專利名稱：活性持續(xù)時(shí)間被增加的修飾抗體和抗體片段的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是1998年11月3日提交的美國(guó)序列號(hào)09/185,151申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，原申請(qǐng)的全部教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文。
血小板的止血和局部生理學(xué)功能，需要細(xì)胞的附著和聚集，通過血小板質(zhì)膜受體與配體的相互作用來調(diào)節(jié)。這些受體(如GPIIb/IIIa)是通常與基質(zhì)蛋白質(zhì)(如，膠原質(zhì)，纖連蛋白，血纖蛋白原，層粘連蛋白，玻連蛋白和von Willebrand因子)結(jié)合的受體整聯(lián)家族的成員，并且除了與血小板功能外，與免疫功能和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，某些整聯(lián)蛋白(如GPII/bIIIa)的拮抗劑具有可作為治療試劑的巨大可能。
對(duì)GPIIb/IIIa的幾種拮抗劑已進(jìn)行了研究，包括蛇毒液蛋白質(zhì)，小型肽，肽聚擬態(tài)物，非-肽化合物和抗體[Cook，N.S.等人，未來藥物，19135-159(1994)；Cox，D.，等人，醫(yī)學(xué)研究評(píng)述，14195-228(1994)；Coller, B.S.，等人，血栓癥和止血法，74(1)302-308(1995)]。結(jié)合GPIIb/IIIa(特異表達(dá)在血小板上)，αvβ3[表達(dá)在血小板，內(nèi)皮細(xì)胞和多半平滑肌細(xì)胞上(Felding-Habermann，B.和Cheresh，D.A.，細(xì)胞生物學(xué)的當(dāng)前觀點(diǎn)，5864-868(1993))，和Mac-1(也稱為CR3，CD11b/CD18，αMβ2，其表達(dá)在激活的白細(xì)胞上，如單細(xì)胞或粒性白細(xì)胞(Altieri，D.C.和Edigington，T.S.，免疫學(xué)期刊，1412656-2660(1988))]的人源化嵌合抗體的一個(gè)片段，c7E3 Fab(也稱為“abciximab”或ReoPro)，已用來預(yù)防冠狀動(dòng)脈的突然關(guān)閉，減小冠狀動(dòng)脈干預(yù)過程后的缺血性并發(fā)癥。然而，用來減輕或預(yù)防某些其他病理學(xué)上的事件的治療需要長(zhǎng)時(shí)間經(jīng)常服用治療試劑。由于患者的配合性問題這種治療方法的效果不能令人滿意。加之，經(jīng)常服用治療試劑(如蛋白質(zhì)或肽)會(huì)引起結(jié)合試劑的抗體產(chǎn)生。因此，患者會(huì)產(chǎn)生免疫復(fù)合物-介導(dǎo)抗性和/或?qū)唧w治療試劑過敏。
因此一直需要一種具有延長(zhǎng)的活性持續(xù)時(shí)間的，較好地，具有低免疫原性的整聯(lián)蛋白受體拮抗劑。
本發(fā)明具體涉及由有機(jī)組成共價(jià)附著修飾的抗體。本發(fā)明的修飾抗體與一種或多種從包括GPIIb/IIIa，αvβ3，和Mac-1的組中選取的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體的修飾抗原結(jié)合片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2)。在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，修飾的抗體與GPIIb/IIIa和/或αvβ3結(jié)合，并拮抗血纖蛋白原與GPIIb/IIIa的結(jié)合及血小板的聚集。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾抗體與GPIIb/IIIa和/或αvβ3的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)地受到7E3的抑制。較好地，本發(fā)明修飾抗體是7E3或人源化7E3。較好的人源化7E3是c7E3。
有機(jī)組成可以是親水聚合物基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)，脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)基團(tuán)或磷脂基團(tuán)。在具體實(shí)施方案中，親水聚合物基團(tuán)可具有分子量為約800到約120,000道爾頓，并可以是聚烷烴乙二醇(如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG))，碳水化合物聚合物，氨基酸聚合物或聚乙烯基吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基團(tuán)可包括約八個(gè)到約四十個(gè)碳原子。
本發(fā)明的修飾抗體包括一個(gè)到約六個(gè)與抗體的羧基末端共價(jià)結(jié)合的和/或與抗體的半胱氨酰殘基的硫原子共價(jià)結(jié)合的有機(jī)組成。因此，本發(fā)明提供了含有位點(diǎn)-特異的修飾的抗體。如，IgG的修飾Fab可以包括PEG組成，其與重鏈的羧基末端結(jié)合。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾的c7E3 Fab’包括兩個(gè)PEG組成，其每一個(gè)與包含在重鏈的絞鏈區(qū)域內(nèi)的一個(gè)半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合(絞鏈區(qū)域中的半胱氨酰殘基在對(duì)應(yīng)IgG或F(ab’)2中形成鏈間二硫鍵)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過非染色質(zhì)肽酶的作用生成的修飾c7E3 Fab包括與重鏈的羧基末端結(jié)合的一個(gè)PEG組成。
本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防表達(dá)GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1的細(xì)胞(如，血小板，內(nèi)皮細(xì)胞，白細(xì)胞)起到疾病病理學(xué)作用的疾病和或病變的方法。這樣的疾病和病變包括，如血栓類病變包括心血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化，心絞痛，冠狀動(dòng)脈疾病)，中風(fēng)，局部缺血，和腫瘤血管化作用，腫瘤轉(zhuǎn)移和炎性病況。這種方法包括給需要的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。這種方法還包括單獨(dú)服用本發(fā)明的抗體或與有效量的一種或多種其他活性試劑一起服用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制人體內(nèi)血小板調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移的方法，包括給人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制人體內(nèi)通過配體與GPIIb/IIIa，αvβ3，或Mac-1結(jié)合調(diào)節(jié)的過程(即一種或多種)，包括給需要的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。GPIIb/IIIa特異地在血小板上表達(dá)，并結(jié)合幾種配體(如血纖蛋白原，纖連蛋白，von Willebrand因子，凝血栓蛋白，玻連蛋白)。αvβ3玻連蛋白受體在細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞和脈管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)，并在較小程度上在血小板上表達(dá)，調(diào)節(jié)與多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(如玻連蛋白，纖連蛋白，von Willebrand因子，血纖蛋白原，骨橋蛋白，凝血栓蛋白，膠原質(zhì)，基底膜蛋白)的附著作用。Mac-1在活化的白細(xì)胞上表達(dá)，如單細(xì)胞和粒性白細(xì)胞，并結(jié)合多種配體(如C3bi，因子X，血纖蛋白原)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及如本文所描述的應(yīng)用在治療(包括預(yù)防)或診斷中的修飾抗體或片段，涉及這樣的修飾抗體或片段的制備治療如本文所描述的具體疾病(如血栓病變，表達(dá)GPIIb/IIIa和/或αvβ3的細(xì)胞起到疾病病理學(xué)作用的疾病或病變)的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明附圖的簡(jiǎn)述

圖1演示了c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2對(duì)ADP-誘導(dǎo)(15μM ADP)血小板聚集(234,000/μL)的劑量依存性抑制作用。
圖2演示了c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2對(duì)ADP-誘導(dǎo)(20μM ADP)血小板聚集(250,000/μL)的劑量依存性抑制作用。
圖3演示了在GPIIb/IIIa覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2與GPIIb/IIIa的結(jié)合。
圖4演示了在αvβ3覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG20,000)2與αvβ3的結(jié)合。
圖5演示了在αvβ3覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2與αvβ3的結(jié)合。
圖6演示了在GPIIb/IIIa覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’(PEG5000)2與GPIIb/IIIa的結(jié)合。
圖7演示了在GPIIb/IIIa覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’-PEG5000與GPIIb/IIIa的結(jié)合。
圖8演示了在αvβ3覆蓋的板上125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)地抑制c7E3 Fab和c7E3 Fab’-PEG5000與αvβ3的結(jié)合。
圖9演示了c7E3 Fab’(PEG5000)2和c7E3 Fab’(NEM)2從鼠血清中澄清的速度。
圖10演示了c7E3 Fab’(PEG20,000)2從鼠血清中澄清的速度。
圖11演示了c7E3 Fab’(PEG5000)2和c7E3 Fab從田鼠血清中澄清的速度。
圖12是柱狀圖，演示了用c7E3 Fab或c7E3 Fab’(PEG5000)2免疫接種的鼠產(chǎn)生的特異IgG抗體(抗-c7E3 Fab)的滴定度。
圖13演示了c7E3 Fab，c7E3 Fab’(PEG2000)2或c7E3Fab’((PEG5000)2)2對(duì)血小板聚集的劑量依存性抑制作用。
圖14演示了c7E3 Fab或c7E3 Fab’((PEG2000)4)2對(duì)血小板聚集的劑量依存性抑制作用。
圖15演示了c7E3 Fab或c7E3 Fab’((PEG2000)2)2對(duì)血小板聚集的劑量依存性抑制作用。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及特異地與一種或多種從包括GPIIb/IIIa，αvβ3和Mac-1的組中選取的人類整聯(lián)蛋白受體結(jié)合的修飾抗體。在一個(gè)較好的的實(shí)施方案中，修飾抗體特異地結(jié)合表達(dá)在血小板的質(zhì)膜上的GPIIb/IIIa，從而抑制血纖蛋白原與GPIIb/IIIa的結(jié)合和血小板的聚集。較好地，結(jié)合GPIIb/IIIa的抗體進(jìn)一步特異結(jié)合人類整聯(lián)蛋白受體αvβ3。
