專(zhuān)利名稱(chēng)：從任意復(fù)雜起始材料中分離核酸的制劑和方法以及接下來(lái)的染色體組基因分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是用于將特別是DNA的核酸結(jié)合到固相而從任意復(fù)雜起始材料(comlex srarting materials)和大量物質(zhì)中分離核酸的不含有離液序列高的成分的制劑，其包括包含至少一種反離液序列高的(antichaotropic)鹽成分的溶解/結(jié)合緩沖液體系，本文公開(kāi)的固相和洗滌和洗脫緩沖液。所述溶解/結(jié)合緩沖液體系可以以備好待用的反應(yīng)器的水溶液或者以固體制劑存在。應(yīng)用于利用離液劑分離的所有載體，優(yōu)選玻璃纖維簇，玻璃膜，硅載體，陶瓷，沸石或者具有可以轉(zhuǎn)化為負(fù)電勢(shì)能的陰性功能化或化學(xué)改性表面的材料，可以作為固相。
此外，本發(fā)明的目的是一種使用根據(jù)本發(fā)明的制劑從任意的復(fù)雜起始材料中分離核酸特別是DNA的方法，其特征在于，溶解起始材料，將核酸結(jié)合到載體上，洗滌結(jié)合載體的核酸，和洗脫核酸，如果需要，接著擴(kuò)增選擇的序列片段，如果需要，接著就在同一反應(yīng)室內(nèi)分析多基因片段。本發(fā)明方法的應(yīng)用領(lǐng)域是所有與DNA分離有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室，例如法醫(yī)學(xué)，食品檢驗(yàn)，藥物檢驗(yàn)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，遺傳工程和所有的其它鄰接領(lǐng)域。
在常規(guī)的條件下，通過(guò)在強(qiáng)變性和還原條件下分解含有核酸的起始材料而從細(xì)胞和組織中分離DNA，部分也使用蛋白質(zhì)降解酶，純化苯酚/氯仿萃取步驟中得到的核酸級(jí)分并且利用透析和乙醇沉淀從水相中獲得核酸(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.；和Maniatis，T，1989，CSH，“分子克隆”(Molecular Cloning)。
用于從細(xì)胞和特別是組織中分離核酸的“常規(guī)方法”是非常費(fèi)時(shí)的(部分超過(guò)48小時(shí))，需要對(duì)設(shè)備付出相當(dāng)可觀(guān)的支出，否則在實(shí)際條件下不能完成。另外，本發(fā)明方法使用化學(xué)品苯酚和氯仿的程度不大，因此對(duì)健康的危害不大。
從各種生物起始材料分離核酸的各種替代方法，使得避免昂貴且不健康的核酸苯酚/氯仿萃取并縮短耗費(fèi)的時(shí)間。
所有這些方法都以Vogelstein和Gillespie研究出的從瓊脂糖凝膠制備和分析純化DNA片段的方法為基礎(chǔ)(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Nalt.Acad.Sc.USA)，1979，76，615～619)。該方法包括將含有要分離的DNA泳帶的瓊脂糖溶解于離液序列高的鹽(NaJ)的飽和溶液，并且使DNA結(jié)合玻璃顆粒。接著用洗滌溶液(20mM tris HCl[pH7.2]；200mM NaCl；2mM EDTA；50％ v/v乙醇)洗滌固定在玻璃顆粒上的DNA，并且從載體顆粒上解溶下來(lái)。
迄今為止，對(duì)該方法已經(jīng)有了幾次改進(jìn)，并且當(dāng)時(shí)用于各種來(lái)源的核酸的提取和純化的各種過(guò)程(Marko，M.A.；Chipperfield，R.和Birnboim，H.G.；1982，生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)，121，382～387)。
另外，今天世界范圍內(nèi)已經(jīng)存在大量的主要用于純化瓊脂糖凝膠的DNA片段和用于從細(xì)菌溶解液分離質(zhì)粒DNA，還有用于從血液，組織還有細(xì)胞培養(yǎng)物分離具有較長(zhǎng)鏈的核酸(基因組DNA，細(xì)胞總RNA)的試劑體系。
所有這些商業(yè)上可獲得的試劑盒都是以在各種公知的離液序列高的鹽的溶液的存在下使核酸結(jié)合無(wú)機(jī)載體的原理為基礎(chǔ)，使用作為載體研細(xì)的玻璃粉末的懸浮液(例如玻璃乳液，BIO101，LaJolla，CA)，硅藻土(Sigma公司)或者還有硅膠(Diagen，DE4139664A1)。
US5,234,809(Boom)公開(kāi)了分離用于實(shí)施多種各種用途的核酸的方法。其中描述了通過(guò)將起始材料與離液序列高的緩沖液和結(jié)合DNA的固相一起溫育而從含有核酸的起始材料中分離核酸的方法。所述離液序列高的緩沖液完成起始材料的溶解以及核酸與固相的結(jié)合。該方法也很好地適合從少量材料中分離核酸，特別是在分離病毒核酸領(lǐng)域中應(yīng)用的實(shí)施中。
這些方法的具體改進(jìn)涉及使用在具體方面應(yīng)用中有利的新的載體(Invitek GmbH WO-A95/34569)。
然而，以將起始材料與離液序列高的緩沖液和結(jié)合DNA的固相一起溫育為基礎(chǔ)的從復(fù)雜起始材料分離核酸的方法的決定性缺陷，事實(shí)上，在于通過(guò)離液序列高的緩沖液分解細(xì)胞不適用于只是十分不充分的所有的材料或工作，并且對(duì)于更大量的起始材料高度費(fèi)時(shí)。除此之外，如果例如必須從組織樣品中分離DNA則需要機(jī)械勻漿方法。此外，總是使用各種濃度的不同的離液序列高的緩沖液來(lái)研究各種方面。因此，該方法不普遍適用。
盡管通過(guò)多種用于分離核酸(特別是從復(fù)雜起始材料分離基因組DNA)的商業(yè)上可獲得的產(chǎn)物可以解決起始材料可能難以溶解而產(chǎn)生的問(wèn)題，但是他們最大的缺陷是不再是常規(guī)的“單一試管”方法，該方法是在含有蛋白水解酶的常規(guī)緩沖液中進(jìn)行起始材料的溶解的根據(jù)該美國(guó)專(zhuān)利的方法的特征。完成溶解之后，必須分開(kāi)向溶解母液加入接下來(lái)的例如核酸與離心膜結(jié)合所需要的離液序列高的離子。但是它們不能形成溶解緩沖液的一部分，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)破壞離液序列高的鹽的功能這一點(diǎn)是公知的，并且將當(dāng)然立即破壞有效溶解需要的蛋白水解酶。
這就是為什么使用離液序列高的鹽的分離核酸的方法盡管有缺點(diǎn)，但是仍然為世界范圍所接受并且利用商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品上百萬(wàn)次使用。這些體系非常容易使用并且總是根據(jù)下面的原理起始材料溶解，接著使核酸與玻璃或載體懸浮液上位于離心柱中的二氧化硅膜的固相結(jié)合，洗滌結(jié)合的核酸，并且接著用不大離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫核酸。
所有這些體系以在離液序列高的鹽的存在下核酸與各載體表面結(jié)合為基礎(chǔ)，即至少一種緩沖液含有離液序列高的鹽作為主要成分。這可能已經(jīng)指溶解緩沖液或者包括蛋白水解酶需要的在起始材料完全溶解之后加入的結(jié)合緩沖液的體系的情況。
用于鹽析帶負(fù)電荷，中性或堿性蛋白質(zhì)溶液的感膠離子序形成離液序列高的鹽的基礎(chǔ)。因此，離液序列高的鹽特征在于將蛋白質(zhì)變性，提高非極性物質(zhì)在水中的溶解度并且破壞疏水相互作用。根據(jù)本領(lǐng)域值得注意的這些性質(zhì)的狀態(tài)，也用離液序列高的鹽緩沖體系，破壞含水介質(zhì)的超級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使核酸與選擇的固相結(jié)合。用于分離核酸的最重要的試劑是高氯酸鈉，碘化鈉，碘化鉀，硫氰酸胍和鹽酸胍。但是，另一方面，它們都昂貴，另一方面，部分有毒或腐蝕性。
