專利名稱：TGFβ1－抑制肽的制作方法
背景技術(shù)：
描述細(xì)胞生長(zhǎng)由生長(zhǎng)因子家族的各種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)(Schalch DS等(1979)內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)1041143-1151)。參與細(xì)胞發(fā)育，并能夠由自分泌和旁分泌機(jī)制發(fā)揮作用的最重要生長(zhǎng)因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)(Braun L.等(1988)細(xì)胞生物學(xué)(Cell Biol.)851539-1543；LyonsRM和Moses HL(1990)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)187467-473)。
術(shù)語(yǔ)TGF首次用于描述由鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系產(chǎn)生的活性(deLarco JE和Todaro GJ(1978)國(guó)立科學(xué)院科學(xué)學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)754001-4005；Mizel SB等(1980)國(guó)立科學(xué)院科學(xué)學(xué)報(bào)，772205-2208)。這些細(xì)胞的懸浮液能夠誘導(dǎo)需要固體支持物支持生長(zhǎng)的細(xì)胞在軟瓊脂中正常生長(zhǎng)。更具體的研究證明存在兩類TGF，稱之為T(mén)GFα和TGFβ，它們又包括相關(guān)蛋白質(zhì)家族。TGFβ家族由五個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)(Schlunneger MP和Gmutter MG(1992)自然358430-434；Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.275-18)的同種型構(gòu)成(Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.275-18)。對(duì)從單一物種純化出來(lái)的成熟蛋白質(zhì)的研究表明它們的序列之間存在高度相同性(表1)。表1.不同型TGFβ之間的同源性。TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3來(lái)源于人，TGFβ4來(lái)源于雞，TGFβ5來(lái)源于狗。(Roberts AB和Sporn MB，1990)。
TGFβ1以一種具有390個(gè)氨基酸稱之為前-原-TGFβ1的前體合成。在第一次水解中，釋放出一種29個(gè)氨基酸的疏水片段，得到原-TGFβ1。然后在TGFβ1氨基末端之前的、由兩個(gè)精氨酸構(gòu)成的區(qū)域中的再次切割得到成熟TGFβ1，其為112個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為12KDa。為了形成生物活性形式，這兩種單體通過(guò)二硫鍵連接到一起，產(chǎn)生一種25KDa的二聚體。這種結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致生物功能的喪失(Barnard JA等(1990)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)(Biochem.Biophys.Acta)103279-87)。
已知TGFβ1結(jié)構(gòu)中存在多種結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域之一定位在氨基酸40-82之間，涉及TGFβ1與其細(xì)胞受體的結(jié)合(Quian SW等(1992)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)學(xué)報(bào)896290-6294；Burmester JK等(1993)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)學(xué)報(bào)908628-8632)。TGFβ1和其它結(jié)合蛋白質(zhì)的受體已經(jīng)鑒定了五種TGFβ1的特異性受體(Cheifetz S等(1988)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26317225-17228；Lopez Casillas F.等(1991)細(xì)胞(Cell)67785-795)。這些受體對(duì)不同型TGFβ1具有不同的親合性。I、II和III型受體目前了解最為清楚(Attisano L等的綜述(1994)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)122271-80；Derynck R(1994)生物化學(xué)趨勢(shì)(Trends Biochem.Sci.)19548-553；Yingling等(1995)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)1242.115-136)。IV型受體(MacKay K.和Danielpour D.(1991)生物化學(xué)雜志2669907-9911)和V型受體(Ichiji H.等(1991)生物化學(xué)雜志26622459-22464)也已有描述。還曾報(bào)道endoglin的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(Cheifetz S等(1993)生物化學(xué)雜志26719027-19030；Bellon T.等(1993)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)2232340-2345；Yamashita等(1995)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)156564-573)與人和大鼠的III型受體具有約70％的相似性。
RIII可能是一種具有下述功能的受體，其結(jié)合TGFβ1并將它呈遞給RII(其可能又與RI形成復(fù)合物)(Yamashita等(1994)生物化學(xué)雜志26920172-20178)或者復(fù)合物(其中各種RI分子與RII結(jié)合)(Weiss G.和Massague J.(1996)EMBO J 15276-289)。RII-RI的相互作用將促進(jìn)RI的磷酸化，隨后激活其絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，該激酶將使類似MADR2蛋白的第二信使磷酸化(Macias-Silva M等(1996)細(xì)胞871215-1224)。TGFβ1在肝分化和再生中的作用根據(jù)發(fā)育時(shí)段和細(xì)胞類型產(chǎn)生的作用是不同的。
·增大胞外基質(zhì)，作用于肝星狀細(xì)胞(Ito細(xì)胞)——基質(zhì)蛋白質(zhì)的基本來(lái)源(Mustoe TA等(1987)科學(xué)2371333-1336)。
·使上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞分化(Florini JR等(1986)生物化學(xué)雜志26116509-16513)。
·在肝再生過(guò)程中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。該作用對(duì)于維持細(xì)胞體外休眠十分重要(Kato Y等(1988)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)學(xué)報(bào)859552-9556)。
·抑制上皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體的胞吞作用，如在胎鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到的那樣(Noda M.和Rodan GA(1987)細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell Physiol.)133426-437)。TGFβ1在肝纖維化中的作用發(fā)現(xiàn)TGFβ1與肝纖維化進(jìn)程有關(guān)(Czaja MJ等(1989)細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)1082477-2482；Annoni G.等(1992)J.Hepatol.14259-264)，其導(dǎo)致通過(guò)肝星狀細(xì)胞(肝細(xì)胞或Ito細(xì)胞)上它們的受體使胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生增加，并抑制使基質(zhì)降解的蛋白水解酶的合成(Ignotz RA和Massague J.(1986)生物化學(xué)雜志2614337-4345)。在肝臟中，TGFβ1誘導(dǎo)肝臟星狀細(xì)胞中膠原蛋白和粘連蛋白的合成(Weiner FR(1990)肝臟學(xué)(Hepatology)11111-117)。還通過(guò)誘導(dǎo)其mRNA，增加其自身合成，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)調(diào)節(jié)。
還發(fā)現(xiàn)TGFβ1涉及由肝細(xì)胞和激活的肝星狀細(xì)胞合成的α2-巨球蛋白的合成增加。據(jù)稱α2-巨球蛋白通過(guò)與TGFβ1結(jié)合并使其滅活(BachemMG(1994)Ann NY Acad.Sci.737421-424)，從胞外空間消除TGFβ1。
對(duì)慢性肝病患者的研究表明，在TGFβ1表達(dá)與I型原膠原蛋白的mRNA表達(dá)和原膠原蛋白III型肽的血清水平之間存在相關(guān)性(Castilla A.等(1991)N.Engl.J.Med.324933-940)。
肝硬化患者由于疾病過(guò)程產(chǎn)生的并發(fā)癥，例如門(mén)靜脈高壓或肝功衰竭，使他們的存活期比正常生命期限短。TGFβ1對(duì)胞外基質(zhì)的影響TGFβ1與細(xì)胞受體的相互作用導(dǎo)致·激活原膠原蛋白、粘連蛋白(Ignotz RA等(1987)生物化學(xué)雜志2626443-6446)和相關(guān)蛋白質(zhì)，包括能夠與胞外基質(zhì)成分相互作用的膜蛋白(Carter WG(1982)生物化學(xué)雜志25713805-13815)的合成。
·抑制能夠降解基質(zhì)的蛋白水解酶的合成(Fukamizu H.和GrinellF.(1990)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(Exp.Cell Res.)190276-282)。
·刺激蛋白水解酶抑制劑的合成(Fukamizu H.和Grinell F.(1990)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究190276-282)。
這些作用導(dǎo)致細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互作用的增強(qiáng)，其與基質(zhì)的組成蛋白質(zhì)的較高識(shí)別結(jié)合，導(dǎo)致胞外基質(zhì)總量增加(Roberts CJ等(1988)生物化學(xué)雜志2634586-4592)。這些結(jié)果證實(shí)TGFβ1參與愈合過(guò)程(Fukamizu H.和Grinnell F.(1990)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究190276-282；Bamard JA等(1990)生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)103279-87)。肽作為配體-受體相互作用的抑制劑存在這樣的可能性，即用小分子、合成肽作為體內(nèi)存在分子的類似物，用于模擬體內(nèi)分子的功能。LeSateur等進(jìn)行的研究證實(shí)了應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的環(huán)狀類似物模擬β回文區(qū)，使其結(jié)合受體的可能性(LeSateur L.等(1996)天然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)141120-1122)。還可能應(yīng)用肽作為這些分子的拮抗劑，通過(guò)該肽介導(dǎo)的封閉作用阻止天然因子與其受體的相互作用(Lasate JJ等(1994)獲得性免疫缺陷綜合癥雜志(J.Acquired Immune Deficiency Syndromes)7129-134；LeSateur等(1995)生物化學(xué)雜志2706564-6569)。早期研究證明了合成肽作為配體-受體相互作用的抑制劑的有用性，甚至當(dāng)識(shí)別表位不連續(xù)時(shí)同樣如此(Daniels AJ等(1995)分子藥理學(xué)(Mol.Pharmacol.)48425-432)。其它有關(guān)TGFβ1的II型受體和胎球蛋白，一種II型受體家族中的糖蛋白的研究，證明了應(yīng)用環(huán)狀肽作為T(mén)GFβ1與RII相互作用抑制劑的可能性(Demetriou M.等(1996)生物化學(xué)雜志27112755-12761)。通過(guò)這種環(huán)化，即可能獲得具有類似于體內(nèi)可能獲得肽結(jié)構(gòu)的肽。發(fā)明詳述由于前面陳述的原因，我們認(rèn)為來(lái)源于TGFβ1和其受體，或者來(lái)源于能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)的肽，能夠作為T(mén)GFβ1活性的抑制劑。因此我們決定開(kāi)發(fā)該可能性。待合成肽的選擇根據(jù)肽來(lái)源于TGFβ1還是來(lái)源于其受體，按照不同方式選擇用于合成的肽。