抗體可以是單克隆的或多克隆的，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體。多克隆和單克隆是指抗體制備的均一性程度，不受到具體制備方法限制。本文所使用的“抗體”也包括抗體的功能片段，包括嵌合，人源化，靈長(zhǎng)類源化，膠合或單鏈抗體。功能片段包括與從包括GPIIb/IIIa，αvβ3和Mac-1的組中選取的整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗原結(jié)合片段。如，能結(jié)合GPIIb/IIIa和/或αvβ3或其部分的抗體片段，包括但不限于，F(xiàn)v，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，和F(ab’)2片段包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的片段可通過酶促裂解或通過重組技術(shù)制備，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶可分別產(chǎn)生Fab或F(ab’)2片段。其他具有必需底物特異性的蛋白酶也可用來制備Fab或F(ab’)2片段。在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，F(xiàn)ab片段可通過非染色質(zhì)肽酶裂解制備。也可使用其中一種或多種終止密碼子已引入到天然終止位點(diǎn)的上游的抗體基因制備多種截短形式的抗體。如，編碼F(ab’)2重鏈部分的嵌合基因可設(shè)計(jì)包括編碼CH1域和重鏈絞鏈區(qū)域的DNA序列。單鏈抗體，和嵌合，人源化或靈長(zhǎng)類源化(CDR-移植的)，或膠合抗體，以及嵌合，CDR-移植或膠合單鏈抗體，包括從不同物種衍生的部分，等等都包括在本發(fā)明和“抗體”的范圍內(nèi)。這些抗體的不同部分也可通過傳統(tǒng)技術(shù)化學(xué)地結(jié)合在一起，或可使用基因工程技術(shù)制備成鄰接蛋白質(zhì)。如編碼嵌合或人源化鏈的核酸可表達(dá)來制備鄰接蛋白質(zhì)，參看如Cabilly等人的美國(guó)專利No.4,816,567；Cabilly等人的歐洲專利No.0,125,023 B1；Boss等人的美國(guó)專利No.4,816,397；Boss等人的歐洲專利No.0,120,694B1；Neuberger，M.S.等人的WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人等人的歐洲專利No.0,194,276 B1；Winter的美國(guó)專利No.5,225,539；Winter的歐洲專利No.0,239,400 B1；Queen等人的歐洲專利No.0,451,216 B1；和Padlan，E.A.等人，歐洲專利0,519 596 A1。也可參看，Newman，R.等人的生物技術(shù)，101455-1460(1992)，關(guān)于靈長(zhǎng)類源化抗體，和Ladner等人的美國(guó)專利No.4,946,778和Bird，R.E.等人，科學(xué)，242423-426(1988)，關(guān)于單鏈抗體。
如本文所使用的，“人源化抗體”是指抗體或其抗原結(jié)合片段包括部分不同源的免疫球蛋白，其中至少一部分是人類源的。如，人源化抗體可以包括非人類源(如，嚙齒動(dòng)物)的抗原-結(jié)合區(qū)域和人類源(如人類構(gòu)架區(qū)，人類恒定區(qū)(如CL，CH1，CH2，CH3，CH4))的恒定區(qū)?？乖Y(jié)合區(qū)域可從具有必需特異性的非人類源的免疫球蛋白衍生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體包括一種或多種免疫球蛋白鏈，包括非人類源(如從非人類源的抗體衍生的一種或多種CDR)的CDR和從人類源的輕或重鏈(如有或沒有構(gòu)架改變的CDR-移植抗體，包括單鏈抗體)衍生的構(gòu)架區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體包括(a)至少一種人源化輕鏈，輕鏈包括從具有必需特異性的非人類免疫球蛋白的輕鏈衍生的抗原結(jié)合區(qū)域，和人類輕鏈恒定區(qū)，和(b)至少一種人源化重鏈，重鏈包括從所說的非人類免疫球蛋白的重鏈衍生的抗原結(jié)合區(qū)域，和人類重鏈恒定區(qū)。在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)方面中，人源化抗體是嵌合抗體，包括非人類源的抗體的一個(gè)輕鏈可變區(qū)域，和一個(gè)重鏈可變區(qū)域，和人類恒定區(qū)。
在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，人源化抗體能與鼠科動(dòng)物7E3單克隆抗體或嵌合7E3，或它們的抗原結(jié)合片段，競(jìng)爭(zhēng)與人類GPIIb/IIIa，或人類αvβ3的結(jié)合。如，人源化抗體的抗原結(jié)合區(qū)域可從7E3單克隆抗體衍生。在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)方面中，人源化免疫球蛋白包括鼠科動(dòng)物7E3抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)域，和人類恒定區(qū)。在另一個(gè)方面中，人源化免疫球蛋白包括鼠科動(dòng)物7E3抗體輕鏈的CDR1，CDR2和CDR3和重鏈的CDR1，CDR2和CDR3，和人類恒定區(qū)。
如本文所使用的，“嵌合抗體”還指包括不同源的部分免疫球蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段。不是包括嵌合抗體的部分免疫球蛋白都需要是人類源的。如嵌合抗體可包括非人類源(如，嚙齒動(dòng)物)的抗原結(jié)合區(qū)域和非人類靈長(zhǎng)類源(如，黑猩猩構(gòu)架區(qū)，黑猩猩恒定區(qū)(如CL，CH1，絞鏈區(qū)，CH2，CH3，CH4))的恒定區(qū)。
人源化或嵌合抗體可包括所需同種型的輕鏈恒定區(qū)(如，CK，Cλ)和重鏈恒定區(qū)(如，CH1，絞鏈區(qū)，CH2，CH3，CH4)，如IgG(如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgA(如，IgA1，IgA2)，IgM，IgE或IgD。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，人源化或嵌合抗體可包括混合同種型的重鏈恒定區(qū)(如，IgG源的CH1和絞鏈區(qū)和IgA源的CH2和CH3)。較好地，人源化或嵌合抗體包括IgG重鏈恒定區(qū)。最好地，人源化或嵌合抗體包括IgG1重鏈恒定區(qū)。
人源化可使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過合成或重組DNA技術(shù)或其他適合的技術(shù)制備。編碼人源化可變區(qū)域的核酸(如cDNA)序列也可通過PCR誘變法改變編碼人類或人源化鏈的DNA序列，如從預(yù)先人源化的可變區(qū)域獲得的DNA模板來構(gòu)建(參看如，Kamman，M.，等人，核酸研究，175404(1989)；Sato，K.，等人，癌癥研究，53851-856(1993)；Daugherty，B.L.等人，核酸研究，19(9)2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.和J.S.Crowe，基因，101297-302(1991))。使用這些或其他適合的方法，變體也可方便地制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，克隆的可變區(qū)域可被誘變，編碼具有所需特異性的變體的序列可被選取(如從噬菌體文庫中；參看如，Krebber等人，美國(guó)專利5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，1993年4月1人公布)。
對(duì)人類GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1特異的抗體可培養(yǎng)來抗適當(dāng)?shù)拿庖咴?，如分離的和/或重組的GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1或它們的一部分(包括合成分子，如合成肽)。抗體也可通過用表達(dá)GPIIb/IIIa的細(xì)胞，如血小板(參看如，Coller，美國(guó)專利No.5,440,020，其全部?jī)?nèi)容參考收入本篇)或表達(dá)αvβ3或Mac-1的細(xì)胞免疫接種適當(dāng)?shù)乃拗?如鼠)來培養(yǎng)。此外，表達(dá)重組體GPIIb/IIIa，αvβ3或Mac-1的細(xì)胞如轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可用作為免疫原或用在結(jié)合受體的抗體篩查中(參看如，Chuntharapai等人，免疫學(xué)期刊，1521783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美國(guó)專利No.5,440,021)。
制備免疫接種抗原，和多克隆和單克隆抗體生產(chǎn)可通過任何合適的技術(shù)實(shí)施。已公開多種方法(參看如，Kohler等人，自然，256495-497(1975)和歐洲免疫學(xué)期刊，6511-519(1976)；Milstein等人，自然，266550-552(1977)；Koprowski等人，美國(guó)專利No.4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，(冷泉港實(shí)驗(yàn)室冷泉港，NY)；分子生物學(xué)的當(dāng)前方案，2卷(增補(bǔ)本27，1994年夏)，Ausubel，F(xiàn).M.等人編輯(John Wiley&Sons紐約，紐約州)，11章，(1991))。通常，通過將適當(dāng)?shù)臒o限增殖細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系，如SP2/0或P3X63Ag8.653)與產(chǎn)生抗體細(xì)胞融合制備雜交瘤。產(chǎn)生抗體細(xì)胞，較好地是脾臟或淋巴結(jié)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，可從用有興趣的抗原免疫接種的動(dòng)物中獲得。融合細(xì)胞(雜交瘤)可通過選擇性的培養(yǎng)條件來分離，并通過有限稀釋來克隆。產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞可通過適當(dāng)?shù)臏y(cè)試法(如，ELISA)來選取。
也可使用制備或分離具有必需特異性的抗體的其他適合的方法，包括如，從文庫(如噬菌體文庫)中選取重組體抗體的方法，或依賴于能產(chǎn)生人類抗體所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如鼠)免疫接種的方法(參看如，Jakobovits等人，Proc，Natl，Acad.Sci.USA，902551-2555(1993)；Jakobivits等人，自然，362255-258(1993)；Lonberg等人，美國(guó)專利No.5,545,806；Surani等人，美國(guó)專利No.5,545,807；Lonberg等人，WO97/13852)。
如本文所使用的，當(dāng)指抗體-抗原相互作用時(shí)，“特異抗體”或“特異”用來指抗體高親和力結(jié)合具體抗原(如，KD小于約10-5M)，而不是指抗體僅結(jié)合一種抗原。
結(jié)合GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1的，較好地抑制纖連蛋白與GPIIb/IIIa的結(jié)合的并抑制血小板聚集的抗體可如本文所述進(jìn)行修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，7E3(鼠科動(dòng)物IgG1，K)或人源化7E3如本文所述進(jìn)行修飾。較好的人源化7E3是c7E3，其包括鼠科動(dòng)物7E3重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合其他，和人類γ1和K恒定區(qū)(Knight，D.M.等人，分子免疫學(xué)，32(16)1271-1281(1995))。其他可包括人類源的其他恒定區(qū)和/或人類構(gòu)架區(qū)的人源化抗體也可如本文所描述的進(jìn)行修飾。在較好的實(shí)施方案中，修飾7E3或人源化7E3的功能片段(如，F(xiàn)v，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2)。對(duì)GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1具有與7E3或c7E3相似的表位特異性的其他抗體，包括在GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1上結(jié)合與7E3或c7E3所結(jié)合的表位相同的或功能等同的表位的抗體也可進(jìn)行修飾。具有與7E3或c7E3相同或相似的表位特異性的抗體，包括能阻斷7E3或c7E3或它們適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合片段與GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-1結(jié)合的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體7E3(鼠科動(dòng)物雜交瘤7E3在美國(guó)VA20110-2209，Manassas，Blvd大學(xué)10801美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，1985年5月30日沉積，在新填編號(hào)HB8 832下和獲得)競(jìng)爭(zhēng)地抑制本發(fā)明的修飾抗體與GPIIb/IIIa和/或αvβ3的結(jié)合。
如本文所描述的抗體修飾改善了抗體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)屬性。具體地，本發(fā)明的修飾抗體特點(diǎn)在于增加了體內(nèi)血清的半衰期。在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，修飾抗體進(jìn)一步的特點(diǎn)在于與未修飾的抗體相比免疫原性減少。對(duì)血清半衰期和蛋白質(zhì)和肽(如，抗體，修飾抗體)的免疫原性的測(cè)定可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)施。如修飾蛋白質(zhì)可給動(dòng)物服用(如，通過注射)，血清可在服用后特定時(shí)間(如，一分鐘，小時(shí)，天，周，月等)從動(dòng)物獲取。血清可進(jìn)行存在修飾蛋白質(zhì)的測(cè)定，或進(jìn)行結(jié)合修飾蛋白質(zhì)的抗體的測(cè)定(如。通過ELISA)。