直到今天，非常多的專(zhuān)利申請(qǐng)和授權(quán)的專(zhuān)利都是以本領(lǐng)域的這種狀態(tài)為基礎(chǔ)，其中總是涉及該方法的變化，例如使用新的載體或更有效的洗滌緩沖液等，基本原理總是使用用于結(jié)合到由二氧化硅材料組成的固相的離液序列高的鹽。
在離液序列高的鹽的存在下核酸與無(wú)機(jī)載體結(jié)合的物理-化學(xué)原理認(rèn)為是技術(shù)人員的知識(shí)范圍。核酸與無(wú)機(jī)載體的表面結(jié)合干擾含水介質(zhì)的超級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)所述含水介質(zhì)核酸被吸附到無(wú)機(jī)材料特別是玻璃或二氧化硅顆粒的表面。干擾含水介質(zhì)的超級(jí)結(jié)構(gòu)總是要求存在離液序列高的離子。在高濃度離液序列高的鹽的情況下，該反應(yīng)幾乎定量進(jìn)行。根據(jù)所述的這些物理-化學(xué)發(fā)現(xiàn)，專(zhuān)家們進(jìn)行了下面的操作所有商業(yè)上可獲得的用于分離核酸的體系，必須含有具有用于使核酸與結(jié)合核酸的固相結(jié)合的高離子強(qiáng)度的離液序列高的鹽的緩沖液成分。
更出人意料的是根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，即，在溶解/結(jié)合緩沖液體系中含有反離液序列高的鹽的制劑，同樣和更好地適合從任意的特別是復(fù)雜起始材料分離核酸。
根據(jù)權(quán)利要求書(shū)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。這就是為什么本發(fā)明主題是用于將特別是DNA的核酸結(jié)合到固相，而從任意復(fù)雜起始材料中分離核酸的不含有離液序列高的成分的制劑和方法，所述制劑包括包含至少一種反離液序列高的鹽成分的溶解/結(jié)合緩沖液體系，本文公開(kāi)的固相和洗滌和洗脫緩沖液。本發(fā)明意義上的反離液序列高的成分是銨鹽，銫鹽，鈉鹽和/或鉀鹽，優(yōu)選氯化銨。
另外，所述溶解/結(jié)合緩沖液體系含有已知的去污劑和添加劑，例如tris-HCl，EDTA，聚乙烯吡咯烷酮，CTAB，tritonX-100，N-月桂基肌氨酸，檸檬酸鈉，DTT，SDS和/或Tween。實(shí)施的一個(gè)優(yōu)選的變化方法中，溶解/結(jié)合緩沖液體系含有一種醇，例如乙醇和異丙醇和酶，如果需要，優(yōu)選降解蛋白質(zhì)的酶，例如蛋白酶，用于結(jié)合固相。
根據(jù)本發(fā)明，可以利用本領(lǐng)域相關(guān)的原理解決分離核酸的具體問(wèn)題，或者就具體相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和使現(xiàn)存變化方法有效。因此其適合用作完全自動(dòng)高產(chǎn)率方法。
完全出人意料并且與本領(lǐng)域已知狀態(tài)不同的是，核酸，特別是基因組DNA，可以根據(jù)本發(fā)明結(jié)合無(wú)機(jī)載體試劑，溶解/結(jié)合緩沖液體系不含有離液序列高的鹽成分并且也在常規(guī)條件下洗脫。
此外，如果需要，多種完全不同的鹽作為溶解/結(jié)合緩沖液體系的成分，對(duì)于核酸與以玻璃或二氧化硅為基礎(chǔ)的常規(guī)載體結(jié)合來(lái)說(shuō)是足夠的。
特別出乎我們意料的是，使用關(guān)于迄今為止使用的用于結(jié)合核酸的離液序列高的鹽表現(xiàn)出絕對(duì)對(duì)立作用的化學(xué)-物理特征的鹽可以實(shí)現(xiàn)最好的結(jié)果。因此，我們可以稱(chēng)這些鹽為反離液序列高的鹽。
因此，使用一種溶解/結(jié)合緩沖液在從各種復(fù)雜起始材料(例如血液，組織，植物)提取基因組DNA方面可能至少實(shí)現(xiàn)相同量和質(zhì)量的結(jié)果，所述溶解/結(jié)合緩沖液的主要成分是例如銨鹽，而不是離液序列高的鹽(商售提取試劑盒)，保持其它反應(yīng)成分，載體不變，并且給出完全相同的反應(yīng)過(guò)程。
因此，特別是，銨離子是化學(xué)-物理方面性質(zhì)表現(xiàn)出與感膠離子序的已知的離液序列高的離子絕對(duì)對(duì)立的感膠離子序中的離子。
只是用一種溶解/結(jié)合緩沖液中的反離液序列高的鹽代替迄今為止使用的離液序列高的鹽，所有其它參數(shù)不變，則在已知固體載體的表面上至少合適的定量分離核酸是可能的。
這意味著同樣有可能通過(guò)不將蛋白質(zhì)變性，并且使其穩(wěn)定的鹽也從復(fù)雜起始材料中分離核酸，所述鹽不提高非極性物質(zhì)在水中的溶解度而是減小該溶解度，并且所述鹽不破壞疏水性相互作用，而是增強(qiáng)該作用，來(lái)純化核酸并且將它們送至通常的應(yīng)用。
本發(fā)明以核酸與固體，優(yōu)選無(wú)機(jī)載體結(jié)合的新的另一種機(jī)理為基礎(chǔ)，提供了一種從復(fù)雜起始材料分離核酸的普遍適用的新的方法。
因此，本發(fā)明使用另一種化學(xué)品作為各試驗(yàn)試劑盒(制劑)的基本成分，通過(guò)使用以離液序列高的鹽為基礎(chǔ)的溶解/結(jié)合緩沖液的新的組合物，以核酸結(jié)合各種二氧化硅或通常的玻璃材料為基礎(chǔ)，來(lái)分離核酸，特別是用于分離基因組核酸。
因此，根據(jù)本發(fā)明的使用反離液序列高的鹽的方法，提供了從試驗(yàn)途徑實(shí)施已知的分離核酸的方法過(guò)程，并且特征在于1.溶解起始材料2.核酸與一種固相結(jié)合(離心柱或懸浮液)3.洗滌結(jié)合的核酸4.用已知的低鹽緩沖液洗脫核酸。
本發(fā)明提供了高效且快速地從任意的，如果需要，從復(fù)雜起始材料，分離核酸，特別是基因組核酸結(jié)合所需要的反離液序列高的離子，可以是溶解/結(jié)合緩沖液的成分，甚至包括蛋白水解酶。根據(jù)本發(fā)明的方法因此容易并且普遍適用。
通過(guò)不使用離液序列高的物質(zhì)通過(guò)孵育含有核酸的起始材料，進(jìn)行從任意的起始材料分離核酸，特別是DNA，將其接觸-包括含有一種反離液序列高的鹽成分，至少一種去污劑，如果需要，添加劑和，如果需要，一種酶的水溶液的溶解/結(jié)合緩沖液體系，-和一種任意的固相，優(yōu)選玻璃纖維簇，玻璃膜，玻璃，沸石，陶瓷和其它二氧化硅載體。
這樣，使起始材料溶解并且接著使DNA與固相結(jié)合。接著，根據(jù)已知的方法洗滌結(jié)合的核酸并且從固相解溶下來(lái)。
在特殊提取方案情況下，如果需要，可以向溶解母液中加入另外的去污劑，醇或去污劑/醇的混合物。
優(yōu)選的起始材料是密集植物材料，例如果實(shí)，種子，葉子，針葉等，臨床相關(guān)樣品，例如全血，組織，microbioptates，石蠟包被的材料，ercp-樣品，棉簽，食品，例如魚(yú)，香腸，罐頭，牛奶，法醫(yī)樣品，例如頭發(fā)根，煙蒂，血跡和其它含有DNA的樣品。
本發(fā)明意義上的優(yōu)選離子是感膠離子序中存在的反離液序列高的銨離子，銫離子和鉀離子和鈉離子或者這些離子的組合，優(yōu)選氯化銨。對(duì)于溶解/結(jié)合，以0.1～8M的離子強(qiáng)度使用離子。
對(duì)于核酸，特別是DNA與固體載體的結(jié)合，優(yōu)選地小于等于1M的這些鹽的低濃度將是足夠的，在一些應(yīng)用中，甚至小于等于0.5M的濃度是優(yōu)選的，在從較大量的起始材料中定量分離核酸中較高的離子濃度是成功的。
在實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式中，通過(guò)使用反離液序列高的鹽，所述鹽具有作為溶解緩沖液的基本成分的蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用，也可以加入蛋白水解酶，例如蛋白酶K用于支持并且更有效地進(jìn)行溶解過(guò)程，因此，也可以加入高離子強(qiáng)度，例如5M的反離液序列高的鹽用于必需的細(xì)胞降解，這樣獲得核酸的定量分離。