對(duì)于TGFβ1序列的情況，從包括TGFβ1全序列的15個(gè)氨基酸合成肽。每個(gè)肽具有與它的兩個(gè)直接鄰居相同的10個(gè)氨基酸。
對(duì)于TGFβ1受體序列的情況，基于我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的軟件選擇肽。用一種計(jì)算機(jī)程序比較兩個(gè)氨基酸序列，旨在于預(yù)測(cè)部分互補(bǔ)區(qū)。也應(yīng)用了其它程序，它們能夠基于構(gòu)成這些序列的氨基酸的疏水性和親水性，預(yù)測(cè)暴露最多的蛋白質(zhì)區(qū)域。肽的合成通過(guò)固相法(Merrifield(1963)美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)852149-54)，應(yīng)用芴基甲氧羰基(Fmoc)作為alpha-氨基的臨時(shí)保護(hù)基(Atherton等(1989)Journal of Chemical Society Perkins Transaction1538-546)合成肽。對(duì)于多種肽的少量合成，應(yīng)用多重合成儀，其允許96個(gè)肽的同步合成(Borras-Cuesta等(1991)生物學(xué)(Biologicals)19187-190)。將肽在-80℃以固體狀態(tài)儲(chǔ)藏，直到使用。通過(guò)HPLC純化肽通過(guò)高效液相色譜(HPLC)，應(yīng)用Waters600E-900系統(tǒng)(MilliporeCorp.，Bedford，USA)分析和純化合成的肽。
應(yīng)用Waters Radial-PakTMC18300 15μm，8×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)通過(guò)分析型HPLC分析肽。將肽溶解于0.1％TFA的蒸餾水溶液，至最大濃度為1mg/ml。將肽溶液(100μl)注射到柱中，在水/乙腈梯度中洗脫(

圖15)(Romid Ltd.，Cambridge，USA)，均用0.1％TFA，流速為1ml/min。通過(guò)220nm和280nm處的肽吸收度檢測(cè)含肽的組分(光敏二極管陣列檢測(cè)儀，Waters 991，Millipore Corp.，Bedford，USA)。
應(yīng)用Waters Delta-PakTMC18300 15μm，25×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)進(jìn)行肽的純化。溶解肽，并在與前面程序同樣的條件下注射(2ml)，應(yīng)用同樣的梯度，流速為5ml/min。將含純化肽的組分收集到一個(gè)燒瓶中。肽活性的體外實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞系使用來(lái)自貂肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞系MV-1-Lu(CCL-64，美國(guó)典型細(xì)胞培養(yǎng)中心(American Type Cell Culture)，Virginia，USA)。細(xì)胞在162cm2的培養(yǎng)瓶(Coster Corporation，Cambridge，USA)中，在37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，直到獲得亞匯合。使用完全培養(yǎng)基添加5％胎牛血清(FCS，Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)、10mM HEPES(1M HEPES緩沖液，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)的含L-谷氨酰胺(GibcoBRL，LifeTechnologies Ltd.，Paisley，Scotland)的RPMI1640。MV-1-Lu細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)用5ml胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)從培養(yǎng)瓶的底部除下如上述生長(zhǎng)的MV-1-Lu細(xì)胞，重懸浮于完全培養(yǎng)基，以1500rev/min離心8分鐘。離心后，將細(xì)胞以50000個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于完全培養(yǎng)基。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，取10ml細(xì)胞懸浮液分散于96孔、平底培養(yǎng)板(Costar Corporation，Cambridge，USA)，每孔加100μl，在37C和5％CO2下培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞附著到孔的底面。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在存在RPMI(R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)中濃度為200pg/ml TGFβ1的情況下，將待實(shí)驗(yàn)的肽加入RPMI至終濃度為200μg/ml。每孔中FCS的終濃度為2.5％。培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔加入1μCi的氚代胸苷(25 Ci/mmol [甲基-3H]-胸苷，Amersham Life Science，Buckinghamshire，UK)再次培養(yǎng)12小時(shí)(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)83764-770；Brennan FM等(1990)臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)81278-285)。
在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA從孔底除下細(xì)胞，通過(guò)人工收獲儀(Titertek細(xì)胞收獲儀，Skatron Instruments Inc.，Sterling，USA)收集細(xì)胞，并破碎細(xì)胞，在硝酸纖維素濾紙(Filter MAT 11731，Skatron InstrumentsInc.，Sterling，USA)上收集固定于其上的DNA。將濾紙分別置于5ml聚丙烯試管，象其中加入4ml發(fā)光液體(Biogreen-11，Reactivos Scharlau S.A.，Barcelona，Spain)。在βLKB發(fā)光記錄儀上90秒定量檢測(cè)各管的活性(Betaplate system，LKB，Uppsala，Sweden)。TGFβ1與細(xì)胞受體結(jié)合的抑制研究細(xì)胞受體的選擇性標(biāo)記(親合性標(biāo)記)從培養(yǎng)瓶取出MV-1-Lu細(xì)胞，將它們與10ml溶液1(128mM NaCl、25mM 4-(2-羥基)-1-哌嗪乙基磺酸鹽pH7.5、5mM葡萄糖和1mMEDTA)在37℃培養(yǎng)10分鐘。然后將取出的細(xì)胞重懸浮于溶液2(128mMNaCl、5mM KCl、50mM 4-(2-羥基)-1-哌嗪乙基磺酸鹽pH7.5、1.2mMMgSO4和5mg/ml BSA)，通過(guò)1000×g離心5分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞離心后，以106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于溶液2。
從該細(xì)胞懸浮液，取0.5mL置于24-孔平板(Greiner GmbH、Frickenhausen，Germany)，加入50μl 0.8mg/ml的肽溶液，然后在4℃保溫2小時(shí)同時(shí)攪拌。接下來(lái)，加入終濃度為277.2pM的125I-TGFβ1(2μCi)(125I-TGFβ1人重組800-2200Ci/mmol，Amersham Lift Science，Buckinghamshire，UK)，再次在4℃攪拌下保溫2小時(shí)。
保溫后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，然后在12000 xg下冷卻離心1分鐘。然后在0.5ml冷溶液2、5μl二甲亞砜(DMSO99.5％，SigmaChemical Co.，St.Louis，USA)和DSS終濃度為0.25mM的二琥珀酰辛二酸酯(DSS，Pierce Chemical Co.，Rockford，USA)中重懸浮。通過(guò)稀釋、離心和用含0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA的溶液(pH7.4)沖洗中止反應(yīng)。細(xì)胞沉淀重懸浮于0.5ml Triton X-100(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)1％v/v、10mM Tris(pH7.0)、1mM EDTA、0.1mM氟化苯甲基磺酸鹽、1μg/ml抑肽素和1μg/ml亮肽素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，并在4℃保溫40分鐘。在去污劑中不溶的部分通過(guò)在12000×g離心15分鐘分離出去。在去污劑中溶解的部分(上清液)和不溶部分(沉淀)在-20℃冷凍(Massague J.和Like B.(1985)生物化學(xué)雜志2602636-2645)。在聚丙烯酰胺十二烷基磺酸鈉凝膠中電泳蛋白質(zhì)通過(guò)在7.5％丙烯酰胺/二丙烯酰胺凝膠中，220伏電壓下電泳5-6小時(shí)，分析在去污劑中的可溶組分和不溶組分。
用考馬斯亮藍(lán) R250(Serva Feinbiochemica GmbH，Heidelberg，Germany)的甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸餾水溶液染色蛋白質(zhì)30分鐘。然后第一次漂洗用甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸餾水溶液沖洗15分鐘，隨后用甲醇(2.5％)、乙酸(0.5％)和蒸餾水進(jìn)行隨后的漂洗，直到背景顏色除去。流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)通過(guò)直接免疫熒光法測(cè)定由肽介導(dǎo)的TGFβ1與細(xì)胞受體結(jié)合的抑制作用。其中應(yīng)用了一種免疫熒光試劑盒(Fluorokine rh TGFβ-生物素，R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)。具體地說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)基于生物素?；疶GFβ1結(jié)合細(xì)胞受體的能力，以及隨后生物素與熒光標(biāo)記抗生物素蛋白的相互作用，因此信號(hào)強(qiáng)度將依賴于與細(xì)胞受體結(jié)合的TGFβ1的量。
用溶液1(前面描述的)除下在162cm2培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的MV-1-Lu細(xì)胞，重懸浮于生理鹽水，在500×g離心5分鐘。離心后，細(xì)胞再次以4×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于生理鹽水。將25μl細(xì)胞懸浮液加入12×75mm硼硅酸鹽試管，向其中加入在40μl RPMI 1640培養(yǎng)基中的待實(shí)驗(yàn)肽，使其終濃度為0.42μg/ml，和10μl生物素酰化的TGFβ1。作為特異性對(duì)照，加入10μl試劑盒中提供的生物素?；噭尤?0μl生物素?；腡GFβ1作為陽(yáng)性對(duì)照，加入20μl抗-TGFβ1的阻斷抗體作為陰性對(duì)照。向所有對(duì)照中加入生理鹽水，至總體積為75μl。所有試管在4℃黑暗條件下保溫1小時(shí)。