在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，修飾作用沒有顯著地影響抗體的抗原結(jié)合屬性?？贵w的抗原結(jié)合屬性可表示為抗原-抗體締合率常數(shù)(ka)，和抗原-抗體解離率常數(shù)(kd)和親和力(KD)。可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ囼?yàn)測(cè)定參數(shù)。(參看，如Berzofsky，等人，“抗體-抗原相互作用”，基礎(chǔ)免疫學(xué)，Paul，W.E.，編輯，Raven出版紐約，紐約州(1984)；Kuby，Janis免疫學(xué)，W.H.Freeman和公司紐約，紐約州(1992)；和本文所描述的方法)。沒有顯著影響抗體的抗原結(jié)合屬性的修飾不會(huì)改變(如，增加或減少)多于因數(shù)約100的抗體親和力。這樣的修飾抗體結(jié)合抗原，親和力與相應(yīng)的未修飾的抗體的親和力基本上相同。如抗體可具有親和力為2×10-9M，修飾抗體可具有親和力在約2×10-11M到約2×10-7M。在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，修飾不會(huì)改變多于因數(shù)約10的抗體親和力。如果在不同條件下(如，鹽的濃度，PH)測(cè)定，所測(cè)得的具體抗體-抗原相互作用可以是變化的。因此，測(cè)定抗原-結(jié)合參數(shù)(如，ka，kb，KD)較好地使用標(biāo)準(zhǔn)化的抗體和抗原溶液，標(biāo)準(zhǔn)化的緩沖液，如本文所描述的緩沖液來實(shí)施。
本發(fā)明的修飾抗體包括一種或多種直接或間接與抗體共價(jià)結(jié)合的有機(jī)組成，從而增加抗體的體內(nèi)血清半衰期，較好地，與未修飾抗體相比減少免疫原性。如本文所使用的，“有機(jī)組成”是指線性的或支化的組成，從親水聚合物基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)，脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)基團(tuán)(如二脂酰甘油基團(tuán)，鞘脂類基團(tuán)(如，神經(jīng)酰胺))或磷脂基團(tuán)(如磷脂酰乙醇胺基團(tuán))中選取。較好的脂質(zhì)和磷脂基團(tuán)分別由結(jié)構(gòu)式I和II表示-O-CH2-CH(R)-CH2-R’ (I)-NH-CH2-CH2-O-P(O-)(O)-O-CH2-CH(R)-CH2-R’(II)在結(jié)構(gòu)式I和II中，R和R’每個(gè)獨(dú)立地是-OH，或是表示為-X-Y的基團(tuán)，其中-X是-O-，-O-C(O)-，-S-，-O-S(O)2-O-，-NH-C(O)-或OCH＝CH-，Y是含有約6個(gè)到約40個(gè)碳原子的烴基團(tuán)，其是飽和的或其含有一個(gè)或多個(gè)不飽和單元(如，烷基，鏈烯基，炔基)，只要R和R’不都是-OH。較好地，-X-是-O-C(O)-。因此，適合的脂質(zhì)和磷脂基團(tuán)包括，如，二脂酰甘油，醚磷脂，硫醚磷脂，溶血磷脂和縮醛磷脂。
與本發(fā)明的抗體結(jié)合的每種有機(jī)組成可獨(dú)立地是親水聚合物基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)，脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)基團(tuán)或磷脂基團(tuán)。如本文所使用的，“脂肪酸”包括單-羧酸和二羧酸。
“親水聚合物基團(tuán)”，如本文所使用的，是指在水中比在辛烷中更具有溶解性的有機(jī)聚合物。如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中更具有溶解性。因此，由聚賴氨酸共價(jià)附著修飾的抗體包括在本發(fā)明中。適合修飾本發(fā)明抗體的親水聚合物可以是線性的或支化的，包括如，聚烷烴乙二醇(如PEG，單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)，PEG二胺，PPG等)，碳水化合物(如，右旋糖苷，纖維素，低聚糖，多聚糖等)，親水氨基酸的聚合物(如，聚賴氨酸，聚精氨酸，聚天冬氨酸)，聚烷烴氧化物(聚乙烯氧化物，聚丙烯氧化物等)和聚乙烯基吡咯烷酮。修飾本發(fā)明抗體的親水聚合物作為獨(dú)立的分子實(shí)體可具有分子量約800到約150,000道爾頓。較好地，有機(jī)組成作為獨(dú)立分子實(shí)體分子量為約2,000道爾頓或更大。如PEG5,000和PEG20,000，其中寫在下面的數(shù)字是聚合物的平均分子量道爾頓，聚合物特別較好的是親水聚合物。同樣較好的是PEG2,000，PEG3,400，PEG10,000，PEG30,000和PEG40,000，其可以是線性的或支化的。支化的PEG(如，(PEG2,000)2，(PEG2,000)4，(PEG5,000)2，)可通過如Harris等人在美國(guó)專利No.5,932,462中所描述的制備，這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容都通過在此引述而合并于本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，親水聚合物基團(tuán)可被一個(gè)到約六個(gè)烷基，脂肪酸，脂肪酸酯，脂質(zhì)或磷脂基團(tuán)(如本文所描述的，如結(jié)構(gòu)式I和II)取代。較好地，取代的親水聚合物基團(tuán)是線性的或支化的PEG。更好地，取代的親水聚合物基團(tuán)是末端被脂肪酸，脂肪酸酯，脂質(zhì)或磷脂基團(tuán)取代的線性PEG(如，PEG二胺)。被烷基，脂肪酸，脂肪酸酯，脂質(zhì)或磷脂基團(tuán)取代的親水聚合物可通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?。如，如本文所描述?實(shí)施例XIV和XV)，修飾試劑可通過將單保護(hù)的PEG二胺與活化的脂肪酸(如，軟脂酰氯化物)反應(yīng)制備。產(chǎn)物可進(jìn)行解保護(hù)，可引入適當(dāng)?shù)幕罨噭?如，maleimido)，產(chǎn)生的修飾試劑可用來制備含有末端被脂肪酸基團(tuán)取代的PEG的修飾Fab’。也可使用多種其他適當(dāng)?shù)暮铣煞桨?，如含有氨基基團(tuán)的聚合物可與如本文所描述的脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯偶聯(lián)，脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸酯(如，用N，N’-羰基二聯(lián)咪唑活化的)可與聚合物上的羥基基團(tuán)偶聯(lián)。
適于修飾本發(fā)明的抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的，或可含有一個(gè)或多個(gè)不飽和單元。在一個(gè)較好的實(shí)施方案中，脂肪酸和脂肪酸酯包括約六個(gè)到約四十個(gè)碳原子，或約八個(gè)到約四十個(gè)碳原子。適于修飾本發(fā)明的抗體的脂肪酸包括，如n-十二烷酸酯(C12，月桂酸酯)，n-十四烷酸酯(C14，肉豆蔻酸酯)，n-十六烷酸酯(C16，棕櫚酸酯)，n-十八烷酸酯(C18，硬脂酸酯)，n-二十烷酸酯(C20，花生酸酯)，n-二十二烷酸酯(C22，山崳酸酯)，n-三十烷酸酯(C30)，N-四十烷酸酯(C40)，順式-Δ9十八烷酸酯(C18，油酸酯)，所有的，順式-Δ5，8，11，14二十碳四烯酸酯(C20，花生四烯酸酯)，辛二酸，十四烯二酸，十八烯二酸，二十二烯二酸，等等。適當(dāng)?shù)闹舅狨グê芯€性或支化小分子烷基基團(tuán)的二羧酸的單酯。小分子烷基基團(tuán)可以含有一個(gè)到約十二個(gè)，較好地含有一個(gè)到約六個(gè)碳原子。修飾本發(fā)明的抗體的適當(dāng)?shù)闹舅狨グ?，十八烷酸甲酯，十八烷酸乙酯，十八烷酸丙酯，十二烷酸丁酯，sec-十二烷酸丁酯，tert-十二烷酸丁酯，十四烷酸新戊酯，十四烷酸己酯，順式-Δ9十八烷酸甲酯，等等。
如本文下面所描述的抗體的修飾較好地使用一種或多種修飾試劑實(shí)施。本文所使用的“修飾試劑”，是指含有活化基團(tuán)的親水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯，脂質(zhì)或磷脂的衍生物。“活化基團(tuán)”是在適當(dāng)?shù)臈l件下，能與另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)從而在修飾試劑和另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)之間生成共價(jià)鍵的化學(xué)組成或功能基團(tuán)。如，胺-活性活化試劑包括親電子基團(tuán)如甲苯磺酸鹽，甲磺酸鹽，鹵素(氯，溴，氟，碘)，N-羥基琥珀酰亞胺基酯(NHS)，酰基鹵化物等等。可與硫醇反應(yīng)的活化試劑包括，如，順丁烯二酰亞胺，碘代乙酰基，丙烯?；?，吡啶基二硫化物，5-硫醇-2-硝基安息香酸硫醇(TNB-硫醇)，等等。醛功能基團(tuán)可與含胺或含酰肼的分子偶聯(lián)，疊氮基團(tuán)可與三價(jià)磷基團(tuán)反應(yīng)形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺鍵。將活化基團(tuán)引入到分子中的適當(dāng)方法在此領(lǐng)域中是已知的[參看如，Hermanson，G.T.，生物偶聯(lián)技術(shù)，學(xué)術(shù)出版社San Diego，CA(1996)]?；罨鶊F(tuán)可以直接或通過接頭組成，如C1-C12的烴基基團(tuán)結(jié)合親水聚合物，脂肪酸，脂肪酸酯，脂質(zhì)或磷脂。如本文所使用的，“烴基基團(tuán)”是指其中一個(gè)或多個(gè)碳原子任意地被雜原子如氧，氮或硫替換的碳?xì)滏湣＿m當(dāng)?shù)慕宇^組成包括，如三縮水四乙二醇，-(CH2)3-，-NH-(CH2)6-NH-，-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。
含有接頭組成的修飾試劑可通過，如在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的情況下將單-Boc-烷基二胺(如，單-Boc-乙二胺，單-Boc-己二胺)與脂肪酸反應(yīng)，在游離胺和脂肪酸羧酸酯之間形成酰胺鍵而制備。Boc保護(hù)基可通過用四氟乙酸(TFA)處理以暴露能與所描述的另一個(gè)羧酸酯偶聯(lián)的伯胺從產(chǎn)物上除去，或可以與馬來酸酐反應(yīng)，產(chǎn)物環(huán)化產(chǎn)生活化的脂肪酸的maleimido衍生物。(參看如，Thompson，等人，WO92/166220，其全文參考收入本篇。)本發(fā)明修飾抗體可通過將適當(dāng)?shù)目贵w(即，抗體或適當(dāng)?shù)目贵w片段，如Fab’)與修飾試劑反應(yīng)來制備，如本文所描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用胺-活性修飾試劑，如PEG的NHS酯，有機(jī)組成可以與抗體以非-位點(diǎn)特異方式結(jié)合。在一個(gè)具體實(shí)施例中，c7E3 Fab通過與NHS-PEG5,000以非-位點(diǎn)特異方式反應(yīng)來進(jìn)行修飾。如本文所演示的，這種類型的修飾顯著地降低了Fab對(duì)GPIIb/IIIa的結(jié)合親和力(實(shí)施例XXII，表6，比較c7E3 Fab和c7E3 Fab隨機(jī)(PEG5,000))。因此，在較好的實(shí)施方案中，修飾抗體可以通過將適當(dāng)?shù)目贵w與一種或多種修飾試劑反應(yīng)，產(chǎn)生含有一個(gè)到約六個(gè)結(jié)合抗體上特異位點(diǎn)的有機(jī)組成的修飾抗體來制備，如(即一個(gè)或多個(gè))羧基末端和/或(即一個(gè)或多個(gè))半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子。在特別推薦的實(shí)施方案中，修飾抗體可以包括一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合抗體上特異位點(diǎn)的(如，形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基，重鏈的羧基末端)大于2,000道爾頓的線性PEG組成。
在其中修飾抗體含有結(jié)合半胱氨酰殘基的有機(jī)組成的實(shí)施方案中，較好地，有機(jī)組成結(jié)合在適當(dāng)折疊(即，天然的)抗體中重鏈絞鏈區(qū)域內(nèi)形成鏈間二硫鍵的的半胱氨酰殘基。如本文所使用的，“鏈間二硫鍵”是指在適當(dāng)折疊(即，天然的)抗體中結(jié)合兩條重鏈的二硫鍵。
這種類型的修飾抗體可通過還原鏈間二硫鍵，從而產(chǎn)生包含重鏈和輕鏈的單價(jià)抗體來制備。適當(dāng)?shù)倪€原試劑包括，如，2-巰基乙醇(2ME)，二硫蘇糖醇(DTT)，2-巰基乙胺(2-MEA)和半胱氨酸。這種單價(jià)抗體可通過適當(dāng)?shù)姆椒?如層析柱)分離提純，提純的抗體可與硫醇-活性修飾試劑反應(yīng)，如O-(2-maleimido乙基)-O’-甲基聚乙二醇5000，制備本發(fā)明的修飾抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，修飾抗體包括(如一種或多種)結(jié)合包含在重鏈絞鏈區(qū)域內(nèi)形成鏈間二硫鍵的至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子的PEG組成。