本領(lǐng)域中含有已知離液序列高的鹽的緩沖液體系可能不含有要求的高離子強(qiáng)度的蛋白水解酶，而一般情況下蛋白水解酶是定量分離核酸所必需的。因此，總是接著加入蛋白水解酶用于核酸與固相的結(jié)合。
在根據(jù)本發(fā)明的溶解緩沖液/結(jié)合緩沖液中，優(yōu)選的是陰性，陽(yáng)性或中性蛋白水解酶，例如SDS，tritonX-100，Tween或CTAB被用作去污劑。
起始材料完全溶解之后，從懸浮液中分離出在快速離心步驟中還沒(méi)有完全溶解的成分，如果需要，在加入另外的去污劑，醇或者與固相孵育的去污劑/醇混合物之后直接與已經(jīng)描述過(guò)的結(jié)合DNA的材料一起孵育。在溶解緩沖液體系中，可能有另外的不大濃度(小于50mM)的EDTA和/或tris-HCl。對(duì)于從非常強(qiáng)程度去污過(guò)的起始材料中分離DNA，優(yōu)選向該緩沖液體系中加入2～4％聚乙烯吡咯烷酮或其它已知物質(zhì)來(lái)選擇性抑制成分。
例如，已經(jīng)證明商業(yè)上可獲得的離心柱中的玻璃纖維簇，硅化合物，例如各種粒度的二氧化硅作為用于要分離的DNA的結(jié)合材料是有效的。因此可以使用利用離液序列高的緩沖液分離核酸所用的所有材料。
與DNA結(jié)合材料孵育之后通過(guò)，通過(guò)快速離心步驟從結(jié)合材料中分離溶解物。接著，用例如由至少50％的乙醇和，如果需要，低鹽濃度的NaCl組成的洗滌緩沖液以已知方法洗滌，干燥載體并且利用已知的低鹽緩沖液(tris-HCl；TE；水)洗脫結(jié)合的DNA，優(yōu)選在50～70℃的溫度下進(jìn)行。
實(shí)施本發(fā)明的另一個(gè)變化方法包括加入蛋白水解酶，優(yōu)選蛋白酶，例如蛋白酶K，用于溶解難于分解的起始材料的溶解，例如密集組織樣品，發(fā)根，或者用于優(yōu)化溶解效率和縮短必需的溶解時(shí)間。
因此，本發(fā)明應(yīng)用從含有DNA的起始材料以及從任意量的最各種各樣的起始材料中分離核酸特別是DNA的普遍適用的方法，以反離液序列高的鹽的新的組合物作為溶解緩沖液混合物的基本成分，迄今為止使用的所有載體和它們的變體同樣有效使用并且調(diào)節(jié)迄今為止用于鑒定性用途的核酸的分離。
在應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法的最一般的變化方法中，利用新的普遍適用的緩沖液體系，可以成功地，極端簡(jiǎn)單和非?？旖莸剡M(jìn)行從本領(lǐng)域相應(yīng)的所有選擇的復(fù)雜起始材料提取核酸，高效溶解并且接著使核酸與來(lái)自下面的材料結(jié)合密集植物材料(例如果實(shí)，種子，葉子，針葉等)，臨床相關(guān)樣品(例如全血，組織，microbioptate，石蠟包被的材料，ercp-樣品，棉簽)，食品(例如魚(yú)，香腸，罐頭，牛奶)，法醫(yī)樣品(例如頭發(fā)根，煙蒂，血跡)和其它起始材料。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于能夠從非常小量的起始材料高效分離DNA(例如從1微升全血，小于1毫克的微生物活組織檢查樣品分離DNA)以及從非常大量的起始材料高效分離DNA，例如50毫升全血，1克組織材料，小于1克的植物材料。
用反離液序列高的鹽代替離液序列高的鹽的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于由于沒(méi)有離液序列高的化學(xué)品，使用的緩沖液不再有毒性或腐蝕作用。
除了實(shí)施的最一般的變化方法之外，涉及具體應(yīng)用的最佳提取方法使得幾乎定量分離起始樣品中含有的DNA量。令人驚訝的是利用不使用高濃度的離液序列高的離子的根據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得高DNA產(chǎn)率，而迄今為止利用商業(yè)上可獲得的最優(yōu)提取試劑盒使用根據(jù)本領(lǐng)域的結(jié)合DNA的高濃度的離液序列高的離子。
利用商業(yè)上可獲得的實(shí)現(xiàn)的各比較結(jié)果的選擇在實(shí)施的實(shí)施例中給出。這些結(jié)果清楚地證明本發(fā)明的效力。
除了從含有DNA的所有復(fù)雜起始材料分離DNA之外，應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)變化方法使得從細(xì)菌溶解物高效分離質(zhì)粒DNA，而不使用根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)使質(zhì)粒DNA結(jié)合無(wú)機(jī)載體所必需的離液序列高的鹽，因此，對(duì)于結(jié)合質(zhì)粒DNA不需要通常加入離液序列高的鹽酸胍鹽。
也用已知方法洗滌結(jié)合的質(zhì)粒DNA并且從載體上洗脫。該方法適合從使用的所有的起始量(小至大)分離質(zhì)粒DNA。因此，獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)率與根據(jù)傳統(tǒng)的商業(yè)上可獲得的方法分離的產(chǎn)率相同。但是，根據(jù)本發(fā)明的方法比所有其它已知體系在價(jià)格上低廉得多，因?yàn)殡x液序列高的鹽非常昂貴。
因此，使用反離液序列高的鹽的本發(fā)明方法非常適合設(shè)計(jì)用于分離質(zhì)粒的自動(dòng)系統(tǒng)，其中已知價(jià)格/制劑是選擇的決定性標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)本發(fā)明的制劑使得進(jìn)一步接近一條出人意料的途徑，非常引人注目并且提供分離核酸和檢測(cè)領(lǐng)域中新的應(yīng)用。
在實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)形式中，含有至少一種反離液序列高的鹽成分的本發(fā)明新的溶解/結(jié)合緩沖液體系使核酸與固相結(jié)合，所述固相具有帶負(fù)電荷表面或具有負(fù)電勢(shì)能的表面。
從現(xiàn)有技術(shù)得知將核酸有效地結(jié)合化學(xué)修飾的固相的純化核酸的方法(美國(guó)專(zhuān)利5,523,392；在硅酸鋁和磷酸硅酸鹽上分離DNA；美國(guó)專(zhuān)利5,503,816；用于DNA純化的硅酸鹽化合物；美國(guó)專(zhuān)利5,674,997；在改性的硅酸鹽上純化DNA；美國(guó)專(zhuān)利5,438,127；使用PCl3改性的玻璃纖維膜通過(guò)固相提取純化DNA；美國(guó)專(zhuān)利5,606,046；使用事先用三氟乙酸并且然后用氟離子，氫氧根離子，或BCl3處理過(guò)的trifluorimetricacid洗滌過(guò)的玻璃纖維膜通過(guò)固相提取純化DNA；美國(guó)專(zhuān)利5,610,291通過(guò)用SiCl3，AlCl3，或BCl3處理并且用氫氧化鈉洗滌修飾的玻璃纖維膜用作DNA吸附劑；美國(guó)專(zhuān)利5,616,701通過(guò)使用氫氧化物洗滌過(guò)的玻璃纖維膜的固相提取純化DNA；美國(guó)專(zhuān)利5,650,506改性的玻璃纖維膜用于通過(guò)固相提取的DNA純化)。
因此，結(jié)合核酸的必要條件總是用于結(jié)合的膜通過(guò)化學(xué)修飾反應(yīng)而帶正離子電荷。因此，明顯的是，使用的膜的帶正電荷表面和核酸的磷酸骨架的陰離子電荷之間發(fā)生電荷相互作用而結(jié)合。因此，核酸與帶正電荷固相結(jié)合的原理很多年就已經(jīng)有了標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用，例如，用于已知的在帶正電荷尼龍過(guò)濾膜上的DNA/RNA印跡技術(shù)，這都是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分公知的。