在保溫結(jié)束時(shí)，加入10μl熒光素標(biāo)記的抗生物素蛋白，在4℃黑暗條件下保溫30分鐘，之后加入2ml清洗液(RDF1)，然后在500×g下離心6分鐘。細(xì)胞沉淀重懸浮于0.2ml冷PBS，用于細(xì)胞記數(shù)(FACScan，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，California，USA)。當(dāng)一束激光偶爾照射到孔上時(shí)，該方法能夠應(yīng)用一種計(jì)算機(jī)程序(LisysTMII，BectonDickinson Immunocytometry Systems，California，USA)測(cè)定各細(xì)胞發(fā)射的熒光。圖16顯示了一副通過(guò)流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)分析得到的典型圖像。
為了得到TGFβ1與其受體結(jié)合抑制的數(shù)據(jù)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，以劃出相當(dāng)于結(jié)合TGFβ1-生物素(M2)和結(jié)合未標(biāo)記細(xì)胞(M1)的標(biāo)記細(xì)胞的范圍。一旦劃出該范圍，則可計(jì)算定位在它們之中每一個(gè)上的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。對(duì)于當(dāng)肽與TGFβ1-生物素或與細(xì)胞(根據(jù)肽是否分別來(lái)源于受體還是TGFβ1)共同保溫時(shí)得到的數(shù)據(jù)，進(jìn)行同樣的操作。利用這些數(shù)據(jù)，同時(shí)應(yīng)用下列算式計(jì)算各肽的抑制百分率100-((M2肽-M2陰性)×100/(M2陽(yáng)性-M2陰性))。在纖維癥模型中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用來(lái)自同一窩(5周±1.5周)的白色雄性大鼠(albino Wistar品系)，為了得到年齡和初始重量均一的一組動(dòng)物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物保持在恒溫(22℃)和12小時(shí)光照和黑暗循環(huán)條件下。它們可以隨意取水和食物。
通過(guò)吸入四氯化碳共11周，每周兩次，誘導(dǎo)肝硬化(HC)(Lopez NovoaJM等(1976)Patologia IX223-240；Camps J.等(1987)胃腸病學(xué)(Gastroenterology)93498-505)。通過(guò)經(jīng)一個(gè)氣體洗瓶，以3升/分鐘的流速吹進(jìn)壓縮空氣，實(shí)現(xiàn)接觸CCl4。最初接觸1分鐘，之后每周增加1分鐘，直到第四周達(dá)到4分鐘。在第五周不給CCl4，第六周重新開(kāi)始，接觸5分鐘。5分鐘的接觸時(shí)間維持到11周。從開(kāi)始接觸CCl4前1周到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在引用水中加入400mg/l苯巴比妥(Luminal，Bayer，Leverkusen，Germany)。在開(kāi)始處理之前，留出一周不施用CCl4。在處理過(guò)程中，按照記錄(圖2)給動(dòng)物施用一周劑量的CCl4。動(dòng)物的分布在開(kāi)始誘導(dǎo)肝硬化之前，將動(dòng)物分成4組。
健康對(duì)照(Co)沒(méi)有接受纖維化處理的動(dòng)物。
處理的健康對(duì)照(Co＋P144)沒(méi)有接受纖維化處理，但在最后3周施用肽P144的動(dòng)物(與大鼠Tto2組的處理時(shí)間一致)。
硬化對(duì)照1(Ci1)每周吸入CCl4兩次，接受硬化誘導(dǎo)處理的動(dòng)物。到第五周時(shí)將這些動(dòng)物分成2組硬化對(duì)照1(Ci1)11周以后，繼續(xù)接受纖維化誘導(dǎo)處理，而沒(méi)有接受肽P144的動(dòng)物。在整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中，在不施用CCl4的其它天給它們施用鹽水血清(第5到11周)。
處理的硬化1(Tto1)在誘導(dǎo)纖維化過(guò)程的第5到11周中，在不施用CCl4的其它天，施用來(lái)自III型受體序列的肽P144的動(dòng)物。
硬化對(duì)照2(Ci2)連續(xù)接受纖維化誘導(dǎo)處理而不接受肽P144或鹽水血清的動(dòng)物。到第11周將這組動(dòng)物分成另兩組。
硬化對(duì)照2(Ci2)不接受任何類型處理的硬化動(dòng)物，作為對(duì)照。這些動(dòng)物接受3周鹽水血清的注射(第13到15周)。
處理的硬化2(Tto2)用來(lái)自III型受體(P144)序列的肽處理3周(第13至15周)的硬化動(dòng)物。動(dòng)物的處理·Tto1組這些動(dòng)物在纖維化過(guò)程中接受處理。在第5周開(kāi)始用肽的處理(在接觸CCl4之前的5分鐘)，持續(xù)到硬化誘導(dǎo)過(guò)程的第11周末。·Tto2組這些動(dòng)物在纖維化誘導(dǎo)過(guò)程(11周)完成后接受處理。在最后一次吸入后的一周開(kāi)始處理，持續(xù)21天。
在開(kāi)始處理之前和處理之后，從所有接受肽處理的動(dòng)物體內(nèi)取血。在腹部以500μl生理鹽水中70μg/只動(dòng)物的劑量皮下注射施用肽。處死動(dòng)物并解剖出肝臟當(dāng)完成用肽處理動(dòng)物后，對(duì)于大鼠模型和小鼠模型，用毛細(xì)管從動(dòng)物的后-眶血管叢取血后，斷頭處死動(dòng)物。
然后立即解剖肝臟并收集樣品。切碎樣品并置于甲醛中作為固定液，用于以后的組織學(xué)檢查。其它碎片置于浸在液氮中的冷凍管中，然后-80℃儲(chǔ)藏。肝臟的病理解剖學(xué)評(píng)價(jià)將之前固定在甲醛中至少24小時(shí)的肝臟碎片進(jìn)行組織學(xué)檢查，之后將它們置于乙醇中(70％)。
脫水后，將它們嵌入石蠟塊。用Leitz旋轉(zhuǎn)式顯微鏡用薄片切片機(jī)和鋼刀從得到的石蠟塊連續(xù)制備3μm厚的切片。染色之前將切片置于二甲苯(AnalaR、BDH、Poole，UK)中15分鐘脫石蠟，將它們?cè)?0℃的烘箱中加熱15分鐘后，使它們連續(xù)通過(guò)濃度降低的乙醇100％、96％、80％和70％最后是水，使它們脫水。使用下列染料蘇木素-曙紅Masson’s三色(trichromic)(Locquin M.和Langeron，(1985)in Manual deMicroscopia Ed.Labor S.A.Barcelona)對(duì)于膠原蛋白應(yīng)用一種特定染料(綠光)。天狼紅膠原蛋白的特異性染料。肝纖維化的確定圖像分析對(duì)于得到樣品的圖像分析，應(yīng)用一種連接有攝象機(jī)(Sony DXP-950P，Sony Co.，Tokyo，Japan)的光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2，Tokyo，Japan)，利用該裝置各切片的每個(gè)視野均被拍攝下來(lái)。對(duì)于每個(gè)切片隨機(jī)拍攝六個(gè)視野。利用計(jì)算機(jī)程序(Visilog 4.1.5，Noesis，Orsay，F(xiàn)rance)分析拍攝的各種圖像，該程序能夠計(jì)算纖維化面積和切片的總面積。從這些數(shù)據(jù)計(jì)算各視野的纖維化指數(shù)(纖維化面積/總面積)。為了能夠應(yīng)用該程序，有必要應(yīng)用偏振光濾光片(Olympus U-POT，Tokyo，Japan)和綠光濾光片(Olympus IF550，Tokyo，Japan)改變圖像的物象，其使樣品分析過(guò)程的自動(dòng)化成為可能。石蠟-處理組織的14μm切片中的膠原檢測(cè)按照前面描述的3μm切片的同樣方式制備用于該方法的14μm切片。將這些切片置于二甲苯12小時(shí)，使它們脫石蠟。去除石蠟后，將它們通過(guò)不同濃度的乙醇96％、80％、50％，使樣品脫水，最后在蒸餾水中完成該過(guò)程。
脫水后，使它們?cè)?60mg Fast Green FCF(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)的160ml飽和苦味酸(Merck，Darmstadt，Germany)溶液中黑暗下保持15分鐘進(jìn)行預(yù)染色處理。將樣品浸入水中漂洗，直到它們不再使漂洗水顯色。去除紫色染料后，使樣品在160mg Direct Red 80(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)和64mg Fast Green的160ml飽和苦味酸溶液中黑暗下保持30分鐘染色樣品。再次漂洗它們，直到去除紫色染料，然后用小抹刀刮樣品，以從薄片上分離樣品。以這種方式分離下來(lái)的切片分別置于含3ml NaOH 0.1N(Quimon，Montplet&Esteban S.A.，Barcelona，Spain)和甲醇(1∶1)的試管中。從各試管取等量液體，在分光光度計(jì)(Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer，Perkin-Elmer，Norwalk USA)上，在波長(zhǎng)540nm和630nm處讀數(shù)，以NaOH0.1N和甲醇液的等量液作為空白(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)Histochem，Cytochem.33737-743；Gaudio E.等(1993)國(guó)際實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志(Int.J.Exp.Path.)74463-469)。
按照Gaudio E.等((1993)國(guó)際實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志74463-469)的工作，施用下列公式計(jì)算膠原蛋白和總蛋白的量 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)Shapiro-Wilks實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證量變的常態(tài)。
由于沒(méi)有將數(shù)據(jù)調(diào)整到正常分布，進(jìn)行了非-參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。利用Kruskal-Wallis H方法，然后通過(guò)Mann-Whitney U.比較，實(shí)現(xiàn)組間比較。數(shù)據(jù)用直方圖表示，并表示了數(shù)據(jù)的中值(每個(gè)框內(nèi)的粗線)，以及四分位內(nèi)數(shù)的間距(框的高度)，而各框的“胡須”表示一個(gè)給定四分位數(shù)的間距的最高和最低觀察值。
用Fisher’s精確度檢驗(yàn)研究變量之間的相關(guān)性。應(yīng)用邏輯回歸研究這些變量相關(guān)性的獨(dú)立性。
P值等于或低于0.05被認(rèn)為具有顯著性。
用Windows V 6.1.3.的程序SPSS完成所有統(tǒng)計(jì)分析。TGFβ1的體外抑制活性抑制MV-1-Lu細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)TGFβ1是一種能夠抑制MV-1-Lu細(xì)胞系體外生長(zhǎng)的細(xì)胞因子(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)83764-770；Brennan FM等(1990)臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)81278-285)，因此用該細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)肽對(duì)TGFβ1的阻斷作用。我們應(yīng)用培養(yǎng)基、細(xì)胞和腺苷的不同組合，研究不同濃度的TGFβ1對(duì)培養(yǎng)中的MV-1-Lu細(xì)胞整合[甲基-3H]胸苷的影響，用于確定實(shí)驗(yàn)的最合適條件。這些條件在圖3中顯示。
