專利名稱：化合物及其用于治療糖尿病并發(fā)癥的用途的制作方法
按照35U.S.C.§202(c)，特此聲明美國政府在本文所公開的發(fā)明中擁有一定權(quán)益，本發(fā)明得到國立衛(wèi)生院基金部分支持(支助號(hào)DK44050、DK50317和DK50364)。
存在4種特別嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，即糖尿病腎病、因?yàn)槠茐囊暰W(wǎng)膜致盲的糖尿病視網(wǎng)膜病變、涉及外周神經(jīng)功能喪失的糖尿病神經(jīng)病變和因?yàn)槊?xì)血管損傷引起的循環(huán)障礙。視網(wǎng)膜病變和腎病均被認(rèn)為是與該病病情有關(guān)的全身性循環(huán)障礙的組成部分。最近綜述了微血管紊亂在晚期糖尿病中的作用(Tooke，Diatetes，44721(1995))。在本發(fā)明整個(gè)公開內(nèi)容中，術(shù)語“糖尿病相關(guān)性病癥(diabetes-associatedpathologic conditions)”和同義術(shù)語意指包括各種周知的視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎病、大血管病變以及其它糖尿病并發(fā)癥。
關(guān)于糖尿病引起的病理和衰老引起的病理的相似性已有非常廣泛的報(bào)道。研究表明，許多糖尿病相關(guān)性病癥在臨床上非常類似于衰老通常引起的病理變化。例如已經(jīng)證實(shí)糖尿病患者動(dòng)脈和關(guān)節(jié)過早僵硬、肺彈性和肺活量過早降低。此外，與年齡相當(dāng)?shù)姆翘悄虿€(gè)體相比，糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞和中風(fēng)的頻率更高。糖尿病也更容易感染，而且與非糖尿病個(gè)體相比，在更年輕的年齡就可能發(fā)生高血壓、骨丟失加速、骨關(guān)節(jié)炎和T細(xì)胞功能損傷。
糖尿病相關(guān)性病癥和衰老的相似性似乎提示，它們存在共同機(jī)理(mechanistic rationale)。作為糖尿病相關(guān)性病癥和衰老的共同生化基礎(chǔ)，已經(jīng)提出了各種機(jī)制。人類受試對(duì)象資料最強(qiáng)有力支持的假說以非酶性糖基化機(jī)制為前提。該假說提出，衰老過程和糖尿病相關(guān)性病癥如上述病癥至少部分是因?yàn)槠咸烟呛推咸烟茄苌拇x物通過Maillard反應(yīng)進(jìn)行的蛋白質(zhì)修飾和交聯(lián)引起的(Monnier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81583(1984)和Lee等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，123888(1984))。因?yàn)檫@樣的糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的修飾蛋白本文稱為高級(jí)糖化終末產(chǎn)物-修飾蛋白(AGE-蛋白)。廣為人知的是，3-脫氧葡糖醛酮(3DG)是形成AGE-蛋白的多步驟反應(yīng)順序中的重要中間體。3DG是可與蛋白反應(yīng)的葡萄糖衍生的代謝物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外蛋白(例如膠原蛋白和基底膜)的交聯(lián)。
糖尿病并發(fā)癥時(shí)，人們認(rèn)為與該疾病相關(guān)的慢性高血糖動(dòng)態(tài)加速產(chǎn)生AGE-蛋白的反應(yīng)。支持該機(jī)制的證據(jù)包括的資料顯示，糖尿病受試對(duì)象的長壽命蛋白(long-lived protein)如膠原蛋白和晶狀體的AGE-蛋白含量明顯高于相當(dāng)年齡的正常對(duì)照。因此，晶狀體的修飾和交聯(lián)速率加快可解釋糖尿病患者為什么在較年輕的年齡的白內(nèi)障發(fā)病率高。同樣，重要的結(jié)構(gòu)蛋白即膠原蛋白的修飾和交聯(lián)速率加快可解釋為什么會(huì)在糖尿病患者觀察到早期發(fā)生關(guān)節(jié)和動(dòng)脈硬化以及肺容量降低。因?yàn)檫@些蛋白是長期存在的，所以其修飾效果往往是累積性的。
證實(shí)糖尿病并發(fā)癥和高血糖的因果關(guān)系的另一個(gè)因素是高血糖記憶。該現(xiàn)象的一個(gè)特別典型的實(shí)例是初期糖尿病經(jīng)治療恢復(fù)正常血糖水平的狗發(fā)生嚴(yán)重腎病。雖然所述狗的眼睛在治療時(shí)的組織學(xué)是正常的，但是盡管血糖濃度已經(jīng)正常，隨著時(shí)間的推移這些狗仍然發(fā)生糖尿病性腎病(Engerman等，Diabetes，36808(1987))。因此，在高血糖早期發(fā)生不可逆性潛在眼損害，之后臨床癥狀才明顯。
已經(jīng)證實(shí)糖尿病病人和動(dòng)物的早期和晚期糖修飾的AGE-蛋白的濃度較正常高。實(shí)際上，AGE-蛋白的增加高于血糖水平的增加。熒光測定可估測AGE-蛋白濃度，因?yàn)橐欢ū壤奶欠肿又嘏女a(chǎn)生蛋白結(jié)合的熒光分子。
AGE-蛋白的病理作用不限于糖尿病。蛋白糖化涉及早老性癡呆(Harrington等，Nature，370247(1994))。蛋白熒光增加還可見于衰老。實(shí)際上，某些理論將衰老過程歸因于氧化損害和糖引起的蛋白修飾的聯(lián)合作用。因此，減少AGE-蛋白形成的療法也可用于治療其它病因相似的人類疾病狀態(tài)，而且可能延緩衰老過程。
普遍認(rèn)為，AGE-蛋白形成始于蛋白質(zhì)的氨基與糖(主要是葡萄糖)反應(yīng)。一種典型的文獻(xiàn)引用描述是“賴氨酸殘基的ε氨基糖化形成最初的加合物為Amadori化合物，果糖賴氨酸…糖化是復(fù)雜的系列反應(yīng)中的初始步驟，所述反應(yīng)總稱為Maillard或褐色反應(yīng)，它最終導(dǎo)致形成交聯(lián)、沉淀、氧化、褐色的熒光蛋白”。K.J.Knecht等，Archivesof Biochem.Biophys.，294130(1992)。
由糖形成AGE-蛋白是一個(gè)多步驟過程，包括與糖的早期、可逆性反應(yīng)產(chǎn)生含果糖-賴氨酸的蛋白。然后這些修飾的蛋白繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生不可逆的修飾AGE-蛋白。顯然AGE-蛋白與含糖化賴氨酸殘基的蛋白不同，因?yàn)獒槍?duì)AGE-蛋白的抗體不與果糖-賴氨酸反應(yīng)。此外顯而易見的是，AGE-蛋白以多種化學(xué)形式存在；然而幾乎沒有鑒定的AGE-蛋白。在最近的研究中，將化學(xué)類型(ε-氨基-(羧甲基)賴氨酸鑒定為一種重要的最終的AGE-蛋白結(jié)構(gòu)(Reddy等，Biochem.，3410872(1995)和Ikeda等，Biochemistry，-358075(1996))。該研究不能化學(xué)鑒定另一種AGE-蛋白表位，它構(gòu)成約50％修飾部位。新近開發(fā)了一種研究由核糖形成AGE-蛋白的動(dòng)力學(xué)的方法(Khalifah等，Biochemistry，354645(1996))。然而，該研究提出核糖可能在AGE-蛋白形成中起重要的生理作用，支持以下提出的糖化-賴氨酸和果糖-賴氨酸的較廣義的定義。
其它參考文獻(xiàn)指出了含糖化賴氨酸殘基的蛋白和AGE蛋白的不同，“在數(shù)小時(shí)和數(shù)周后分別達(dá)到Schiff堿和Amadori產(chǎn)物的平衡水平。早期糖基化產(chǎn)物的可逆平衡特性是重要的，因?yàn)樗馕吨词箤?duì)非常長壽命蛋白而言，這種產(chǎn)物的總量也在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)平臺(tái).....因?yàn)檫@些早期糖基化產(chǎn)物不能幾年內(nèi)繼續(xù)累積于慢性糖尿病患者的膠原蛋白和其它穩(wěn)定組織蛋白上，所以其濃度與糖尿病性腎病的存在或嚴(yán)重程度不相關(guān)是不令人驚奇的...然而膠原蛋白和其它血管壁長壽命蛋白上的某些早期糖基化產(chǎn)物不會(huì)解離。相反，它們經(jīng)過一個(gè)緩慢復(fù)雜系列的化學(xué)重排形成不可逆的高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物”。M.Brownlee等，New England Journal of Medicine，3181315(1988)?？茖W(xué)文獻(xiàn)描述的產(chǎn)生這些修飾蛋白的唯一途徑包括蛋白和糖分子的初始反應(yīng)。
許多參考文獻(xiàn)指出，通過多步驟途徑形成AGE-蛋白而且3-脫葡糖醛酮(3DG)是該途徑的重要中間體。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)；M.Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)；T.Niwa等，Nephron，69438(1995)；W.L.Dills，Jr.，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993)；H.Yamadat等，J.Biol.Chem.，26920275(1994)；N.Igaki等，Clin.Chem.，36631(1990)。
圖1說明了普通接受的由糖和蛋白反應(yīng)形成3GD的途徑。由圖1可見，糖(葡萄糖)分子開始與蛋白質(zhì)-賴氨酸氨基(I)形成Schiff堿。產(chǎn)生的Schiff堿然后重排產(chǎn)生果糖-賴氨酸修飾蛋白(II)。產(chǎn)生(II)的反應(yīng)是自由可逆的。(II)可重排產(chǎn)生3DG和游離的蛋白賴氨酸。隨后的3DG和蛋白反應(yīng)是AGE-蛋白形成中第一個(gè)不可逆步驟。
迄今已知，從沒有關(guān)于其它途徑可產(chǎn)生3DG的報(bào)道，或者實(shí)際上從沒有報(bào)道酶催化代謝途徑是3-DG的主要來源，而不是圖1所示的非催化反應(yīng)。
糖尿病患者的血清3DG顯著高于非糖尿病患者(12.78±2.49μM與1.94±0.17μM)。(Toshimitsu Niwa等，Nephron，69438(1995))。盡管如此，此毒性化合物還是見于正常健康個(gè)體。所以，機(jī)體對(duì)該分子產(chǎn)生去毒途徑是不令人驚奇的。醛還原酶催化這些反應(yīng)中的一個(gè)反應(yīng)，該酶通過將30G還原為3-脫氧果糖(3DF)使3DG脫毒，3DF可有效分泌到尿中(Takahashi等，Biochem，341433(1995))。另一個(gè)脫毒反應(yīng)是通過酮醛(oxoaldehyde)脫氫酶將3DG氧化為3-脫氧-2-酮基葡萄糖酸(DGA)(Fujii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，210852(1995))。
迄今的研究結(jié)果表明，糖尿病時(shí)負(fù)面影響至少其中一種酶醛還原酶的效率。當(dāng)從正常大鼠肝臟分離時(shí)，在賴氨酸67、84和140上部分糖化該酶的一部分，與正常非修飾酶相比，該酶的催化效率低(Takahaski等，Biochem.，341433(1995))。因?yàn)樘悄虿』颊叩奶腔鞍椎谋嚷瘦^血糖量正常個(gè)體高，所以糖尿病患者的3DG水平可能高，而通過將3DG還原為3DF去除該活性分子毒性的能力可能降低。
已經(jīng)研究了醛還原酶的機(jī)制。這些研究證實(shí)，醛糖還原酶抑制劑(ARI)抑制此重要的脫毒酶(Barski等，Biochem.，3411264(1995))。目前正在對(duì)ARI用于降低糖尿病并發(fā)癥的潛力進(jìn)行臨床研究。已經(jīng)證實(shí)歸為一類的這些化合物對(duì)短期糖尿病并發(fā)癥具有一定效果。然而，它們對(duì)長期糖尿病并發(fā)癥缺乏臨床效果，而且使喂飼高蛋白飼料的大鼠的腎功能惡化。從以下可看出，此發(fā)現(xiàn)與作為本發(fā)明基礎(chǔ)的新發(fā)現(xiàn)的賴氨酸回收代謝途徑一致。高蛋白膳食將增加果糖-賴氨酸消耗，果糖-賴氨酸通過腎臟賴氨酸回收途徑轉(zhuǎn)化為3DG。ARI治療抑制所產(chǎn)生的3DG通過還原為3DF脫毒，與未接受ARI的大鼠相比，結(jié)果導(dǎo)致腎臟損害加重。這是因?yàn)锳RI對(duì)醛糖還原酶的抑制作用降低了還原3DG和3DF的醛糖還原酶的有效性。
由以下概述的專利綜述可知，以前研究了3-DG在人類疾病中的作用。
Ulrich等的美國專利5,476,849描述了用氨基-苯甲酸和衍生物抑制形成AGE-蛋白的方法。推測這些化合物作用是與3-DG反應(yīng)并在其可與蛋白反應(yīng)以啟動(dòng)形成AGE-蛋白的不可逆步驟之前將其由系統(tǒng)中去除。