然而，所述的該方法的一個(gè)完全基本的缺點(diǎn)在于其不適合從復(fù)雜起始材料分離核酸，即，完全不可能從復(fù)雜起始材料分離核酸。起始材料總是必須以所述的美國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的已知方法要分離的已經(jīng)分離過(guò)的核酸。特別是，有一個(gè)方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)看起來(lái)還不清楚。所述的結(jié)合條件(在生理緩沖液條件下結(jié)合)和洗脫條件是相同的。不清楚核酸怎么可以在給定的相同緩沖液條件下再次從膜上溶解用于核酸與帶正電荷膜結(jié)合。
最后，只是在一個(gè)非常窄的途徑中可以實(shí)際施用代表性方法和各方法。合成制備的寡核苷酸與陽(yáng)性表面的結(jié)合也是已知的。這接著通過(guò)利用電荷相互作用來(lái)進(jìn)行，即，以正電荷和負(fù)電荷的連接為基礎(chǔ)，例如通過(guò)修飾的寡核苷酸(與氨基連接體或磷酸連接體鍵連)。這些變化方法不能從復(fù)雜起始材料分離核酸。
根據(jù)詳細(xì)的解釋?zhuān)嬖谟糜诩兓瘞в凶銐蛘姾傻哪さ慕Y(jié)合核酸的另外的形式，其不代表用于分離核酸的方法。以膜的正離子電荷和核酸骨架的負(fù)離子電荷之間的相互作用為基礎(chǔ)的庫(kù)侖引力使得核酸結(jié)合。因此，該原理看起來(lái)可以局部得以解釋。
以用根據(jù)本發(fā)明的反離液序列高的鹽從復(fù)雜起始材料分離核酸為基礎(chǔ)，檢測(cè)到一種出人意料的現(xiàn)象。因此，證明帶負(fù)電荷表面或可以轉(zhuǎn)化為負(fù)電勢(shì)的表面也適合使用根據(jù)本發(fā)明的溶解/結(jié)合緩沖液體系結(jié)合核酸。一般情況下，我們不能預(yù)期由于等電荷勢(shì)能而發(fā)生的不是結(jié)合而是推斥的可能性。
根據(jù)已知方法產(chǎn)生陰性功能化表面或者帶有潛在的陰性修飾的表面。證明例如?；然蛄u基與反應(yīng)器表面的光化學(xué)偶聯(lián)是合適的。
本發(fā)明變化方法完全打開(kāi)了用于復(fù)合核酸分析的新的前景。也就是說(shuō)，變成明顯的是核酸不需要象迄今為止描述的所有的變化方法一樣已經(jīng)被分離用于陰性或潛在陰性表面結(jié)合。從溶解反應(yīng)母液進(jìn)行結(jié)合，即將溶解含有核酸的起始樣品并且釋放的核酸，將與帶負(fù)電荷表面(例如微量培養(yǎng)板腔或Eppendorf反應(yīng)器)結(jié)合。
現(xiàn)在，根據(jù)本發(fā)明的變化方法使得應(yīng)用完全新的用于從復(fù)雜起始材料分離核酸的“單一試管”和一步方法。這樣的方法，提供了對(duì)于使用者的應(yīng)用范圍非常大的優(yōu)點(diǎn)(簡(jiǎn)單，廉價(jià)，減少?gòu)U物，快捷，適合常規(guī)應(yīng)用，自動(dòng)化等等)。
另外，該變化方法的進(jìn)一步的應(yīng)用不只是在反應(yīng)體中提取核酸，而且還在反應(yīng)器中接著進(jìn)行靶物擴(kuò)增和接著水解，并且如果需要，進(jìn)行雜交反應(yīng)，如果需要，或者在固相上測(cè)序。
以此為基礎(chǔ)，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，通過(guò)帶負(fù)電荷或潛在陰性官能團(tuán)改進(jìn)例如0.5毫升Eppendorf PCR容器。例如酰基，羧基或羥基與反應(yīng)器表面的光化學(xué)偶聯(lián)適合這樣的改進(jìn)。然后，選擇用于分離核酸的樣品(例如全血)放在反應(yīng)器中，并且與含有反離液序列高的鹽級(jí)分的溶解緩沖液孵育，加入例如氯化銨，去污劑和蛋白水解酶，該容器在70℃下孵育5分鐘。
為了使核酸的結(jié)合最大化，還可以在起始材料完全溶解之后用吸移管移取去污劑/醇混合物。然后，短時(shí)間孵育母液，并且接著從反應(yīng)器倒出?，F(xiàn)在，核酸與反應(yīng)器的功能化表面結(jié)合，接著用醇洗滌緩沖液快速洗滌并且通過(guò)在70℃下孵育去除醇。此外，通過(guò)向反應(yīng)器加入低鹽緩沖液(例如10mM tris-HCl)，以專(zhuān)業(yè)方法進(jìn)行結(jié)合的核酸的洗脫，并且例如在70℃下短時(shí)間孵育(例如2分鐘)。這樣，獲得核酸備用。
正如已經(jīng)顯示的，在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行了從復(fù)雜起始材料分離核酸的所有的反應(yīng)，即溶解起始材料，結(jié)合核酸，洗滌結(jié)合的核酸和洗脫核酸，都在一個(gè)反應(yīng)器中并且用一個(gè)反應(yīng)器完成。
現(xiàn)在世界范圍內(nèi)最常使用的Qiagen公司的提取試劑盒對(duì)于溶解，結(jié)合，洗滌和洗脫總是需要一個(gè)過(guò)濾柱和至少4個(gè)反應(yīng)器，另外，包括多個(gè)離心步驟。
與此相反，根據(jù)本發(fā)明的變化方法使得沒(méi)有一個(gè)離心步驟就提取核酸。由此也帶來(lái)與時(shí)間相關(guān)的多種好處。這些好處也涉及Boom描述的美國(guó)專(zhuān)利5,234,809中所述的核酸提取方法。
但是在不考慮核酸的有效提取的情況下，結(jié)合的核酸也可以保留在0.5毫升反應(yīng)器所述的表面，并且例如接著通過(guò)加入完全PCR混合物(引物，核苷酸，聚合酶緩沖液，Taq聚合酶，鎂)直接用于PCR應(yīng)用，即提取，并且接著在相同反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)增。
這些實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明帶來(lái)的多種好處和寬的適用性。在一個(gè)變化方法中，在一個(gè)反應(yīng)空間內(nèi)進(jìn)行通過(guò)擴(kuò)增的樣品制備的整個(gè)過(guò)程，如果需要，還有分析。因此，考慮到改進(jìn)的反應(yīng)器(或者還有其它固體表面)和合適的溶解/結(jié)合緩沖液，在與分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出新的標(biāo)準(zhǔn)，并且主要涉及核酸檢測(cè)，眾所周知，通過(guò)應(yīng)用新的有效溶液大大減小了污染樣品問(wèn)題。
其它的優(yōu)點(diǎn)以及其它的應(yīng)用是固定在表面上的核酸將穩(wěn)定保持固定至少一段較長(zhǎng)時(shí)間，備用于后面的處理，即PCR不必要在提取之后立即進(jìn)行。其它應(yīng)用領(lǐng)域是使用本文描述的攜帶負(fù)電荷或潛在的負(fù)電荷的表面(優(yōu)選合適反應(yīng)空間的塑料表面，例如微量培養(yǎng)板)完全自動(dòng)提取核酸，并且如果需要，進(jìn)行分析。
如果需要，含有蛋白水解酶的用反離液序列高的鹽作為主要成分的根據(jù)本發(fā)明的溶解/結(jié)合緩沖液體系也可以以固體制劑提供。為此目的，如果需要，在通常的反應(yīng)器中將鹽和去污劑的混合物，添加劑和酶分成等份，并且在95℃下孵育幾小時(shí)，并且根據(jù)已知方法凍干，從而轉(zhuǎn)化為固體制劑。
用于分離核酸的復(fù)合備用反應(yīng)混合物中這些固體制劑在長(zhǎng)期貯存中是穩(wěn)定的，即在長(zhǎng)期貯存期間保持蛋白水解酶成分的生物活性(參見(jiàn)實(shí)施例)。因此，不加入已知的保護(hù)性添加劑，而只是通過(guò)低溫凍干，制備溶解緩沖液混合物的穩(wěn)定制劑。