確定MV-1-Lu細(xì)胞的最佳濃度(5000細(xì)胞/孔)和能夠產(chǎn)生約90％細(xì)胞抑制的最低TGFβ1濃度(200pg/ml，圖18)之后，對(duì)濃度為200μg/ml的合成肽的抑制作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。合成肽對(duì)TGFβ1活性的體外抑制用MV-1-Lu細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)作為T(mén)GFβ1活性的潛在抑制劑的合成肽，該合成肽是按照“待合成肽的選擇(來(lái)源于結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)和TGFβ1本身的肽)”部分描述的方法選擇出來(lái)的。將肽溶解于緩沖的RPMI培養(yǎng)基，無(wú)胎牛血清，應(yīng)用下列程序?qū)儆谑荏w序列的肽，或互補(bǔ)于TGFβ1親水性峰的肽，在存在該細(xì)胞因子的情況下，保溫30分鐘，然后與細(xì)胞培養(yǎng)物混合。將來(lái)源于TGFβ1序列的肽在加入TGFβ1之前加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，因?yàn)樗鼈兣c細(xì)胞表面受體相互作用。在100μl用于加入細(xì)胞的同樣培養(yǎng)基中進(jìn)行上述保溫。根據(jù)活性肽抑制TGFβ1的能力不同，使細(xì)胞生長(zhǎng)程度較大或較小。利用來(lái)源于TGFβ1的肽抑制TGFβ1首先，合成來(lái)源于TGFβ1的重疊肽。合成這些肽(表2)，期望它們中的某些能夠結(jié)合細(xì)胞受體，因此防止天然TGFβ1與這些受體的結(jié)合。表2.來(lái)源于TGFβ1的肽。顯示了肽的數(shù)目，在完全序列中的位置，以及其氨基酸序列。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一個(gè)丙氨酸，其未在表中顯示。肽 序列Pl(280-293)AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsnP2(284-297)AsnTyrCysSerSerThrGluLysAsnCysCysValArgP3(288-301)SerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGlnLeuTyrIleP4(294-307)CysCysValArgGlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuP5(296-311)GlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpP6(302-315)AspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProP7(306-319)AspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisP8(308-321)GlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnP9(312-325)IleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyP10(316-329)LysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrPll(319-333)HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuP12(322-335)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP13(326-339)ProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysP14(330-343)IleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuP15(335-349)ThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP16(336-349)GlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP17(340-353)ValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaP18(343-358)LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP19(344-358)TyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP20(348-360)AsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnP21(350-363)GlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluP22(354-367)AlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleP23(358-371)ValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleValTyrTyrValP24(364-377)ProLeuProIleValTyrTyrValGlyArgLysProLysValP25(368-381)ValTyrTyrValGlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerP26(372-385)GlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerAsnMetIleValP27(378-391)GluGlnLeuSerAsnMetIleValArgSerCysLysCysSer
圖4顯示了表6中的肽對(duì)TGFβ1活性的抑制作用。因?yàn)門(mén)GFβ1抑制MV-1-Lu細(xì)胞的生長(zhǎng)，肽對(duì)這些細(xì)胞因子的抑制作用導(dǎo)致重新實(shí)現(xiàn)MV-1-Lu細(xì)胞的生長(zhǎng)。
從圖4中可以看到，來(lái)源于TGFβ1序列的肽P12是一種對(duì)TGFβ1活性表現(xiàn)較高抑制作用。為了更詳細(xì)研究肽P12的抑制作用，進(jìn)行下列關(guān)于肽濃度對(duì)細(xì)胞因子抑制作用影響的研究，其在下面描述。肽P12對(duì)TGFβ1的抑制作用的劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究了肽P12的濃度對(duì)TGFβ1活性的抑制作用的影響。由于該肽不容易溶解于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，用肽的名義濃度(那將是如果肽完全溶解得到的濃度)制備儲(chǔ)備液或懸浮液，然后從中取等分液，過(guò)濾，或甚至直接用于抑制實(shí)驗(yàn)。
圖5考察了過(guò)濾前和過(guò)濾后，名義濃度的肽的抑制作用?？梢钥吹剑^(guò)濾或不過(guò)濾，肽P12實(shí)際上具有相同的活性。
得到肽P12的結(jié)果后，決定在N-末端和C-末端雙向延長(zhǎng)肽，研究對(duì)其活性的影響。另外，對(duì)其序列進(jìn)行改變，以改善其溶解性，并研究其序列中兩個(gè)半胱氨酸對(duì)TGFβ1抑制活性的重要性。表3中描述了合成的肽。表3.來(lái)源于對(duì)肽P12進(jìn)行修飾的肽肽 序列P12(322-335)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP28(322-344)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnLysValLeuAlaLeuTyrP29(313-335)HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP30 PheSerLeuGiyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP31 PheCysLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP32 PheSerLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP33 PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP34 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP35 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP36 GlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP37 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerP38 AspGlyProCysProTyrIleTrpSerAsp圖6顯示了表3中的肽對(duì)TGFβ1的抑制作用的結(jié)果。
從圖6中可以看到，肽P29是有活性的。該肽包括以前實(shí)驗(yàn)的肽P12，并在N-末端方向具有9個(gè)額外氨基酸(圖4)。按照Quian SW等((1992)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展896290-6294)和Brmester JK等((1993)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展908628-8632)的方法，應(yīng)用鑒定有上述細(xì)胞因子活性必須的TGFβ1區(qū)(成熟TGFβ1序列中的氨基酸40到82)的嵌合重組蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。推測(cè)肽P29(成熟TGFβ1序列中的氨基酸34到56)，其比肽P12(氨基酸43到56)延長(zhǎng)了一個(gè)較長(zhǎng)的區(qū)域，可能需要一種更類似環(huán)狀TGFβ1結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。由于這個(gè)原因，用肽P29基于親合性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)合細(xì)胞受體。肽P29對(duì)TGFβ1與其受體結(jié)合的抑制實(shí)驗(yàn)(親合性標(biāo)記)將來(lái)源于TGFβ1序列的肽P29用于親合性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，用于驗(yàn)證其抑制TGFβ1與其細(xì)胞受體結(jié)合的能力(材料和方法)。
由于應(yīng)用的125I-TGFβ1的不同批次的活性不同，該實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的肽的濃度按照各情況下使用的125I-TGFβ1批次的濃度調(diào)整。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖7和8中顯示。
進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以尋找阻斷125I-TGFβ1與細(xì)胞受體結(jié)合所需的最小濃度。來(lái)源于大鼠III型受體序列的肽對(duì)TGFβ1的抑制為了尋找抑制TGFβ1活性的新肽，合成了來(lái)源于大鼠III型受體的肽。在預(yù)測(cè)與TGFβ1序列的氨基酸序列模塊互補(bǔ)的序列區(qū)域基礎(chǔ)上選擇一些肽。期望這些肽將能夠結(jié)合游離TGFβ1，遮蔽它并防止它與細(xì)胞受體結(jié)合。
通過(guò)重疊10個(gè)氨基酸并覆蓋部分III型受體的胞外區(qū)(氨基酸45到410)合成另外一些肽。曾報(bào)道可溶性III型受體存在對(duì)應(yīng)的受體胞外區(qū)，將該區(qū)從膜上切下來(lái)，作為循環(huán)系統(tǒng)中TGFβ1的遮蔽劑(Lopez CasillasF.等(1991)細(xì)胞67785-795)。后來(lái)的研究描述了兩種結(jié)合TGFβ1的可能區(qū)域，一種定位在受體的N-末端(Lopez-Casillas等(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志124557-568)，另一種定位在C-末端側(cè)最靠近膜的區(qū)域(Fukushima D.等(1993)生物化學(xué)雜志26822710-22715；Pepin MC等(1995)FEBS Lett.377368-372)。由于上述原因，合成了這些受體的胞外區(qū)，猜測(cè)這些肽可能能夠遮蔽循環(huán)中的TGFβ1。
