專利名稱：脫髓鞘病或海綿狀病的診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物和人脫髓鞘疾病和海綿狀腦病的診斷，尤其涉及人BSE以及類似或相關(guān)疾病的診斷。
在我們共同申請待審的國際申請WO97/02667中，我們公開了一種新的哺乳動物海綿狀腦病和其它脫髓鞘病癥的診斷實驗。公開于我們在先申請中的上述實驗基于一種適用于在人和其他動物中出現(xiàn)的多種形式的病理狀況的發(fā)生模型。對于牛海綿狀疾病，該模型提供了一種對基于形成蛋白感染素的目前理論的替換。簡單地說，該新模型基于分子模擬現(xiàn)象，按照該模型，哺乳動物接觸某些具有模擬髓磷脂肽序列的細菌后，會產(chǎn)生一種自動免疫反應(yīng)。在涉及產(chǎn)生自動免疫反應(yīng)的細菌中，最重要的是不動桿菌種，尤其是乙酸鈣不動桿菌。基于這種新模型的該診斷實驗開發(fā)了早期治療這類感染的可能性，例如，通過應(yīng)用一種適當(dāng)?shù)目股胤乐惯M一步的自動-免疫攻擊動物自身髓磷脂。
在我們的國際申請WO99/47932種，我們已經(jīng)確證在患多發(fā)性硬化(MS)和Creutzfeld-Jacob癥(CJD)的患者血清中不動桿菌IgA抗體水平升高。
在我們的在先申請UK 9825948.4中，我們描述了進一步實驗，該實驗確證在死于BSE的牛血清中存在抗牛髓磷脂和抗牛髓磷脂神經(jīng)微絲的抗體。這些抗體屬于IgA型。在患MS和CJD的患者血清中也得到相似結(jié)果。這些結(jié)果證實了上述模型的有效性，并可得出這樣的結(jié)論，即我們發(fā)現(xiàn)了在脊椎動物包括人和其它例如家畜飼養(yǎng)場中的家畜中發(fā)生或可能發(fā)生的相似疾病的起源的通用模型。我們的最近研究結(jié)果還提供了早期證實這些疾病，尤其是牛初始BSE的進一步實驗基礎(chǔ)。這些進一步的實驗可以是對基于檢測針對不動桿菌種，例如乙酸鈣不動桿菌的IgA抗體實驗的替代或補充。
本發(fā)明因此包括診斷脊椎動物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病，包括BSE、MS和CJD的方法，其包括分析生物樣品中的抗體，尤其是IgA抗體，該抗體結(jié)合髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或其抗原(免疫原)部分，包括下文說明的肽成分。
本發(fā)明優(yōu)選包括分析針對脊椎動物例如?；蛉祟愃枇字?或髓磷脂神經(jīng)微絲的抗體。然而，可以選擇使用來自其它物種的、經(jīng)評價與結(jié)合抗體的?；蛉祟惖乃枇字退枇字窠?jīng)微絲具有足夠同源性的那些髓磷脂和髓磷脂神經(jīng)微絲。
在實施該方法中，陽性結(jié)果表示抗體水平在對照樣品的抗體水平之上至少約兩個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本發(fā)明還包括一種檢測脊椎動物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病的診斷試劑盒，包括例如實驗抗原、髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲或其抗原(免疫原)部分。
前面描述方法中使用的實驗抗原和診斷試劑盒可以是髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲的肽成分，例如具有序列ID Nos1-8的下列序列之一，即，1.NEALEK2.LKKVHEE3.EALEKQL4.ELEDKQN5.EALEKQL 6.KKVHEE 7.EIRDLR 8.EQEIRDLR上述序列已經(jīng)從蛋白質(zhì)信息資源(Protein Information Resource)數(shù)據(jù)庫中提取出來，釋放號為44。
由于IgA抗體在免疫反應(yīng)中的較高特異性，可以得出這樣的結(jié)論，即不動桿菌感染機制是經(jīng)機體粘膜途徑，原始部位為腸道或鼻腔?？赡鼙乔皇歉腥静课?，由于吸入由干燥污水或動物糞便形成的攜帶不動桿菌的灰塵導(dǎo)致。該機制提示有必要改善家畜飼養(yǎng)工作中的衛(wèi)生狀況。實驗對前面提到的生物體的分析在前面提到的我們共同申請待審的申請中描述，因此其內(nèi)容被參考插入本文。用髓磷脂蛋白或神經(jīng)微絲作為實驗抗原進行的類似分析程序如下描述。ELISA實驗(1)吸取200ul抗原懸浮液A或B，置于96孔平底硬聚苯乙烯微滴板中在4℃下過夜。(抗原A是牛髓磷脂，來自Sigma Chemical Company，F(xiàn)ancy Road，Poole，Dorset，BH12 4XA，UK，濃度為5ug/ml，抗原B是牛神經(jīng)微絲，同樣來自Sigma，濃度為5ug/ml)。(2)然后用含0.1％(v/v)Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3次。(3)向各孔中加入300ul在PBS中的封閉液(0.2％w/v卵清蛋白，0.1％v/v Tween)，然后在37℃保溫1小時。(4)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(5)取200ul血清樣品(實驗或?qū)φ?用PBS以1/200的比例稀釋。加入Tween，然后在37℃保溫2小時。(6)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(7)取200ul結(jié)合兔抗-牛IgA(alpha鏈)的過氧化物酶用PBS以1/4000的比例稀釋。(8)然后用PBS.Tween 20沖洗平板三次。(9)每孔加入200ul 0.5mg/ml(2，2’-連氮雙(3-乙基芐-噻唑啉-6-磺酸)的含0.98mM過氧化氫的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.1)，在室溫下保持20分鐘，形成比色分析的顏色。(10)然后用100ul 2mg/ml氟化鈉中止反應(yīng)，用微量-ELISA平板讀數(shù)儀在波長630nm處測定光密度。(11)所有分析均在編號的情況下進行，以便實驗者清楚進行研究的血清的來源(實驗或?qū)φ?。(12)所有實驗進行兩次。