商業(yè)上提供的用于提取核酸的所有試驗(yàn)試劑盒含有各需要的成分，必須只由使用者制備具體的溶液。除此之外，限制了溶液的穩(wěn)定性。另一個(gè)缺點(diǎn)在于使用者必須考慮在當(dāng)前使用常規(guī)試劑盒分離核酸時(shí)對(duì)于各種溶液進(jìn)行多個(gè)移液步驟。這樣就加大了深度污染的危險(xiǎn)，特別是在藥物診斷領(lǐng)域。此外，例如，由于主要用于分離核酸的常規(guī)離心柱的廣泛加載的限制，起始材料的量也受到極大限制。這是由于提取所需的溶解和結(jié)合緩沖液仍然被加入到起始材料中的事實(shí)。
通過(guò)提供以反離液序列高的鹽為基礎(chǔ)的作為在貯存中穩(wěn)定的混合物的穩(wěn)定制劑，以完全簡(jiǎn)單的方法解決了存在的問(wèn)題。該制劑具有下面的優(yōu)點(diǎn)1.長(zhǎng)期貯存準(zhǔn)備好待用的溶解緩沖液混合物。
2.在準(zhǔn)備好的溶解混合物中穩(wěn)定蛋白水解酶以及它們長(zhǎng)期貯存。
3.以現(xiàn)存離心柱的等規(guī)格使用更大量的起始材料(例如起始量的三倍)。
4.通過(guò)減少移液步驟和移液溶液而降低污染的危險(xiǎn)。
5.也可以在實(shí)驗(yàn)室之外在準(zhǔn)備好備用的溶解混合物中攝取樣品，
并且如果需要，長(zhǎng)期貯存。
6.樣品穩(wěn)定裝運(yùn)和冷卻。
由如果需要包括蛋白水解酶的各成分組成的準(zhǔn)備好的固體的穩(wěn)定溶解緩沖液混合物容易操作(也可以由不具備專(zhuān)業(yè)知識(shí)的人操作)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)加入含有要分離的核酸的樣品簡(jiǎn)單起始該反應(yīng)。除此之外，根據(jù)它們所含有的物質(zhì)，混合物具有至少6個(gè)月的壽期，因此在室溫下樣品的運(yùn)輸不再是問(wèn)題，以此事實(shí)實(shí)施本發(fā)明。
固體制劑的優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)在于只是將含有核酸的樣品放入含有貯存穩(wěn)定的溶解緩沖液的反應(yīng)器中，用于樣品材料所含有的核酸的溶解，并且如果需要，通過(guò)加入水，在各反應(yīng)器中溶解樣品。完全減少帶來(lái)污染的昂貴的多個(gè)移液步驟。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的制劑解決給定條件下與收集和制備臨床和法醫(yī)學(xué)樣品相關(guān)的已知問(wèn)題。
出乎我們意料的是，實(shí)際應(yīng)用還表現(xiàn)出，如果需要，在給定的標(biāo)準(zhǔn)條件下，在加入要溶解的起始材料之后，當(dāng)加入H2O之后加入固體樣品時(shí)，固體制劑可以再轉(zhuǎn)化為液相而不帶來(lái)問(wèn)題。
總結(jié)如下本發(fā)明的主題是不含有離液序列高的成分的制劑中的反離液序列高的鹽，用于從任意復(fù)雜起始材料分離核酸特別是DNA的用途，其中所述核酸與固相結(jié)合。所述制劑含有溶解/結(jié)合緩沖液體系，其含有至少一種反離液序列高的鹽成分，本文公開(kāi)的一種固相和洗滌及洗脫緩沖液。
所述溶解/結(jié)合緩沖液體系可以以在反應(yīng)器中備好待用的水溶液或以固體制劑獲得。
所有載體可以作為固相用于分離離液劑，優(yōu)選玻璃纖維簇，玻璃膜，硅載體和高度分散的硅膠或具有帶負(fù)電荷表面或化學(xué)改性的表現(xiàn)出負(fù)電荷勢(shì)能的表面的載體。
此外，本發(fā)明的主題是使用提到的制劑，從任意復(fù)雜起始材料分離核酸特別是DNA的方法，其特征在于溶解起始材料，使核酸與載體結(jié)合，洗滌與載體結(jié)合的核酸和洗脫核酸。
由于獲得的DNA的質(zhì)量，其也很好地適合基因治療中使用的DNA的制備分離和純化。
再有，本發(fā)明的主題是貯存中穩(wěn)定的并且備好用于以反離液序列高的鹽為基礎(chǔ)分離核酸的溶解緩沖液體系的固體制劑，其作為備好在常規(guī)反應(yīng)器中使用的混合物可以獲得。通過(guò)只是加入樣品(在液體樣品例如全血，唾液，細(xì)胞懸浮液，血清，血漿，體液)活化溶解緩沖液母液的固體制劑，在固體起始材料例如組織，發(fā)根，固體表面上的血跡，煙蒂，脫蠟的組織等等的情況下，另外加入水，并且進(jìn)行起始材料的水解。起始材料完全溶解之后，如果需要，在加入醇溶液或醇/去污劑混合物之后，溶解母液以已知方式和使用的各種結(jié)合核酸的固相(懸浮液，離心柱)一起孵育。接著根據(jù)本領(lǐng)域已經(jīng)公開(kāi)的進(jìn)行結(jié)合的核酸的洗滌和最后的洗脫。
利用這些固體制劑，主要對(duì)于核酸檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域提供新的溶液。
應(yīng)該再一次指出，作為一步方法和“單一試管”方法的本發(fā)明變化方法使得從復(fù)雜起始材料分離核酸，如果需要，并且擴(kuò)增，并且，如果需要，接著分析擴(kuò)增的核酸片段。因此，起始材料不需要是已經(jīng)分離過(guò)的核酸而是含有核酸的復(fù)雜起始材料。結(jié)合核酸所需表面包含陰性或潛在陰性官能團(tuán)的溶解/結(jié)合緩沖液中實(shí)現(xiàn)核酸的結(jié)合，帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合陰性功能化表面所需離子來(lái)自反離液序列高的鹽。
因此，實(shí)現(xiàn)1.用于從復(fù)雜起始材料分離核酸的“單一試管”方法2.用于分離核酸并且接著靶物擴(kuò)增的“單一試管”方法
3.用于從復(fù)雜起始材料分離核酸，接著靶物擴(kuò)增和接著分析擴(kuò)增的核酸片段的“單一試管”方法。
這意味著，在正是同樣的反應(yīng)體中或者如果需要，在一個(gè)且相同的反應(yīng)表面上，進(jìn)行從含有DNA的最多種起始材料分離核酸，和如果需要，靶物擴(kuò)增和分析。
根據(jù)本發(fā)明的制劑和用于從任意含有核酸的起始材料和大量物質(zhì)中分離，純化核酸和接下來(lái)的染色體組分子分析的普遍適用的方法，代表用于基因分析的整體完全自動(dòng)化系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的新的平臺(tái)技術(shù)，其使得在一個(gè)反應(yīng)體內(nèi)制備樣品，擴(kuò)增和分析靶物。
下面，通過(guò)實(shí)施的實(shí)施例更詳細(xì)解釋本發(fā)明。1.從各種植物材料分離基因組DNA總是在液氮下用研缽研碎50～100毫克的起始材料，并且接著轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中。
加入500微升溶解緩沖液(2％CTAB，2％聚乙烯吡咯烷酮，10mMtris-HCl，20mM EDTA和1.3M氯化銨)，并且在65℃下孵育至少30分鐘。
離心沒(méi)有溶解的成分，并且將上清液與200微升異丙醇混合。
將該溶液轉(zhuǎn)移到帶有玻璃過(guò)濾膜的離心柱上(micro spin柱，LIDA公司)。
以12000rpm離心2分鐘。棄除濾液，并且用洗滌緩沖液(50mMNaCl；10mMtris-HCl，1mM EDTA；70％ v/v乙醇)洗滌膜兩次。
在短時(shí)離心步驟(12000rpm離心2分鐘)之后，加入200微升洗脫液(10mM tris-HCl，pH8.7)，并且通過(guò)以10000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
總是將20微升洗脫出的DNA放在瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后表現(xiàn)出來(lái)(如

圖1所示)。2.用不普遍適用的緩沖液體系從各種起始材料同時(shí)分離基因組DNA下面的樣品用于分離1-冷凍的全血50毫升，2-全血100微升，3-黃瓜50毫克；4-西紅柿植物葉100毫克；5-唾液樣品100微升；6-雞肝；冷凍的食品5毫克；7-雞肝；冷凍的食品20毫克；8-發(fā)根，9-火雞乳酸發(fā)酵香腸50毫克；10-紫杉，針葉100毫克。