表4顯示了合成的肽。表4.來(lái)源于大鼠III型受體的肽。P39到P65是預(yù)測(cè)互補(bǔ)于TGFβ1的肽，P66到P138是覆蓋受體胞外區(qū)的重疊肽。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加一個(gè)丙氨酸，其在表中沒(méi)有顯示。肽序列P39(91-102)AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProP40(104-115)ValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpP41(109-120)SerProGlnProLauValTrpHisLeuLysThrGluP42(110-121)ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgP43(333-344)TrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP44(428-439)ProIleValProSerValGlnLeuLeuProAspHisP45(555-566)GlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAlaP46(363-574)LeuSerArgAlaGlyValValValPheAsnCysSerP47(603-614)LeuPheLeuValProSerProGlyValPheSerValP48(605-616)LeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGluP49(707-718)GluLeuThrLeuCysSerArgLysLysGlySerLeuP50(712-723)SerArgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCysP51(717-728)SerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAspP52(722-733)ArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeuP53(727-738)AspAspAlaCysThrSerLeuAspAlaThrMetIleP54(731-742)ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP55(732-743)SerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetGlnP56(737-748)MetIleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPheP57(742-752)MetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAlaP58(747-758)ThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnValP59(761-775)LysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProIleProProP60(766-780)SerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnIleP61(771-785)SerProIleProProProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspP62(776-790)ProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetP63(781-795)PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaP64(786-800)ThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaAlaPheValIleGlyP65(797-809)LeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrIleTyrSerHisP66(45-55)LeuMetGluSerPheThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyP67(50-64)ThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProP68(55-69)CysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluValHisValP69(60-74)ThrThrGlyLeuProArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerP70(65-79)ArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProP7l(70-84)LeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgP72(75-89)ThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisP73(80-94)GlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaP74(85-99)GluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisP75(90-104)LeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProIleValP76(95-109)SerValHisThrHisHisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerP77(100-114)HisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValP78(105-119)PheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrP79(110-124)ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaP80(115-129)TrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuP81(120-134)ArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlyP82(125-139)GlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlySerValValGlnP83(130-144)PheLeuValSerGluGlySerValValGlnPheProSerGlyAsnP84(135-149)GlySerValValGlnPheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaP85(140-154)PheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgP86(145-159)PheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluP87(150-164)GluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValP88(155-169)AsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysP89(160-174)AsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValP90(163-179)ArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluP91(170-184)GluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgP92(175-189)ThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysP93(190-194)LeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnP94(185-159)AsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnValPheProProThrP95(190-201)ValGlyGluAspGlnValPheProProThrCysAsnIleGlyLysP96(195-209)ValPheProProThrCysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuP97(200-214)CysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluP98(205-219)AsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysP99(210-224)AsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCysP100(215-229)TyrLeuGlnProLysAlaA1aGluGlyCysValLeuProSerGlnP101(220-234)AlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGlnProHisGluLysGluP102(225-239)ValLeuProSerGlnProHisGluLysGluValHisIleIleGluP103(230-244)ProHisGluLysGluValHisIleIleGluLeuIleThrProSerP104(235-249)ValHisIleIleGluLeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerP105(240-254)LeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspP110(265-279)AspProGluValValLysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysP11l(270-284)LysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpP112(275-289)IleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpValIleLysSerPheP113(210-294)LysSerValAsnTrpValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnP114(285-299)ValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnLeuLysValI1eAlaP115(250-304)AspValLysGlyAsnLeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyP106(245-259)SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIleP107(250-264)AlaPheGlnValAspIleIleValAspIleArgProAlaGlnGluP108(255-269)IleIleValAspIleArgProAlaGlnGluAspProGluValValP109(260-274)ArgProAlaGlnGluAspProGluValValLysAsnIeuValLeuPl16(295-309)LeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerP117(300-314)ProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrP118(305-319)PheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrMetThrLysLeuValP119(310-324)GluArgSerMetThrMetThrLysLeuValArgAspAspIleProP120(315-329)MetThrLysLeuValArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnP121(320-334)ArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaP122(325-339)SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrP123(330-344)LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP124(335-349)LeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerTyrThrMetAlaProP125(340-354)ArgProValThrSerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheP126(345-359)TyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGluP127(350-364)ValAlaAsnArgPheHisLeuArgLauGluAsnAsnGluGluMetP128(355-369)HisLeuArgLeuG1uAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValP129(360-374)AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThrIleProProP130(365-379)ArgAspGluGluValHisThrIleProProGluLeuArgIleLeuP131(370-384)HisThrIleProProGluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisP132(375-389)GluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisProProAlaLeuAspP133(380-394)LeuAspProAspHisProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProP134(385-399)ProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProGlyGluGlySerProP135(390-404)AsnProLeuPheProGlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProP136(395-409)G1yGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspP137(400-414)AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGlyP138(405-419)PheProPheProAspIleProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