上述實驗程序可以應(yīng)用人髓磷脂或髓磷脂神經(jīng)微絲或來源于它們的肽以同樣方式進行。
該分析是診斷患牛海綿狀腦病的牛和患MS和CJD的人的新方法，其中描述了一個能夠測定?；蛉搜逯锌箖煞N腦抗原的抗體的實驗。任何比健康對照高出2個標(biāo)準(zhǔn)偏差的讀數(shù)表示為陽性反應(yīng)。而且，實驗對于兩種抗原(A)牛髓磷脂蛋白和(B)牛神經(jīng)微絲將都是陽性的(高2個標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
這是描述測定BSE感染牛和患MS和CJD患者中，抗腦抗原的自動抗體的的首次分析。
對于BSE的結(jié)果在附

圖1和2中顯示。
對于MS和CJD的結(jié)果在附圖3中顯示。
在我們的前面提到的國際申請中描述的實驗可以與本發(fā)明的實驗組合起來。該組合實驗特別適用于檢測BSE的應(yīng)用。該組合實驗也可以被稱為“MAN實驗”，其基于抗牛髓磷脂(腦白質(zhì))和抗牛神經(jīng)微絲(腦灰質(zhì))的自動抗體以及抗腐生細菌乙酸鈣不動桿菌的特定抗體的分別測定。
抗牛髓磷脂和牛神經(jīng)微絲的自動抗體和抗不動桿菌的抗體按照以前描述的方法，針對各實驗動物測定。然后按照下列運算法則，通過乘光密度得到MAN指數(shù)＝髓磷脂IgA自動抗體x不動桿菌抗體x神經(jīng)微絲自動抗體，即M×A×N的乘積。
附圖4顯示了該實驗與健康“生物體”對照或患其他疾病的對照(CVL)(CVL＝中心脊椎動物實驗室(Central Veterinary Laboratory，UK，從那兒得到患其他疾病的動物血清)比較之后的結(jié)果。
MAN實驗針對“生物體”大田對照校準(zhǔn)，所述對照是來自飼料僅由青草和干草構(gòu)成的大田動物。MAN實驗是一種經(jīng)驗性實驗，如果僅實驗健康牛，得到非常低的MAN指數(shù)值。
當(dāng)實驗懷疑有BSE的牛血清時，當(dāng)MAN指數(shù)比對照值高3個標(biāo)準(zhǔn)偏差時，認定為陽性反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種診斷脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病，包括BSE，MS和CJD的方法，該方法包括分析生物樣品中結(jié)合髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或結(jié)合一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲的抗原(免疫原)部分的抗體。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中抗體是IgA抗體。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中分析是針對結(jié)合脊椎動物髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲或其部分的抗體。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中脊椎動物是?；蛉?。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中實驗抗原是選自具有上文中說明的序列ID Nos.1-8的序列的一種肽。
6.按照權(quán)利要求1-5之一的方法，其中陽性結(jié)果表示抗體水平比對照樣品的抗體水平至少高約兩個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
7.一種權(quán)利要求1-6之一的方法與分析抗不動桿菌種抗體的方法組合的方法。
8.一種檢測脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病的診斷試劑盒，包括作為實驗抗原的髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲和/或一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經(jīng)微絲的一部分。
9.按照權(quán)利要求8的診斷試劑盒，其中實驗抗原是一種具有選自上文說明的序列ID Nos.1-8序列的肽。
10.按照權(quán)利要求8或9的診斷試劑盒，其中含有作為實驗抗原的髓磷脂、髓磷脂神經(jīng)微絲、和乙酸鈣不動桿菌。
全文摘要
一種診斷脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病,包括BSE、MS和CJD的方法,該方法包括分析生物樣品中結(jié)合髓磷脂和/或神經(jīng)微絲或結(jié)合一種或多種其抗原(免疫原)部分的抗體。
文檔編號C07K14/435GK1338053SQ9981369
公開日2002年2月27日 申請日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月26日
發(fā)明者艾倫·埃布林格 申請人:倫敦皇家學(xué)院