不同而不同。因此，一般情況下這些天然糖蛋白激素是由結(jié)合的但非共價相連的α和β亞基構(gòu)成的異二聚體。大多數(shù)脊椎動物產(chǎn)生FSH、TSH和LH；絨毛膜促性腺激素只見于包括人在內(nèi)的靈長類和懷孕母馬中。
動物中，各激素的α和β亞基由不同的基因編碼，而且分別合成，然后被裝配成非共價相連的異二聚體復(fù)合物。對本發(fā)明的化合物而言，在單鏈一級結(jié)構(gòu)中至少有一個β亞基直接連于α亞基。由二級和三級結(jié)構(gòu)因素所賦予的三維構(gòu)象與天然異二聚體形式十分相似，從而使該β亞基所代表的糖蛋白激素的功能得以表現(xiàn)。其他β亞基連接于此單鏈，可以是共價的(式(1)—(3))或通過栓住的α亞基與另一β亞基非共價連接。
通過β亞基結(jié)構(gòu)的適當(dāng)變化，本發(fā)明的化合物可以具有促效劑和/或拮抗劑活性(“相應(yīng)于”天然激素的活性)；例如，該化合物可表現(xiàn)出針對某一糖蛋白激素受體的拮抗劑活性，但是又表現(xiàn)出對另一受體的促效劑活性，或者可以對兩種受體都有促效劑活性或拮抗劑活性。本發(fā)明化合物所表現(xiàn)出的活性譜，將取決于選擇的各α和β亞基、所用的變異體、連接部分的性質(zhì)、以及α和β亞基的取向。
在式(1)、(2)或(3)的化合物中，這三種亞基都是共價連接的；式(4)和(5)的化合物含有單鏈β—α或α—β共價連接的二聚體。各種情況中的共價連接鍵靠近各個亞基的N—或C—端，在兩種亞基情況下可能是頭對頭(即靠近兩種成分的N—端)、尾對尾(即靠近兩種成分的C—端)，或最佳的是頭對尾(其中一個亞基的N—端與另一個亞基C—端共價連接)。可用標(biāo)準(zhǔn)重組方法不難制備這種含有頭對尾連接鍵的融合蛋白，只要任何接頭和亞基中的所有氨基酸都是由此基因所編碼。另外，可用合成方法制備本發(fā)明的化合物，其中除頭對尾構(gòu)型外，還可用接頭連接亞基使它們靠近于它們各末端?？蓮腜ierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois購得雙功能接頭，包括異雙功能類型和同雙功能類型接頭。可用那些能提供連接兩個氨基、或兩個羧基、或一個羧基和一個氨基的接頭。如果在N—端的連接不精密，則要求在靠近待連接端的位置有一個能提供含側(cè)鏈官能團的氨基酸。
所以，在本發(fā)明的最佳實施例中，式(1)、(2)或(3)化合物是融合蛋白，只有基因編碼的氨基酸構(gòu)成序列時，其中α和β亞基或直接地或通過肽接頭而頭對尾地相連。這些化合物可用重組方法合成。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施例中，式(4)和(5)的化合物包括單鏈形式，其中α和β亞基或直接地或通過肽接頭頭對尾連接，另一個β亞基非共價地連接于栓住的α亞基，且只有基因編碼的氨基酸構(gòu)成了多結(jié)構(gòu)域復(fù)合物。該復(fù)合物也可用重組法合成。然而，并不需要將本發(fā)明化合物局限于這種方式；α和β亞基以及接頭可包括非基因編碼的氨基酸。此外，接頭可以是肽之外的物質(zhì)，例如二羧酸或酸酐、二胺、或雙功能接頭(例如PierceChemical Co.，Rockford，IL出售的)等。此外，單鏈形式的亞基可以如融合蛋白所需要的那樣以頭對頭或尾對尾構(gòu)型、以及頭對尾構(gòu)型直接地或通過接頭而相連。在這些情況下，用標(biāo)準(zhǔn)活化技術(shù)，對于頭對頭構(gòu)型而言，兩個氨基可以通過酸酐或通過任何二羧酸衍生物而連接；兩個羧基可以通過二胺或二醇連接。
但是，為了方便起見，最優(yōu)選的形式是頭對尾構(gòu)型，其中標(biāo)準(zhǔn)的肽鍵即夠，而且單鏈形式可以通過重組技術(shù)或采用肽合成技術(shù)制備成融合蛋白，它或者是諸反應(yīng)成分的一個序列，或者較佳地，整個序列的各部分連接起來。
不論哪個實例，α和β亞基在靠近其N端和C端的位置處與該分子的其余部分連接。優(yōu)選的是，這些亞基直接在其末端相連，然而這種連接鍵也許單純的是“靠近”型。一般地，“靠近”表示在該末端的10個氨基酸之內(nèi)，較佳地在5個氨基酸之內(nèi)，更佳地在2個氨基酸之內(nèi)的一個位置，最佳地為末端本身。如上所述，當(dāng)連接鍵位于N—或C—端本身之外時，必須在靠近合適末端的一個位置提供一側(cè)鏈功能基團。
亞基組份如本文所用，共同的α亞基，和FSH、LH、TSH和CG的β亞基以及本發(fā)明的化合物具有其常規(guī)定義，指具有本領(lǐng)域中所知的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或其等位基因變異體，而不論其所表現(xiàn)的糖基化方式或氨基酸側(cè)鏈的其他衍生變化。
這些肽的“天然”形式是指具有從相關(guān)脊椎動物組織中分離出的氨基酸序列、而且具有序列本身已知的那些肽的天然形式或其等位基因變異體的天然形式。
這些蛋白質(zhì)和CTP單元的“變異體”形式，指對應(yīng)于天然亞基，但通過例如定點突變或其他重組操作而產(chǎn)生的，或者用合成的方法制備，在該天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列中具有故意改變(包括截短)的蛋白質(zhì)。
產(chǎn)生的“變異體”可作為促效劑或拮抗劑。與天然形式相比，促效劑可具有提高的活性或減低的活性。通過調(diào)節(jié)本發(fā)明組合物所含的兩種β亞基的活性水平，可實現(xiàn)這些激素有效比率的諸種變化。例如，通過提供LH活性減低，但FSHβ亞基仍為天然活性或提高的活性，可提高FSH/LH活性比率。
導(dǎo)致產(chǎn)生“變異體”的改變包括1-10、較佳地1-8、更佳地1-5個氨基酸的變化，包括缺失、插入和取代，其中最佳的是保守性氨基酸取代。得到的變異體必須保留活性以影響天然激素的相應(yīng)活性，即或者它們必須保留其相對應(yīng)的天然激素的生物學(xué)活性從而能起促效劑作用；或者它們必須起拮抗劑的作用，這通常是靠其能與天然激素的受體結(jié)合但缺乏實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能量而致。
按常規(guī)含義，“保守性取代”指這樣的取代，其中被取代的殘基與進(jìn)行取代的殘基屬于同一類氨基酸。如本領(lǐng)域中熟知的那樣，氨基酸已分類成幾組，例如參見Dayhoff，M.等人，Atlas of Protein Sequences and Structure(1972)589-99。通常，酸性氨基酸被歸在一組；堿性氨基酸被歸在另一組；中性親水氨基酸被歸在一組；等等。更具體的分類情況列于WO96/05224，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