實(shí)驗(yàn)了表4中的肽在MV-1-Lu細(xì)胞系抑制模型中阻斷TGFβ1的能力。因?yàn)門(mén)GFβ1能夠抑制該細(xì)胞系的生長(zhǎng)，肽對(duì)TGFβ1的抑制能夠使細(xì)胞重新開(kāi)始生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)在圖9到12中顯示。
如圖9到12所示，存在多種能夠較高或較低程度地抑制Mv-1-IU細(xì)胞系生長(zhǎng)的肽，但僅肽P54能夠幾乎完全地抑制TGFβ1的活性。為了對(duì)該肽進(jìn)行更完全的研究，對(duì)不同濃度的肽抗固定濃度為200pg/ml的TGFβ1，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。肽P54對(duì)TGFβ1抑制的劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)研究了肽P54的濃度對(duì)TGFβ1活性抑制作用的影響。由于該肽溶解性較低，制備名義濃度的肽儲(chǔ)備液，如同對(duì)肽P12進(jìn)行的同樣操作，從中取等分液，過(guò)濾，或者甚至直接用于抑制實(shí)驗(yàn)。
圖13考察了過(guò)濾前和過(guò)濾后，名義濃度的肽的抑制作用。可以看到在肽P54的濾液中沒(méi)有可檢測(cè)到的抑制活性。
驗(yàn)證了肽P54以應(yīng)用劑量依賴方式抑制TGFβ1活性的能力后，我們接著以P54序列為基礎(chǔ)合成了新肽，目的在于試圖改善溶解性并由此提高在較低劑量中的活性。還合成了兩種來(lái)源于人III型受體的肽。一種肽(P144)等價(jià)于肽P54。另一種肽(P145)類似于大鼠III型受體的肽P106，該肽也證明具有活性。這些新肽在表5中顯示。表5.來(lái)源于對(duì)肽P54進(jìn)行修飾的肽(肽P139-P143)，以及來(lái)源于人III型受體的肽(肽P144和P145)。肽 序列 來(lái)源P54(731-742)ThrSerLuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet大鼠III型受體P139 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpAspAspAspP140 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP141 AspAlaThrMetIleTrpAspP142 ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMetP143 ThrSerLeuAspAlaThrThrMetMetP144(729-742)TnrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMet人III型受體GlnAsnP145(241-254)SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThr人III型受體IleAsp表5中的肽的活性實(shí)驗(yàn)在圖14中顯示。肽P144對(duì)TGFβ1抑制作用的劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)用來(lái)源于人III型受體序列的肽P144進(jìn)行劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)，目的在于實(shí)驗(yàn)其活性是否依賴于濃度(圖15)?？梢钥吹?，肽的活性隨著實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的肽濃度的降低而降低。肽P144對(duì)TGFβ1與其受體結(jié)合的抑制實(shí)驗(yàn)(親合性標(biāo)記)在親合標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用來(lái)源于人III型受體序列的肽P144，用于驗(yàn)證其抑制TGFβ1與TGFβ1的細(xì)胞受體結(jié)合的能力(材料和方法)。
由于使用的不同批次的125I-TGFβ1的活性不同，該實(shí)驗(yàn)中使用的肽的濃度按照每種情況下使用的125I-TGFβ1批次的濃度調(diào)整。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖15中顯示。
當(dāng)驗(yàn)證了肽P144抑制TGFβ1與其細(xì)胞受體結(jié)合后，進(jìn)行新的實(shí)驗(yàn)以確定肽P144的濃度。觀察到當(dāng)肽的濃度為125I-TGFβ1的分子濃度的2×105倍時(shí)，該肽喪失了其活性。來(lái)源于能夠結(jié)合TGFβ1的其它蛋白質(zhì)并預(yù)測(cè)互補(bǔ)于TGFβ1的肽的抑制作用在該部分中合成了表6中的肽，它們來(lái)源于能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)。表6.來(lái)源于各種能夠結(jié)合TGFβ1的蛋白質(zhì)(II型受體P146，胎球蛋白P147至P149，endoglin P150至P154和α2-巨球蛋白P155至P179)的肽。顯示了肽的數(shù)目，其在完整序列中的位置，其氨基酸序列以及其來(lái)源。為了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一個(gè)丙氨酸，其未在表中顯示。肽 序列 來(lái)源P146(84-102)CysValAlaValTrpArgLysAsnAspGluAsnIleThr II型受體LeuGluThrValCysP147(114-322)CysAspPheGlnLeuLeuLysLeuAspGlyLysPheSer FetuinValValTyrAlaLysCysP149(114-122)CysAspPheHisIleLeuLysGlnAspGlyGlnPheArg FetuinValCysHisAlaGlnCysP149(114-132)CysAspIleHisValLeuLysGlnAspGlyPheSerVal FetuinLeuPheThrLysCysAspP150(247-261)GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSer EndoglinTrpLeuP151(289-393)ValAsnLeuProAspThrArgGlnGlyLeuLeuGluGlu EndoglinAlaArgP152(445-459)LeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSer EndoglinProHisP153(482-495)ProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAspSerCys EndoglinGlnLeuP154(479-493)MetSerProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAsp EndoglinSerCysP155(22-24)LeuLeuLeuLeuValLeuLeuProThrAspAlaSerα-2-巨球蛋白P156(20-31)ProThrAspAlaSerValSerGlyLysProGlnTyrα-2-巨球蛋白P157(44-53)ThrGluLysGlyCysValLeuLeuSerTyrLeuAsnα-2-巨球蛋白P158(166-177)TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGlnα-2-巨球蛋白P158(166-177)TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGlnα-2-巨球蛋白P159(193-283)PheProLeuSerSerGluProPheGlnGlySerTyrα-2-巨球蛋白P160(247-258)AsnValserValCy5GlyLeuTyrThrTyrGlyLysα-2-巨球蛋白P161(244-259)ValSerValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysProα-2-巨球蛋白P162(250-261)ValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysProValProα-2-巨球蛋白P163(267-278)SerIleCysArgLysTyrSerAspAlaSerAspCysα-2-巨球蛋白P164(469-480)ProCysGlyHisThrGlnThrValGlnAlaHisTyrα-2-巨球蛋白P165(554-565)AspSerAlaLysTyrAspValGluAsnCysLeuAlaα-2-巨球蛋白P167(730-801)GlnProPhePheValGluLeuThrMetProTyrSerα-2-巨球蛋白P168(827-838)GlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAlaValProα-2-巨球蛋白P169(835-816)SerValGlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAlaα-2-巨球蛋白P170(876-887)AlaLeuGluSerGlnGluLeuCysGlyThrGluValα-2-巨球蛋白P171(1081-1012)LysSerLysIleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyr α-2-巨球蛋白P172(1085-1016)IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeuα-2-巨球蛋白P173(1062-1073)LysArgLysGluValLeuLysSerLeuAsnGluGluα-2-巨球蛋白P174(1193-1204)ValGlyHisPheTyrGluProGlnAlaProSerAlaα-2-巨球蛋白P175(2209-1220)ThrSerTyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAlaα-2-巨球蛋白Pl76(1211-1222)TyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrAlaGlnProAlaα-2-巨球蛋白P177(1256-1167)ValAlaLeuHisAlaLeuSerLysTyrGlyAlaAlaα-2-巨球蛋白P178(1232-1243)TyrG1yArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaα-2-巨球蛋白Pl79(1234-1245)ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaPheValα-2-巨球蛋白圖17和18顯示了來(lái)源于表10的肽的抑制活性。