所有的樣品在500微升溶解緩沖液(2％CTAB，2％聚乙烯吡咯烷酮，10mMtris-HCl，20mM EDTA和1.5M氯化銨)中孵育，除了所有的植物樣品在65℃下加入20微升蛋白酶K(20毫克/毫升)。
接著向溶解液加入200微升異丙醇，并且轉(zhuǎn)移到帶有玻璃過(guò)濾膜的離心柱上(micro spin柱，LIDA公司)。
以12000rpm離心2分鐘。棄除濾液并且用洗滌緩沖液(50mM NaCl；10mM tris-HCl，1mM EDTA；70％ v/v乙醇)洗滌膜兩次。在短時(shí)離心步驟(12000rpm離心2分鐘)棄除乙醇之后，加入50～200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl，pH8.7)，并且通過(guò)以10000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
總是將1/5的洗脫出的DNA加載在瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后表現(xiàn)出來(lái)(圖2)。3.從口腔粘膜的擦拭棉簽分離基因組DNA如下文所述，從口腔粘膜的擦拭棉簽分離DNA。
總是將400微升溶解緩沖液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化銨，tris，EDTA)轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中。將棉簽中的材料擠出并且向懸浮液加入20微升的蛋白水解酶(20毫克/毫升)。接著母液在70℃下孵育10分鐘。溶解之后加入200微升去污劑/異丙醇混合物，短時(shí)振蕩樣品，接著轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的離心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm離心1分鐘。
然后，用含有乙醇的洗滌緩沖液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗滌柱子兩次(以12000rpm離心1分鐘)，并且在短時(shí)離心步驟中干燥膜。通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl)，在短時(shí)離心步驟(以10000rpm離心1分鐘)中將結(jié)合的DNA從過(guò)濾膜上洗脫出來(lái)。
總是將從兩個(gè)提取過(guò)程中分離的20微升DNA放置在0.7％ TAE瓊脂糖凝膠上用于分析，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析(圖3)。4.將根據(jù)本發(fā)明從全血樣品(200微升)提取DNA的情況，與以在離液序列高的鹽的存在下結(jié)合核酸為基礎(chǔ)的商售試劑盒相比較利用根據(jù)本發(fā)明方法的基因組DNA的分離，與使用用于結(jié)合核酸的離液序列高的鹽分離基因組DNA的商業(yè)上可獲得的傳統(tǒng)應(yīng)用方法相比較。以調(diào)節(jié)控制應(yīng)用為基礎(chǔ)進(jìn)行利用對(duì)比方法的基因組DNA的提取。
下文描述利用根據(jù)本發(fā)明方法的DNA的分離。
總是將200微升全血樣品(用EDTA處理過(guò)的新鮮樣品)轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中。
加入350微升溶解緩沖液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化銨，tris，EDTA)和20微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)，在70℃下孵育10分鐘，以溶解起始材料。
溶解之后，加入180微升去污劑/異丙醇混合物，短時(shí)振蕩樣品，接著轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的離心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm離心2分鐘。
然后，用含有乙醇的洗滌緩沖液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗滌柱子兩次(以12000rpm離心1分鐘)，并且在短時(shí)離心步驟中干燥膜。通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl)，在短時(shí)離心步驟(以10000rpm離心1分鐘)中將結(jié)合的DNA從過(guò)濾膜上洗脫出來(lái)。
總是將從兩個(gè)提取過(guò)程中分離的10微升DNA放置在0.7％ TAE瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
比較基因組DNA的產(chǎn)率，它們的整合性(沒(méi)有低分子量不清晰的成片電泳條帶的清晰的各電泳條帶)和提取方法的再現(xiàn)性。可以看到，利用根據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得比對(duì)比方法更好的結(jié)果(圖4)。5.將根據(jù)本發(fā)明從全血樣品(5微升)提取DNA的情況，與利用以在離液序列高的鹽的存在下結(jié)合核酸為基礎(chǔ)的商售試劑盒相比較利用根據(jù)本發(fā)明方法的基因組DNA的分離，與使用用于結(jié)合核酸的離液序列高的鹽的商業(yè)上可獲得的傳統(tǒng)應(yīng)用方法的基因組DNA分離相比較。以調(diào)節(jié)控制應(yīng)用為基礎(chǔ)根據(jù)對(duì)比方法提取基因組DNA。
下文描述利用根據(jù)本發(fā)明方法的DNA的分離。
總是將5微升全血樣品(用EDTA處理過(guò)的新鮮樣品)轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中。
通過(guò)加入195微升的1XPBS緩沖液而將樣品填充到200微升的體積，并且加入350微升溶解緩沖液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化銨，tris，EDTA)和20微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)之后，在70℃下孵育10分鐘以溶解起始材料。
溶解之后，加入180微升去污劑/異丙醇混合物，短時(shí)振蕩樣品，接著轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的離心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm離心2分鐘。
然后，用洗滌緩沖液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗滌柱子兩次(以12000rpm離心1分鐘)，并且在短時(shí)離心步驟中干燥膜。通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl)，在短時(shí)離心步驟(以10000rpm離心1分鐘)中將結(jié)合的DNA從過(guò)濾膜上洗脫出來(lái)。
總是將從兩個(gè)提取過(guò)程中分離的20微升DNA放置在0.7％ TAE瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