一組優(yōu)選變異體是其中α或β亞基或兩者的糖基化位點被改變的變異體。本文所述的激素四成員家族(quartet)的某些有用的變異體在美國專利5,177,193中有描述(1993年1月5日出版，在此引用作為參考)。如其所述，可以通過破壞相關(guān)位點，或者通過選擇產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞而改變糖基化方式。
氨基酸序列的改變也包括插入和缺失。因此，激素的截短形式包括在變異體中，例如缺失C末端85—92位中部分或全部氨基酸的α亞基的突變型。此外還包括缺失N末端的1—10個氨基酸的α亞基。
突變蛋白還包括非關(guān)鍵區(qū)域被改變或被去除的突變蛋白。這種缺失和改變可包括整個環(huán)，從而缺失或改變的序列遠(yuǎn)大于10個氨基酸。但是產(chǎn)生的變異體必須至少保留受體結(jié)合域和/或涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)域。
有相當(dāng)多的文獻(xiàn)是關(guān)于糖蛋白激素變異體的，而且己明確可以制備大量可能具有促效劑和拮抗劑活性的變異體。公開的這些變異體參見Chen，F(xiàn).等人，MolecEndocrin ol(1992)6914-919；Yoo，J.等人，J Biol Chem(1993)26813034-13042；Yoo，J等人，J Biol Chem(1991)26617741-17743；Puett，D.等人，Glycoprotein Hormones，Lusbader，J.W.等人，EDS，Springer Verlag NewYork(1994)122-134；Kuetmann，H.T.et al(ibid)P103-117；Erickson，L.D.等人，End ocrinology(1990)1262555-2560；和Bielinska，M.等人，J CellBiol(1990)1113 30a(Abstract 1844)。
其他的變異體包括其中有一個或多個胱氨酸連接鍵缺失的變異體，這典型地是通過用中性氨基酸置換一個或兩個參與連接的半胱氨酸而實現(xiàn)。特別優(yōu)選的可被缺失的胱氨酸連接鍵是位于26位和110位之間以及23位和72位之間的胱氨酸連接鍵。
此外，已表明，激素四成員家族的β亞基可以以嵌合形式構(gòu)建從而提供嵌合體兩種組份的生物學(xué)功能，或者通常提供生物學(xué)功能改變的激素。因此，可以按Moyle，Proc Natl Acad Sci(1991)88760-764；Moyle，Nature(1994)368251-255描述的方法構(gòu)建具有FSH和LH/CG活性的嵌合分子。如這些文章中所述，用FSH-β的101-109位氨基酸置換CG-β亞基中的相應(yīng)殘基可得到具有hCG和FSH二者活性的類似物。
如本文所用，“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，因為它們之間的長度區(qū)別是任意的。
如上所述，在構(gòu)成本發(fā)明的具有或不具有連接部分的化合物時，用作α和β亞基的“變異體”可以是此二亞基的完整氨基酸序列或僅是其一部分。
“變異體”還包括含有插入在非關(guān)鍵區(qū)域的CTP(或變異的CTP)的α和/或β鏈。
“變異體”可以是含相應(yīng)天然β亞基的激素的促效劑或拮抗劑，即LHβ亞基的“變異體”指LH的促效劑或拮抗劑活性。促效劑活性可與天然β亞基相同或有所增加或減少。
α和β亞基的“非關(guān)鍵”區(qū)域是該分子生物學(xué)活性(包括促效劑和拮抗劑活性)非必需的區(qū)域。通?？蓪⑦@些區(qū)域從結(jié)合位點、前體剪切位點和催化區(qū)域中去除。對引導(dǎo)適當(dāng)折疊、與受體結(jié)合和催化活性等至關(guān)重要的區(qū)域，應(yīng)加以評估。應(yīng)注意，二聚體中對α和β相互作用是關(guān)鍵的某些區(qū)域在單鏈單元中會變成非關(guān)鍵的，因為該分子所賦予的構(gòu)象限制可能會消除這些區(qū)域的必須性。非關(guān)鍵區(qū)域的確定可以方便地通過缺失或修飾候選區(qū)域并對所需活性進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y試即可實現(xiàn)。因修飾而導(dǎo)致活性損失的區(qū)域是關(guān)鍵的；而改變導(dǎo)致相同或相似活性(包括拮抗劑活性)的區(qū)域被認(rèn)為是非關(guān)鍵的。
應(yīng)再次強調(diào)，“活性”指對相應(yīng)天然激素的活性起促效的或拮抗的活性。因此，某些區(qū)域?qū)ψ儺愺w能否起拮抗劑作用至關(guān)重要，盡管拮抗劑不能直接提供該激素的生理效應(yīng)。
例如，對于α亞基，33—59位被認(rèn)為是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，而羧基端20個氨基酸的延伸段是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體結(jié)合所必需的。與β亞基裝配的關(guān)鍵殘基至少包括殘基33—58，尤其是37—40。
當(dāng)非關(guān)鍵區(qū)域“靠近”N末端或C末端時，插入可以位于該末端10個氨基酸中的任何位置，更佳地在5個氨基酸中，最佳地在末端本身。
如本文所用，“CTP單元”指在人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基端發(fā)現(xiàn)的、在C末端從氨基酸112—118延伸至殘基145的氨基酸序列，或指其一部份。因此，每個“完整”CTP單元含有28—34個氨基酸，其長度取決于CTP的N末端。
“部分”CTP單元指這樣的氨基酸序列，它位于位置112—118至145(含145本身)，但是最短的“完整”CTP單元(即從118—145位)中缺失至少一個氨基酸。這些“部分”序列包括在“變異體”的定義內(nèi)?！安糠帧盋TP單元宜含有至少一個0-糖基化位點。CTP單元含有絲氨酸殘基處的4個糖基化位點，分別位于121(位點1)、127(位點2)、132(位點3)和138(位點4)位。用于促效劑的CTP部分形式可含有一個或多個按天然CTP序列中的次序排列的這些位點，盡管可以刪去介于中間的部位。這些激素的某些非糖基化形式是拮抗劑，因此可以作為拮抗劑使用。
在某些情況下，可以插入CTP單元或用作串聯(lián)接頭?！按?lián)”插入或延伸表示插入子或延伸段含有至少兩個“CTP單元”。每個CTP單元可以是完整的或是片段，可以是天然的或變異體。在串聯(lián)延伸或插入中的所有CTP單元可以是相同的，也可以互不相同。
“接頭”是將α和β序列連接在一起而又不干擾其活性的組成部分，這些活性由作為激素成員的相同α鏈和β鏈所表現(xiàn)，或者它發(fā)生了改變使其活性從促效劑轉(zhuǎn)變成拮抗劑活性?；钚运娇梢栽诤侠淼姆秶鷥?nèi)變動，但是接頭的存在不能使該單鏈激素喪失其基本的促效劑和拮抗劑活性。單鏈形式必須表現(xiàn)出與天然激素(天然激素的元件形成其組成)的激素活性相關(guān)的活性。