在另一個(gè)實(shí)施例中，修飾抗體是Fab’，其包括結(jié)合形成鏈間二硫鍵的至少一個(gè)絞鏈區(qū)域半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子的有機(jī)組成。
在另一個(gè)實(shí)施例中，修飾抗體是Fab，其包括共價(jià)附著重鏈羧基末端的有機(jī)組成。這種類型的修飾抗體可通過將IgG木瓜蛋白酶裂解產(chǎn)生的Fab與，如含有胺活化試劑的PEG，在存在EDC的條件下反應(yīng)制備。然而，胺-活化PEG可與抗體上的所有羧基基團(tuán)反應(yīng)，使提純含有特異結(jié)合重鏈羧基末端的PEG的抗體很難進(jìn)行。
制備修飾抗體的一種較好的方法是通過反向蛋白質(zhì)水解在重鏈羧基末端引入獨(dú)特的活化基團(tuán)。“反向蛋白質(zhì)水解”是此領(lǐng)域中的一個(gè)術(shù)語，其是指在特定條件下，某些蛋白酶可催化形成肽(酰胺)鍵。如由蛋白酶活性產(chǎn)生的提純Fab可在適合反向蛋白質(zhì)水解的條件下(如，碳酰肼相對(duì)Fab過量250-倍摩爾量)與所說的蛋白酶和碳酰肼混合，制備在重鏈羧基末端上含有獨(dú)特酰肼官能的Fab。
含酰肼的Fab可通過與適當(dāng)?shù)男揎椩噭┓磻?yīng)來修飾。如，F(xiàn)ab可與含有醛官能基團(tuán)的修飾試劑反應(yīng)，制備含有通過腙鍵特異附著重鏈羧基末端的有機(jī)組成的修飾抗體。腙通過與適當(dāng)?shù)倪€原試劑(如，氰基硼氫化鈉)反應(yīng)進(jìn)一步穩(wěn)定化。
能酶切抗體產(chǎn)生所需片段的多種酶可用來通過反向蛋白質(zhì)水解引入酰肼。反向蛋白質(zhì)水解的條件對(duì)此領(lǐng)域中的技術(shù)人員是眾所周知的，包括大量過摩爾量(如250倍)的碳酰肼和延長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。并且，反向蛋白質(zhì)水解較好地在與蛋白質(zhì)水解最優(yōu)PH不同的PH下進(jìn)行(Fisch等人，生物偶聯(lián)化學(xué)，3147-153(1992)；Werlen等人，生物偶聯(lián)化學(xué)，2；411-417(1994)；Kumaran等人，蛋白質(zhì)科學(xué)，6(10)2233-2241(1997)；Itoh等人，生物組織化學(xué)，24(1)59-68(1996)；Capellas等人，生物技術(shù)生物工程，56(4)456-463(1997))。反向蛋白質(zhì)水解的最優(yōu)PH可使用標(biāo)準(zhǔn)方法試驗(yàn)確定。羧基末端修飾較好的酶是非染色質(zhì)肽酶。
輕鏈的羧基末端也可通過反向蛋白質(zhì)水解引入酰肼來修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，選取能酶切輕鏈但不顯著影響抗體的抗原結(jié)合特性的蛋白酶，如所述進(jìn)行輕鏈修飾。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用重組DNA技術(shù)，非染色質(zhì)肽酶或其他蛋白水解裂解位點(diǎn)能引入到克隆抗體的輕鏈中。這種類型的抗體能被非染色質(zhì)肽酶或適當(dāng)?shù)拿杆盖?，產(chǎn)生通過反向蛋白質(zhì)水解能將酰肼基團(tuán)引入到重鏈和輕鏈的羧基末端的Fab。
在其他實(shí)施方案中，重組DNA技術(shù)能用來引入或從克隆抗體的重鏈除去非染色質(zhì)肽酶或其他酶切位點(diǎn)(如，通過誘變)。如，自然發(fā)生的非染色質(zhì)肽酶的酶切位點(diǎn)可被除去并在不同的位置上引入新的酶切位點(diǎn)。因此，非染色質(zhì)肽酶或其他適當(dāng)?shù)拿缚捎脕懋a(chǎn)生本發(fā)明的多種修飾抗體。如，可以制備含有中重鏈的羧基末端和/或輕鏈的羧基末端的有機(jī)組成的Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2或Fab’片段。這樣的片段可進(jìn)一步包括結(jié)合半胱酰氨殘基的側(cè)鏈硫原子的一種或多種其他有機(jī)組成。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有兩個(gè)PEG5,000基團(tuán)的c7E3 Fab’，其中每個(gè)PEG5,000基團(tuán)與形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有兩個(gè)PEG20,000基團(tuán)的c7E3 Fab’，其中每個(gè)PEG20,000基團(tuán)與形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有一個(gè)與重鏈羧基末端結(jié)合的PEG5,000基團(tuán)的c7E3 Fab。在一個(gè)較好的方面中，F(xiàn)ab由非染色質(zhì)肽酶酶切產(chǎn)生。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有一個(gè)與重鏈羧基末端結(jié)合的PEG20,000基團(tuán)的c7E3 Fab。在一個(gè)較好的方面中，F(xiàn)ab由非染色質(zhì)肽酶酶切產(chǎn)生。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有一個(gè)PEG5,000基團(tuán)和一個(gè)C22脂肪酸基團(tuán)并各自獨(dú)立地與形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有一個(gè)與重鏈羧基末端結(jié)合的PEG5,000基團(tuán)的c7E3 Fab，該P(yáng)EG5,000基團(tuán)與重鏈羧基末端結(jié)合，其中PEG5,000基團(tuán)帶有C22脂肪酸取代物。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的PEG20,00基團(tuán)的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的PEG10,000基團(tuán)的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的(PEG2,000)2基團(tuán)的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的(PEG2,000)4基團(tuán)的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的(PEG5,000)2基團(tuán)的c7E3 Fab’。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有(一個(gè)或更多個(gè))與在連接區(qū)形成鏈間二硫鍵的半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子結(jié)合的終端取代的PEG3,400基團(tuán)的c7E3 Fab’，其中的終端取代是棕櫚?；鶊F(tuán)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾抗體是含有重鏈羧基連接的C22脂肪酸基團(tuán)的c7E3 Fab。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，修飾了含有基因工程設(shè)計(jì)的半胱氨酰殘基(如，通過重組DNA技術(shù)引入的半胱氨酰)的抗體。這種類型的抗體，包括如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2或Fab’片段，可通過此領(lǐng)域中普通技術(shù)方便地制備。含有基因工程設(shè)計(jì)的半胱氨酰殘基的抗體可與硫醇-活性修飾試劑反應(yīng)，制備本發(fā)明的修飾抗體。含有基因工程設(shè)計(jì)的半胱氨酰殘基的抗體可進(jìn)一步包含非染色質(zhì)肽酶或其他裂解位點(diǎn)，并在這個(gè)位點(diǎn)上如所述進(jìn)行修飾。
如本文所描述的抗體的位點(diǎn)特異修飾(如，羧基末端的PEG化)提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括增加了活性持續(xù)時(shí)間。并且，含有位點(diǎn)特異修飾的抗體不可預(yù)料地比相應(yīng)的未修飾抗體免疫原性低。如，含有一個(gè)或兩個(gè)低分子量的有機(jī)組成(如，PEG5,000)的Fab片段的位點(diǎn)特異修飾產(chǎn)生了具有增加的血清半衰期和顯著降低的免疫原性的修飾Fab，其用與未修飾抗體基本上相同的親和力結(jié)合GPIIb/IIIa或αvβ3(參看實(shí)施例IX，XI和XII)。有限修飾產(chǎn)生的顯著降低免疫原性的沒有預(yù)料到的益處可能是由于本文所描述修飾的位點(diǎn)特異性。
本發(fā)明的修飾抗體可通過使用此領(lǐng)域中的技術(shù)人員眾所周知的方法提純。適當(dāng)?shù)奶峒兎椒òǎ?，層析柱?如，離子交換，凝膠過濾，疏水-相互作用，親和柱)，制備天然電泳法，沉淀法和超濾法。較好地，如本文所述，修飾抗體通過疏水-相互作用層析法提純。
如本文所使用的，“純的”或“提純的”是指制備品，其中本發(fā)明的修飾抗體占存在于制備品中的大分子的約75％。較好地，修飾抗體占存在于制備品中的大分子的約90％或95％。更好地，修飾抗體占約99％或基本上全部是存在于制備品中的大分子。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(如減緩疾病和病變的嚴(yán)重性或預(yù)防)其中在人體內(nèi)表達(dá)GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的細(xì)胞(如，血小板，內(nèi)皮細(xì)胞，白細(xì)胞)起到疾病病理學(xué)作用的疾病或病變的方法。這樣的病變包括，如，血栓病變?nèi)缧难芗膊?如，動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈疾病，心肌梗死)，深靜脈血栓癥，中風(fēng)，局部缺血，腫瘤血管化(如，αvβ3-調(diào)節(jié)的血管生成)，腫瘤轉(zhuǎn)移(如，血小板調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)移)。表達(dá)GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的細(xì)胞(如，血小板，內(nèi)皮細(xì)胞，白細(xì)胞)也在炎性疾病和病況中起到疾病病理學(xué)作用，炎性疾病和病況包括，如，自身免疫疾病，成年呼吸不良應(yīng)激綜合癥，同種異體移植排斥，膿血癥，再灌注損傷(如，與移植有關(guān)的再灌注損傷，中風(fēng)或心肌梗死患者中再灌注產(chǎn)生的損傷)，心肌梗死，血管成形術(shù)和外科手術(shù)。
本發(fā)明的方法還可用來在人體內(nèi)有益地抑制血栓癥，器官狹窄，心瓣手術(shù)后再狹窄和/或由配體與GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1結(jié)合調(diào)節(jié)的過程(如，附著，聚集，分泌(如，脫粒)，增殖，氧自由基的產(chǎn)生)。如修飾抗體發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用在要預(yù)防血栓形成或再形成或器官狹窄和/或心瓣手術(shù)后再狹窄的情況中，如在脈管干預(yù)過程期間或后，如，血管造影術(shù)，血管成形術(shù)(如，用氣囊實(shí)施的atherectomy，激光血管成形術(shù)或其他適當(dāng)?shù)姆椒?有或沒有rotablation和/或stent替換))，冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)，stent替換(如，冠狀stent)，和/或其他脈管干預(yù)過程(如，脈管手術(shù)，脈管移植，外周stent展開，假體瓣膜或脈管插入(如，自體同源，非自體同源或合成脈管移植))。具體地，方法可用來在冠狀動(dòng)脈干預(yù)過程，如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)期間或后有益地抑制血栓癥。
該方法包括給人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體，預(yù)防或減緩其中血小板起到疾病病理學(xué)作用的疾病和/或病變的嚴(yán)重性，或抑制(減緩或預(yù)防)血栓癥，器官狹窄，心瓣手術(shù)后再狹窄和/或由配體與GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1結(jié)合調(diào)節(jié)的過程。如，修飾抗體可在脈管干預(yù)過程(如，血管成形術(shù))前，期間和/或后給人服用，預(yù)防脈管(再閉塞)的突然關(guān)閉，預(yù)防/或減緩急性局部缺血。