檢測(cè)并且比較從非常小量的起始材料分離基因組DNA的可能性和提取方法的再現(xiàn)性?？梢钥吹?，利用根據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得比對(duì)比方法更好的結(jié)果(圖5)。6.將根據(jù)本發(fā)明從各種類(lèi)型動(dòng)物組織樣品和各種量的起始材料提取DNA的情況，與利用以在離液序列高的鹽的存在下結(jié)合核酸為基礎(chǔ)的商售試劑盒相比較利用根據(jù)本發(fā)明方法的基因組DNA的分離，與使用用于結(jié)合核酸的離液序列高的鹽的商業(yè)上可獲得的傳統(tǒng)應(yīng)用方法的基因組DNA的分離相比較。以調(diào)節(jié)控制應(yīng)用為基礎(chǔ)根據(jù)對(duì)比方法提取基因組DNA。
下文描述利用根據(jù)本發(fā)明方法的DNA的分離。
總是將5毫克或20毫克的豬腎，豬心和豬肝的組織樣品轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中。
向樣品加入400微升溶解緩沖液(CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，氯化銨，tris，EDTA)和40微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)。
通過(guò)在52℃下孵育進(jìn)行起始材料的溶解。
在短時(shí)離心步驟(以14000rpm離心1分鐘)中離心出沒(méi)有溶解溶解成分，并且將上清液加入含有200微升去污劑/異丙醇混合物的新的反應(yīng)器中之后，短時(shí)振蕩樣品，接著轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可獲得的離心柱(LIDA公司；玻璃膜)，并且以12000rpm離心2分鐘。
然后，用含有乙醇的洗滌緩沖液(NaCl；tris-HCl，EDTA，乙醇)洗滌柱子兩次(以12000rpm離心1分鐘)，并且在短時(shí)離心步驟中干燥膜。通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl)，在短時(shí)離心步驟(以10000rpm離心1分鐘)中將結(jié)合的DNA從過(guò)濾膜上洗脫出來(lái)。
總是將從兩個(gè)提取過(guò)程中分離的10微升DNA放置在0.7％ TAE瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
檢測(cè)并且比較從各種組織樣品和各種量的起始材料分離基因組DNA的可能性，基因組DNA的產(chǎn)率，它們的整合性(沒(méi)有低分子量不清晰的成片電泳條帶的清晰的各電泳條帶)和提取方法的再現(xiàn)性。
可以看到，利用根據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得比對(duì)比方法更好的結(jié)果(圖6)。7.利用根據(jù)本發(fā)明的方法從全血樣品(200微升)提取DNA，并且使用離液序列高的鹽為介體使核酸與用于結(jié)合的各種載體相結(jié)合給出利用根據(jù)本發(fā)明的方法從200微升全血樣品分離基因組DNA，并且使用離液序列高的鹽使核酸與用于分離核酸的各種載體(柱子膜和懸浮液)相結(jié)合。
用代替LIDA公司的玻璃過(guò)濾膜的各種載體如實(shí)施例4所述進(jìn)行DNA的提取。
總是將20微升的分離的DNA放置在0.7％ TAE瓊脂糖凝膠上，并且在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁染色之后分析。
如圖7所示，根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了核酸與迄今為止已知的離液序列高的方法中使用的各種載體的結(jié)合。8.制備含有蛋白水解酶的貯存中穩(wěn)定的溶解緩沖液體系(緩沖混合物1)和使用該溶解緩沖液體系來(lái)從各種起始材料中分離基因組DNA制備含有3M氯化鉀，2％ CTAB，18.2mM tris-HCl(pH8.3)，12.5mMEDTA 2.8％聚乙烯吡咯烷酮的溶解緩沖貯存溶液。在1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中分成400微升的等份，并且加入40微升的蛋白酶K(20毫克/毫升)。
在凍干室將溶解緩沖液混合物凍干(α2；Christ公司)。
接著在密封反應(yīng)器中在室溫下將溶解緩沖液混合物貯存6個(gè)月。
從下面的材料中提取基因組DNAA500微升全血B400微升唾液樣品C脫蠟組織材料。1.從全血提取DNA向溶解緩沖液的固體制劑加入500微升全血，并且在70℃下孵育10分鐘。加入200微升異丙醇，并且將該懸浮液加入離心柱(玻璃纖維簇)。
以最大離心速度離心1分鐘，并且棄除離心液。
加入600微升洗滌緩沖液(70％乙醇，氯化鈉，tris，EDTA)，以最大離心速度離心1分鐘，并且棄除離心液。重復(fù)洗滌步驟。接著通過(guò)以最大離心速度離心2分鐘將膜干燥。
通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(70℃)，并且以最大離心速度離心1分鐘從膜上洗脫出DNA。2.從唾液樣品提取DNA向溶解緩沖液的固體制劑加入500微升唾液樣品，并且在70℃下孵育10分鐘。加入200微升異丙醇，并且將該懸浮液加入離心柱(玻璃纖維簇)。
以最大離心速度離心2分鐘，并且棄除離心液。加入600微升洗滌緩沖液(70％乙醇，氯化鈉，tris，EDTA)，以最大離心速度離心1分鐘，并且棄除離心液。重復(fù)洗滌步驟。接著通過(guò)以最大離心速度離心2分鐘將膜干燥。
通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(70℃)，并且以最大離心速度離心1分鐘從膜上洗脫出DNA。3.從脫蠟組織提取DNA向溶解緩沖液的固體制劑加入脫蠟組織碎屑。加入500微升ddH2O，并且在52℃下孵育30分鐘。
加入200微升異丙醇，并且將該懸浮液加入離心柱(玻璃纖維簇)。
以最大離心速度離心2分鐘，并且棄除離心液。加入600微升洗滌緩沖液(70％乙醇，氯化鈉，tris，EDTA)，以最大離心速度離心1分鐘，并且棄除離心液。重復(fù)洗滌步驟。接著通過(guò)以最大離心速度離心2分鐘將膜干燥。
通過(guò)加入200微升洗脫緩沖液(70℃)，并且以最大離心速度離心1分鐘從膜上洗脫出DNA。
接著對(duì)提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳分析。
為此目的，總是使用1/10的全DNA洗脫液(圖8)。9.制備含有蛋白酶K的貯存中穩(wěn)定的溶解緩沖液體系(緩沖混合物2)和使用該溶解緩沖液體系來(lái)從8個(gè)各血液樣品(100微升)中分離基因組DNA制備含有3M氯化銨，2％聚乙烯吡咯烷酮，16.7mM EDTA，60mMtris-HCl，1.6％ CTAB，20微升蛋白酶K(20毫克/毫升)的溶解緩沖貯存溶液。
在1.5毫升Eppendorf反應(yīng)器中分成400微升的等份，并且將開(kāi)口的Eppendorf反應(yīng)器置于95℃下的熱混合器中孵育，直至其完全干結(jié)。接著密封反應(yīng)器，并且在室溫下貯存12個(gè)月。從全血中提取DNA向溶解緩沖液的固體制劑加入100微升全血，并且在70℃下孵育10分鐘。在硅基上加入20微升無(wú)機(jī)載體懸浮液并短時(shí)混合。將母液孵育1分鐘。短時(shí)離心使載體沉積。用800微升洗滌緩沖液(70％乙醇，氯化鈉，tris，EDTA)洗滌載體沉積物，并且通過(guò)在70℃下孵育而去除剩余的乙醇。通過(guò)加入加熱至70℃的200微升洗脫緩沖液(10mM tris-HCl；pH8.69)從載體上洗脫出DNA，并且以最大離心速度離心1分鐘從載體中分離核酸，并且將核酸轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)器。接著對(duì)提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳分析。為此目的，總是使用1/10的全DNA洗脫液(圖9)。10.通過(guò)與微量培養(yǎng)板的功能化表面直接結(jié)合而從外周血淋巴細(xì)胞分離基因組DNA使用商業(yè)上可獲得的帶有COO-基團(tuán)包被的平板作為微量培養(yǎng)板。