本文所用的“≈”或“非共價鍵”指共價連接于β1亞基的α亞基與另一β2亞基間存在的非共價鍵。
不同作用的糖蛋白激素的優(yōu)選例本發(fā)明的化合物可用重組技術(shù)進(jìn)行最有效和最經(jīng)濟地生產(chǎn)。因此，優(yōu)選的是那些僅含有基因編碼的氨基酸的α和β鏈、CTP單元和其他接頭部分形式的單鏈蛋白。然而，如上所述，有可能用合成肽技術(shù)或其他有機合成技術(shù)來構(gòu)建單鏈激素的至少某些部分，因此含有非基因編碼的氨基酸和非肽型接頭的變異體也在本在一優(yōu)選實例中，β1亞基的C-末端共價地(可任選地通過接頭)連于成熟α亞基的N-末端，該α亞基又共價地(可任選地通過接頭)連于β2亞基。連接鍵可以是直接肽鍵，其中一個亞基的C末端氨基酸與另一亞基的N末端直接通過肽鍵而相連；然而，在許多情況下，最好在兩個末端之間含有一接頭部分。在大多數(shù)情況下，接頭部分在兩個鏈之間至少提供一個β轉(zhuǎn)角。因此，在接頭中存在脯氨酸殘基也許是有利的。
(應(yīng)理解，在討論構(gòu)成單鏈形式的亞基末端之間的連接鍵中，一個或多個末端也可以通過如上所述的取代和/或缺失而改變。)在一組特別優(yōu)選的實施例中，連接是頭對尾型，接頭部分含有一個或多個CTP單元和/或其變異體或截短形式。用于這種接頭部分的CTP單元的優(yōu)選形式在下面描述。
如上所述，CTP和其變異體除了位于接頭部分中之外，還可以包含在構(gòu)成單鏈激素各亞基的任何非關(guān)鍵區(qū)域中。
盡管CTP單元宜包含在接頭中，應(yīng)理解該接頭可以是能提供α和β亞基之間適當(dāng)空間關(guān)系的任何合適的共價結(jié)合材料。因此，對于頭對尾構(gòu)型，接頭一般是二價的，例如含有任意數(shù)目的、但通常小于100個、更佳地小于50個的氨基酸的肽，它具有適當(dāng)?shù)挠H水性/疏水性比率以便在溶液中能提供適當(dāng)?shù)拈g隔和構(gòu)象，或者是可賦予這些特性的非肽型接頭。通常，接頭應(yīng)有平衡的親水性，從而位于周圍溶液中并且不干擾α和β亞基或者兩個β亞基之間的相互作用。較佳地，接頭含有通常由肽接頭中脯氨酸提供的β轉(zhuǎn)角，或者含有絲氨酸和/或甘氨酸殘基。可以使用具有上述正確特性的任何合適的聚合物，其中包括肽接頭。
特別優(yōu)選的本發(fā)明單鏈形式的實施例包括如下頭對尾構(gòu)型βFSH-α-βFSH；α-βFSH-βLH；βFSH-α-βLH；βLH-α-βLH；α-βLH-βFSH；βLH-α-βFSH；βTSH-α-βTSH；βTSH-βFSH-α；βTSH-α-βFSH；βCG-α-βCG；α-βCG-βFSH；α-βCG-βTSH；βCG-βFSH-α；βCG-α-βTSH；βFSH-CTP-αβFSH；α-βFSH-CTP-βLH；βFSH-CTP-α-βLH；βLH-CTP-αβLH；α-βLH-CTP-β FSH；βLH-α-CTP-βFSH；βLH(δ115-123)-α-βFSH；βLH(δ115-123)-CTP-α-βFSH；βCG-CTP-αCTP-βFSH-CTP-CTP；βTSH-CTP-CTP-αβFSH-CTP-CTP；βFSH-CTP-CTP-α-βLH；βLH-CTP-CTP-βLH-α；βCG-CTP-CTP-α-βTSH；βCG-CTP-CTP-βLH-α；βFSH-CTP-βLH(δ 115-123)-CTP-α；等。人類的亞基形式也是特別優(yōu)選的。在上述構(gòu)建物中，“CTP”指CTP或其變異體(包括截短片段)，如WO96/05224中所述。
在一實例中，β1亞基的C—末端任選地通過接頭共價地連接于成熟α亞基的N—末端，該α亞基又非共價地連接于另一β2亞基。本發(fā)明單鏈形式中的α和β亞基使另一β亞基非共價連接于栓住的α亞基。特別優(yōu)選地用于本發(fā)明方法的式(4)和(5)的化合物包括頭對尾構(gòu)型(對單鏈成分而言)βFSH-α≈βFSH；βFSH-α≈βCG；βFSH-α≈βLH；βFSH-α≈βTSHβCG-α≈βCG；βCG-α≈βFSH；βCG-α≈βCG；βLH-α≈βTSHβLH-α≈βLH；βLH-α≈βFSH；βLH-α≈βCG；βLH-α≈βTSHβTSH-α≈βTSH；βTSH-α≈βCG；βTSH-α≈βLH；βTSH-α≈βFSH；βFSH-α≈βFSH；βFSH-α≈βCG；βLH≈α-βFSH；βTSH≈α-βFSH；βCG≈α-βCG；βFSH≈α-βCG；βLH≈α-βCG；βTSH≈α-βCG；βLH≈α-βLH；βFSH≈α-βLH；βCG≈α-βLH；βTSH≈α-βLH；βTSH≈α-βTSH；βCG≈α-βTSH；βLH≈α-βTSH；βFSH≈α-βTSH等。所以，在本發(fā)明的一實例中，栓住的β亞基和另一β亞基彼此互不相同。例如，若栓住的β亞基是FSH的β亞基或變異體，而非共價連接的β亞基是CG的β亞基或變異體，則得到的化合物將同時具有作用于FSH和CG受體的能力。非共價連接的β亞基可具有促效劑或拮抗劑活性，這獨立于栓住的β亞基的活性。另外，該β亞基的循環(huán)半衰期可與栓住的β亞基不同。β亞基循環(huán)半衰期的這種差異使得活性程度隨著時間變化。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中附加的β亞基與栓住的β亞基是相同的或各是彼此的變異體。例如，共價連接的FSHβ亞基和附加的非共價連接的βFSH亞基。這種類型的實施例對增加促效劑或拮抗劑的活性有效。在較短的循環(huán)半衰期持續(xù)過程中活性最大。由于栓住的β亞基的循環(huán)半衰期較長(當(dāng)β亞基相同時則另當(dāng)別論)，當(dāng)非共價連接的β亞基不再有效時，單鏈形式依舊具有活性，但程度較低。
在本發(fā)明的另一實施例中，將一個β亞基突變成比其他β亞基活性高或低的亞基。例如，具有LH拮抗劑活性栓住的β亞基與具有FSH促效劑活性的β亞基相聯(lián)合，能增加FSH/LH比率的作用，適用于卵泡發(fā)育和受精。如果需要較短的LH活性循環(huán)半衰期，則栓住的β亞基具有FSH活性，其他β亞基具有LH活性。
應(yīng)用于人體，人類形式的α和β亞基是理想的。應(yīng)指出，其他脊椎動物中的對應(yīng)形式可用于獸醫(yī)用途。因此，牛、羊、馬、豬、貓、犬和其他動物特有的FSH、TSH和LH亞基，適用于影響這些物種自身的各種病癥。
在一些實施例中，可以將其他藥物包含在接頭部分中。這些藥物可以是肽或蛋白質(zhì)，例如類胰島素生長因子；表皮生長因子；酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子；血小板衍生的生長因子；各種集落刺激因子(CFS)，例如粒細(xì)胞CFS、巨噬細(xì)胞CFS等；以及各種細(xì)胞因子如IL-2、IL-3和多種其他白細(xì)胞介素蛋白質(zhì)；各種干擾素；腫瘤壞死因子等?？梢园糜卺尫胚@些藥物的合適的切割位點，如某蛋白酶的靶序列，而該蛋白酶的靶位點并不存在于α和β亞基中。肽類或蛋白質(zhì)類藥物的優(yōu)點是整個構(gòu)建物可以方便地通過單基因的重組表達(dá)而生產(chǎn)。另外，也可以使用小分子藥物如抗生素、消炎藥、毒素等。