如圖17和18所示，僅肽P150顯示了高于50％的活性。然而，對(duì)于肽P146和P149，Demetriou M等((1996)生物化學(xué)雜志27112755-12761)報(bào)道具有活性，但在該實(shí)驗(yàn)使用的條件下沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活性。合成肽對(duì)TGFβ1與其細(xì)胞受體結(jié)合的抑制作用的流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)測(cè)定通過(guò)流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)測(cè)定來(lái)源于前面合成過(guò)程的肽，包括從TGFβ1序列和從III型受體序列合成的肽，測(cè)定它們抑制TGFβ1與其細(xì)胞受體結(jié)合的能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與肽保溫，然后加入TGFβ1-生物素，其將用抗生物素蛋白-FITC檢測(cè)到(材料和方法)。然后測(cè)定抗生物素蛋白-FITC發(fā)散的熒光它將與結(jié)合到細(xì)胞上的TGFβ1的量成正比，而與肽的活性成反比。最相關(guān)肽得到結(jié)果在圖19和表7中顯示。表7.通過(guò)抑制MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)1的生物分析測(cè)定(肽濃度200μg/ml)和應(yīng)用流動(dòng)細(xì)胞記數(shù)2測(cè)定抑制TGFβ1與其細(xì)胞受體結(jié)合(肽濃度420μg/ml)，比較了一些肽的TGFβ1的抑制活性。肽生物檢測(cè) 細(xì)胞記數(shù)序列(％抑制率)1(％抑制率)2P29 77.6 92.34 HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP11 40 86HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuP12 96 77PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP18 18.2 6.5 LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP54 97 82.3 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP140 -1.7 69.8 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP142 70 72ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMetP106 40 91SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIleP145 21 74.35 SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThrIleAspP144 88 80ThrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMetGlnAsnP150 64 73GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSerTrpP152 45 68.4LeuLeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSerProHisTGFβ1活性的體內(nèi)抑制已經(jīng)證明在抑制MV-1-Lu細(xì)胞系生長(zhǎng)的生物檢測(cè)中具有活性的、來(lái)源于人III型受體的序列的肽P144，應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，用于研究其在大鼠模型中對(duì)CCl4誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)硬化的抑制作用。Wistar大鼠的硬化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谠撃Ｐ椭校ㄟ^(guò)吸入四氯化碳11周，每周兩次，誘導(dǎo)肝硬化(LopezNovas JM等(1976) Patologia IX223-240；Camps J.等(1987)胃腸病學(xué)93498-505)，如材料和方法中描述的那樣。
按照兩種方案施用肽P1441.方案1在硬化誘導(dǎo)過(guò)程中(11周)，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑每隔一天施用肽一次。圖20和21。2.方案2當(dāng)出現(xiàn)硬化時(shí)，即從開(kāi)始誘導(dǎo)硬化的第12周開(kāi)始，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑每隔一天施用肽一次，連續(xù)3周。圖22和23。
通過(guò)兩種方法測(cè)定兩種方案中產(chǎn)生的膠原蛋白。
圖36和38顯示了產(chǎn)生的總膠原，通過(guò)染色的肝切片(每只動(dòng)物兩個(gè)切片)，用East Green和Direct Red測(cè)定顏色的洗脫，在分光光度計(jì)上讀數(shù)(材料和方法)(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)(Histochem.Cytochem.)33737-743；Gaudio E.等(1993)國(guó)際實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志(Int.J.Exp.Path)74463-469)。
圖21和23顯示了產(chǎn)生的膠原，通過(guò)對(duì)天狼紅染色的肝切片用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行的圖像分析測(cè)定(材料和方法)。
如圖20所示，當(dāng)研究膠原蛋白與總蛋白的比率時(shí)，在用肽P144處理的大鼠組(Tto1)和硬化大鼠的對(duì)照組(Ci1)之間，觀察到顯著差異(P＜0.05)。在圖37中，當(dāng)研究纖維化面積時(shí)，肽P144處理大鼠組(Tto1)和硬化大鼠的對(duì)照組(Ci1)之間的差異也是顯著的(P＜0.001)。
如圖22和23所示，它們顯示了出現(xiàn)硬化后處理大鼠的結(jié)果，當(dāng)用兩種測(cè)定纖維化方法中的任何一種，肽P144處理的大鼠組(Tto2)和硬化大鼠的對(duì)照組(Ci2)之間的差異都是不顯著的。
用線性回歸比較了這兩種測(cè)定膠原的方法，目的在于驗(yàn)證各制備過(guò)程中選擇的研究視野的隨機(jī)性，由此證明圖像分析的有效性，圖24和25。
如圖24和25所示，兩種方法之間存在相關(guān)性，兩種情況下，均R＞0.85，它們是高度顯著的(F≤0.001)。這證明用于研究的圖像的精確性完全隨機(jī)實(shí)現(xiàn)，因此證明圖像分析得到的數(shù)據(jù)的有效性。
圖26和27顯示了從天狼紅染色的肝切片(從硬化誘導(dǎo)過(guò)程中處理大鼠(Ci1和Tto1)的肝得到)的光學(xué)顯微鏡得到的圖像，10X放大倍數(shù)。
圖26中的圖像由沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何類型的濾光片得到。
圖27顯示了應(yīng)用特殊軟件為研究而修飾后的圖像。這些修飾包括應(yīng)用兩種濾光片，一個(gè)是偏振光的，另一個(gè)是綠光的，目的為了改善圖像的質(zhì)量，有助于它們的自動(dòng)檢查。
圖26和27表明，在從硬化大鼠(Ci1)得到的圖像和從肽P144處理大鼠(Tto1)得到的圖像之間存在差異。
方案1和2之間有效性的差異可能由于CCl4誘導(dǎo)出現(xiàn)硬化后(方案2)比CCl4誘導(dǎo)硬化過(guò)程中(方案1)可能產(chǎn)生較少的TGFβ1，甚至可能在正常水平所致，因此在方案2中比在方案1中用肽P144處理產(chǎn)生的效果將不顯著。
當(dāng)我們比較硬化誘導(dǎo)過(guò)程結(jié)束時(shí)的未處理大鼠組(Ci1)和誘導(dǎo)結(jié)束后第4周未處理的硬化大鼠組(Ci2)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)兩組之間存在顯著差異(P＝0.016)(圖28)，這表明當(dāng)硬化物質(zhì)除去后，硬化的部分衰退，多位作者公開(kāi)了這一觀察結(jié)果(Szende-B等(1992)體外(In Vivo)6355-361；Columbano A(1996)癌發(fā)生(Carcinogenesis)17395-400)。
兩種方案之間上述有效性的差異也可能由于方案自身，因?yàn)榉桨?的動(dòng)物僅隔天處理一次，處理3周，而方案1的動(dòng)物處理了較長(zhǎng)時(shí)間(7周，同樣隔天處理一次)。
得到的結(jié)果證明，來(lái)源于不同蛋白質(zhì)的合成肽在體外和體內(nèi)均可能抑制TGFβ1。將來(lái)可能更多關(guān)注于試圖增加這些肽的生物活性。這可以通過(guò)將這些序列的各氨基酸由另外19個(gè)系統(tǒng)取代而實(shí)現(xiàn)。一旦發(fā)現(xiàn)具有較高活性的肽，將必須制備模擬型(mimotope)(McConnell-SJ(1994)基因(gene)151115-118；Steward-MW(1995)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)697668-7673)，其目的在于增加生物體中抑制物質(zhì)的平均壽命。
圖2.CCl4誘導(dǎo)硬化過(guò)程的示意圖。黑箭頭顯示施用給大鼠的CCl4兩周劑量，黑色虛線箭頭表示一周劑量?；疑^表示施用肽P144。A健康對(duì)照；B健康對(duì)照+P144，B1肽70μg/天；C硬化；C1生理鹽水；C2為肽70μg/天；DCCl4+苯巴比妥誘導(dǎo)硬化；D1加鹽水；D2加肽70μg/天。
圖3.TGFβ1對(duì)MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在指示的TGFβ1濃度(pg/ml)下培養(yǎng)，橫坐標(biāo)TGFβ1濃度(pg/ml)；縱坐標(biāo)c.p.m.。
圖4.來(lái)自TGFβ1的肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。對(duì)TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)MV-1-Lu細(xì)胞的生長(zhǎng)。
圖5.在存在各種名義濃度的肽P12時(shí)，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，過(guò)濾(◆)和未過(guò)濾(●)。
圖6.來(lái)自TGFβ1的肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。對(duì)TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)MV-1-Lu細(xì)胞的生長(zhǎng)。
圖7.TGFβ1受體的親和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的放射能照相。C1道細(xì)胞與濃度為0.16μM相應(yīng)于0.3μCi活性的125I-TGFβ1(陽(yáng)性對(duì)照)共同培養(yǎng)的效果。C2道細(xì)胞與濃度10倍于125I-TGFβ1的非-放射性TGFβ1(陰性對(duì)照)預(yù)培養(yǎng)的效果。C3道與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高106倍濃度的肽P29預(yù)培養(yǎng)的效果?？梢钥吹?，肽P29和非-放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1與I、II和II型細(xì)胞受體的結(jié)合。
圖8.TGFβ1受體的親合標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的放射能照相。C1到C6道MV-1-Lu細(xì)胞與不同濃度的肽P29(分別為125I-TGFβ1分子濃度的106、8×105、6×105、4×105、2×105、和105倍)預(yù)培養(yǎng)，之后加入125I-TGFβ1的效果。道C7MV-1-Lu細(xì)胞與未標(biāo)記的TGFβ1(125I-TGFβ1分子濃度的102)預(yù)培養(yǎng)，之后加入125I-TGFβ1的效果(陰性對(duì)照)。C8道MV-1-Lu細(xì)胞與濃度為0.42μM125I-TGFβ1，相應(yīng)于0.4μCi活性共培養(yǎng)，而沒(méi)有之前的預(yù)培養(yǎng)的效果(陽(yáng)性對(duì)照)。
圖9.預(yù)測(cè)與TGFβ1區(qū)域互補(bǔ)的受體肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖10.來(lái)源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖11.來(lái)源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖12.來(lái)源于III型受體胞外區(qū)的重疊肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖13.在存在不同名義濃度的肽P54時(shí)，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，過(guò)濾(◆)和未過(guò)濾(●)。
圖14.來(lái)源于對(duì)肽P54修飾的受體肽(P139-P143)和來(lái)源于人III型受體的肽(P144和P145)對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖15.在存在不同名義濃度的肽P144而未過(guò)濾時(shí)，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率。