Cerami等的美國專利4,798,583和5,128,360描述了應(yīng)用氨基胍防止形成AGE-蛋白和糖尿病引起的動(dòng)脈壁蛋白交聯(lián)。證實(shí)氨基胍與早期糖基化產(chǎn)物反應(yīng)。本文定義的此早期產(chǎn)物是3DG。這些專利并沒有設(shè)想抑制形成3-DG的可能性。他們僅僅專注于絡(luò)合此毒性分子。
France等的美國專利5,468,777描述了防止由非酶性褐色化蛋白在口腔引起的牙齒著色的方法和藥物。該申請認(rèn)為半胱氨酸和半胱氨酸衍生物特別有用。
Ulrich等的美國專利5,358,960描述了用氨基取代的咪唑抑制AGE-蛋白形成的方法。證實(shí)了這些化合物與早期糖基化產(chǎn)物(3DG)反應(yīng)。在該專利中未述及可能存在的3DG代謝來源。該專利設(shè)想3DG只作為非酶性褐色化蛋白中的中間體產(chǎn)生。
Ulrich等的美國專利5,334,617描述了用作AGE-蛋白形成抑制劑的氨基酸。認(rèn)為賴氨酸和其它雙功能氨基酸在該方面特別有用。認(rèn)為這些氨基酸與來自葡萄糖和蛋白反應(yīng)的早期糖基化產(chǎn)物反應(yīng)。似乎在該專利中描述的早期糖基化產(chǎn)物是3DG。
Ulrich等的美國專利5,318,982描述了用1，2，4-三唑作抑制劑對(duì)AGE-蛋白形成的抑制作用。該專利描述的抑制劑包括二氨基-取代物，該取代物能夠與3DG反應(yīng)并絡(luò)合。此專利描述這些化合物與早期糖基化產(chǎn)物(本文定義為3DG)反應(yīng)。
Ulrich等的美國專利5,272,165描述了2-亞烷基-氨基胍作為AGE-蛋白形成的抑制劑的用途。認(rèn)為該專利描述的抑制劑與3DG是高度反應(yīng)性的。該專利未提及抑制3DG的代謝形成。
Ulrich等的美國專利5,262,152描述應(yīng)用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白形成。該專利描述的化合物是α-效應(yīng)胺類。W.P.Jencks，第三版，McGraw Hill，New York。已知此類化合物與二羰基化合物例如3DG反應(yīng)。
Ulrich等的美國專利5,258,381描述應(yīng)用2-取代-2-咪唑啉抑制AGE-蛋白形成。該專利描述的化合物含有鄰近的氨基，它們能夠容易地與3DG反應(yīng)。
Ulrich等的美國專利5,243,071描述了應(yīng)用2-亞烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白形成。該專利描述的化合物與3DG具有高度反應(yīng)性，而且其作用是絡(luò)合該活性毒性分子。
Ulrich等的美國專利5,221,683描述了應(yīng)用二氨基吡啶化合物抑制AGE-蛋白形成。認(rèn)為特別有用的所述二氨基吡啶化合物與3DG反應(yīng)形成含有穩(wěn)定的6元環(huán)的復(fù)合物。
Ulrich等的美國專利5,130,337描述了應(yīng)用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白形成。該專利描述的抑制劑是α-效應(yīng)胺類，本領(lǐng)域已知它們將與3DG快速反應(yīng)并形成穩(wěn)定復(fù)合物。
Ulrich等的美國專利5,130,324描述了應(yīng)用2-亞烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白形成。該專利描述的化合物的作用是與早期糖基化產(chǎn)物(3DG)反應(yīng)，所述早期糖基化產(chǎn)物由葡萄糖與蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生。
Ulrich等的美國專利5,114,943描述了應(yīng)用氨基-取代的嘧啶抑制AGE-蛋白形成。認(rèn)為該專利描述的化合物與3DG快速反應(yīng)而且使其脫毒。
沒有一個(gè)上述專利提出將對(duì)代謝性形成3DG的抑制作用用作防止糖尿病并發(fā)癥的治療性干預(yù)的手段。實(shí)際上，甚至這些專利中沒有一個(gè)專利提示，3DG的產(chǎn)生涉及酶性途徑。
Ulrich等的美國專利5,108,930描述了檢測生物樣品氨基胍水平的方法。認(rèn)為該測定在通過測量氨基胍的消除時(shí)間確定腎功能中具有潛在性效用。用于該專利描述的測定方法的主要效用是測量氨基胍的組織水平，以便在動(dòng)物和人類研究中能夠維持足以抑制AGE-蛋白形成的劑量。該專利未提及使用尿的3DG、3DF或DGA比率確定糖尿病患者發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
Szwergold等的美國專利5,231,031描述了評(píng)估糖尿病相關(guān)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)和確定對(duì)這些并發(fā)癥的治療功效的方法。該專利描述了測量糖尿病患者紅細(xì)胞中的兩種磷酸化化合物。該專利沒有化學(xué)鑒定這兩種化合物。然而，兩種化合物均不是3DG或3DF，在本發(fā)明的診斷實(shí)施方案中測定其在尿中的水平。
通過測量糖基化終末產(chǎn)物監(jiān)測糖尿病患者的代謝控制的方法是已知的。已知糖基化血紅蛋白濃度反映了前幾周的平均血糖濃度。頒發(fā)給A.Cerami等的美國專利4,371,374描述了通過定量尿中的糖基化蛋白降解產(chǎn)物監(jiān)測血糖水平的方法，更具體地說所述糖基化蛋白的降解產(chǎn)物為非酶性糖基化氨基酸和肽。該方法意味著利用堿性硼酸親和力以與見于糖基化終末產(chǎn)物的共平面順式-二醇基團(tuán)形成特異性復(fù)合物，從而分離并定量這類終末產(chǎn)物。
頒發(fā)給A.Cerami的美國專利4,761,368描述了分離和純化存在于褐色多肽例如牛血清白蛋白和聚-L-賴氨酸的發(fā)色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)2-(2-呋喃甲?；?-4(5)-2(呋喃甲?；?-1H-咪唑(FFI)是2分子葡萄糖與2個(gè)賴氨酸來源的氨基縮合衍生的共軛雜環(huán)。該專利進(jìn)一步描述將FFI用于檢測蛋白樣品的“老化”(高級(jí)糖基化的程度)的方法中，其中通過測量所述樣品中的上述發(fā)色團(tuán)的量，然后比較該測量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品(其FFI含量與所述樣品的“年齡”有關(guān)的蛋白樣品)，從而確定所述樣品“年齡”。
糖尿病患者的現(xiàn)有治療方案中沒有實(shí)現(xiàn)的長期存在的需要是用于以下目的的有效方法鑒定具有發(fā)生糖尿病相關(guān)性病癥風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者；通過治療性干預(yù)預(yù)防、降低或延遲這類病癥的發(fā)生以及確定這樣的治療性干預(yù)的利益。
發(fā)現(xiàn)此發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明中具有實(shí)用性，一方面，本發(fā)明提供一類化合物，這類化合物具有酶抑制活性而且有效抑制果糖-賴氨酸酶性轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸。通過測定容易確定本發(fā)明化合物的有關(guān)的酶抑制活性。所述測定方法包括提供果糖-賴氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶來源和本發(fā)明化合物的水溶液，其中本發(fā)明化合物的量足以證實(shí)其抑制活性；使所獲得的溶液接受促進(jìn)作為上述激酶、果糖-賴氨酸和三磷酸腺苷相互作用的產(chǎn)物的果糖-賴氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷形成的條件；以及檢測至少一種這樣的產(chǎn)物的產(chǎn)量，與相同量的果糖-賴氨酸、三磷酸腺苷和果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶來源而未加入本發(fā)明化合物的水溶液相比，本發(fā)明化合物降低了這類產(chǎn)物的量。剛才描述的測定方法也屬于本發(fā)明的范疇。
按照另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防、降低或延遲糖尿病患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的藥用制劑，該制劑包括作為活性成分的上述本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
按照本發(fā)明的再一方面，提供預(yù)防、降低或延遲具有糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的方法，該方法包括給予所述患者抑制果糖-賴氨酸酶性轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸的有效量本發(fā)明化合物。該方法可用于預(yù)防或治療其它病因相似的疾病狀態(tài)，詳見下文。
按照本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供評(píng)價(jià)糖尿病患者發(fā)生糖尿病相關(guān)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括給予所述患者產(chǎn)生預(yù)定量糖化賴氨酸殘基的量的糖化賴氨酸殘基來源；以正常受試對(duì)象(即非糖尿病受試對(duì)象或沒有糖尿病臨床癥狀的受試對(duì)象)的3-脫氧葡糖醛酮與3-脫氧果糖的比率為基準(zhǔn)，測定獲自所述患者的生物樣品中的3-脫氧葡糖醛酮與3-脫氧果糖的比率。與無癥狀受試對(duì)象相比，糖尿病患者樣品中的3-脫氧葡糖醛酮與3-脫氧果糖的比率高，說明糖尿病患者發(fā)生糖尿病相關(guān)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。
本發(fā)明還提供評(píng)價(jià)治療性干預(yù)在防止糖尿病并發(fā)癥中的效用的方法。該方法包括檢測在開始治療性干預(yù)之前和之后獲自糖尿病患者的生物樣品中的3-脫氧葡糖醛酮、3-脫氧果糖和果糖-賴氨酸的濃度。然后比較所述樣品中的3-脫氧葡糖醛酮和3-脫氧果糖濃度和與果糖-賴氨酸的濃度。與在開始治療性干預(yù)之前采集的生物樣品中檢測的相對(duì)于果糖-賴氨酸濃度的3-脫氧葡糖醛酮和3-脫氧果糖濃度和相比，開始治療性干預(yù)之后采集的生物樣品中的該濃度和降低，說明治療性干預(yù)有效。
本發(fā)明再一方面，提供告知糖尿病患者可能導(dǎo)致發(fā)生糖尿病相關(guān)性病癥的食品的方法。該方法包括檢測食品中的糖化賴氨酸殘基的含量，將該信息例如在食品包裝上或在糖尿病患者使用的公開出版物上告知糖尿病患者。
按照本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)生物樣品例如尿液中的3DF水平升高與發(fā)生糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供評(píng)價(jià)糖尿病患者發(fā)生糖尿病相關(guān)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法基于參照一個(gè)或多個(gè)3DF預(yù)定基線水平，將存在于糖尿病患者生物樣品中的3DF的測量結(jié)果作為所述患者是否發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的可能性的指標(biāo)。
本發(fā)明的另一方面包括降低患者對(duì)與攝食糖化蛋白有關(guān)的癌癥的敏感性的方法。該方法包括給予藥用組合物，該組合物含有對(duì)果糖-賴氨酸酶性轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸具有抑制活性的活性化合物。本發(fā)明還包括預(yù)防、降低或延遲發(fā)生AGE-蛋白形成引起的癌癥的方法。該方法包括給予治療量的抑制產(chǎn)生3-脫氧葡糖醛酮的藥物。
作為進(jìn)一步評(píng)價(jià)與給予含糖化蛋白膳食有關(guān)的惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制的手段，提供在易感受試動(dòng)物誘導(dǎo)癌癥的方法，該方法包括用糖化蛋白膳食喂飼所述動(dòng)物足夠時(shí)間，使得生物體液中的3-脫氧葡糖醛酮水平升高至少3倍。相對(duì)于非處理對(duì)照動(dòng)物評(píng)價(jià)這類動(dòng)物。