一般，包含在接頭中的藥物可以是需要在激素通常結(jié)合的受體附近發(fā)揮作用的藥物。還可提供將藥物從接頭的包含中釋放出來的合適方法，例如通過在下面的“制備方法”一節(jié)中所述的引入酶催化裂解位點的方法。
此外，如果需要可將藥物的活性和循環(huán)時間限制在非共價連接的β亞基的較短循環(huán)半衰期中。這可通過在非共價連接的β亞基中而不是單鏈形式中含有藥物來實現(xiàn)。
其他修飾本發(fā)明的化合物還可以用公知的方法進(jìn)一步偶聯(lián)或衍生從而對氨基酸序列進(jìn)行衍生變化，例如磷酸化、糖基化、對通常的糖基化形式去糖基化、?；Π被醾?cè)鏈進(jìn)行修飾(如將脯氨酸轉(zhuǎn)變成羥基脯氨酸)，以及與那些翻譯后修飾(已發(fā)現(xiàn)普遍存在)相類似的修飾。
本發(fā)明的激素的糖基化狀態(tài)尤為重要。這些激素可以以非糖基化形式制備，可在原核宿主中生產(chǎn)，或通過突變亞基和/或CTP單元中通常存在的糖基化位點來制備。非糖基化和部分糖基化的激素可以通過對糖基化位點的操作來制備。當(dāng)然，糖基化形式也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
正如本領(lǐng)域中熟知的那樣，本發(fā)明的化合物也可與標(biāo)記物、載體、固相載體等偶連，這取決于所需的用途?？梢允褂闷錁?biāo)記形式來跟蹤其代謝結(jié)果；用于該目的的合適標(biāo)記物包括(尤其是)放射性同位素標(biāo)記物如碘131、锝99、銦111等。這些標(biāo)記物也可在測試系統(tǒng)中用于介導(dǎo)對該單鏈蛋白質(zhì)的檢測；在這種例子中，可以使用放射性同位素以及酶標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、生色標(biāo)記物等。使用這類標(biāo)記物可對有關(guān)受體進(jìn)行定位，因為它們可用作這些受體的靶向(targeting)試劑。
本發(fā)明的化合物還可與載體偶聯(lián)以增加其免疫原性來制備與這些新的修飾形式起特異性免疫反應(yīng)的抗體。用于該目的的合適載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、白喉類毒素等。可以采用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)技術(shù)將本發(fā)明的修飾肽與載體相連，包括使用雙功能接頭。
可以使用類似的連接技術(shù)及其他技術(shù)，將本發(fā)明的蛋白質(zhì)偶聯(lián)于固相載體。偶聯(lián)后，可以將這些蛋白質(zhì)用作親和試劑，來分離所需的、與其有特異性反應(yīng)的組份。因此，它們可用于純化和分離與適當(dāng)β亞基相互反應(yīng)的受體。
制備方法構(gòu)建本發(fā)明的化合物的方法是本領(lǐng)域中所熟知的。如上所述，如果僅含有基因編碼的氨基酸，而且單鏈?zhǔn)穷^對尾構(gòu)型，那么目前最實際的方法是通過表達(dá)編碼所需蛋白質(zhì)的DNA而重組合成這些材料。本發(fā)明化合物包括的含有編碼單鏈形式(包括變異體)的核苷酸序列的DNA可以由天然序列制備，或者從頭人工合成，或者組合使用這些技術(shù)。定點誘變、連入額外序列、擴增反應(yīng)(如PCR)和構(gòu)建合適表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)目前都是本領(lǐng)域中所熟知的。編碼所需蛋白質(zhì)的部分或全部DNA可以用標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)來構(gòu)建，最好引入限制性酶切位點以方便連接?？蓪诰幋a序列中的轉(zhuǎn)錄和翻譯的合適控制元件提供給DNA編碼序列。眾所周知，目前已有可與各種不同宿主相容的表達(dá)系統(tǒng)，這些宿主包括原核宿主如大腸桿菌或枯草桿菌和真核宿主如酵母、其他真菌(如曲霉和鏈孢霉屬)、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)、鳥類細(xì)胞等。
宿主的選擇尤其關(guān)系到翻譯后加工，特別是包括糖基化。糖基化的位置主要由分子內(nèi)的糖基化位點的性質(zhì)所控制；然而，占據(jù)該位點的糖的性質(zhì)主要由宿主的性質(zhì)所決定。因此，本發(fā)明激素性質(zhì)的微調(diào)可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇宿主而實現(xiàn)。
對于α亞基部分(其中α亞基是修飾的或非修飾的)的一種特別優(yōu)選的基因形式是“小基因”(minigene)構(gòu)建物。如本文所用，α亞基“小基因”指在Matzuk，M.M.，et al，Mol Endocrinol(1988)295-100中描述pM2/CGα或pM2/α構(gòu)建物中所公開的基因構(gòu)建物。
對于重組生產(chǎn)，可使用已用表達(dá)系統(tǒng)修飾的宿主細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)從而產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。此處使用的術(shù)語如下“修飾的”重組宿主細(xì)胞，即“經(jīng)修飾從而含有”本發(fā)明的重組表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，指這樣的宿主細(xì)胞它已經(jīng)用方便的引入方法(包括轉(zhuǎn)染、病毒感染等)處理從而含有此表達(dá)系統(tǒng)?！靶揎椀募?xì)胞”是指細(xì)胞含有該表達(dá)系統(tǒng)而不論該表達(dá)系統(tǒng)是整合入染色體還是位于染色體之外?！靶揎椀摹奔?xì)胞對于所包含的表達(dá)系統(tǒng)而言可以是穩(wěn)定的，或者該編碼序列可被瞬時表達(dá)。簡而言之，帶有本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的“修飾的”重組宿主細(xì)胞是指，當(dāng)天然不含有該表達(dá)系統(tǒng)時，通過引入操作而含有該表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞，而不論用何種方式實現(xiàn)這種引入。