圖16.TGFβ1受體的親合標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的放射能照相。C1道與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高106倍的肽P144進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。C2和C3道細(xì)胞與濃度比125I-TGFβ1的分子濃度高10倍濃度的非放射性TGFβ1預(yù)培養(yǎng)的效果(陰性對(duì)照)。C4和C5道細(xì)胞與濃度為0.1μM，相應(yīng)于0.2μCi活性的125I-TGFβ1共培養(yǎng)的效果(陽(yáng)性對(duì)照)?？梢钥吹诫腜144和非放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1與細(xì)胞受體的結(jié)合。
圖17.來(lái)源于人II型受體的肽(P146)、來(lái)源于胎球蛋白的肽(P147-149)和來(lái)源于endoglin的肽(P150-P154)對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖18.來(lái)源于α2-巨球蛋白的肽對(duì)TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的濃度實(shí)驗(yàn)。TGFβ1的100％抑制對(duì)應(yīng)無(wú)TGFβ1時(shí)獲得的MV-1-Lu細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖19.各種合成肽對(duì)TGFβ1與MV-1-Lu細(xì)胞結(jié)合的百分抑制率。對(duì)于各肽，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞(發(fā)散熒光)和未標(biāo)記細(xì)胞(未發(fā)散熒光)的百分率研究抑制。
圖20.在用CCl4誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性硬化過(guò)程中，施用肽P144對(duì)膠原合成的影響?？v坐標(biāo)顯示了膠原蛋白與總蛋白的比率。橫坐標(biāo)顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto1＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化并在該過(guò)程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖21.在CCl4誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性硬化過(guò)程中，施用肽P144對(duì)膠原合成的影響?？v坐標(biāo)顯示了天狼紅染色的組織切片中纖維化面積與總面積的比率。橫坐標(biāo)顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto1＝接受CCI4誘導(dǎo)硬化并在該過(guò)程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖22.用CCl4誘導(dǎo)硬化后，施用肽P144對(duì)膠原合成的影響?？v坐標(biāo)顯示了膠原蛋白與總蛋白的比率。橫坐標(biāo)顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化并在該過(guò)程結(jié)束時(shí)，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖23.用CCl4誘導(dǎo)硬化后，施用肽P144對(duì)膠原合成的影響?？v坐標(biāo)顯示了組織切片中纖維化面積與總面積的比率。橫坐標(biāo)顯示了大鼠的各不同組Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144處理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化并在該過(guò)程結(jié)束時(shí)，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4誘導(dǎo)硬化11周，并且不用肽P144處理的大鼠。
圖24.通過(guò)應(yīng)用的兩種方法得到的膠原蛋白量和纖維化面積的數(shù)據(jù)的比較。橫坐標(biāo)表示通過(guò)圖像分析得到的纖維化面積與總面積的比值。縱坐標(biāo)表示通過(guò)Direct Red和Fast Green染色的肝臟切片的分光光度計(jì)分析得到的膠原量(μg)與總蛋白(mg)的比值。顯示了R2(F≤0.001)。
圖25.在方案2結(jié)束時(shí)，使用兩種考察樣品的方法得到的膠原量和纖維化面積的數(shù)據(jù)比較。橫坐標(biāo)表示通過(guò)圖像分析得到的纖維化面積與總面積的比值?？v坐標(biāo)表示通過(guò)Direct Red和Fast Green染色的肝臟切片的分光光度計(jì)分析得到的膠原量(μg)與總蛋白(mg)的比值。顯示了R2(F≤0.001)。
圖26.通過(guò)用光學(xué)顯微鏡(10X)對(duì)天狼紅染色的大鼠肝臟切片觀察得到24個(gè)代表性視野的圖像。CCl4誘導(dǎo)硬化結(jié)束時(shí)的硬化大鼠(Ci1)和CCl4誘導(dǎo)硬化過(guò)程中用肽P144處理的硬化大鼠(Tto1)。不同視野取自從各動(dòng)物得到的切片(R＝大鼠，C＝視野)。
圖27.通過(guò)用光學(xué)顯微鏡(10X)對(duì)天狼紅染色的大鼠肝臟切片觀察得到24個(gè)代表性視野的圖像。CCl4誘導(dǎo)硬化結(jié)束時(shí)的硬化大鼠(Ci1)和CCl4誘導(dǎo)硬化過(guò)程中用肽P144處理的硬化大鼠(Tto1)。不同視野取自從各動(dòng)物得到的切片(R＝大鼠，C＝視野)。使用了偏振光和綠光濾光片，以便顯露出膠原纖維。
圖28.兩組未處理的硬化大鼠之間的比較。Ci1是在CCl4誘導(dǎo)硬化的12周末的硬化大鼠，Ci2是誘導(dǎo)硬化過(guò)程結(jié)束后4周的硬化大鼠。P＝0.016?？v坐標(biāo)纖維化面積/總面積。序列表<110>納瓦拉公司科學(xué)與技術(shù)研究所<120>TGFβ1-抑肽<160>10<210>SEQ IN NO1<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來(lái)源于TGFβ1，319-333位<400>His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp5 10Ser Leu15<210>SEQ IN NO2<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來(lái)源于TGFβ1，322-335位<400>Phe Cys Leu Gly Pro Cys pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp5 10Thr<210>SEQIN NO3<211>12<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>推測(cè)與TGFβ1，731-742位互補(bǔ)<400>Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met5 10<210>SEQ IN NO4<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>與大鼠III型受體的胞外區(qū)，245-259位重疊<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val5 l0Asp Ile15<210>SEQ IN NO5<211>9<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>推測(cè)與TGFβ1，731-742位互補(bǔ)的修飾P54<400>Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met5<210>SEQ IN NO6<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來(lái)源于修飾的人III型受體，729-742位<400>Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln5 10Asn<210>SEQ IN NO7<211>14<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>來(lái)源于修飾的人III型受體，241-254位<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile5 10Asp<210>SEQ IN NO8<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>endoglin的247-261位<400>Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser5 10Trp Leu15<210>SEQ IN NO9<211>15<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>endoglin的445-459位<400>Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser5 10Pro His15<210>SEQ IN NO10<211>23<212>肽<213>人工序列<220>結(jié)構(gòu)域<223>TGFβ1的322-335位的修飾P12<400>His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly5 10Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr15 20
權(quán)利要求
1.一種作為體內(nèi)TGFβ1與其受體結(jié)合的拮抗劑的肽，其特征在于，它們具有部分等同于或類似于TGFβ1本身和/或其受體的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
3.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
5.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO5的氨基酸序列。
7.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
8.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO7的氨基酸序列。
9.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO8的氨基酸序列。
10.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO9的氨基酸序列。
11.按照權(quán)利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO10的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1-11之一的活性肽的模擬型(mimotope)，特征在于它們表現(xiàn)類似于權(quán)利要求1-11活性肽的拮抗作用，但比后者在體內(nèi)具有更長(zhǎng)的平均壽命。
13.一種應(yīng)用至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽和/或至少一種它們的模擬型生產(chǎn)應(yīng)用于肝臟疾病的組合物的方法。
14.一種應(yīng)用至少一種編碼至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽的DNA生產(chǎn)應(yīng)用于肝臟疾病的組合物的方法，任選包括至少一種所述活性肽的模擬型。
15.一種應(yīng)用至少一種編碼至少一種權(quán)利要求1-11的活性肽的重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)應(yīng)用于肝臟疾病的組合物的方法，任選包括至少一種所述活性肽的模擬型。
16.按照權(quán)利要求15的方法，特征在于所述重組表達(dá)系統(tǒng)是一種缺陷型腺病毒。
17.按照權(quán)利要求15的方法，特征在于所述重組表達(dá)系統(tǒng)是一種質(zhì)粒。
18.按照權(quán)利要求13-17的方法應(yīng)用于肝纖維化。
全文摘要
從生物體中的TGFβ1或從其受體得到的拮抗性合成肽,它們能夠即可以以它們自身,也可以以編碼它們的基因序列和表達(dá)它們的重組系統(tǒng),用于生產(chǎn)用于治療肝臟疾病,更具體地說(shuō)是纖維化的組合物。所述組合物能夠任選地包括所述活性肽的模擬型(mimotope)。
文檔編號(hào)C07K14/71GK1328569SQ9981361
公開(kāi)日2001年12月26日 申請(qǐng)日期1999年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月24日
發(fā)明者伊格納西奧·何塞·埃斯克羅·薩恩斯, 胡安·何塞·拉薩爾特·薩加斯蒂韋爾薩, 赫蘇斯·普列托·巴爾圖埃納, 弗朗西斯科·博拉斯·奎斯塔 申請(qǐng)人:納瓦拉公司科學(xué)與技術(shù)研究所