“有效量的”，如本文所使用的，是指足以獲得所需治療效果(如，抑制血栓癥形成，預(yù)防脈管再閉塞，抑制器官狹窄和/或再狹窄，抑制炎癥，炎癥αvβ3調(diào)節(jié)的血管生成)的量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)抑制血栓癥的方法，包括給所說的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)脈管干預(yù)過程(如，冠狀動(dòng)脈干預(yù)過程如PTCA)后抑制器官狹窄和/或再狹窄的方法，包括給所說的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)減緩或預(yù)防局部缺血的方法，包括給所說的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給所說的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)抑制αvβ3-相關(guān)血管生成的方法，包括給所說的人服用有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是一種在人體內(nèi)抑制由配體與GPIIb/IIIa，αvβ3，和/或Mac-1的結(jié)合調(diào)節(jié)的過程的方法，包括給所說的人服用治療上有效量的本發(fā)明的修飾抗體。
本發(fā)明的方法包括單獨(dú)服用一種或多種修飾抗體，或與有效量的一種或多種其他活性試劑，如，溶解血纖維蛋白試劑(如，Retavase)，溶解血栓試劑，如血纖維蛋白溶酶原激活劑(如，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑，尿激酶，鏈激酶，重組血纖維蛋白溶酶原激活劑)，抗凝血?jiǎng)?如，肝磷脂，hirulog，水蛭素，乙酰水楊酸)，或香豆素抗凝血?jiǎng)?如，丙酮芐羥香豆素，ethyledine雙香豆素)一起服用。本發(fā)明的修飾抗體也可與β-腎上腺素阻斷劑(如，烯丙心安，醋丁酰心安，心得安)，鈣通道阻斷劑(如，硝苯吡啶，硫氮草酮，肉桂苯哌嗪，芐環(huán)烷)或血管擴(kuò)張劑(如，硝化甘油，amotriphene，赤藻糖醇，雙苯丙胺)一起服用。本發(fā)明的修飾抗體還可與刺激產(chǎn)生氮氧化物的試劑一起服用(參看如，Singh等人，美國(guó)專利No.5,811,437)。
可以使用多種服用途徑。如本發(fā)明的修飾抗體可用與已經(jīng)公開的其他治療抗體相同的方式制備和服用(Faanes等人，美國(guó)專利No.5,695,760；Coller等人，WO95、12412；兩篇文獻(xiàn)參考收入)。有效量的本發(fā)明的修飾抗體可經(jīng)非腸道服用(如，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下)，如，通過注射到血管，肌肉或體腔(如，腹腔，胸腔)內(nèi)。修飾抗體還可口服，局部用藥，通過吸入(如，支氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，口吸入或鼻內(nèi)滴液)，或直腸用藥。較好地，修飾抗體通過靜脈內(nèi)服用。修飾抗體可以單一劑量，連續(xù)注入，或多劑量和/或注入(如，丸藥劑量后連注入)服用。
服用抗體的配方根據(jù)所選取的服用方式變化(如，溶液，乳液，膠囊)。本發(fā)明的修飾抗體可以中性蛋白質(zhì)或以生理上可接受的鹽服用?！胞}”意指蛋白質(zhì)上帶電基團(tuán)(如，質(zhì)子化胺，羧酸酯)與相反電荷的可交換的離子締合。如，正電荷氨基基團(tuán)(如，質(zhì)子化胺)可與無機(jī)酸(如，鹽酸，磷酸，甲烷磺酸)或有機(jī)酸(如，乙酸，乳酸，檸檬酸等)形成酸式加成鹽，并含有抗衡離子離子如Cl-，CH3SO3-，乙酸酯，乳酸酯，檸檬酸酯等。羧酸鹽可通過與適當(dāng)?shù)膲A如氫氧堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀)反應(yīng)形成，并含有抗衡離子如Na+，K+等。
修飾抗體可作為部分藥物組合物服用，藥物組合物包括修飾抗體和藥物可接受的載體或賦形劑。適當(dāng)?shù)乃幬镙d體可含有不與修飾抗體相互作用的惰性組分?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)藥物配方技術(shù)，如在Remington藥物科學(xué)，Mack出版公司，Easton，PA中所描述的。非腸道用藥適用的藥物載體包括，如，滅菌水，生理鹽水，細(xì)菌抑制鹽水(含有約0.9％毫克/毫升芐甲醇)，磷酸緩沖液鹽水，Hank溶液，Ringer-乳酸鹽等?？贵w配方可含有其他添加劑母乳穩(wěn)定劑(如，聚山梨醇酯80，USP/NP)。膠囊化組合物的方法(如，硬質(zhì)凝膠或環(huán)糊精包裹)在此領(lǐng)域中是眾所周知的[Baker等人，生物活性試劑的控釋給藥，John Wiley andSons，(1986)]。
給人服用的抗體的量可以取決于疾病的種類和嚴(yán)重性，以及人的特性，如通常的健康狀況，年齡，性別和體重及對(duì)藥物的耐受性。其還可以取決于疾病的種類，程度，嚴(yán)重性。根據(jù)這些和其他因素，此領(lǐng)域中的技術(shù)人員能確定適當(dāng)?shù)膭┝?。一般，盡管大些或小些量也可使用，但治療上有效量的修飾抗體范圍可在對(duì)每個(gè)丸藥從約0.01毫克/公斤到約100毫克/公斤，及對(duì)每一次連續(xù)注入約0.001毫克/分鐘到約1毫克/分鐘。
實(shí)施例II 合成c7E3 Fab’(PEG20,000)2將7毫升c7E3(Fab’)2(5.2毫克/毫升，在磷酸緩沖液鹽水中)用0.7毫升二硫蘇糖醇(16毫克/毫升)處理，并在室溫保持1小時(shí)。在溶液中溶解0.63克的硫酸銨，將Fab’溶液加入到TosoHass苯基-5PW柱中(21.5毫米×15厘米，13μm)，TosoHass苯基-5PW柱已用含0.6M硫酸銨的pH7.5的0.1M磷酸鈉平衡過。經(jīng)65分鐘，流速6毫升/分鐘，通過降低硫酸銨濃度到0洗脫Fab’。收集含F(xiàn)ab’部分，并在在Amicon攪拌細(xì)胞中濃縮到最終濃度為2.2毫克/毫升。獲得總量22毫克的Fab’。然后用2毫升的O-(2-maleimido乙基)-O’-甲基聚乙二醇20000(57毫克/毫升；13eq總量)的水溶液(Shearwater聚合物，Huntsville，A1)處理Fab’。兩個(gè)小時(shí)后，加入0.95克硫酸銨并溶解在Fab’溶液中，將溶液加入到用含0.6M硫酸銨PH7.5的0.1M磷酸鈉平衡過的苯基柱中。經(jīng)65分鐘，流速6毫升/分鐘，使用50％到100％梯度的PH7.5 0.1M磷酸鈉洗脫P(yáng)EG化的產(chǎn)物。收集純組成獲得13毫克產(chǎn)物。通過質(zhì)譜法(MALDI-TOF)確定平均分子量為91078道爾頓。
實(shí)施例III 合成c7E3 Fab-PEG5,000在通過非染色質(zhì)肽酶對(duì)c7E3 IgG作用制備的5毫升c7E3 Fab(7.3毫克/毫升)中加入1.0克碳酰肼。通過加入300μl的冰乙酸將pH調(diào)節(jié)到4.95。加入10,000個(gè)單位的非染色質(zhì)肽酶，將產(chǎn)物溶液在環(huán)境溫度下溫育24小時(shí)。將溶液透析到10mM乙酸鈉中，加入Ph4.5、0.875毫克的單甲氧基聚乙二醇醛(PEG5,000醛，MW＝5,000)(Shearwater聚合物，Huntsville，A1)，接著加入0.3毫克的氰基硼氫化鈉。反應(yīng)在環(huán)境溫度保持過夜。加入硫酸銨以使最終溶液在硫酸銨中為0.6M。將TosoHass TSK 5PW苯基柱(21.5毫米×15厘米)用含有0.6M硫酸銨(緩沖液A)pH7.5的100mM磷酸鈉平衡。反應(yīng)混合物注入到苯基柱中，并經(jīng)60分鐘，流速6毫升/分鐘，用緩沖液A到100mM磷酸鈉，pH7.5(緩沖液B)的線性梯度洗脫。收集在約58分鐘時(shí)的峰值洗脫，并通過用分子量排除為10,000的膜在40psi超濾濃縮到5毫升。將濃縮液透析到磷酸緩沖液鹽水(PBS)中。將少量樣品在PD-10柱上脫鹽，用水洗脫。質(zhì)譜分析獲得集中在52,846道爾頓的一束峰值(由于PEG5,000醛的分子量分散)，對(duì)應(yīng)加入碳酰肼和PEG5,000醛后的c7E3 Fab預(yù)計(jì)分子量。
實(shí)施例IV c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2對(duì)血小板聚集的抑制作用制備富含血小板血漿(PRP)和血小板數(shù)量調(diào)節(jié)所有研究使用從正常，非-藥物治療的人類供體獲得的血小板實(shí)施。通過靜脈穿刺從每個(gè)供體抽取血液到60毫升含40％檸檬酸三鈉的1/100終稀釋液的注射器中。PRP通過在室溫下在600g離心4分鐘制備。將PRP小心地移出，通過在室溫下在2500g離心剩余血液20分鐘制備貧血小板血漿(PPP)。在計(jì)數(shù)前可將PRP在室溫下保持20分鐘。使用Coulter T-80確定PRP血小板數(shù)量。使用自體同源PPP將血小板數(shù)量調(diào)節(jié)到每μl 200,000-250,000血小板。血小板聚集使用PAP-4D血小板聚集器實(shí)施血小板聚集測(cè)試。對(duì)每一項(xiàng)測(cè)試，在聚集器的備有攪拌棒的透明玻璃管內(nèi)加入450μlPRP。將起始20μg/毫升(終濃度)或鹽水(50μl)的連續(xù)稀釋c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)，c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2加入到每個(gè)透明玻璃管中并在開始操作前在37℃溫育10分鐘。然后將玻璃管轉(zhuǎn)移到聚集器通道中，將攪拌速度調(diào)節(jié)到1200rpm。在加入12-20μM腺苷二磷酸(ADP)前監(jiān)測(cè)一分鐘半到一分鐘基線聚集。加入刺激劑后監(jiān)測(cè)聚集作用4分鐘，將僅用鹽水處理的對(duì)照樣品進(jìn)行每項(xiàng)操作以確定最大刺激劑誘導(dǎo)血小板聚集。對(duì)聚集作用的抑制對(duì)聚集作用的抑制表示為在存在c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的情況下，刺激劑刺激血小板最大化聚集的百分比。對(duì)于每種抗體，對(duì)聚集的抑制程度計(jì)算如下％抑制作用＝[1-％光透射抗體/％光透射鹽水對(duì)照物]×100將c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的終濃度數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化到摩爾濃度并相對(duì)于％對(duì)聚集作用的抑制作用作圖。c7E3，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2樣品表現(xiàn)出相似的抑制ADP調(diào)節(jié)血小板聚集的能力，在兩倍摩爾IC50濃度內(nèi)。
圖1和圖2說明c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2在它們抑制血小板聚集的能力方面與c7E3 Fab相似，說明增加半衰期的化學(xué)修飾不影響活性。
實(shí)施例V c7E3 Fab’(PEG20,000)2與125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)與提純整聯(lián)蛋白的結(jié)合將提純的αvβ3[Smith等人，生物化學(xué)期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科學(xué)，231(4745)1559-1562(1986)]稀釋到含2mM氯化鈣(TBS/Ca)的Tris-緩沖液鹽水(TBS)中，濃度為0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆蓋96-培養(yǎng)皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技術(shù)，Chantilly，VA)，將50μl適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶液等分到每個(gè)培養(yǎng)皿中并在室溫下溫育板2.5小時(shí)。將板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液沖洗并用其在室溫下阻斷1小時(shí)。將c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化學(xué)，Rockford，IL)碘化到約2μCi/μg。在TBS/BSA/Ca中制備2X終濃度的未標(biāo)記c7E3 Fab’(PEG20,000)2和未標(biāo)記c7E3 Fab的稀釋液系列。將c7E3Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升終濃度)的稀釋液與2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升終濃度)以1∶1混合并加入到板上。將板在37℃溫育2小時(shí)。沖洗板，培養(yǎng)皿分離到試管中，在計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)的結(jié)合放射性。數(shù)據(jù)表示為在存在c7E3Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab的情況下，最大125I-c7E3 Fab結(jié)合百分比，使用GraphPad Prism實(shí)施非線性回歸分析。
圖3和圖4演示了從c7E3 Fab’(PEG20,000)2或c7E3 Fab分別與GPIIb/IIIa和αvβ3獲得的數(shù)據(jù)，說明用來產(chǎn)生c7E3 Fab’(PEG20,000)2的衍生技術(shù)對(duì)其結(jié)合沒有顯著的影響。