“表達(dá)系統(tǒng)”指含有待表達(dá)的編碼核苷酸序列及相伴隨的、實現(xiàn)該編碼序列表達(dá)所必需的控制序列的DNA分子。通常，這些控制序列包括啟動子、終止調(diào)控序列以及(在某些情況下)操縱子或其他調(diào)控表達(dá)的機制?？刂菩蛄惺悄切┰O(shè)計用于在特定重組宿主靶細(xì)胞中發(fā)揮作用的序列，因此必須選擇宿主細(xì)胞使之與構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)中的控制序列相容。
通常需要分泌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。所以還要包含編碼信號肽的核苷酸序列，從而產(chǎn)生操作性連接于(operably linked)所需單鏈激素的信號肽，進(jìn)而產(chǎn)生前體蛋白，一旦分泌，信號肽被切除釋放出成熟的單鏈激素或所需的β亞基。糖蛋白激素通常是分泌性蛋白質(zhì)，且所包括的信號序列可能是與激素本身相關(guān)的那些或與它們是異源的。雖然不是優(yōu)選的，但細(xì)胞內(nèi)激素的生產(chǎn)可受到對編碼基因作適當(dāng)操縱的影響。
如本文所用，“細(xì)胞”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“細(xì)胞系”可互換使用而不必在意其細(xì)微區(qū)別。在需要區(qū)分它們是重要時，會在上下文中清楚地表明。對于都可以表示的場合，所有含義的都包括在內(nèi)。
產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞裂解液中回收獲得(如果產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi))，或者從培養(yǎng)基中獲得(如果是分泌的)。從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收重組蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，而且可以用已知技術(shù)如層析、凝膠電泳、選擇性沉淀等純化這些蛋白質(zhì)。
對式(1)—(3)化合物的重組生產(chǎn)而言，可采用包含編碼這些分子式化合物的核苷酸序列的一種表達(dá)系統(tǒng)。對式(4)和(5)的化合物而言，通常優(yōu)選采用兩種表達(dá)系統(tǒng)，它們都包含在重組宿主中。所以，可將化合物的α—(接頭)m—β1或β1—(接頭)m—α部分的表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成含有編碼此單鏈肽的核苷酸序列，且在該細(xì)胞中還可包含編碼β2的其他表達(dá)系統(tǒng)。這兩個表達(dá)系統(tǒng)可包含在宿主細(xì)胞染色體的一個載體中、不同的載體中，或一個表達(dá)系統(tǒng)可留在染色體中，另一個則在染色體外復(fù)制性載體中。另外，包含兩種所需編碼核苷酸序列的雙順反子(dicistronic)表達(dá)系統(tǒng)可用于染色體外復(fù)制性載體中或包含在宿主細(xì)胞染色體中。還有一種方法，即可分開制備兩種非共價結(jié)合的成分，再在體外適當(dāng)條件下結(jié)合。適合式(4)或(5)化合物裝配的條件與本領(lǐng)域的那些條件類似，且可模擬細(xì)胞內(nèi)條件。
此外，本發(fā)明的全部或部分激素可以用本領(lǐng)域已知的肽合成技術(shù)直接合成。合成的部分可以連接起來，而在接頭部分中所含藥物的釋放位點可以用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法引入。當(dāng)然，對于那些含有非基因編碼的氨基酸的實施例以及采用頭對頭或尾對尾構(gòu)型的實施例，合成工作必須至少部分是處于蛋白質(zhì)水平的。在天然N端或靠近天然N端的位置的頭對頭連接，可以通過含有與氨基起反應(yīng)的功能基團的接頭如二羧酸衍生物而實現(xiàn)。在C端或靠近C端位置的尾對尾構(gòu)型，可以通過二胺、二醇或其組合的接頭而實現(xiàn)。
抗體本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生能與本文所公開的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白激素起特異性免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體可以用于各種診斷和治療用途。
抗體一般是用標(biāo)準(zhǔn)免疫方案在哺乳動物如兔、小鼠、羊或大鼠中制備，并且測定多克隆抗血清的抗體效價以保證免疫充分。然后收獲多克隆抗血清用于例如免疫試驗。宿主的抗體分泌細(xì)胞，如脾細(xì)胞或外周血白細(xì)胞，可以用已知的技術(shù)進(jìn)行永生化處理并篩選，以產(chǎn)生對本發(fā)明的蛋白質(zhì)呈免疫特異性的單克隆抗體。
任何種類動物(包括人)的“抗體”，包括其保留了所需免疫特異性的任何片段，例如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)v等。因此，抗體也可以用重組技術(shù)制備，通常是分離出至少編碼單克隆抗體可變區(qū)(具有合適的特異性)的核苷酸序列，并構(gòu)建合適的表達(dá)系統(tǒng)。這種方法允許進(jìn)行任何所需的修飾，例如產(chǎn)生Fv形式、嵌合形式、“人源化”形式等。
“對本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫特異性的”抗體指在確定親和性或非親和性所考慮的普通參數(shù)內(nèi)，能特異性地結(jié)合本發(fā)明的化合物，但不結(jié)合天然糖蛋白激素或其亞基本身或僅包括一個β亞基的任何單鏈單位的抗體。應(yīng)理解，特異性是一個相對概念，可以選擇任意的限度，例如特異性結(jié)合可相差100倍或更多。因此，本發(fā)明包括的免疫特異性抗體與其針對的多結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的反應(yīng)，比與相應(yīng)天然激素、現(xiàn)有技術(shù)的單鏈形式或各亞基的反應(yīng)至少強100倍。這些抗體的獲得，可以通過例如篩選能與本發(fā)明化合物結(jié)合的抗體并且棄去也結(jié)合天然激素、亞基或現(xiàn)有技術(shù)單鏈形式(描述于WO95/22340和WO96/05224)的那些抗體。