總是將平板的帶有官能團(tuán)的一欄(8個(gè)孔)和作為陰性對(duì)照的不帶COO-基團(tuán)的一欄用于分離。
所有的孔中加有30微升1XPBS緩沖液中的外周血淋巴細(xì)胞，并且加入180微升溶解緩沖液(氯化銨，CTAB，聚乙烯吡咯烷酮，tris-HCl，EDTA，蛋白酶K)，并且在70℃下孵育5分鐘。接著加入80微升去污劑/異丙醇混合物。將母液短時(shí)振蕩，并且孵育5分鐘。接著將溶液倒出孔外。隨即，用含有乙醇的洗脫緩沖液將各個(gè)孔洗滌兩次，并且通過(guò)在70℃下短時(shí)孵育而去除剩余的乙醇。
通過(guò)加入25微升10mM的tris-HCl進(jìn)行核酸的洗脫，并且孵育2分鐘。
隨即，在0.7％瓊脂糖凝膠上評(píng)價(jià)洗脫液(圖10)。
權(quán)利要求
1.用于使核酸與固相結(jié)合的從任意復(fù)雜起始材料中分離核酸，特別是DNA的沒(méi)有離液序列高的成分的制劑，包括--一個(gè)含有至少一種反離液序列高的鹽成分的溶解/結(jié)合緩沖液體系，--一個(gè)固相，--本文公開(kāi)的洗滌和洗脫緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于所述反離液序列高的成分是銨，銫，鈉和/或鉀鹽，優(yōu)選氯化銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制劑，其特征在于如果需要，所述溶解/結(jié)合緩沖液體系含有去污劑和添加劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其特征在于去污劑和添加劑是tris-HCl，聚乙烯吡咯烷酮，CTAB，tritonX-100，正-月桂基肌氨酸，檸檬酸鈉，DTT，SDS和/或Tween。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系含有用于與固相結(jié)合的醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系含有酶，優(yōu)選降解蛋白質(zhì)的降解酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系是水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系是在備好待用的反應(yīng)器中在貯存中穩(wěn)定的固體制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于所有載體作為用于利用離液劑分離的固相，優(yōu)選玻璃纖維簇，玻璃膜，玻璃，沸石，陶瓷，二氧化硅載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于具有陰性功能化表面或者可以轉(zhuǎn)化為負(fù)電荷勢(shì)能的功能化表面的所有載體作為固相。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制劑，其特征在于通過(guò)?；?，羧基或羥基修飾載體表面。
12.利用根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的制劑從任意復(fù)雜起始材料分離核酸，特別是DNA的方法，其特征在于溶解起始材料，使核酸結(jié)合固相，洗滌與載體結(jié)合的核酸并且進(jìn)行核酸的洗脫。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離核酸的方法，其特征在于含有DNA的材料--接觸包括含有一種反離液序列高的鹽成分，至少一種去污劑，如果需要，添加劑和，如果需要，一種蛋白水解酶的水溶液的溶解/結(jié)合緩沖液體系，--接觸一種固相，如果需要，該固相中加入乙醇，--接著洗滌并且將核酸從固相解溶下來(lái)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于起始材料是密集植物材料，例如果實(shí)，種子；葉子，針葉等，臨床相關(guān)樣品，例如全血；組織；microbioptates，石蠟包被的材料，ercp-樣品，棉簽，食品，例如魚(yú)，香腸，罐頭，牛奶，法醫(yī)樣品，例如頭發(fā)根，煙蒂，血跡和其它含有DNA的樣品。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于用于溶解/結(jié)合的反離液序列高的鹽的離子強(qiáng)度在0.1和8M之間。
16.利用根據(jù)權(quán)利要求1至8和10至11中任一項(xiàng)所述的制劑從任意復(fù)雜起始材料分離核酸，特別是DNA的方法，其特征在于--起始材料于“單一試管”中或者化學(xué)修飾的一步方法中，用陰性功能化表面或可以轉(zhuǎn)化為負(fù)電荷勢(shì)能的表面接觸起始材料并溶解，--進(jìn)行核酸對(duì)表面的結(jié)合，--洗滌結(jié)合的核酸，如果需要，洗脫。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于陰性功能化表面是如此修飾的平面表面，過(guò)濾膜，傳統(tǒng)的塑料容器或微量培養(yǎng)板。
18.根據(jù)權(quán)利要求16和17所述的方法，其特征在于接著使核酸在相同的反應(yīng)母液中進(jìn)行選擇的序列片段的擴(kuò)增反應(yīng)，如果需要，隨即分析基因序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求16和17所述的方法，其特征在于接著使核酸在相同的反應(yīng)母液中雜交和/或測(cè)序。
20.反離液序列高的成分在溶解/結(jié)合緩沖液體系中通過(guò)使核酸結(jié)合固相的分離和純化核酸的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于反離液序列高的成分是銨，銫，鈉和/或鉀鹽，優(yōu)選氯化銨。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的用途，其特征在于對(duì)于溶解/結(jié)合使用離子強(qiáng)度在0.1和8M之間的反離液序列高的鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系以水溶液使用。
24.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于溶解/結(jié)合緩沖液體系以貯存中穩(wěn)定的穩(wěn)定制劑存在。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于用于在基因治療中應(yīng)用的制備分離和純化DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從任意復(fù)雜起始材料和含有溶解/結(jié)合緩沖液體系的量通過(guò)使核酸與固相結(jié)合來(lái)分離核酸,特別是DNA的不含有離液序列高的成份的制劑,所述溶解/結(jié)合緩沖液體包括至少一種反離液序列高的鹽成份,本文公開(kāi)的固相和洗滌及洗脫緩沖液。所述溶解/結(jié)合緩沖液體可以是在反應(yīng)器中備好待用的水溶液或固體制劑。用于利用離液劑分離的所有載體,優(yōu)選玻璃纖維簇,玻璃膜,二氧化硅載體,陶瓷,沸石或表現(xiàn)出陰性功能化表面的材料或具有可轉(zhuǎn)化為負(fù)電勢(shì)能的化學(xué)修飾表面的材料,可作為固相。本發(fā)明還涉及使用據(jù)本發(fā)明的制劑從任意復(fù)雜起始材料中分離核酸,特別是DNA的方法,溶解起始材料,使核酸結(jié)合載體,洗滌與載體結(jié)合的核酸和洗脫核酸。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1332798SQ99815132
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
發(fā)明者蒂莫·希勒布蘭德, 彼得·本茨科 申請(qǐng)人:茵微特克有限公司