實(shí)施例VI c7E3 Fab’(PEG5,000)2與125I-c7E3Fab競(jìng)爭(zhēng)與提純整聯(lián)蛋白的結(jié)合將提純的αvβ3[Smith等人，生物化學(xué)期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科學(xué)，231(4745)1559-1562(1986)]稀釋到含2mM氯化鈣(TBS/Ca)的Tris-緩沖液鹽水(TBS)中，濃度為0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆蓋96-培養(yǎng)皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技術(shù)，Chantilly，VA)，將60μl適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶液等分到每個(gè)培養(yǎng)皿中并在4℃溫育板過夜。將板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液沖洗并用其在室溫下阻斷1小時(shí)。將嵌合7E3 Fab(c7E3 Fab)(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化學(xué)，Rockford，IL)碘化到約2μCi/μg。在TBS/Ca中制備2X終濃度的未標(biāo)記c7E3 Fab’(PEG5,000)2和未標(biāo)記c7E3 Fab的稀釋液系列。將c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升終濃度)的稀釋液與2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升終濃度)以1∶1混合并加入到板上。將板在37℃溫育2小時(shí)。沖洗板，培養(yǎng)皿分離到試管中，在計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)的結(jié)合放射性。數(shù)據(jù)表示為在存在c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab的情況下，最大125I-c7E3 Fab結(jié)合百分比，使用GraphPad Prism實(shí)施非線性回歸分析。
圖5和圖6演示了從c7E3 Fab’(PEG5,000)2或c7E3 Fab分別與GPIIb/IIIa和αvβ3獲得的數(shù)據(jù)，說明用來產(chǎn)生c7E3 Fab’(PEG5,000)2的衍生技術(shù)沒有不利地影響結(jié)合。
實(shí)施例VII c7E3 Fab’PEG5,000與125I-c7E3 Fab競(jìng)爭(zhēng)與提純整聯(lián)蛋白的結(jié)合將提純的αvβ3[Smith等人，生物化學(xué)期刊，263(35)18726-18731(1988)]或GPIIb/IIIa[Pytela等人，科學(xué)，231(4745)1559-1562(1986)]稀釋到含2mM氯化鈣(TBS/Ca)的Tris-緩沖液鹽水(TBS)中，濃度為0.5μg/毫升(αvβ3)或1.5μg/毫升(GPIIb/IIIa)。用αvβ3或GPIIb/IIIa覆蓋96-培養(yǎng)皿的聚苯乙烯Immulon Removawell板(Dynex技術(shù)，Chantilly，VA)，將60μl適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶液等分到每個(gè)培養(yǎng)皿中并在4℃溫育板過夜。將板用1％牛血清清蛋白(BSA)的TBS/Ca溶液沖洗并用其在室溫下阻斷1小時(shí)。將嵌合7E3 Fab(c7E3 Fab)(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)用Iodobeads(Pierce化學(xué)，Rockford，IL)碘化到約2μCi/μg。在TBS/Ca中制備2X終濃度的未標(biāo)記c7E3 Fab’PEG5,000和未標(biāo)記c7E3 Fab的稀釋液系列。將c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab(起始于20μg/毫升終濃度)的稀釋液與2X125I-c7E3 Fab(1μg/毫升終濃度)以1∶1混合并加入到板上。將板在37℃溫育2小時(shí)。沖洗板，培養(yǎng)皿分離到試管中，在計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)的結(jié)合放射性。數(shù)據(jù)表示為在存在c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab的情況下，最大125I-c7E3 Fab結(jié)合百分比，使用GraphPad Prism實(shí)施非線性回歸分析。
圖7和圖8演示了從c7E3 Fab’PEG5,000或c7E3 Fab分別與GPIIb/IIIa和αvβ3獲得的數(shù)據(jù)，說明用來產(chǎn)生c7E3 Fab’PEG5,000的衍生技術(shù)沒有不利地影響結(jié)合。
實(shí)施例VIII GPIIb/IIIa受體阻斷(血纖蛋白原珠測(cè)試)在活化血小板上的GPIIb/IIIa復(fù)合物是血纖蛋白原的受體。配體結(jié)合的機(jī)理主要依據(jù)Arg-Gly-Asp(RGD)依賴過程，其中含RGD序列的肽阻斷血小板聚集并抑制血纖蛋白原的結(jié)合。Coller等人觀察到，血小板通過GPIIb/IIIa血纖蛋白原相互作用粘著血纖蛋白原覆蓋的珠子。阻斷GPIIb/IIIa受體的單克隆抗體可以預(yù)防配體和受體的相互作用，因此預(yù)防血纖蛋白原覆蓋的珠子的粘著。
血纖蛋白原與珠子(羧酸酯化聚苯乙烯微型顆粒)的共價(jià)偶聯(lián)將血纖蛋白原(酶研究，South Bend，IN)預(yù)溫?zé)岬?7℃并重新組建在溫水中。在13,000-14,000g離心7分鐘除去顆粒。除去上清液并測(cè)定其在OD280，E＝1.5處的吸光率。將血纖蛋白原溶液保持在室溫直到準(zhǔn)備使用。如所述準(zhǔn)備珠子(藍(lán)色羧酸酯化聚苯乙烯微型顆粒3μm直徑，2.5％固體顆粒)([Coller等人，循環(huán)系統(tǒng)，95(4)860-867(1997)]。簡(jiǎn)單地，將珠子置于室溫并劇烈振蕩。將珠子(5毫升)放置在15毫升含0.1M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液的離心試管中，在室溫下離心10分鐘。將沉淀用碳酸鹽緩沖液再一次沖洗，離心，將上清液除去。將沉淀重新懸浮到pH4.5，0.02M磷酸鈉緩沖液中，劇烈振蕩，在環(huán)境溫度下離心10分鐘。將上清液除去，在磷酸鹽緩沖液中沖洗兩次沉淀。通過將沉淀重新懸浮到6.25毫升磷酸鹽緩沖液中并緩慢加入6.25毫升新鮮制備的2％碳化二亞胺溶液來實(shí)施珠子活化。在環(huán)境溫度下在搖擺平臺(tái)上混合珠子/碳化二亞胺3小時(shí)，然后離心10分鐘。將上清液除去，用磷酸鹽緩沖液沖洗三次沉淀，除去任何未反應(yīng)的碳化二亞胺。一旦除去未反應(yīng)的碳化二亞胺完成，將上清液除去。在這個(gè)時(shí)候，沉淀約為250μl。將沉淀重新懸浮到硼酸鹽緩沖液中制備2％泥漿。將2％珠子泥漿在冰浴中冷卻，并間歇移動(dòng)，以振蕩獲得單一分散度。計(jì)算加入每毫升原料2.5％泥漿0.8毫克的血纖蛋白原所需要的血纖蛋白原貯存物的體積。將活化珠用硼酸鹽緩沖液稀釋到加入血纖蛋白原后獲得終反應(yīng)物密度為1％固體泥漿的濃度。將珠子用血纖蛋白原覆蓋過夜并在室溫下輕柔搖晃。第二天加入每毫升原料2.5％珠泥漿0.1毫升0.25M乙醇胺。將溶液在室溫下輕柔混合30分鐘以阻斷珠子上未反應(yīng)的部位。將珠子溶液在室溫下離心10分鐘。保留上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)確定。為了確定珠子覆蓋程度，從存在于上清液中的量將初始加入血纖蛋白原的量減去。將珠子沉淀重新懸浮成含有10毫克/毫升BSA的硼酸鹽緩沖液的1％泥漿。再次確定單一分散度。將珠/BAS溶液在室溫下混合30分鐘，并輕柔搖晃，以阻斷任何殘留非特異蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，并沖洗掉松散結(jié)合的血纖蛋白原。將珠/BAS溶液在室溫下離心30分鐘。重復(fù)BSA阻斷和離心步驟。將沉淀重新懸浮成含有貯存緩沖液(PBS/1％BSA/0.1％疊氮化鈉/5％甘油)的2.5％泥漿。在這時(shí)候，將珠子保存在4℃或使用血纖蛋白原珠測(cè)試中。測(cè)試方案將70μl血液(1/100檸檬酸鈉，從7天沒有接受藥物治療的人類供體獲取的)和50μl不同濃度的抗體(室溫下稀釋在10mM Tris/0.1％BSA中)混合，并在室溫下溫育10分鐘。將血液/抗體混合物加入到含有20μl血纖蛋白原-覆蓋的測(cè)試珠子，105μl 10mM HEPES緩沖液，和20μM凝血酶受體活化肽(Coller等人，循環(huán)系統(tǒng)95(4)860-867(1997))的12×75毫米的玻璃測(cè)試試管中。將試管蓋上并置于速度為8g的搖晃平臺(tái)上4分鐘。珠子粘著在血液中呈現(xiàn)為中度尺寸的藍(lán)色簇。如上面所提及的，粘著意味著GPIIb/IIIa受體沒有被測(cè)試抗體阻斷。
用c7E3 Fab’(PEG5,000)2進(jìn)行血纖蛋白原珠測(cè)試與c7E3 Fab比較依據(jù)上面描述的測(cè)試方案，在2-倍稀釋液中測(cè)試抗體，起始濃度位50μg/毫升到0.5μg/毫升。在濃度從108-868nM c7E3Fab’(PEG5,000)2阻斷珠子粘著，而c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，PA)在從131-1050nM阻斷。
用c7E3 Fab’(PEG20,000)2進(jìn)行血纖蛋白原珠測(cè)試與c7E3 Fab比較依據(jù)上面描述的測(cè)試方案，在2-倍稀釋液中測(cè)試抗體(起始濃度位50μg/毫升到0.5μg/毫升)。在濃度從143-571nM c7E3Fab’(PEG20,000)2阻斷GPIIb/IIIa受體，而c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，PA)在從263-1050nM阻斷。實(shí)施例IX c7E3 Fab’(PEG5,000)2在鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)在第0天，將測(cè)試動(dòng)物(CD-1雌性鼠，體重25-30克)分配到四個(gè)治療組中的一組中，如表1中所示。
表1
所有動(dòng)物在指定時(shí)間點(diǎn)放血。對(duì)于所有測(cè)試組，通過眼窩竇后取血收集所有取樣時(shí)間點(diǎn)(除最后的樣品)的250μl血液，最后的樣品通過心臟穿刺取樣。將血液在室溫下保持30-60分鐘，在2500rpm離心15分鐘，將血清分離并保存在-70℃，直到實(shí)施藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)試。鼠血清中抗體測(cè)試將C295A(Centocor鼠科動(dòng)物單克隆抗＝7E3-個(gè)體基因型抗體)稀釋到PBS中，5μg/毫升，并涂覆在板上(滅菌的，96-培養(yǎng)皿ELISA板，Corning目錄#25805-96)，50μl/培養(yǎng)皿，在4℃溫育過夜。然后將板用沖洗緩沖液(0.9％氯化鈉，0.02％Tween-20)沖洗三次，每次沖洗約使用200μl/培養(yǎng)皿。在37℃將板用阻斷緩沖液/樣品稀釋液(1％BSA的PBS溶液，含0.1％2-氯乙酰胺)阻斷1小時(shí)，然后密封保存在4℃，在使用前溫?zé)岬绞覝?。從?shí)際測(cè)試物質(zhì)(是c7E3 Fab’NEM2，或c7E3 Fab’(PEG5,000)2)及使用直接對(duì)應(yīng)使用在動(dòng)物測(cè)試組中的物質(zhì)(NEM＝N-乙基順丁烯二酰亞胺)制成的50μg/毫升貯存物制成標(biāo)準(zhǔn)物。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍從1000ng/毫升到0.95ng/毫升(在1∶2連續(xù)稀釋中)。將標(biāo)準(zhǔn)物稀釋到阻斷緩沖液/樣品稀釋液中。動(dòng)物血清樣品也稀釋到阻斷緩沖液/樣品稀釋液中。用根據(jù)劑量和時(shí)間點(diǎn)估計(jì)確定的起始稀釋制備每種樣品的五份1∶2連續(xù)稀釋液。將阻斷緩沖液/樣品稀釋液的板空白對(duì)照加入到每塊板中，三份，50μl/培養(yǎng)皿。標(biāo)準(zhǔn)物和樣品都加在板上，三份，50μl/培養(yǎng)皿，并在37℃溫育1小時(shí)。然后將板如上描述沖洗。然后通過加入以50μl/培養(yǎng)皿稀釋在阻斷緩沖液/樣品稀釋液中生物素化的C281A單克隆抗體(不與C295A競(jìng)爭(zhēng)的Centocor鼠科動(dòng)物單克隆抗-7E3個(gè)體基因型抗體)，檢測(cè)由板上的C295A單克隆抗體從標(biāo)準(zhǔn)物/樣品中捕獲的測(cè)試物質(zhì)。將板在37℃溫育1小時(shí)，然后如上沖洗。將鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的山葵過氧化物酶(Amersham，產(chǎn)品目錄#RPN.1051)稀釋到阻斷緩沖液/樣品稀釋液中，并以50μl/培養(yǎng)皿加入到板上，將板在37℃溫育1小時(shí)。在溫育步驟結(jié)束前10分鐘，將OPD(o-苯二胺)片劑(Sigma，產(chǎn)品目錄#P-8412)溶解到OPD稀釋液(檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，含0.03％過氧化氫和0.1％2-氯乙酰胺)中，到1毫克/毫升。然后將板如上沖洗，將OPD底物以200μl/培養(yǎng)皿加入，并在室溫在黑暗中顯影15分鐘。通過加入50μl/培養(yǎng)皿的4NNH2SO4終止顯影。讀取用從所有培養(yǎng)皿減去的板空白對(duì)照值在四參數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)物的條件下評(píng)定的每塊板和樣品的OD490。最接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的兩個(gè)稀釋液是每種樣品稀釋液的平均。沒有稀釋的樣品，使用較高，或較低，適當(dāng)?shù)某跏枷♂屢褐貜?fù)進(jìn)行。