按照本發(fā)明還提供篩選影響癌癥發(fā)生的物質(zhì)的方法。通過喂飼受試動(dòng)物糖化蛋白膳食使得生物體液3DG水平升高至少3倍，從而誘發(fā)癌癥。然后將動(dòng)物分為兩組，其中一組動(dòng)物接受待評(píng)價(jià)化合物，而另一組動(dòng)物用作陰性對(duì)照。合適時(shí)間后處死兩組動(dòng)物，評(píng)價(jià)兩組動(dòng)物存在和/或沒有的癌瘤。
最后，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供篩選預(yù)防、降低或延遲發(fā)生癌癥的物質(zhì)的方法。該方法包括以下步驟用糖化蛋白飼料喂飼易感受試動(dòng)物，喂飼所述飼料的量和時(shí)間足以維持生物體液的3-脫氧葡糖醛酮(3DG)含量不同于喂飼基本上不含糖化蛋白飼料的相似易感受試動(dòng)物的3DG含量。然后將受試物質(zhì)給予一部分所述受試動(dòng)物，而另一部分動(dòng)物不給予受試物質(zhì)。再后處死動(dòng)物，比較每個(gè)所述部分的易感受試動(dòng)物的組織切片，評(píng)價(jià)所述受試物質(zhì)的作用。
圖2圖示賴氨酸回收途徑包括的反應(yīng)。
圖3為尿液分布形式的示意圖，圖示攝食2gFL以及連續(xù)監(jiān)測24小時(shí)的一個(gè)個(gè)體的隨時(shí)間變化的3DF、3DG和FL。
圖4為攝食2g果糖賴氨酸的7個(gè)志愿者尿液分泌3DF隨時(shí)間變化的示意圖。
圖5為對(duì)照組動(dòng)物和保持?jǐn)z食含0.3％糖化蛋白膳食的實(shí)驗(yàn)組的3DF和N-乙?；?β-氨基葡糖苷酶(NAG)的比較圖。
圖6圖示攝食對(duì)照飼料或富含糖化蛋白飼料的大鼠尿液3DF和3DG水平之間的線性關(guān)系。
圖7A和7B圖示正常個(gè)體和糖尿病患者尿液的禁食水平3DG對(duì)禁食水平3DF的作圖。
發(fā)明詳述提供以下定義幫助理解本發(fā)明，詳述如下1.糖化賴氨酸殘基-本文使用的表述“糖化賴氨酸殘基”是指還原糖和含賴氨酸蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的修飾賴氨酸殘基的穩(wěn)定加合物。
大部分的蛋白賴氨酸殘基作為預(yù)期的正電荷氨基酸位于蛋白表面。因此，與血清或其它生物體液接觸的蛋白上的賴氨酸殘基可與溶液中的糖分子自由反應(yīng)。該反應(yīng)存在多個(gè)階段。初始階段包括賴氨酸游離氨基與糖的酮基形成Schiff堿。然后此初產(chǎn)物經(jīng)過Amadori重排產(chǎn)生穩(wěn)定的酮胺化合物。
可用多種糖發(fā)生該系列反應(yīng)。當(dāng)涉及的糖為葡萄糖時(shí)，最初的Scchiff堿產(chǎn)物將參與在葡萄糖的C-1上的醛部分與賴氨酸ε-氨基之間的亞胺形成。Amadori重排形成與果糖C-1碳連接的賴氨酸、1-脫氧-1-(ε-氨基賴氨酸)-果糖(本文稱為果糖-賴氨酸或FL)。
可用其它醛糖例如半乳糖和核糖進(jìn)行相似的反應(yīng)(Dills，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993))。對(duì)于本發(fā)明的目的，不管修飾糖分子的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)如何，糖化賴氨酸殘基的涵義包括任何還原糖和蛋白質(zhì)賴氨酸的ε-氨基殘基反應(yīng)的早期產(chǎn)物。
此外，術(shù)語糖化賴氨酸殘基、糖化蛋白和糖基化蛋白或糖基化賴氨酸殘基在本文中可交互使用，這與通常交互使用這樣的表述的科學(xué)雜志中的現(xiàn)時(shí)用法一致。
2.果糖-賴氨酸-術(shù)語“果糖-賴氨酸”(FL)本文用來指任何糖化賴氨酸，無論是摻入蛋白/肽的糖化賴氨酸還是通過蛋白水解消化從蛋白/肽釋放的糖化賴氨酸。該術(shù)語不特別限于通常稱為果糖-賴氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，據(jù)報(bào)道蛋白賴氨酸殘基和葡萄糖反應(yīng)形成果糖-賴氨酸。如上所述，賴氨酸氨基可與各種各樣的糖反應(yīng)。實(shí)際上，一個(gè)報(bào)道指出，在一組16種(16)不同測試糖中葡萄糖是活性最低的糖(Bunn等，Science，213222(1981))。因此，與葡萄糖類似，無論在本說明書何處提及術(shù)語果糖-賴氨酸，均包括半乳糖和賴氨酸形成的塔格糖-賴氨酸，同樣包括所有其它糖的縮合產(chǎn)物，無論所述糖是天然糖還是合成糖。從本說明書可知，蛋白-賴氨酸殘基和糖的反應(yīng)包括多個(gè)反應(yīng)步驟。該反應(yīng)系列的最后步驟包括蛋白交聯(lián)并產(chǎn)生稱為AGE-蛋白的多聚類物質(zhì)，其中某些物質(zhì)為熒光物質(zhì)。蛋白水解消化這類修飾蛋白不會(huì)產(chǎn)生與糖分子共價(jià)結(jié)合的賴氨酸。因此，當(dāng)“果糖-賴氨酸”的本文中使用時(shí)，該術(shù)語的涵義不包括這些類型的物質(zhì)。
3.果糖-賴氨酸-3-磷酸-通過從ATP酶性轉(zhuǎn)移高能磷酸基至FL形成該化合物。本文使用的術(shù)語果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)意指包括所有能夠酶性形成的磷酸化果糖-賴氨酸部分，無論是游離的還是蛋白結(jié)合的。
4.果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶-該術(shù)語是指，如上定義，當(dāng)另外提供高能磷酸來源時(shí)能夠使FL酶性轉(zhuǎn)化為FL3P的一種或多種蛋白。
5.3-脫氧葡糖醛酮-3-脫氧葡糖醛酮(3DG)是1，2-二羰基-3-脫氧糖(也稱為3-脫氧己糖醛酮)，當(dāng)裂解FL3P產(chǎn)生游離賴氨酸和無機(jī)磷酸時(shí)形成3-脫氧葡糖醛酮。對(duì)于本發(fā)明目的，術(shù)語3-脫氧葡糖醛酮包括裂解FL3P時(shí)形成的所有可能的二羰基糖，F(xiàn)L3P如上所述具有廣泛的定義。
6.FL3P賴氨酸回收途徑-賴氨酸回收途徑存在于人體腎臟，也可能存在于其它組織，它再生為游離氨基酸的未修飾賴氨酸或再生摻入多肽鏈的未修飾賴氨酸。進(jìn)一步的解釋見下文，該途徑是引起糖尿病并發(fā)癥的一個(gè)重要因素。
7.AGE-蛋白-在科學(xué)雜志和本文使用的術(shù)語“AGE-蛋白”(高級(jí)糖化終末產(chǎn)物修飾蛋白)是指糖和蛋白反應(yīng)的終末產(chǎn)物(Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)和Niwa等，Nephron，69438(1995))。顯然，例如蛋白賴氨酸殘基和葡萄糖反應(yīng)不會(huì)隨著果糖-賴氨酸的形成而停止。FL可以經(jīng)受多個(gè)脫水和重排反應(yīng)產(chǎn)生非酶性3DG，3DG再與游離氨基反應(yīng)，導(dǎo)致有關(guān)蛋白的交聯(lián)和褐色化。實(shí)際上，適當(dāng)?shù)淖C據(jù)表明，以上定義的3DG是該修飾反應(yīng)中的中心中間體。
9.“糖化膳食”-本文使用的該表述是指其中糖化蛋白代替部分正常蛋白的任何特定膳食。表述“糖化膳食”和“糖化蛋白膳食”在本文中可交互使用。
至少部分、也可能所有糖尿病并發(fā)癥是因?yàn)槠咸烟呛推渌钚蕴枪矁r(jià)修飾蛋白所致。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)。如上所述，已經(jīng)證實(shí)糖尿病病人和動(dòng)物的糖修飾蛋白濃度較正常個(gè)體高。事實(shí)上，糖尿病相關(guān)性AGE-蛋白的增加高于血糖水平的增加。
以前，人們普遍認(rèn)為體內(nèi)3DG來源于含糖化賴氨酸殘基的蛋白分解。還普遍認(rèn)為這些糖化賴氨酸不能用作氨基酸來源。由下文可知，以前相信的這種觀點(diǎn)是錯(cuò)誤的。
10.“易感受試動(dòng)物”-本文使用的該表述是指因?yàn)榇嬖谀承┻z傳突變其惡性轉(zhuǎn)化和形成腫瘤的傾向性較高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系。在本文所述的研究中使用結(jié)節(jié)性硬化基因(Tsc-2)突變的Eker大鼠。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知道形成腫瘤的傾向性高的其它實(shí)驗(yàn)大鼠或小鼠品系。術(shù)語“相似的易感受試動(dòng)物”是指用作對(duì)照非處理動(dòng)物的遺傳背景相似的動(dòng)物。
如上所述，本發(fā)明產(chǎn)生于對(duì)以前未知代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，該途徑以酶催化反應(yīng)產(chǎn)生3DG?？梢悦感砸种圃撁感酝緩?，因此減少毒性3DG的產(chǎn)生。
在對(duì)糖尿病腎臟的一系列研究過程中，鏈脲霉素(streptozotoxin)誘發(fā)的糖尿病大鼠腎臟的高氯酸提取物的31P NMR光譜檢測顯示一個(gè)異常的NMR光譜新的峰。本發(fā)明者的以前的研究證實(shí)，在大鼠晶狀體和人紅細(xì)胞中存在果糖-3-磷酸(A.Petersen等，Biochem.J.，284363-366(1992)；Lal等，Arch.Biochem.Biophys.，318191(1995)；Szwergold等，Science，247451(1990)和Lal等，InvestigativeOpthalmology and Visual Science，36(5)969(1995))。早期的研究在大鼠晶狀體中鑒定了其它非尋常磷酸化糖(Szwergold等，Diabetes，44810(1995)和Kappler等，Metabolism，44，1527(1995))。因此，有充分理由認(rèn)為，該新鑒定的峰是另一種磷酸化糖。進(jìn)一步深入的實(shí)驗(yàn)研究表明，這種新化合物不是一種單純的糖，而是在果糖組分的3位磷酸化的果糖-賴氨酸。
用兩種方法證實(shí)了該鑒定。用以下實(shí)施例2公開的方法合成真正的果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)，顯示在31P NMR光譜中與糖尿病大鼠腎臟峰共振。還將合成果糖-賴氨酸注射入非糖尿病大鼠。注射后這些大鼠腎臟的FL3P水平顯著升高。
進(jìn)行了2個(gè)實(shí)驗(yàn)以證實(shí)FL3P以酶催化反應(yīng)直接衍生自FL。合成以氘在果糖部分的C3位標(biāo)記的果糖-賴氨酸，并將其注射入大鼠。注射后3小時(shí)，從這些大鼠取出腎臟，用高氯酸進(jìn)行提取。NMR光譜學(xué)顯示，分離自這些大鼠的FL3P物質(zhì)在果糖部分C3位含有氘標(biāo)記。此外，大鼠腎臟組織勻漿顯示在同時(shí)需要ATP和果糖-賴氨酸的反應(yīng)中可產(chǎn)生FL3P。最后提及的實(shí)驗(yàn)證實(shí)存在特異性FL3P激酶，因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下只將果糖賴氨酸和ATP一起溫育時(shí)不形成FL3P。涉及腎臟皮質(zhì)部分的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該激酶活性不是均勻分布于腎臟，而是集中在腎小管近側(cè)區(qū)，該區(qū)是最早證實(shí)人類和動(dòng)物糖尿病腎臟損害的解剖部位之一。
FL3P水溶液是不穩(wěn)定的。它快速降解形成3DG、賴氨酸和無機(jī)磷酸鹽。體內(nèi)也發(fā)生這種反應(yīng)。目前仍然不知道FL3P體內(nèi)降解是自然發(fā)生的反應(yīng)還是酶催化反應(yīng)。然而，非常懷疑酶催化參與降解，因?yàn)樵谕旰媚I臟非?？焖儆晒?賴氨酸產(chǎn)生3DG。
圖2圖示FL3P賴氨酸回收途徑反應(yīng)步驟。在第一步中，果糖-賴氨酸和ATP在FL3P激酶催化的反應(yīng)中反應(yīng)形成果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)和ADP。果糖部分的3-位磷酸化使果糖賴氨酸分子不穩(wěn)定。然后獲得的F3LP分解形成3-脫氧葡糖醛酮(3DG)、無機(jī)磷酸鹽和未修飾游離的可再利用的賴氨酸，賴氨酸可用于蛋白質(zhì)合成。醛還原酶使3DG還原為3-脫氧果糖(3DF)，從而使3DG脫毒，3DF分泌到尿液中。