配方和使用方法可用已知的、相當(dāng)于相應(yīng)的異二聚體的方法，來配制和施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，配制和施用方法會隨所用的具體激素或激素組合而有所不同。然而，與天然異二聚體相比，施用的劑量水平和頻率可能會改變，尤其是如果存在CTP單元，那么生物學(xué)半衰期會因其存在而延長。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的配方是典型的用于蛋白質(zhì)或肽藥物的配方，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack Publishing Company，Easton，PA中所見。蛋白質(zhì)的給藥一般通過注射，例如靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、或腹膜內(nèi)注射，或者使用透粘膜或透皮給藥的配方。也可使用其他方式的送遞，如栓劑。這些配方一般含有去污劑或滲透劑如膽鹽、梭鏈孢酸等。這些配方還可以以氣霧劑或栓劑形式，或者在透皮給藥中以皮膚膏藥(patch)形式給藥?？诜o藥也是可行的，只要配方能保護本發(fā)明的肽在消化道中不被降解。
劑量方案和配方的優(yōu)化可按常規(guī)方法并如本領(lǐng)域中通常進(jìn)行的那樣進(jìn)行。這些配方也可修改以包含適合獸醫(yī)應(yīng)用的那些成分。
本發(fā)明的組合物可以用于許多方面，最明顯地是作為激素天然形式的替代物。因此，本發(fā)明的組合物可用于治療不育癥(作為體外受精技術(shù)的輔助劑)以及其他與天然激素或它們亞基相關(guān)的治療方法。這些技術(shù)適用于人和其他動物。當(dāng)然，就其品種衍化物而言組合物的選擇取決于對病人采用的方法。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明組合物所反應(yīng)的不同作用的能力，為以前不能得到的治療提供了機會。
本發(fā)明組合物還可以以類似于天然異二聚體的方式用作試劑。
此外，本發(fā)明化合物可用作診斷工具，以檢測生物樣品中抗體的存在與否，該抗體結(jié)合于天然蛋白質(zhì)的程度達(dá)到了結(jié)合多結(jié)構(gòu)域化合物相關(guān)部分的程度。在評估各種樣品中這些激素水平的試劑盒中它們還可以用作對照試劑。評估激素本身的水平或針對它們的抗體的水平的方法是本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗方法?？梢允褂酶鞣N涉及放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等標(biāo)記技術(shù)的競爭性和直接試驗方法。
本發(fā)明化合物還可用于檢測和純化與天然激素結(jié)合的受體。因此，可將本發(fā)明化合物偶聯(lián)于固相載體，用于受體或抗激素抗體的親和層析制備。得到的受體本身在治療和候選試劑的篩選試驗中可用于評估作為候選藥物的激素活性。當(dāng)然，當(dāng)β亞基不同時，必須考慮這些化合物中β亞基的雙重特異性。然而，當(dāng)兩個β亞基相同時，它們提供了一種親和純化相關(guān)受體的強有力的工具。
最后，唯一地與本發(fā)明的單鏈激素反應(yīng)的抗體可用作純化工具，用于分離隨后制備物中的這些材料。它們還可用于監(jiān)測這些化合物作為藥物給藥后的水平。
下列實施例用于闡述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例1制備CGβ-α-CTP-FSHβ用現(xiàn)有的編碼各亞基相關(guān)部分的核苷酸序列制備了編碼標(biāo)題化合物的核苷酸序列。CGβ區(qū)域編碼人CGβ的145個氨基酸；編碼α亞基的核苷酸序列編碼人α的92個氨基酸(作為小基因)；編碼CTP的序列編碼人絨毛膜促性腺激素118-145位的28個氨基酸；而FSHβ的編碼區(qū)域編碼人FSHβ亞基的111個氨基酸。
按Sachais， Biol.Chem(1993)2682319所述的方式，將含有CGβ外顯子3、α小基因、CTP和βFSH的擴增片段插入pM2HA-CGβexon1，2(一種衍生自pM2且含CGβ外顯子1，2的表達(dá)載體)的SalI位點。含CGβ外顯子1，2的pM2在Matzuk，M.M.等人，Proc Natl Acad Sic USA(1987)846354-6358和Matzuk，M.M.等人，JCell Biol(1988)1061049-1059中有描述。首先，將在CGβ外顯子3下游含有α小基因的片段插入該載體，從而獲得pM2-HACGβα。然后pM2-HACGβα用ScaI進(jìn)行酶切，再與ScaI限制性消化過的pBIIKS(+)α-CTP-FSH連接。產(chǎn)生的表達(dá)載體pM2-HACGβ-α-CTP-FSH，當(dāng)插入合適宿主時，產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
實施例2CGβ-α-CTP-FSHβ的產(chǎn)生和活性將實施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，通過放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)在SDS凝膠上的免疫沉淀評估該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生情況。
收集培養(yǎng)液，濃縮，然后測試其與人LH受體(預(yù)計會結(jié)合βCG-α部分)的結(jié)合情況。
對于該試驗，將編碼完整人LH受體的cDNA插入表達(dá)載體pCMX中制備LH受體(Oikawa，J.X-C等人，Mol Endocrinol(1991)5759-768)。將處于指數(shù)生長期的293細(xì)胞用該載體并用Chen，C.等人，Mol Cell B iol(1987)72745-2752的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致LH受體在表面上表達(dá)。
在該試驗中，將表達(dá)人LH受體的細(xì)胞(2×105/管)與1ng標(biāo)記的hCG一起溫育，并與濃度逐漸增加的未標(biāo)記hCG或數(shù)量逐漸增加的待測樣品在22℃競爭反應(yīng)18小時。在樣品存在時，標(biāo)記的下降便表明樣品的結(jié)合能力。在該試驗中，對于293細(xì)胞中的人LH受體，異二聚體型hCG具有野生型的活性(這與以前的測定相同)，而含CGβ-α-CTP-FSHβ的培養(yǎng)液也表現(xiàn)出活性。這些結(jié)果示于

圖1。如圖所示，異二聚體的hCG(實心方塊)和本發(fā)明的雙功能單鏈蛋白(實心圓圈)都成功地與標(biāo)記的hCG競爭LH受體。雙功能化合物的效力稍低，因為α亞基羧基末端被修飾。
同樣，圖1還顯示了另一試驗的結(jié)果，其中測試了衍生自被修飾從而含有兩個表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞的不同數(shù)量的培養(yǎng)上清液。一種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生了單鏈FSHβ-α；另一系統(tǒng)產(chǎn)生hCG的β亞基。形成的非共價相連的單鏈FSHα-β/CGβ復(fù)合物(實心三角形)也成功地競爭結(jié)合。