其他適合使用在所描述的測(cè)試中的抗-7E3-個(gè)體基因型抗體可通過已知的方式制備。如，適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物(如，鼠)可用7E3免疫接種，制備雜交瘤，通過任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)篩查，如本文所描述的那些技術(shù)。
圖9演示了相對(duì)測(cè)試物質(zhì)時(shí)間的血清濃度，表現(xiàn)出比NEM-阻斷的Fab’顯著增加的c7E3 Fab’(PEG5,000)2半衰期。
實(shí)施例X 鼠中c7E3 Fab’(PEG20,000)2的藥物代謝動(dòng)力學(xué)在第0天，將測(cè)試動(dòng)物(CD-1雌性鼠，體重25-30克)分配到兩個(gè)治療組中的一組中，如表1中所示。
表2
所有動(dòng)物在指定時(shí)間點(diǎn)放血。對(duì)于所有測(cè)試組，通過眼窩竇后取血收集所有取樣時(shí)間點(diǎn)(除最后的樣品)的250μl血液，最后的樣品通過心臟穿刺取樣。將血液在室溫下保持30-60分鐘，在2500rpm離心15分鐘，將血清分離并保存在-70℃，直到實(shí)施藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)試。如實(shí)施例IX實(shí)施測(cè)試c7E3 Fab’(PEG20,000)2的血清含量。
圖10顯示了在c7E3 Fab’(PEG20,000)2的血清中增加的持續(xù)性。實(shí)施例XI 田鼠中c7E3 Fab’(PEG5,000)2的藥物代謝動(dòng)力學(xué)體重約350克的雄性CD1田鼠分配到四個(gè)治療組中的一組中，如在表3中所示。
表3
動(dòng)物單獨(dú)稱重并計(jì)算測(cè)試物質(zhì)劑量。將靜脈內(nèi)用導(dǎo)管插入到側(cè)后部靜脈中并輕敲到部位中。在用藥血液取樣前用戊巴比妥將動(dòng)物麻痹，并且在整個(gè)血液取樣過程中保持麻痹狀態(tài)。依據(jù)上面表中的方案，使用含16μl 40％檸檬酸鈉的3毫升注射器通過心臟穿刺收集血液樣品。將血液樣品在注射器中轉(zhuǎn)移到1.5毫升的microfuge試管中，并以10,000rpm瞬時(shí)旋轉(zhuǎn)(4-5秒)到微型離心器中。富含血小板血漿(PRP)從頂部移出，將剩余血液樣品在微型離心器中以10,000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘以獲得貧血小板血漿(PPP)。確定PRP樣品的血小板數(shù)量，并使用Coulter計(jì)數(shù)儀ZM用自體同源PPP將血小板調(diào)節(jié)到200,000到300,000個(gè)血小板/μl之間。剩余的PPP冷凍用來確定游離Fab或Fab’(PEG5,000)2的濃度。
在同時(shí)可以評(píng)定用藥前，用藥后10分鐘和60分鐘每只動(dòng)物的PRP樣品聚集反應(yīng)的四-通道Bio/DATA APA4Caggregometer上實(shí)施血小板聚集。對(duì)于每種樣品，將250μl PRP轉(zhuǎn)移到硅化aggregometer透明容器內(nèi)上并在沒有攪拌的情況下在37℃溫育10分鐘。監(jiān)測(cè)基線聚集信號(hào)1分鐘。在每個(gè)透明容器內(nèi)加入ADP(10μM)，再監(jiān)測(cè)聚集反應(yīng)4分鐘。記錄每種PRP樣品的最大反應(yīng)(％光透射)。使用下列等式確定用藥后PRP樣品相對(duì)于用藥前PRP樣品的對(duì)聚集的抑制作用百分比其中C＝(A-B)/A×100C＝％PRP用藥后樣品的聚集抑制作用A＝％PRP用藥前樣品的光透射B＝％PRP用藥后樣品的光透射如在實(shí)施例VIII中所描述的，確定Fab或Fab’(PEG5,000)2的血清含量。
圖11顯示Fab’(PEG5,000)2的血清含量比相應(yīng)的Fab要持久，結(jié)論性地顯示延長(zhǎng)的Fab’(PEG5,000)2半衰期。
在下列表中來自體內(nèi)的聚集數(shù)據(jù)顯示，在血清中Fab’(PEG5,000)2延長(zhǎng)的持續(xù)性以增加的活性持續(xù)時(shí)間反應(yīng)出來。使用Fab’(PEG5,000)2的小時(shí)時(shí)的聚集作用與使用c7E3 Fab在60分鐘的聚集作用相似。
表4
實(shí)施例XII 確定c7E3 Fab，c7E3 Fab’，c7E3(Fab’)2或其他類似物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)使用NHS/EDC(N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基-N’(二甲基氨基丙基)碳化二亞胺)將山羊(Fab’)2抗-人類(Fab’)2(Jackson實(shí)驗(yàn)室)共價(jià)固定到BIAcore CM-5(羧甲基)片上。將片用40μl依據(jù)制造商指示以10μl/分鐘制備的從BIAcore獲得的偶聯(lián)試劑1∶1混合物活化。將10μg/毫升的(Fab’)2的10mM乙酸鈉溶液，pH4.8，以10μl/分鐘流經(jīng)片直到2,500RU被捕獲。未反應(yīng)的羧基基團(tuán)用40μl 1M乙醇胺注射劑蓋住。使用含有2mM氯化鈣，2mM氯化鎂，0.01％Tween-10和25μg/毫升BSA的10mM Tris緩沖液鹽水，pH7.5的存在緩沖液，c7E3 Fab，c7E3 Fab’或c7E3(Fab’)2流經(jīng)固定的抗-人類(Fab’)2，以捕獲500-700RU。將250μl的GPIIb/IIIa或αvβ3(從2-10μg/毫升)溶液以30μl/分鐘流經(jīng)捕獲抗體片段，之后是800秒的不中端的解離時(shí)間。將片用連續(xù)的15μl的含0.05％CHAPS的100mM磷酸再生。使用分析締合(ka)和解離常數(shù)(kb)的BIA評(píng)定3.0(BIAcore)分析締合和解離相。使用ka除以kb來計(jì)算KD。列在表5中的結(jié)合常數(shù)顯示用來生產(chǎn)c7E3 Fab PEG5,000，c7E3 Fab’(PEG5,000)2和c7E3 Fab’(PEG20,000)2的衍生技術(shù)沒有不利地影響結(jié)合。
表5
實(shí)施例XIII 與c7E3 Fab相比c7E3 Fab’(PEG5,000)2的免疫原性動(dòng)物和試劑將來自Charles河實(shí)驗(yàn)室的兩組六周大Balb/c鼠(每組八只動(dòng)物)通過腹腔內(nèi)(IP)注射用稀釋在生理鹽水(Baxter)及乳化在等體積完全Freund輔劑的100μg c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)或c7E3 Fab’(PEG5,000)2免疫接種。隨后用乳化在不完全Freund輔劑的100μg c7E3 Fab(ReoPro，Centocor有限公司，Malvern，PA)或c7E3 Fab’(PEG5,000)2的注射在14天后實(shí)施。在第20天，在沒有抗-促凝劑的情況下通過眼窩竇后穿刺給鼠放血。將血液在室溫下1小時(shí)凝結(jié)成塊，收集血清。
通過固相酶結(jié)合免疫測(cè)試(EIA)測(cè)定免疫反應(yīng)來評(píng)定c7E3Fab和c7E3 Fab’(PEG5,000)2的免疫原性。將10μg/毫升10mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6的c7E3 Fab以50μl/培養(yǎng)皿涂在96-培養(yǎng)皿平底EIA板上，保持在4℃過夜。用0.15M鹽水和0.02％(v/v)Tween20沖洗后，在室溫下將培養(yǎng)皿用200μl/培養(yǎng)皿的1％(w/v)牛血清清蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)阻斷1小時(shí)。立即使用板或?qū)謇鋬鲈?20℃作將來使用。
將所有的血清以1∶50稀釋到PBS中并在4℃保存直到測(cè)試。將二倍稀釋免疫血清在室溫下(RT)以50μl/培養(yǎng)皿在免疫原覆蓋板上溫育1小時(shí)。將板沖洗，然后在室溫下用50μl/培養(yǎng)皿以1∶20,000稀釋在BSA-PBS中的山羊抗-鼠IgG，F(xiàn)c特異，山葵過氧化物酶標(biāo)記的綴合物探查1小時(shí)。在室溫下將板再次沖洗，將100μl/培養(yǎng)皿的檸檬酸鹽-磷酸鹽底物溶液[1.0M檸檬酸和0.2M磷酸鈉，0.01％過氧化氫(Sigma)和1毫克/毫升苯二胺二氫氯化物]經(jīng)15分鐘加入。然后加入25μl/培養(yǎng)皿的終止溶液(4N硫磺酸)，在Dynatech MR5000自動(dòng)板分光光度儀上讀取490nm的光密度。
圖12顯示滴定度的幾何平均倒數(shù)。C7E3 Fab’(PEG5,000)2顯示出比c7E3 Fab顯著小的免疫原性。
實(shí)施例XIV 合成N-maleimido乙?；?N’-棕櫚?；?PEG3,400步驟1將棕櫚酰氯(80.8毫克，0.2942mM)溶解在2毫升丙酮中，并滴加入到N-叔-丁氧基羰基-PEG3,400二胺(Shearwater聚合物有限公司)(500毫克，0.1471mM)的5.0毫升嘧啶溶液中，將產(chǎn)物反應(yīng)混合物回流三小時(shí)。減壓下將嘧啶蒸發(fā)，產(chǎn)物油用40毫升乙基醚處理，產(chǎn)生白色沉淀，通過過濾移出，用醚沖洗并在減壓下干燥得到554毫克白色固體物質(zhì)。粗制物質(zhì)通過硅膠柱層析法(Baker硅膠，40μm，急驟層析填充，玻璃柱，2×30厘米)用氯仿∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫提純。將組分收集，蒸發(fā)到干燥并用乙基醚磨碎。過濾出白色沉淀，用醚沖洗，在減壓下干燥得到266毫克N-叔-丁氧基羰基-N’-棕櫚?；?PEG3,400[MH+3770.15(簇)]。步驟2在環(huán)境溫度下，將227毫克N-叔-丁氧基羰基-N’-棕櫚酰基-PEG3,400與25毫升三氟代乙酸∶二氯甲烷(1∶1，v/v)15分鐘。減壓蒸發(fā)溶劑，在剩余物中加入乙基醚(100毫升)。過濾出產(chǎn)物白色沉淀，用醚沖洗，減壓干燥得到141毫克三氟代乙酸N-棕櫚酰-PEG3,400胺酯。步驟3將三氟代乙酸N-棕櫚酰-PEG3,400胺酯(350毫克，0.0925mM)溶解在3.5毫升四氫呋喃中，將二異丙基乙基胺(40毫升)加入調(diào)節(jié)pH到約8.0(用濕潤(rùn)的指示紙測(cè)定)。攪拌約10分鐘后，將maleimido乙酸N-羥基琥珀酰胺酯(48毫克，0.185mM)(分子生物科學(xué)，Lot 11158)加入，將混合物再攪拌約4小時(shí)。加入二乙基醚(90毫升)產(chǎn)生白色固體沉淀，分離并在減壓下干燥得到330毫克N-Maleimido乙?；?N’-棕櫚?；?PEG3,400(MH+3806.89(簇))。
實(shí)施例XV 合成c7E3 Fab’(棕櫚?；?PEG3,400)2將c7E3 (Fab’)2(43.6毫克溶解于9毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入135μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(714毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。向其中加入28毫克N-maleimido乙?；?N’-棕櫚酰基-PEG3,400，反應(yīng)輕柔攪拌約30分鐘，得到標(biāo)題化合物[MH+56,362.4(簇)]。
實(shí)施例XVI 合成c7E3 Fab’(PEG3,400)2將c7E3(Fab’)2(28.8毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入182μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(761毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。加入46.2毫克甲氧基-順丁烯二酰亞胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中并在環(huán)境溫度下輕柔攪拌約15小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮到10毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮得到9毫克產(chǎn)物(MH+69,832(簇))。
實(shí)施例XVII 合成c7E3 Fab’[(PEG2,000)4]2將c7E3(Fab’)2(40.1毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入163μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(777毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。加入50.2毫克(PEG2,000)4-順丁烯二酰亞胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在環(huán)境溫度下輕柔攪拌約2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(50-70％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮得到13.5毫克產(chǎn)物(MH+65,942(簇))。