盡管圖2圖示用最普遍的糖化賴氨酸即果糖-賴氨酸的此途徑，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員非常顯而易見的是，各種各樣的相似分子可以經(jīng)該途徑反應(yīng)。實(shí)際上，見下文詳細(xì)解釋，F(xiàn)L3P賴氨酸回收途徑的底物選擇是非常廣泛的，保證以上給定術(shù)語的廣泛定義。
其它實(shí)驗(yàn)表明，賴氨酸回收途徑見于各種動(dòng)物，包括綿羊、豬、狗、兔、母牛、小鼠和雞。該途徑也存在于人類。已知賴氨酸是一種必需氨基酸，其在大多數(shù)食物的濃度較低，所以可以認(rèn)為FL3P賴氨酸回收途徑是遍在存在的。此外，食物中相當(dāng)比例的賴氨酸殘基是以糖化形式存在的，烹制食物時(shí)將增加這種修飾賴氨酸的比例。因?yàn)檫@些糖化賴氨酸殘基不能用于合成蛋白質(zhì)，所以賴氨酸回收途徑具有極大的實(shí)用價(jià)值，并為存在該途徑的生物體提供選擇優(yōu)勢。
糖尿病對(duì)賴氨酸回收途徑具有2個(gè)作用。分離自糖尿病患者的血液蛋白的糖化賴氨酸濃度比非糖尿病個(gè)體高。所以與非糖尿病個(gè)體相比，必須使糖尿病患者的更多賴氨酸進(jìn)入賴氨酸回收途徑。此外，根據(jù)對(duì)糖尿病患者和正常個(gè)體尿液中的3DG與3DF比率的初步觀測結(jié)果可以看出，糖尿病患者通過該途徑使3DG脫毒的能力降低。這兩個(gè)因素一起使糖尿病患者尿液3DG濃度增高(見圖7；此外參見Lal等，Arch.Biochem.and Biophys.，342(1)254-60(1997))。
除了腎臟之外，在其它組織，尤其是紅細(xì)胞、晶狀體和外周神經(jīng)組織中，也已經(jīng)鑒定出了參與賴氨酸回收途徑的因子。糖尿病并發(fā)癥累及所有這些組織。紅細(xì)胞定位與糖尿病微血管并發(fā)癥例如糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)，腎臟定位與糖尿病性腎病有關(guān)，而外周神經(jīng)定位與糖尿病外周神經(jīng)病有關(guān)。這些因子還見于胰腺。正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定這些因子在皮膚中的存在情況。如果發(fā)現(xiàn)這些因子存在于皮膚，則認(rèn)為可用本發(fā)明抑制性化合物的合適載體局部治療，防止膠原蛋白交聯(lián)，并由此改善皮膚彈性，從而緩解其有害效應(yīng)。
已進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)往往證明，人類由經(jīng)口攝食含糖化賴氨酸殘基的蛋白既產(chǎn)生3DG又產(chǎn)生3DF。以下詳細(xì)描述的這些實(shí)驗(yàn)令人信服地證實(shí)，人類存在賴氨酸回收途徑。這些實(shí)驗(yàn)還闡明了一個(gè)令人困惑的現(xiàn)象，即某些糖尿病患者產(chǎn)生糖尿病并發(fā)癥，而另一部分糖尿病患者即使血糖控制很不好，也不會(huì)發(fā)生這樣的并發(fā)癥。根據(jù)本文提供的資料可知道該現(xiàn)象的原因。糖尿病患者的3DG解毒能力各不相同。部分糖尿病人群的醛還原酶活性似乎比大多數(shù)糖尿病人群的高。因此，這些個(gè)體能夠通過有效地使高于正常水平的3DG脫毒，從而增加進(jìn)入賴氨酸回收途徑的量。其它功能受損的患者不大能夠使其升高的3DG水平脫毒，因此發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。
見下文更詳細(xì)的描述，已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)能夠通過應(yīng)用糖化蛋白膳食刺激賴氨酸回收途徑。與上述FL情況相同，在喂飼糖化蛋白膳食的受試動(dòng)物觀測到FL3P、3DG和3DF升高。
本發(fā)明酶抑制劑化合物阻斷賴氨酸回收途徑，防止由FL3P形成毒性3DG。
下述是說明酶抑制劑適用于實(shí)施本發(fā)明的一套完整標(biāo)準(zhǔn)，以及確定任何推定抑制劑是否符合這些標(biāo)準(zhǔn)的某些實(shí)驗(yàn)。適用于本發(fā)明的候選激酶抑制劑可以是分離自植物或微生物的天然產(chǎn)物?；蛘咚鼈兛梢允歉鶕?jù)對(duì)酶反應(yīng)和其機(jī)制的正確認(rèn)識(shí)獲得的合成分子。也可用聯(lián)合的方法合成抑制劑。由隨機(jī)起始點(diǎn)可產(chǎn)生混合文庫。而且，可用聯(lián)合方法制備與以前鑒定的FL3P激酶靶抑制劑有關(guān)的各種化合物。
無論推定抑制劑的來源如何，不能認(rèn)為不符合所有以下列舉標(biāo)準(zhǔn)的化合物是能夠抑制賴氨酸回收途徑，由此預(yù)防、降低或延遲發(fā)生糖尿病并發(fā)癥或有關(guān)病因?qū)W病癥的有用治療藥物。
1.所述抑制劑應(yīng)該是小分子而且易于被細(xì)胞攝取。為了滿足此標(biāo)準(zhǔn)，所述抑制劑的分子量必須小于2,000道爾頓，約1,000或更小更理想。
2.所述抑制劑必須競爭性、非競爭性、不可逆性或自殺性抑制FL3P激酶。如果所述抑制劑是競爭性或非競爭性抑制劑，則抑制常數(shù)Ki必須小于約1mM。理想的是，抑制常數(shù)必須小于100μM，更理想的是，約40μm或更低。如果所述抑制劑的抑制作用是自殺式或其它不可逆式的，則此抑制常數(shù)要求無實(shí)際意義。
3.所述抑制劑必須可溶于水溶液，而且在生理pH的水溶液中是穩(wěn)定的。只有在所述抑制劑或抑制劑鹽可以等于或大于10μM的濃度溶解于生理鹽水或血清，才滿足溶解度要求。只有在溶解于37℃生理鹽水的抑制劑溶液在溫育1小時(shí)后其活性保持50％以上時(shí)，才滿足該穩(wěn)定性要求。理想的是，溫育1天或1天以上所述抑制劑活性必須保持50％以上。
4.所述抑制劑必須具有可接受的藥代動(dòng)力學(xué)。即，給予所述藥物后其治療有效濃度必須保持至少1小時(shí)。理想的是，其有效濃度應(yīng)該至少保持8小時(shí)。更理想的是，每天給藥一次就足以維持所述抑制劑的治療濃度。該要求并不意味著所述抑制劑在第一次給藥后就一定能夠達(dá)到治療濃度。已有許多成功藥物實(shí)例，此時(shí)只要延長給藥就可觀測到藥物效用。此標(biāo)準(zhǔn)的真正意義在于，一旦達(dá)到有效濃度，在最后一次給藥后此有效濃度能夠維持1小時(shí)以上。本文描述了測試治療效能的實(shí)驗(yàn)。
5.所述抑制劑必須是無毒的。此標(biāo)準(zhǔn)要求，給予治療劑量時(shí)該抑制劑對(duì)人類沒有毒性。理想的是，當(dāng)抑制劑在血液和/或靶組織的水平兩倍于治療作用水平時(shí)其毒性不明顯。更理想的是，當(dāng)抑制劑水平6倍于或更高于治療范圍時(shí)，其毒性不明顯。長期的抑制劑治療才能防止糖尿病并發(fā)癥。所以，無毒性要求必須包括急性毒性和慢性毒性，慢性毒性可能在延長的長期使用時(shí)才顯現(xiàn)。采用良好建立的動(dòng)物研究能夠容易地評(píng)價(jià)候選分子的毒性。在I期臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)人體毒性。
用于實(shí)施本發(fā)明的化合物包括下式化合物和所述化合物的異構(gòu)體以及藥學(xué)上可接受的鹽
其中X為-NR’-或-O-，R’選自H、和直鏈或支鏈烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R為選自以下基團(tuán)的取代基H、氨基酸殘基、聚氨基酸殘基、肽鏈、直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)(未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代)、直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)(未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代，而且被至少一個(gè)-O-、-NH-或-NR”-部分間斷)，R”是直鏈或支鏈烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是當(dāng)X表示-NR’-時(shí)，R和R’與其連接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7環(huán)原子的雜環(huán)，其中氮和氧中的至少一個(gè)是所述環(huán)中的唯一雜原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述雜環(huán)取代基選自H、烷基(C1-C6)、鹵素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4個(gè)線性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羥亞甲基部分 ；Z選自-H、-O-烷基(C1-C6)、-鹵素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2以及任選為-OH。
含氮或氧的“R”取代基的實(shí)例包括衍生自以下物質(zhì)的取代基γ-氨基-α-羥基丁酸(-(CH2)2-CHOH-COOH)、1，2，4-三氨基丁烷(-(CH2)2-CHNH2-CH2NH3)、3，6-二氨基-5-羥基庚酸(-CH2-CH(OH)-CH2-CH(NH2)-CH2-COOH)等。
式I結(jié)構(gòu)具有不對(duì)稱中心，可以以外消旋物、外消旋混合物和各種立體異構(gòu)體以及它們的混合物存在，所有這樣的異構(gòu)體形式屬于本發(fā)明范疇。
盡管某些具有上式I結(jié)構(gòu)的化合物是以前已經(jīng)知道的，但是相信其它化合物是新的，這樣的化合物屬于本發(fā)明范疇，所有式I化合物用于抑制體內(nèi)酶催化產(chǎn)生3DG的用途也屬于本發(fā)明范疇。
可使合適的糖例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或其衍生物與氨基酸或其它合適的伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生具有羰基部分(即Y＝-C(＝O)-)的抑制劑，從而制得以上結(jié)構(gòu)式的抑制劑?；蛘咴谶x擇性使Schiff堿中間體還原為胺的因子例如NaBH3CN存在下，可使糖例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖等與氨基-或羥基-取代的上述類型反應(yīng)物反應(yīng)，因此產(chǎn)生具有醇部分(即Y＝-CH(-OH)-)的抑制劑。使用時(shí)，氨基酸反應(yīng)物的活性部分可以是α碳原子上的胺基或氨基酸側(cè)鏈上的胺基或羥基。合適氨基酸包括必需氨基酸。具體實(shí)例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸。其它合適反應(yīng)物來自更廣泛類型的氨基羧酸，例如焦谷氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸等。必要時(shí)，也可以使用上述氨基酸的N-?；苌?，例如甲?；嚢彼?。
其它合適反應(yīng)物包括但不限于未取代或取代芳基(C6-C10)化合物，其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、烷氧基、羧基、硝基或鹵基，未取代或取代的鏈烷，其中所述取代基可至少為一個(gè)烷氧基；或者未取代或取代含氮雜環(huán)化合物，其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、芳基(C6-C10)、烷氧基、羧基、硝基或鹵基。最后一組反應(yīng)物的實(shí)例包括m-甲基、p-甲基-、m-甲氧基、o-甲氧基-和m-硝基-氨基苯，o-和p-氨基苯甲酸；n-丙胺、n-丁胺、3-甲氧基丙胺；嗎啉和哌啶。
上式的典型抑制劑化合物見附表A?？捎米鲗?shí)施本發(fā)明的抑制劑的已知化合物實(shí)例包括但不限于葡甲胺(meglumine)、山梨醇賴氨酸和甘露醇賴氨酸。
本文所述抑制劑化合物可以與各種無機(jī)或有機(jī)酸或堿形成藥學(xué)上可接受的鹽。合適的堿包括例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、取代的銨鹽和其它胺鹽。合適的酸包括例如鹽酸、氫溴酸和甲磺酸。
式I化合物的藥學(xué)上可接受的鹽可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制得。