以類似方式，還測試了含CGβ-α-CTP-FSHβ的培養(yǎng)基上清液與293細(xì)胞中表達(dá)的FSH受體的結(jié)合情況。該試驗按上述方式進(jìn)行，不同點在于用表達(dá)人FSH受體的細(xì)胞替換表達(dá)人LH受體的細(xì)胞，并采用標(biāo)記的FSH作為競爭劑。該試驗的結(jié)果示于圖2。
如圖所示，單鏈的標(biāo)題化合物(實心圓圈)成功地與FSH(實心方塊)競爭結(jié)合。在另一無關(guān)的試驗中，同樣如圖2所示，不同類型復(fù)合物(即非共價地連于CGβ的單鏈FSHβ-α)的混合物(與非復(fù)合的過量的單鏈FSHβ-α(實心三角形)混合而成)，是一種出色的競爭劑。
實施例3構(gòu)建其他的表達(dá)載體按與實施例1類似的方式，制備產(chǎn)生單鏈雙功能FSHβ-CTP-α-CGβ、α-FSHβ-CTP-CGβ、CGβ-βFSH-CTP-α和βLH-CTP-βFSH-CTP-α的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。收獲培養(yǎng)上清液，并如上所述針對LH受體和FSH受體進(jìn)行測試。這些化合物也表現(xiàn)出結(jié)合兩種受體的能力。
實施例4制備FSHβ—α≈CGβ為了產(chǎn)生化合物FSHβ—α≈CGβ，制備了產(chǎn)生單鏈FSHβ—α和人CGβ亞基的表達(dá)系統(tǒng)，并采用與本發(fā)明發(fā)明者的PCT申請WO96/05224(1996年2月22日出版)中公開的方法相類似的方法，將它們共轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。CGβ亞基結(jié)合FSHβ—α形成非共價的FSHβ-α≈CG復(fù)合物。通過放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)在SDS凝膠上的免疫沉淀評估了該非共價FSHβ-α≈CG復(fù)合物的產(chǎn)生情況和活性。
收集培養(yǎng)液，濃縮，然后測試其與人LH受體(預(yù)計會結(jié)合βCG部分)和人FSH受體(預(yù)計會結(jié)合FSHβ-α)的結(jié)合情況。
結(jié)果表明非共價FSHβ—α復(fù)合物表現(xiàn)出與CG和FSH特異性受體結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明雖然共價結(jié)合于FSHβ結(jié)構(gòu)域，栓住的α亞基還能與不同β亞基起反應(yīng)，這種構(gòu)型的存在不會消除生物活性。也可用類似的方法產(chǎn)生其他多結(jié)構(gòu)域復(fù)合物，如βFSH—α≈βLH、βCG—α≈βLH、βLH-α≈βFSH。
實施例5用作用不同的化合物調(diào)節(jié)激素比例配制作用不同的化合物，并用已知的、相應(yīng)于它們相應(yīng)的天然激素的方法給藥。
A.通過增加FSH/LH比例和/或增加CG來增加生育力通過采用式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有減弱的LH促效劑活性或LH拮抗劑活性，其他β亞基具有(任選地增加)FSH促效劑活性，來增加FSH/LH比例，可實現(xiàn)提高生育力。通過消除LHβ鏈的糖基化或點突變，可將LHβ亞基修飾成具有較低的促效劑活性或拮抗劑活性，而FSHβ亞基可以其天然形式使用或經(jīng)修飾增加其促效劑活性。得到的化合物將具有增加FSH激素水平并同時減低LH水平的能力。當(dāng)此化合物以治療劑量給予處于月經(jīng)周期的卵泡階段的哺乳動物時，增加了生育力。
另外，它的優(yōu)點是能使FSH亞基的循環(huán)半衰期長于LHβ的循環(huán)半衰期。這可用FSHβ—α≈LHβ化合物來輔助。
也可通過給予式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有LH拮抗劑活性或LH促效劑活性，其他β亞基具有CG促效劑活性，來增加CG減少水平和減少LH激素水平，來實現(xiàn)提高生育力。另外，可將CGβ亞基經(jīng)基因工程改造成與CG/LH受體的結(jié)合親和力比LHβ大。當(dāng)在合適的時間以合適的劑量給藥時，F(xiàn)SH/LH的比例將增加到有利于生育力的比例，CG的活性也將增加到有利于懷孕的水平。
同樣也可用式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有FSH促效劑活性，其他β亞基具有CG促效劑活性，來增加受精。給予這些復(fù)合物將增加FSH/LH比例而有利于受精，也將增加CG活性至有利于懷孕的水平。
通過采用式(4)或(5)的化合物的輔助，使一個β亞基的循環(huán)半衰期比其他β亞基長也是有利的。
B.減少FSH/LH比例和/或減少CG來誘導(dǎo)不育通過給予式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有LH促效劑活性，其他β亞基具有FSH拮抗劑活性或減弱的FSH促效劑活性，來減少FSH/LH比例，可誘導(dǎo)不育。在該應(yīng)用中，通過改變LHβ鏈的糖基化或通過點突變，可將LHβ亞基修飾成具有提高的促效劑活性，而FSHβ亞基可經(jīng)修飾而具有較低促效劑活性。得到的化合物將具有增加LH活性并同時減少FSH活性的能力，從而將FSH/LH比例降低至不利于受精的水平。
也可通過給予式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有LH促效劑活性，其他β亞基具有CG促效劑活性，來降低FSH/LH比例，可誘導(dǎo)不育。給予這種化合物將導(dǎo)致低FSH/LH比例和高CG激素水平，這兩者都不利于受精和懷孕。
如上所述，它的優(yōu)點是用式(4)或(5)的化合物，能使一個β亞基的循環(huán)半衰期比其他β亞基更長。這對改變β亞基的結(jié)合親和力也是有利的。
C.降低LH/FSH比例來治療多囊卵巢綜合癥多囊卵巢綜合癥的特征是卵泡發(fā)育不完全和排卵異常?；歼@種疾病的女性與正常能育女性相比雄激素升高且LH/FSH比例也高。所以，在月經(jīng)周期中估計卵泡發(fā)育正常啟動時，給予式(1)—(5)的化合物，其中一個β亞基具有較低的LH促效劑活性或拮抗劑活性，其他β亞基具有FSH促效劑活性，將加速卵泡的發(fā)育，誘導(dǎo)排卵。由于給予FSH促效劑有引起過度刺激的危險性，較佳地是FSHβ亞基是非共價連接的β亞基，具有較短的循環(huán)半衰期，和/或FSHβ亞基經(jīng)基因工程改造而具有降低的結(jié)合親和力。
權(quán)利要求