可用各種激酶活性測定方法檢測化合物抑制FL3P激酶的能力。一種有用的測定法包括使?jié)撛谝种苿┡c果糖-賴氨酸和ATP在存在腎臟組織勻漿或其它酶來源的情況下一起溫育。制備檢測組分溶液，檢測溶液一般包含1mM或更少的本發(fā)明抑制劑化合物、1-10mM果糖賴氨酸(FL)、0.1-10mM ATP和足以使FL轉(zhuǎn)化為果糖賴氨酸-3-磷酸的酶源量。在4.5-9.5pH范圍、最好是在中性pH或接近中性pH下進(jìn)行溫育。溫育溫度應(yīng)該為與酶活性匹配的4-40℃。最好是在生理溫度下進(jìn)行溫育。溫育后，加入酸沉淀蛋白終止反應(yīng)，用31P-NMR光譜學(xué)檢測產(chǎn)生的EL3P。與不含抑制劑的對(duì)照樣品相比，含有抑制劑化合物的樣品減少或消除產(chǎn)生FL3P。
其它測定法適用于快速測定酶抑制作用。一種這樣的測定法包括應(yīng)用果糖-賴氨酸和γ-標(biāo)記的32P或33P-ATP。因?yàn)镕L3P不結(jié)合Dow-1，但是ATP和大多數(shù)其它磷酸鹽卻結(jié)合Dow-1，因此在預(yù)定反應(yīng)時(shí)間、通常為10分鐘后，使檢測溶液通過Dow-1樹脂柱可以使產(chǎn)物FL3P與其余反應(yīng)混合物分開。將產(chǎn)生的溶液加入裝有閃爍液如Ecoscint A的容器中，進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定所產(chǎn)生的放射性量。
因?yàn)殡y以獲得大量人體組織，所以最好使用克隆入表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌的重組型激酶。從組織特異性cDNA文庫的“鳥槍法”克隆能夠容易地獲得克隆激酶。這類文庫容易從商業(yè)來源獲得。例如它們可得自Clontech，Palo Alto，CA?？捎觅徸許tratagen(位于San Diego，California)的λ克隆系統(tǒng)進(jìn)行所設(shè)想的鳥槍法克隆。該克隆試劑盒包括其使用的詳細(xì)說明。
本發(fā)明的藥用制劑包括作為活性成分的一種或多種上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑。
這些成分可以制備成適用于給藥的各種形式，包括液體和固體形式。因此，所述制劑的形式可以是片劑、囊片(caplet)、丸劑或錠劑，或者所述制劑可以填充于合適容器中，例如膠囊，或者如果是懸浮劑，可灌裝于瓶中。本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)”包括所有溶劑、稀釋劑或其它液體溶媒、分散或懸浮輔助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體黏合劑、潤滑劑等，只要適用于需要的特定劑型。合適載體介質(zhì)的典型實(shí)例包括明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物和動(dòng)物脂肪和油、樹膠、聚二醇等。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(MackPublishing Co.，Easton，PA1975)公開了配制藥用組合物使用的各種載體和已知用于其制備的技術(shù)。除非某一常規(guī)載體介質(zhì)與本發(fā)明酶抑制劑不匹配，例如產(chǎn)生任何不需要的生物效應(yīng)或與藥用制劑的任何其它組分以有害方式相互作用，否則其應(yīng)用屬于本發(fā)明范疇。
在本發(fā)明藥用制劑中，所述活性藥物的含量至少為所述制劑總量的5％(重量)，一般不高于98％(重量)，如果有的話，包括載體介質(zhì)和/或輔助劑?；钚运幬锏谋壤詈脼樗鼋M合物的65％-95％(重量)。
輔助活性藥物最好為結(jié)合體內(nèi)3DG的化合物。這類化合物包括但不限于氨基胍、氨基苯甲酸及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、氨基取代的咪唑、1，2-二取代的苯咪唑、取代的1，2，4-三唑、二氨基吡啶及其衍生物、氨基取代的嘧啶、氨基醇類、二胺類等。本發(fā)明藥用制劑也可以包括作為輔助活性藥物的抗高血壓藥物，特別包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑。
如果必要或需要，所述藥用制劑中也可加入輔助物質(zhì)，例如保護(hù)所述活性化合物免被胃酸破壞或有助于所述活性化合物吸收入血液的化合物。這樣的輔助物質(zhì)可以包括例如絡(luò)合劑，例如部分抵消胃內(nèi)酸性條件的硼酸鹽或其它鹽等。以脂肪酸鹽傳遞所述活性化合物可增強(qiáng)吸收(在所述活性化合物含有一個(gè)或多個(gè)堿性官能團(tuán)的情況下)。
可以采用有效抑制FL3P賴氨酸回收途徑的任何給予量和任何給藥途徑一起給予本發(fā)明化合物和任何輔助活性成分。因此，本文使用的表述“治療有效量”是指所述酶抑制劑的無毒但是足夠的劑量，該足夠量足以達(dá)到需要治療以防止糖尿病并發(fā)癥或抑制其它醫(yī)學(xué)原因所致的代謝性產(chǎn)生3DG，例如減輕衰老效應(yīng)或AGE-蛋白形成具有致病作用的其它人類疾病狀態(tài)。需要的精確劑量可以各不相同，取決于患者類型、年齡和一般狀況、并發(fā)癥性質(zhì)、具體的酶抑制劑和其給藥方式等。
本發(fā)明化合物最好配制成易于給藥和劑量均一的劑型。本文使用的劑量單位形式是指適用于待治療患者的酶抑制劑的物理獨(dú)立單位。每個(gè)劑量應(yīng)該包含估計(jì)其本身或與選定的藥用載體介質(zhì)一起可產(chǎn)生需要的治療效應(yīng)的活性物質(zhì)的量。通常給予本發(fā)明化合物的劑量單位含約1mg-2,500mg所述化合物(以所述制劑重量計(jì))，優(yōu)選含約5mg-250mg。
根據(jù)需要治療的糖尿病并發(fā)癥的性質(zhì)，本發(fā)明化合物可以口服或胃腸外給予，胃腸外給予例如為肌內(nèi)注射、腹膜注射、靜脈輸注等。為了獲得需要的治療效應(yīng)，口服或胃腸外給予本發(fā)明化合物的劑量水平為每天每公斤患者體重約0.7μg-20mg、優(yōu)選為約30μg-3.5mg，每天一次或多次。
特別優(yōu)選口服活性酶抑制劑，前提是口服劑量能夠使抑制劑在血液和/或靶組織達(dá)到有效治療水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地測定去蛋白血液、腎臟和其它靶組織樣品中的小分子抑制劑水平?？梢员容^這些樣品中的抑制劑濃度與預(yù)定抑制常數(shù)。組織水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抑制常數(shù)說明缺乏治療活性。如果是不可逆性抑制劑，可通過測定相應(yīng)組織的FL3P激酶水平證實(shí)或反駁缺乏這樣的治療活性。在所有情況下，可通過使人類或動(dòng)物受試者攝食富含糖化賴氨酸殘基或果糖-賴氨酸的食物，以及在攝食前和攝食后檢測其尿液中的3DG和3DF量，評(píng)價(jià)治療活性。與相同受試者抑制劑治療之前分泌水平相比，其系統(tǒng)內(nèi)具有治療活性抑制劑的受試者分泌3DG和3DF均降低，而尿液分泌的果糖-賴氨酸增加，詳見下文。
根據(jù)選定的確切抑制劑，通常給予本發(fā)明化合物一天一次或最高可達(dá)每天4-5次。盡管優(yōu)選一天一次的給藥方案，但是使糖尿病患者習(xí)慣于密切注意其疾病狀態(tài)，這樣如果需要的話容易接受更頻繁的給藥方案，以便傳遞上述日劑量。但是，給予本文所述化合物和組合物的準(zhǔn)確方案必須取決于所治療患者個(gè)體的需要、所給予治療的類型和主治醫(yī)師的判斷。本文使用的術(shù)語“患者”包括人類和動(dòng)物。
本文所述抑制劑化合物可用于抵抗糖尿病并發(fā)癥，尤其是可用于抵抗影響40％以上的糖尿病患者而且是需要透析和腎臟移植的終末期腎病的主要原因的糖尿病腎病。此外，這些抑制劑可用于預(yù)防或治療AGE-蛋白形成引起的其它病癥，例如高血壓、中風(fēng)、神經(jīng)變性性疾病如Alzheimer型老年性癡呆、循環(huán)疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障和老年性全身性衰老作用。
初步的實(shí)驗(yàn)表明，長期攝食糖化蛋白刺激賴氨酸回收途徑對(duì)健康引起嚴(yán)重不利影響。與FL的情況相同，在喂飼糖化蛋白膳食的受試動(dòng)物觀測到FL3P、3DG和3DF升高。見表B。經(jīng)過8個(gè)月這樣的膳食后，在糖化蛋白膳食動(dòng)物觀測到類似于在糖尿病腎臟見到的明顯腎臟病理學(xué)證據(jù)，詳見下文實(shí)施例10。還在攝食少量糖化蛋白的人類自愿者觀測到尿液中的3DG和3DF水平瞬時(shí)升高。
表B糖化蛋白％FL3P濃度(nM，腎臟)3DG/3DF濃度(μM，血漿)0 97 1.4/0.051 295 -2.5605 -5 937 -10 10663.6/0.1220 12595.2/0.1430 12676.2/0.28因?yàn)榇碳ば掳l(fā)現(xiàn)的賴氨酸回收途徑導(dǎo)致系統(tǒng)性3DG水平顯著升高，所以進(jìn)行研究確定糖化膳食是否對(duì)妊娠產(chǎn)生明顯影響。迄今獲得的結(jié)果提示，該途徑具有非常強(qiáng)的作用，見隨后的實(shí)施例。
另外，眾所周知的是，大鼠和小鼠易感品系早期(斷奶后)供給的膳食對(duì)1型糖尿病具有顯著影響，發(fā)病率10-90％。在最近10年，人們對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了較多的研究。參見例如，Diabetes，46(4)589-98(1997)和Diabetes Metab.Rev.，12(4)341-59(1996)，以及其中引用的參考文獻(xiàn)。部分本發(fā)明者就兩種由兩個(gè)極端誘導(dǎo)糖尿病的膳食進(jìn)行了研究。AIN-93(Dyets，Inc.)引起的糖尿病發(fā)病率最低，而且尿中3DF/肌苷比值在已進(jìn)行的觀測中最低(1.0)。Purina500引起的糖尿病發(fā)病率最高，尿中3DF/肌苷比值升高2.5倍。由于在大鼠胰腺觀測到FL3P、3DG和3DF，所以果糖賴氨酸激酶和該代謝途徑的代謝物可能參與I型糖尿病的發(fā)生。該型糖尿病易感動(dòng)物(人類胰島素依賴性糖尿病或I型糖尿病的有用模型)的免疫系統(tǒng)異常，使其對(duì)出現(xiàn)于胰腺β-細(xì)胞的未知抗原敏感，導(dǎo)致所述動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)對(duì)其β-細(xì)胞的自身免疫性攻擊。隨后導(dǎo)致胰腺破壞，因此使動(dòng)物不能產(chǎn)生胰島素。3DG與蛋白反應(yīng)可產(chǎn)生新的抗原位點(diǎn)是眾所周知的。因此，看來各種膳食的抗原性質(zhì)來源是胰腺分解果糖賴氨酸-3-磷酸產(chǎn)生的3DG。
此外，因?yàn)橐阎?DG一般與胺類反應(yīng)，所以它能夠與DNA相互作用，而且具有致突變和致癌潛能以及交聯(lián)蛋白質(zhì)。
發(fā)現(xiàn)FL3P賴氨酸回收途徑使得首次可以有效區(qū)分糖尿病人群，而且可以確定什么亞群的糖尿病患者可能發(fā)生糖尿病并發(fā)癥?？梢詫?duì)受試者生物體液如尿液、血液組分(尤其是血漿或血清)、淋巴液、間隙液等方便地進(jìn)行該檢測。
過夜禁食后，人類受試者攝食含較高濃度的糖化賴氨酸殘基的食品。例如該食品形式可以是奶酪/糖“糕點(diǎn)”(見下文實(shí)施例5所述)或某些其它糖化賴氨酸或合成果糖-賴氨酸的合適來源。當(dāng)使用含糖化賴氨酸殘基的蛋白時(shí)，糖化賴氨酸含量優(yōu)選為總蛋白氨基酸的0.02-10％，或更優(yōu)選為約0.2-0.4％?？诜┝康奶腔嚢彼釟埢目偭繎?yīng)該約0.3g。最好在攝食糖化賴氨酸來源之前、之后1、3和5小時(shí)、或各個(gè)臨床情況許可的其它合適時(shí)間收集尿液樣品。
檢測尿液樣品的3DG和3DF水平，計(jì)算3DG和3DF代謝物的比率。在該檢測中使用的具體方法學(xué)對(duì)實(shí)施本發(fā)明不是必需的。需要的話，可使用以下實(shí)施例5所述的GC方法。或者可以使用比色測定法或免疫測定法，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
顯然，糖尿病患者面對(duì)的主要危險(xiǎn)因子是血糖控制，新近的完全的糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(yàn)清楚地證實(shí)這一點(diǎn)。但是，僅用血糖水平不能解釋糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生；比較糖尿病并發(fā)癥發(fā)生率與歷史血糖水平可見，是相當(dāng)分散的。
確定發(fā)生糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)最高的糖尿病亞組人群的方法是本發(fā)明特別重要的一個(gè)方面。該方法包括攝食糖化賴氨酸源之前以及攝食后最佳時(shí)間測量FL、3DG和3DF水平。
例如，正常受試者禁食的尿液3DG/3DF比率約0.025，而糖尿病患者的該比率較高，可最高達(dá)5倍甚至更高。圖7的數(shù)據(jù)證實(shí)了這一點(diǎn)，圖7顯示血糖量正常者的3DG/3DF比為0.025(1/39.77)，在該值的周圍的散射非常緊密，而糖尿病患者的平均比率(平均值0.069)增高2倍以上，圍繞該平均值的散射也大得多。
本發(fā)明證實(shí)，糖尿病患者產(chǎn)生的3DG增加。所以，拮抗糖尿病并發(fā)癥需要高度有效地去除這種毒性代謝物。用本文所述方法計(jì)算的3DG/3DF比值使得人們可以評(píng)價(jià)3DG解毒途徑的效率。低比值的個(gè)體一般不容易發(fā)生糖尿病并發(fā)癥。較高比率個(gè)體(包括比率在正常范圍內(nèi)的個(gè)體)的風(fēng)險(xiǎn)較高，而比率高于正常范圍的個(gè)體發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)特別高。
最近對(duì)4種不同大鼠品系的血漿和尿液果糖賴氨酸(FL)的測量結(jié)果證實(shí)，其相應(yīng)腎臟處理血液FL的方式變異非常大。實(shí)際上，根據(jù)FL和其代謝物與肌苷的比值，4個(gè)品系中的2個(gè)品系(Long Evans，Brown Norway)中，腎臟濾過的所有FL都出現(xiàn)在尿液中。根據(jù)與過濾的肌苷比較，其它2個(gè)品系(Sprague Dawley，F(xiàn)ischer)中，10-20％血漿FL出現(xiàn)在尿液中。這些測量結(jié)果強(qiáng)有力地提示，哺乳動(dòng)物腎臟處理FL的變異性大。假如已知嚙齒動(dòng)物和人類腎臟功能相同，則有充分理由認(rèn)為，處理FL的相似變異存在于人類。因?yàn)镕L主要進(jìn)入果糖賴氨酸回收途徑，所以整個(gè)途徑可能在由超濾液吸收大量FL的人類個(gè)體受到明顯刺激，導(dǎo)致在腎臟局部以及整個(gè)機(jī)體產(chǎn)生高水平的3-脫氧葡糖醛酮(3DG)。該觀測結(jié)果可用作診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)，其中比較同時(shí)獲得的血漿或血清樣品和尿液樣品確定FL進(jìn)入腎臟的量以及進(jìn)一步出現(xiàn)在尿液中的部分。那么該比率明顯低于1的個(gè)體具有發(fā)生各種腎臟病理的風(fēng)險(xiǎn)，所述腎臟病理包括但不限于糖尿病腎病、老年性腎功能衰竭和腎癌。
利用對(duì)賴氨酸回收途徑的測試能夠簡便安全地測定本發(fā)明激酶抑制劑的治療效用。測試方案與以上剛提供的方案相同，例外的是除了檢測尿液3DG和3DF水平之外還檢測尿液果糖賴氨酸水平。在開始FL3P激酶抑制劑治療之前和之后進(jìn)行該試驗(yàn)均是有用的。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的尿液3DG和3DF水平相加，并與用相同樣品測定的果糖-賴氨酸水平相比較。
賴氨酸回收途徑的活動(dòng)導(dǎo)致攝食富含糖化賴氨酸殘基的食物后尿液中的3DG和3DF水平達(dá)到峰值。這些代謝物與未反應(yīng)的果糖-賴氨酸(為人體尿液的正常組分)的濃度比反映該途徑的活性。抑制賴氨酸回收途徑使排泄3DG和3DF的量減少，而果糖-賴氨酸的排泄水平增加。因此，在開始治療后，檢測(3DG＋3DF)/果糖-賴氨酸比的降低可定量激酶抑制劑的治療效用。值得注意的是，尿液體積或代謝物濃度不是解釋此測定的因素，因?yàn)橹豢紤]代謝物比值。
根據(jù)以上公開的內(nèi)容可知，經(jīng)口攝食含高濃度糖化賴氨酸殘基的食物導(dǎo)致產(chǎn)生腎臟和血清3DG。應(yīng)當(dāng)告誡腎病風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體例如糖尿病患者避免這些高濃度食物?？捎酶鞣N方法檢測糖化賴氨酸殘基濃度。下文實(shí)施例4描述了一種這樣的測量方法。然而，精確測定糖化賴氨酸殘基水平的任何合適測量方法學(xué)均可代替以下例舉的測定方法。具體設(shè)計(jì)的測定方法實(shí)例包括但不限于比色法和免疫法。
不管所用的測定方法如何，測定制成食品的糖化賴氨酸殘基含量以及將這些測定結(jié)果告知發(fā)生腎臟功能紊亂的風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，使得這類個(gè)體避免攝食糖化賴氨酸含量高的食品，均屬于本發(fā)明范疇。
提供以下實(shí)施例以更詳細(xì)地描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的目的，絕不能解釋為限制本發(fā)明。除非另有說明，否則實(shí)施例中的所有溫度均為攝氏度。
實(shí)施例1FL3P的分離和鑒定糖尿病大鼠腎臟的高氯酸提取物的31P NMR分析表明，新的糖一磷酸鹽的共振為6.24ppm，在非腎臟組織未觀測到這樣的結(jié)果，而在非糖尿病腎臟的水平明顯較低。用1-丁醇-乙酸-水(5∶2∶3)作洗脫液在微晶纖維素柱上層析所述提取物，分離出與所觀測到的共振有關(guān)的化合物。用質(zhì)子2D COSY測定其結(jié)構(gòu)為果糖-賴氨酸3-磷酸。之后通過用如上所述制備的FL注射動(dòng)物(Finot和Mauson，Helv.Chim.Acta，521488(1969))，而且表明直接磷酸化為FL3P，證實(shí)了這一點(diǎn)。用位置-3特異性氘化的FL證實(shí)磷酸位置為碳-3。這可通過分析連接和非連接的31P NMR光譜進(jìn)行。正常的P-O-C-H連接產(chǎn)生J值為10.3Hz的FL3P雙峰，而P-O-C-D沒有連接，并且產(chǎn)生連接和非連接的單峰，與3-氘化FL3P所見相同。FL3P的獨(dú)特特性是，當(dāng)用硼氫化鈉處理時(shí)，它轉(zhuǎn)化為2個(gè)新的共振5.85和5.95ppm，它們相對(duì)于甘露醇-和山梨醇-賴氨酸3-磷酸。
實(shí)施例2FL3P的合成用50ml MeOH回流1mmol二芐基-葡萄糖3-磷酸和0.25mmol α-芐酯基-賴氨酸3小時(shí)。用100ml水稀釋溶液，以吡啶鎓形式在Dow-50柱(2.5×20cm)上層析，首先用水(200ml)、然后用600ml緩沖液(0.1M吡啶和0.3M乙酸)洗脫。在水洗滌結(jié)束、緩沖液洗滌開始時(shí)洗出目標(biāo)化合物。用5％Pd/C在20psi氫下去除芐酯基和芐基封閉基團(tuán)，獲得6％產(chǎn)率的FL3P。
實(shí)施例3由FL和ATP酶性產(chǎn)生FL3P以及篩選抑制劑的測定法開始用31P NMR證實(shí)腎臟皮質(zhì)的激酶活性。用9ml含有150mM氯化鉀、5 mM DTT、15mM氯化鎂，pH7.5的50mM Tris·HCl勻漿3g新鮮的豬腎臟皮質(zhì)樣品。以10,000g離心30分鐘，然后將上清液以100,000g離心60分鐘。加入硫酸銨至60％飽和度。于4℃1小時(shí)后，離心收集沉淀物，將其溶解于5ml原緩沖液中。將該溶液的2ml等份與10mM ATP和10mM FL(按上述實(shí)施例1制備)于37℃溫育2小時(shí)。用300μl高氯酸猝滅反應(yīng)，離心去除蛋白，在SephadexG10(5×10cm)柱上脫鹽。31P NMR分析反應(yīng)混合物檢測形成的FL3P。
根據(jù)由此獲得的激酶活性證據(jù)，進(jìn)行放射性檢測。利用FL3P不能結(jié)合Dow-1陰離子交換樹脂設(shè)計(jì)此測定。試圖分離FL3P時(shí)發(fā)現(xiàn)了其該特性。因?yàn)榇蠖鄶?shù)磷酸鹽結(jié)合該樹脂，所以懷疑大量與ATP反應(yīng)的全部化合物以及任何過量的ATP會(huì)發(fā)生結(jié)合，使FL3P留在溶液中。第一步是確定去除該測定中的ATP需要的樹脂量。將所述混合物吸入200mg Dow-1的0.9ml水懸浮物中，渦旋并離心以填充樹脂，從而完成該步驟。由此吸取0.8ml上清液加到200mg新鮮干樹脂上，渦旋以及離心。吸取0.5ml體積上清液加入10ml Ecoscint A中，并計(jì)數(shù)。殘余物計(jì)數(shù)為85cpm。該步驟用于所述測定。將用60％硫酸銨沉淀皮質(zhì)勻漿粗品獲得的沉淀物于4℃再溶解于勻漿緩沖液。該測定在0.1ml 50mM Tris·HCl，pH7.5中含有10mM γ33P-ATP(40,000cpm)、10mMFL、150mM KCl、15mM氯化鎂、5mM DTT。用1、2和4mg蛋白于37℃一式三份測量30分鐘以確定FL3P產(chǎn)生速率和酶濃度之間的關(guān)系。減去同時(shí)操作的沒有FL的空白值，并記錄數(shù)據(jù)。觀測到的活性相當(dāng)于FL3P合成速率為約20nmols/hr./mg.蛋白。
實(shí)施例4葡甲胺和不同多元醇賴氨酸對(duì)形成3-脫氧葡糖醛酮的抑制作用a.一般的多元醇賴氨酸合成將糖(11mmole)、α-芐酯基-賴氨酸(10mmol)和NaBH3CN(15mmole)溶解于50ml MeOH-H2O(3∶2)中，于25℃攪拌18小時(shí)。用過量Dow-50(H)離子交換樹脂處理溶液，以分解過量的NaBH3CN。將此混合物(液體和樹脂)轉(zhuǎn)移到Dow-50(H)柱(2.5×15cm)上，用水充分洗滌，以去除過量的糖和硼酸。用5％氫氧化銨洗脫芐酯基-多元醇賴氨酸。將蒸發(fā)時(shí)獲得的殘余物溶解于水-甲醇(9∶1)中，用10％披鈀炭催化劑以氫氣(20psi)還原。過濾并蒸發(fā)獲得多元醇賴氨酸。
b.用山梨醇賴氨酸、甘露醇賴氨酸和半乳糖醇賴氨酸還原尿液和血漿3-脫氧葡糖醛酮的實(shí)施方案從6只大鼠收集尿液3小時(shí)。還獲取血漿樣品。然后腹膜注射給予大鼠10μmol山梨醇賴氨酸、甘露醇賴氨酸或半乳糖醇賴氨酸。再收集尿液3小時(shí)，在3小時(shí)結(jié)束時(shí)獲取血漿樣品。
如以下實(shí)施例5所述測定這些樣品中的3-脫氧葡糖醛酮，并將不同體積對(duì)肌苷歸一化。山梨醇賴氨酸使尿液3-脫氧葡糖醛酮平均降低50％、甘露醇賴氨酸平均降低35％，而半乳糖醇賴氨酸平均降低35％。山梨醇賴氨酸使血漿3-脫氧葡糖醛酮降低40％、甘露醇賴氨酸降低58％，而半乳糖醇賴氨酸降低50％。
c.應(yīng)用葡甲胺降低尿中的3-脫氧葡糖醛酮按上述b)處理3只大鼠，例外的是腹膜注射葡甲胺(100μmol)，代替上述的賴氨酸衍生物。注射后3小時(shí)，尿中的平均3-脫氧葡糖醛酮濃度降低42％。
實(shí)施例5人類攝食糖化蛋白后尿中的FL、3DG和3DF升高a.制備含糖化蛋白的食品將260g酪蛋白、120g葡萄糖和720ml水混合獲得均一混合物。將該混合物轉(zhuǎn)移到金屬碟并于65℃烹制68小時(shí)。然后將獲得的糕點(diǎn)磨成粗粉(a course powder)。
Kjeldahl方法測定此粉含有60％的蛋白質(zhì)。
b.測定糖化賴氨酸含量按以上步驟a制備1g所述糕點(diǎn)粉，以6N HCl回流水解20小時(shí)。用氫氧化鈉溶液將獲得的溶液pH調(diào)節(jié)為18，并稀釋至100ml。以果糖賴氨酸酸水解產(chǎn)生的產(chǎn)物furosine在氨基酸分析儀上測量果糖賴氨酸含量。用這種方法測得所述糕點(diǎn)的果糖賴氨酸含量為5.5％(w/w)。
c.實(shí)施方案讓志愿者進(jìn)食不含果糖賴氨酸的膳食2天，然后攝食如本文所述制備的食品22.5g，由此有效接受2g劑量的果糖賴氨酸。以2小時(shí)間隔收集尿液，連續(xù)收集14小時(shí)，24小時(shí)時(shí)收集最后一次尿液。
d.測量尿中的FL、3DG和3DF用Waters C18 Free Amino Acid柱和乙腈-甲醇-水(45∶15∶40)到乙腈-乙酸鈉-水(6∶2∶92)的梯度洗脫系統(tǒng)以Waters 996二極管陣列經(jīng)HPLC測量FL，洗脫速率為1ml/min。定量使用內(nèi)標(biāo)葡甲胺。
使樣品去離子后用HPLC測量3DF。應(yīng)用PA1柱(Dionex)和用32mM氫氧化鈉以1ml/min洗脫，在Dionex DX-500HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析。由用合成3DF每天獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