1.一種向?qū)ο筇峁┎煌堑鞍准に鼗钚缘姆椒?，其特征在于，所述的方法包括給予需要所述活性的對象下式化合物β1-(接頭1)m-α-(接頭2)n-β2(1)；β1-(接頭1)m-β2-(接頭2)n-α(2)；α-(接頭1)m-β1-(接頭2)n-β2(3)；β2≈α-(接頭)m-β1(4)；或β1-(接頭)m-α≈β2(5)式中，各β1和β2為脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或其變異體；“α”為脊椎動物糖蛋白激素α亞基的氨基酸序列或其變異體；“接頭”指接頭部分；和“≈”是α和β2間的非共價鍵；各m和n獨立地為0或1；其中各個β1和β2賦予所述的化合物不同的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2相應(yīng)于不同的天然β亞基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2表現(xiàn)出不同的生物半衰期。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，β1和β2一個賦予促效劑活性，另一個賦予拮抗劑活性。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對象需要提高生育力。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，其中β1和β2都賦予所述的化合物FSH促效劑活性；或其中β1和β2都賦予CG促效劑活性；或其中β1和β2都賦予LH拮抗劑活性；或其中β1和β2一個賦予FSH促效劑活性，另一個賦予LH拮抗劑活性或降低的LH促效劑活性；或其中β1和β2一個賦予FSH促效劑活性，另一個賦予CG促效劑活性；或其中β1和β2一個賦予LH拮抗劑活性或降低的LH促效劑活性，另一個賦予CG促效劑活性。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對象需要變成不育或維持不育。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，其中β1和β2二者賦予所述的化合物FSH拮抗劑活性；或其中β1和β2都賦予CG拮抗劑活性；或其中β1和β2都賦予LH促效劑活性；或其中β1和β2一個賦予FSH拮抗劑活性或降低的FSH促效劑活性，另一個賦予LH促效劑活性；或其中β1和β2一個賦予FSH拮抗劑活性或降低的FSH促效劑活性，另一個賦予CG拮抗劑活性或降低的CG促效劑活性；或其中β1和β2一個賦予LH促效劑活性，另一個賦予CG拮抗劑活性或降低的CG促效劑活性。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的對象需要治療多囊卵巢病。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，其中β1和β2一個賦予所述的化合物FSH促效劑活性，另一個賦予LH拮抗劑活性或降低的LH促效劑活性；或其中β1和β2都賦予FSH促效劑活性；或其中β1和β2都賦予LH拮抗劑活性。
11.一種下式的糖基化或非糖基化化合物β2≈α-(接頭)m-β1(4)；或β1-(接頭)m-α≈β2(5)其特征在于，其中各β1和β2為脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或其變異體；“α”為脊椎動物糖蛋白激素α亞基的氨基酸序列或其變異體；“接頭”指接頭部分；和“≈”是α和β2間的非共價鍵；m為0或1；其中各個β1和β2賦予所述的化合物不同的活性；和附加條件為如果β1是CG則β2不是FSH。
12.一種調(diào)節(jié)哺乳動物糖蛋白激素濃度的藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包含與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合的有效劑量的下式化合物β2≈α-(接頭)m-β1(4)；或β1-(接頭)m-α≈β2(5)其中各β1和β2為脊椎動物糖蛋白激素β亞基的氨基酸序列，或其變異體；“α”為脊椎動物糖蛋白激素α亞基的氨基酸序列或其變異體；“接頭”指接頭部分；和“≈”是α和β2間的非共價鍵；各m和n獨立地為0或1；其中各個β1和β2賦予所述的化合物不同的活性；和附加條件為如果β1是CG則β2不是FSH。
13.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，它經(jīng)修飾而含有包括第一表達(dá)系統(tǒng)的核酸，所述的第一表達(dá)系統(tǒng)包含操作性連接于一表達(dá)的控制序列的α—(接頭)m—β1或β1—(接頭)m—α的核苷酸編碼序列，和包括第二表達(dá)系統(tǒng)的核酸，所述的第二表達(dá)系統(tǒng)包含操作性連接于一表達(dá)的控制序列的β2的核苷酸編碼序列，其中α、β1、β2、接頭和m的定義如權(quán)利要求11。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的第一表達(dá)系統(tǒng)和第二表達(dá)系統(tǒng)具有同樣的控制序列。
15.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的第一表達(dá)系統(tǒng)和第二表達(dá)系統(tǒng)位于分開的染色體外復(fù)制載體中。
16.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的第一表達(dá)系統(tǒng)和第二表達(dá)系統(tǒng)位于宿主細(xì)胞的染色體中。
17.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的第一和第二表達(dá)系統(tǒng)一個位于所述細(xì)胞的染色體中，另一個位于染色體外復(fù)制載體中。
18.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其特征在于，第一和第二表達(dá)系統(tǒng)都在同一個染色體外復(fù)制載體中。
19.一種產(chǎn)生式(4)或(5)化合物的方法，其特征在于，該方法包括；在產(chǎn)生所述化合物的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞；和從培養(yǎng)物中回收所述化合物。
20.一種與權(quán)利要求11所述的化合物起特異性免疫反應(yīng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了作用不同的糖蛋白激素形式。這些化合物具有式:(1)β
文檔編號C07K19/00GK1330665SQ99813541
公開日2002年1月9日 申請日期1999年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月19日
發(fā)明者I·布伊米, D·本－梅納漢 申請人:華盛頓大學(xué)