使樣品去離子后通過GC-MS測量3DG。以10倍過量的二氨基萘的PBS衍化3DG。乙酸乙酯提取獲得不含鹽的組分，用Tri-Sil(Pierce)將其轉(zhuǎn)化為三甲基甲硅烷基醚。在選擇離子監(jiān)測GC-MS系統(tǒng)的Hewlett-Packard5890上進(jìn)行分析。應(yīng)用以下溫度程序在融合二氧化硅毛細(xì)柱(DB-5，25mx.25mm)上進(jìn)行GC注射端口250℃、起始柱溫150℃保持1分鐘、然后以16℃/分鐘升高至290℃并保持15分鐘。定量3DG應(yīng)用使用內(nèi)標(biāo)U-13C-3DG的選定離子監(jiān)測。
圖3為一名志愿者攝食糖化蛋白后尿中產(chǎn)生的FL、3DF和3DG。顯然全部3種代謝物均快速出現(xiàn)在尿中。即使24小時(shí)后尿中3DF和3DG也都略為升高。
圖4為在7個(gè)人的受試組的每個(gè)成員中的3DF形成。在所有受試?yán)姷较嗨茍D形分布。如圖4所示，快速濃注FL后約4小時(shí)出現(xiàn)3DF排泄峰，甚至快速濃注后24小時(shí)仍可見到3DF略為升高。
實(shí)施例6進(jìn)食實(shí)驗(yàn)糖尿病患者排泄到尿中的N-乙?；?β-葡糖胺酶(NAGase)的濃度升高。人們認(rèn)為它是腎小管損害的早期標(biāo)志，但是不完全了解尿中NAGase升高的發(fā)病機(jī)理。已經(jīng)提出糖尿病患者尿中NAGase排泄量增高是由于糖尿病引起近端腎小管溶酶體活化使尿中的排泄物增加而不是細(xì)胞破壞所致。
該實(shí)施例獲得的結(jié)果表明，在所有比較中，實(shí)驗(yàn)組3DF和NAGase水平相對(duì)于對(duì)照組均升高。因此，喂飼糖化蛋白動(dòng)物將過量的NAGase排泄到尿中，類似于在糖尿病患者獲得的結(jié)果。與對(duì)照動(dòng)物相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尿中NAGase排泄量增高約50％。與對(duì)照相比，這些動(dòng)物尿中的3DF也增高5倍。由圖5和6可見，尿3DF和3DG密切相關(guān)?？磥韮煞N化合物均以腎小球?yàn)V過率從血漿中清除，而沒有重吸收。
實(shí)施例7腎臟蛋白的SDS凝膠電泳對(duì)兩只大鼠每日注射5μmol FL或甘露醇(用作對(duì)照)，連續(xù)5日。處死動(dòng)物，取出腎臟并解剖腎皮質(zhì)和髓質(zhì)。用5體積含150mM氯化鉀、15mM氯化鎂和5mM DTT，pH7.5的50mM Tris·HCl勻漿組織。以10,000g離心15分鐘去除細(xì)胞碎片，然后再將上清液以150,000g離心70分鐘。在12％聚丙烯酰胺凝膠以及4-15％和10-20％梯度凝膠上經(jīng)SDS PAGE分析溶解蛋白。在所有情況下，與注射甘露醇的動(dòng)物相比，注射FL動(dòng)物的腎臟提取物的低分子量帶消失或肉眼檢測低分子量帶減弱。
實(shí)施例83-O-甲基果糖賴氨酸的合成回流19.4g(0.1mol)無水3-O-甲基葡萄糖和1g亞硫酸氫鈉在30ml甲醇和15ml甘油中的懸浮液30分鐘，然后加入0.035molα-芐酯基-賴氨酸和4ml乙酸。回流該溶液3小時(shí)。用1體積水處理該溶液，以吡啶鎓形式在Dowex-50柱(4×50cm)上層析，首先用水洗脫，然后用乙酸吡啶鎓洗脫。合并并蒸發(fā)含純物質(zhì)的流分。將所獲得的物質(zhì)溶解于50ml水-甲醇(9∶1)，用10％披鈀炭催化劑以氫氣(20psi)還原。過濾并蒸發(fā)獲得3-O-甲基-果糖賴氨酸。
例如按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法用糖化劑例如果糖糖化選定的含氮或氧的原料(可以是氨基酸、聚氨基酸、肽等)，可制備具有上式(I)結(jié)構(gòu)的其它具體化合物，需要的話，所述糖化劑可以是化學(xué)修飾的糖化劑。
實(shí)施例9FL3P激酶活性的其它測定方法a.制備母液制備檢測緩沖液，它為100mM HEPES pH8.0、10mMATP、2mM氯化鎂、5mM DTT、0.5mM PMSF。制備2mM果糖基-精胺鹽酸的果糖基-精胺母液。制備2mM精胺鹽酸的精胺對(duì)照液。
b.合成果糖基-精胺應(yīng)用已知方法(J.Hodge和B.Fisher，Methods Carbohydr.Chem.，299-107(1963))合成果糖基-精胺。以摩爾比8∶4∶1(精胺∶葡萄糖∶焦亞硫酸鹽)制備精胺(500mg)、葡萄糖(500mg)和焦亞硫酸鈉(80mg)的50ml甲醇-水(1∶1)混合物，回流12小時(shí)。用水將所述產(chǎn)物稀釋至200ml，上樣于DOW-50柱(5×90cm)。用2柱體積水去除未反應(yīng)葡萄糖，用0.1M氫氧化銨去除所述產(chǎn)物和未反應(yīng)精胺。凍干合并的所述產(chǎn)物峰流分，通過測定所述產(chǎn)物的定量13C NMR光譜(以45°脈沖、10秒松弛延遲而且沒有NOE去連接收集NMR數(shù)據(jù))的C-2果糖基峰的積分，從而確定果糖基-精胺濃度。
c.激酶純化分析制備溫育混合物，它包含10μl所述酶制劑、10μl檢測緩沖液、1.0μCi33P ATP、10μl果糖基-精胺母液和70μl水，使其于37℃溫育1小時(shí)。溫育結(jié)束時(shí)，將90μl(2×45μl)樣品點(diǎn)樣于2個(gè)直徑2.5cm的磷酸纖維素圓盤(Whatman P-81)上，讓其干燥。用水充分洗滌圓盤。干燥后，將圓盤置于閃爍瓶中并計(jì)數(shù)。
用合適精胺對(duì)照復(fù)份測定每個(gè)酶流分。
實(shí)施例10在糖化蛋白膳食受試動(dòng)物觀測到的腎臟病理學(xué)使3只大鼠攝食糖化蛋白膳食(20％總蛋白；3％糖化蛋白)8個(gè)月，并與9只相同年齡的攝食對(duì)照膳食大鼠進(jìn)行比較。主要發(fā)現(xiàn)糖化膳食動(dòng)物的腎小球損害明顯增加。在這些動(dòng)物觀測到的常見病變是附著于腎小球囊的腎小球叢的節(jié)段性硬化、腎小管壁上皮變形和間質(zhì)纖維化。全部3只糖化蛋白膳食動(dòng)物以及僅1只對(duì)照膳食動(dòng)物的腎小球損害超過13％。其機(jī)會(huì)性發(fā)生的概率小于2％。除了在腎小球觀測到的病理學(xué)改變之外，還在腎小管中觀測到許多透明(hylinated)管型。盡管沒有定量，但是在糖化膳食動(dòng)物透明管型更多。在糖化膳食動(dòng)物還觀測到NAGase水平升高。
由該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，糖化膳食引起受試動(dòng)物發(fā)生一系列類似于在糖尿病患者腎臟觀測到的組織學(xué)病變。
實(shí)施例11糖化膳食對(duì)子代的影響在初步的實(shí)驗(yàn)中，使5對(duì)小鼠攝食糖化膳食(18％總蛋白；3％糖化蛋白)，并在7個(gè)月內(nèi)對(duì)其育種6次。產(chǎn)生的6個(gè)子代得到以下數(shù)目的活幼鼠17、23、13、0、3和0。鑒于第三次育種后活幼鼠明顯減少，所以使兩組(每組10對(duì))攝食或糖化膳食(13％總蛋白；3％糖化蛋白)或?qū)φ丈攀?13％總蛋白；0％糖化蛋白)。迄今，兩組幼鼠已經(jīng)育種4次，在兩組獲得相似的結(jié)果。第一次妊娠產(chǎn)生49/20(糖化膳食/對(duì)照膳食)幼鼠；第二次妊娠，18/41；第三次，37/27；第四次，20/33。第五次妊娠目前正在進(jìn)行中。已經(jīng)測試了小鼠對(duì)的高血糖情況。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血糖水平分別為120和112mg/dl。
小鼠尿液3DF水平的初步測定結(jié)果表明，正如所預(yù)料，攝食本文所述糖化膳食時(shí)，系統(tǒng)性3DF明顯升高(約5-10倍)。
實(shí)施例12果糖賴氨酸途徑的致癌效應(yīng)為了研究果糖賴氨酸途徑形成的代謝物的致癌潛力，在腎癌高易感性大鼠品系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。使4只大鼠攝食糖化蛋白膳食，3只大鼠攝食對(duì)照膳食。攝食10周后，處死動(dòng)物，檢測其腎臟。發(fā)現(xiàn)攝食糖化膳食的全部4只大鼠的腎癌大小超過1mm，而在對(duì)照大鼠沒有見到這樣大的腎癌。其機(jī)會(huì)性發(fā)生的概率小于2％。資料表明，動(dòng)物膳食中的糖化蛋白產(chǎn)生的過量果糖賴氨酸在腎小管細(xì)胞(已知腎小管細(xì)胞是大多數(shù)腎癌的細(xì)胞來源)中引起3DG水平升高，3DG可與細(xì)胞DNA相互作用，引起各種突變，最終導(dǎo)致發(fā)生癌癥?？赡茉撨^程在人類腎癌以及其它部位的癌癥發(fā)生中起作重要作用。
實(shí)施例13糖化蛋白膳食對(duì)易感大鼠腎細(xì)胞癌的膳食效應(yīng)在評(píng)價(jià)糖化蛋白膳食和腎細(xì)胞癌的關(guān)系的其它實(shí)驗(yàn)中，將28只具有使其對(duì)發(fā)生腎癌易感的突變的大鼠分為兩組。一組攝食糖化蛋白膳食，另一組攝食對(duì)照膳食。糖化蛋白膳食為其中加入3％糖化蛋白的標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)膳食。糖化蛋白的制備為加入水(2×干燥物質(zhì)重量)使酪蛋白和葡萄糖(2∶1)混合在一起，于60℃焙烤混合物72小時(shí)。以相同方式制備對(duì)照，不同的是不用水而且在焙烤前不將酪蛋白和葡萄糖混合在一起。3周齡斷奶后立即使大鼠攝食所述膳食，并在以后的16周中保持任意進(jìn)食所述膳食。然后處死動(dòng)物，固定腎臟，制作hemotoxylin和曙紅切片。受過訓(xùn)練的病理學(xué)家檢測病變。鑒定了4種類型的病變。包括囊腫、非常小的腫瘤樣細(xì)胞團(tuán)塊(通常不到10個(gè)細(xì)胞)、0.5mm或更小的小腫瘤以及大于0.5mm的腫瘤。在攝食糖化膳食的動(dòng)物觀測到的每種類型病變均較攝食對(duì)照膳食的動(dòng)物多，見下表所示。
為了總結(jié)所述結(jié)果，計(jì)算每種膳食的每個(gè)腎臟切片的平均病變數(shù)。對(duì)照膳食和糖化膳食分別為0.82±0.74和2.43±2.33。機(jī)會(huì)性發(fā)生的概率約2/100,000。
這些結(jié)果強(qiáng)有力地支持上述假說本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)即賴氨酸回收途徑的作用還引起突變，也因此產(chǎn)生致癌效應(yīng)。這些結(jié)果為開發(fā)抑制該途徑的治療方法和治療藥物以減輕腎癌以及其中該途徑可能具有相似作用的其它器官癌癥提供了基礎(chǔ)。
實(shí)施例14尿中排泄3-脫氧-果糖說明I型糖尿病患者發(fā)生微量蛋白尿如上所述，糖尿病患者的糖化中間體3脫氧-葡糖醛酮(3DG)及其還原性去毒產(chǎn)物3脫氧-果糖(3DF)的血清水平升高。在Joslin糖尿病中心一組前展性胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和微量蛋白尿(根據(jù)開始于1990-1993在兩年中對(duì)基線水平的多次測定結(jié)果)而沒有服用ACE抑制劑的患者中的一組39名個(gè)體中，鑒定了所述化合物基線水平和隨后的微量蛋白尿(MA)進(jìn)展的關(guān)系。
通過HPLC和GC-MS檢測隨尿滴(random spot urine)的3DF和3DG基線水平。與非進(jìn)展者(non-progressor)(n＝15)相比，在隨后的4年中發(fā)展為高水平MA或蛋白尿的個(gè)體(n＝24)的log 3DF/尿肌苷比的基線水平明顯較高(p＝0.02)。在該研究中測得的進(jìn)展者(progressor)的肌苷基線水平為約0.24μmole/mg，而非進(jìn)展者的肌苷基線水平約0.18μmole/mg。各組的基線3DG/尿液肌苷比不同。調(diào)整HgAIC(糖基化血紅蛋白的主要部分)基線水平不會(huì)明顯改變這些發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果為尿3DF和糖尿病腎臟并發(fā)癥發(fā)生有關(guān)提供了另外的證據(jù)。
A.定量3-脫氧果糖如下處理樣品使0.3mL等份受試樣品通過含0.15mL AG 1-X8和0.15ml AG 50W-X8樹脂的離子交換柱。然后用0.3mL去離子水將柱洗滌2次，吸去多余液體，經(jīng)0.45mm Millipore濾器過濾。
用Dionex DX500層析系統(tǒng)分析注射(50μL)的處理樣品。carbopac PA1陰離子交換柱應(yīng)用16％氫氧化鈉(200mM)和84％去離子水組成的洗脫液。應(yīng)用脈沖電流檢測器通過電化學(xué)檢測3DF。在每個(gè)未知樣品前后均進(jìn)行包括預(yù)期3DF濃度的標(biāo)準(zhǔn)3DF溶液。
B.尿液肌苷的測量采用改良用于板讀器的終點(diǎn)比色法(Sigma診斷試劑盒555-A)測定尿液肌苷濃度。鑒定肌苷濃度使尿液體積歸一化，以測定其中存在的代謝物水平。
C.尿液白蛋白的測量為了測定受試者尿液白蛋白水平，收集尿滴，用N-白蛋白試劑盒(Behring)在BN100裝置上進(jìn)行免疫濁度測定法?？墒惺郢@得抗白蛋白抗體。用任何合適的測定法均可測定尿液白蛋白水平，包括但不限于ELISA測定法、放射免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡分析和點(diǎn)印跡分析。
根據(jù)在Joslin糖尿病中心的患者獲得的研究資料，可知尿液3DF水平升高與發(fā)生糖尿病微量蛋白尿有關(guān)。該觀測結(jié)果為評(píng)價(jià)糖尿病患者發(fā)生嚴(yán)重腎臟并發(fā)癥的可能性提供了新的診斷參數(shù)。
盡管以上描述和/或例舉了一些本發(fā)明實(shí)施方案，但是根據(jù)以上的公開內(nèi)容，各種其它實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。所以，本發(fā)明不限于所述和/或例舉的具體實(shí)施方案，而是能夠在不偏離所附權(quán)利要求書范圍下進(jìn)行各種改變和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.用于降低患者對(duì)與該患者攝入糖化蛋白有關(guān)的癌癥的易感性的化合物，所述化合物為具有下式結(jié)構(gòu)的化合物及其異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽 其中X為-NR’-或-O-，R’選自H、和直鏈或支鏈烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R為選自以下基團(tuán)的取代基H、氨基酸殘基、聚氨基酸殘基、肽鏈、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代而且被至少一個(gè)-O-、-NH-或-NR”-部分間斷的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)，R”是直鏈或支鏈烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是當(dāng)X表示-NR’-時(shí)，R和R’與其連接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7環(huán)原子的雜環(huán)，其中氮和氧中的至少一個(gè)是所述環(huán)的唯一雜原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述雜環(huán)取代基選自H、烷基(C1-C6)、鹵素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4個(gè)線性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羥亞甲基部分 ；Z選自-H、-O-烷基(C1-C6)、-鹵素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2，
2.用于降低患者對(duì)與該患者攝入糖化蛋白有關(guān)的癌癥的易感性的方法，該方法包括給予包含活性化合物的藥用組合物的步驟，所述活性化合物具有有效抑制果糖-賴氨酸酶性轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸的抑制活性。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述癌癥為腎細(xì)胞癌。
4.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述活性化合物具有競爭性或非競爭性酶抑制作用，而且其抑制常數(shù)(Ki)小于約1mM。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述活性化合物(i)分子量小于約2,000道爾頓；(ii)在生理鹽水或血清中的溶解度大于或等于10μM；(iii)在生理鹽水或血清中溫育至少1小時(shí)后其酶抑制活性保留至少50％。
6.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述化合物為具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物及其異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽 其中X為-NR’-或-O-，R’選自H、和直鏈或支鏈烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R為選自以下基團(tuán)的取代基H、氨基酸殘基、聚氨基酸殘基、肽鏈、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代而且被至少一個(gè)-O-、-NH-或-NR”-部分間斷的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)，R”是直鏈或支鏈烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是當(dāng)X表示-NR’-時(shí)，R和R’與其連接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7環(huán)原子的雜環(huán)，其中氮和氧中的至少一個(gè)是所述環(huán)的唯一雜原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述雜環(huán)取代基選自H、烷基(C1-C6)、鹵素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4個(gè)線性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羥亞甲基部分 ；Z選自-H、-O-烷基(C1-C6)、-鹵素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2。
7.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述藥用組合物口服給予。
8.預(yù)防、減輕或延遲患者因?yàn)锳GE-蛋白形成導(dǎo)致發(fā)生癌癥的方法，該方法包括給予所述患者治療有效量的抑制所述患者產(chǎn)生3-脫氧葡糖醛酮的化合物。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述癌癥是腎細(xì)胞癌。
10.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述化合物為具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物及其異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽 其中X為-NR’-或-O-，R’選自H、和直鏈或支鏈烷基(C1-C4)和取代或未取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R為選自以下基團(tuán)的取代基H、氨基酸殘基、聚氨基酸殘基、肽鏈、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)、未取代或被含至少一個(gè)氮或氧的取代基取代而且被至少一個(gè)-O-、-NH-或-NR”-部分間斷的直鏈或支鏈脂肪族基團(tuán)(C1-C8)，R”是直鏈或支鏈烷基(C1-C6)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是當(dāng)X表示-NR’-時(shí)，R和R’與其連接的氮原子一起也可以表示取代或未取代的5-7環(huán)原子的雜環(huán)，其中氮和氧中的至少一個(gè)是所述環(huán)的唯一雜原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)和所述雜環(huán)取代基選自H、烷基(C1-C6)、鹵素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1是具有1-4個(gè)線性碳原子的多元醇部分；Y是羰基部分 或羥亞甲基部分 ；Z選自-H、-O-烷基(C1-C6)、-鹵素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2。
11.在易感受試動(dòng)物誘發(fā)癌癥的方法，該方法包括喂飼所述受試動(dòng)物糖化蛋白膳食，所述喂飼糖化蛋白膳食的量和時(shí)間足以維持所述受試動(dòng)物生物體液的3-脫氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂飼基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受試動(dòng)物生物體液3DG含量的至少三倍。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中所述癌癥是腎細(xì)胞癌。
13.篩選影響癌癥發(fā)生的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(i)如下在易感受試動(dòng)物誘發(fā)癌癥喂飼所述動(dòng)物糖化蛋白膳食，所述喂飼糖化蛋白膳食的量和時(shí)間足以維持所述動(dòng)物生物體液的3-脫氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂飼基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受試動(dòng)物相同生物體液3DG含量的至少三倍；(ii)將受試物質(zhì)給予一部分所述受試動(dòng)物，而不給予另一部分受試動(dòng)物；(iii)處死所述受試動(dòng)物；以及(iv)比較在各所述部分易感受試動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的核癌(nucleiccarcinomas)。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中各所述部分約為所述受試動(dòng)物的一半。
15.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述癌癥是腎細(xì)胞癌。
16.篩選預(yù)防、降低或延遲癌癥發(fā)生的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟喂飼易感受試動(dòng)物糖化蛋白膳食，所述喂飼糖化蛋白膳食的量和時(shí)間足以維持所述動(dòng)物生物體液的3-脫氧葡糖醛酮(3DG)含量升高至喂飼基本上不含所述糖化蛋白的膳食的相似易感受試動(dòng)物相同生物體液3DG含量的至少三倍；將受試物質(zhì)給予一部分所述受試動(dòng)物，而不給予另一部分受試動(dòng)物；處死所述受試動(dòng)物；以及比較各所述部分易感受試動(dòng)物組織切片。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中各所述部分約為所述受試動(dòng)物的一半。
18.按照權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是腎細(xì)胞癌。
全文摘要
本發(fā)明所公開的一類化合物在新發(fā)現(xiàn)的代謝途徑的ATP依賴性反應(yīng)中抑制果糖－賴氨酸酶性轉(zhuǎn)化為果糖－賴氨酸－3－磷酸。按照該途徑的正常作用,分解果糖－賴氨酸－3－磷酸(FL3P)形成游離賴氨酸、無機(jī)磷酸鹽和3－脫氧葡糖醛酮(3DG),后者是活性蛋白修飾劑。3DG還原為3－脫氧果糖(3DF)可去除毒性,或者它可以與內(nèi)源蛋白反應(yīng)形成高級(jí)糖化終末產(chǎn)物修飾蛋白(AGE－蛋白),人們認(rèn)為AGE－蛋白引起糖尿病并發(fā)癥。還公開了應(yīng)用這類抑制劑減少AGE－蛋白形成,因此緩解、減輕和延遲糖尿病并發(fā)癥的方法,以及評(píng)價(jià)糖尿病患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法和通過檢測口服含果糖－賴氨酸的食品后生物樣品中的3DG與3DF的比率確定所公開抑制劑的治療效力的方法。
文檔編號(hào)C07H15/12GK1331599SQ99815023
公開日2002年1月16日 申請日期1999年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月28日
發(fā)明者T·R·布朗 申請人:?？怂蛊跛及┌Y中心