實(shí)施例XVIII 合成c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2將c7E3(Fab’)2(54.3毫克溶解于10毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入342μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(756毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。加入39.3毫克[(PEG2,000)2]2-順丁烯二酰亞胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在環(huán)境溫度下輕柔攪拌約2.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(50-70％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮得到15.6毫克產(chǎn)物[MH+57,313.5(簇)]。
實(shí)施例XIX 合成c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2將c7E3(Fab’)2(54.3毫克溶解于10毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入342μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(756毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。加入104毫克[(PEG5,000)2]2-順丁烯二酰亞胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在環(huán)境溫度下輕柔攪拌約2.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(50-70％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮得到14.2毫克產(chǎn)物[MH+71,194(簇)]。
實(shí)施例XX 合成c7E3 Fab’(PEG2,000)2將c7E3(Fab’)2(40.1毫克溶解于9.5毫升PBS中)置于水浴(37℃)中。加入163μl的1.0M L-半胱氨酸(Sigma，St.Louis)的水溶液，反應(yīng)混合物在30℃保持30分鐘。加入硫酸銨(756毫克)，將反應(yīng)混合物加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨/0.05％EDTA，pH6.5到0.1M磷酸鈉/0.05％EDTA，pH6.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)c7E3 Fab’的峰值。加入20毫克PEG2,000-順丁烯二酰亞胺(Shearwater聚合有限公司)到Fab’溶液中，并在環(huán)境溫度下輕柔攪拌約2.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮到9.8毫升加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(0-100％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮，重新加入到HPLC柱(Tosohaas，苯基5PW，10μm，0.75×7.5厘米)中，以6毫升每分鐘的流速，進(jìn)行60分鐘的0.1M磷酸鈉/0.6M硫酸銨，pH7.5到0.1M磷酸鈉，pH7.5的線性梯度(50-70％)洗脫。收集對(duì)應(yīng)標(biāo)題化合物的的峰值，濃縮得到10.4毫克產(chǎn)物[MH+52,817(簇)]。
實(shí)施例XXI 對(duì)血小板聚集的抑制作用如在實(shí)施例IV中所描述的，測(cè)試c7E3，c7E3 Fab’(PEG2,000)2，c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2，c7E3 Fab’[(PEG2,000)4]2和c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2對(duì)血小板聚集抑制活性。這些試驗(yàn)的結(jié)果在圖13-15中圖示演示，說明增加半衰期的c7E3的化學(xué)修飾沒有影響活性。
實(shí)施例XXII 確定修飾抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)，與GPIIb/IIIa結(jié)合的速度常數(shù)和親和力如實(shí)施例XII中計(jì)算得到。表5(實(shí)施例XII)和表6中列出的速度常數(shù)和親和力是至少兩個(gè)和多達(dá)約七個(gè)獨(dú)立確定值的平均值。表5中列出的用來計(jì)算速度常數(shù)和親和力的數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)一起來計(jì)算在表6中列出的速度常數(shù)和親和力。表6中列出的速度常數(shù)和親和力進(jìn)一步說明，在沒有不利地影響結(jié)合的情況下，可實(shí)施c7E3的位點(diǎn)特異修飾，而隨機(jī)的修飾大大地降低了親和力。
表6 結(jié)合常數(shù)
實(shí)施例XXIII 鼠的藥物代謝動(dòng)力學(xué)使用與在實(shí)施例IX和X中所描述的相同的方案實(shí)施藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)試。給鼠靜脈內(nèi)服用測(cè)試物質(zhì)。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)抽取血液，確定測(cè)試物質(zhì)的血清濃度。使用3-5只鼠實(shí)施七項(xiàng)獨(dú)立的試驗(yàn)。每項(xiàng)試驗(yàn)服用不同的測(cè)試物質(zhì)，如下試驗(yàn)1，以劑量20毫克/公斤服用c7E3 Fab；試驗(yàn)2，以劑量20毫克/公斤服用c7E3 Fab’PEG5,000；試驗(yàn)3，以劑量0.6毫克/公斤服用c7E3Fab’[(PEG2,000)2]2；試驗(yàn)4，以劑量0.65毫克/公斤服用c7E3Fab’PEG20,000；試驗(yàn)5，以劑量0.56毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG2,000)2；試驗(yàn)6，以劑量0.75毫克/公斤服用c7E3Fab’[(PEG5,000)2]2；試驗(yàn)7，以劑量0.74毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG10,000)2。每項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果列在表7中，顯示出在靜脈內(nèi)服用后保留在血清中的c7E3 Fab’PEG5,000，c7E3 Fab’[(PEG2,000)2]2，c7E3 Fab’PEG20,000，c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2和c7E3 Fab’(PEG10,000)2比未修飾的c7E3 Fab保留時(shí)間長(zhǎng)。這些試驗(yàn)結(jié)果還說明了c7E3 Fab’(PEG2,000)2在血清中的保留時(shí)間約與未修飾的c7E3 Fab一樣長(zhǎng)。
表7
Nd-沒有確定實(shí)施例XXIV 在短尾猴體內(nèi)的藥效使用2-4只短尾猴實(shí)施七項(xiàng)獨(dú)立的試驗(yàn)。每只動(dòng)物裝配有血管通路口(VAP)以獲取血液樣品。在安置VAP時(shí)，獲取初始血液樣品，并測(cè)定血小板聚集。每只動(dòng)物通過靜脈內(nèi)注射服用單劑測(cè)試物質(zhì)。每項(xiàng)試驗(yàn)服用不同的測(cè)試物質(zhì)，如下試驗(yàn)1，以劑量0.4毫克/公斤服用c7E3 Fab；試驗(yàn)2，以劑量1.050毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG5,000)2；試驗(yàn)3，以劑量0.6毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG10,000)2；試驗(yàn)4，以劑量0.6毫克/公斤服用c7E3 Fab’[(PEG5,000)2]2；試驗(yàn)5，以劑量1.4毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG20,000)2；試驗(yàn)6，以劑量0.74毫克/公斤服用c7E3 Fab’(PEG2,000)2。在服用測(cè)試物質(zhì)前，和預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集血液，以測(cè)定血小板功能，血液學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。如在實(shí)施例IV中所描述的測(cè)定血小板聚集。如在實(shí)施例VIII中所描述的評(píng)定測(cè)試物質(zhì)的血清濃度。試驗(yàn)的結(jié)果在表8a和表8b中列出。
試驗(yàn)顯示，在服用c7E3 Fab后1小時(shí)血小板聚集受到96％的抑制，之后抑制作用下降迅速。一小時(shí)后在血清中測(cè)得的c7E3的量也迅速下降，與血小板聚集的抑制作用相應(yīng)。當(dāng)服用c7E3Fab’(PEG2,000)2時(shí)獲得相似的結(jié)果，說明與未修飾的Fab相比，分子量2,000的兩個(gè)線性PEG鏈的修飾沒有增加血清持續(xù)性。相反，服用用分子量大于2,000的PEG鏈修飾的Fab’片段，產(chǎn)生延長(zhǎng)的對(duì)血小板聚集的抑制作用和緩慢下降的抑制活性，相似地，服用一小時(shí)后，在血清中測(cè)得的用分子量大于2,000的PEG鏈修飾的Fab’片段的量高于未修飾的Fab’，并且血清含量下降速度較慢。
表8a 猴子體內(nèi)的藥效
Nd-沒有確定表8b 猴子體內(nèi)的藥效
Nd-沒有確定實(shí)施例XXV c7E3 Fab’PEG20,000如實(shí)施例III中所描述的制備標(biāo)題化合物，除了用PEG20,000醛替換PEG5,000醛。
雖然本發(fā)明已進(jìn)行了具體地演示及有關(guān)其較好的實(shí)施方案的描述，此領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)理解到，在不背離如所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種形式和細(xì)節(jié)的變通。
權(quán)利要求
1.一種修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其特異地結(jié)合一種或多種從下列組中選取的抗原，包括GPIIb/IIIa，αvβ3，和Mac-1，該修飾包括一個(gè)或多個(gè)與所說的抗體或抗原結(jié)合片段共價(jià)結(jié)合的有機(jī)組成。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的修飾包括一個(gè)到約六個(gè)有機(jī)組成，它們每個(gè)獨(dú)立地是親水聚合物基團(tuán)，脂肪酸基團(tuán)，脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)或磷脂。
3.依據(jù)權(quán)利要求2的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與所說的抗體或抗原結(jié)合片段的至少一個(gè)羧基末端共價(jià)結(jié)合。
4.依據(jù)權(quán)利要求3的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab。
5.依據(jù)權(quán)利要求4的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的Fab是非染色質(zhì)肽酶片段。
6.依據(jù)權(quán)利要求3的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成與重鏈的羧基末端結(jié)合。
7.依據(jù)權(quán)利要求3的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包括每個(gè)獨(dú)立地與半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)到約四個(gè)其他有機(jī)組成。
8.依據(jù)權(quán)利要求7的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中重鏈包括所說的半胱氨酰殘基。
9.依據(jù)權(quán)利要求2的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合。
10.依據(jù)權(quán)利要求9的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中重鏈包括所說的半胱氨酰殘基。
11.依據(jù)權(quán)利要求9的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab’，所說的有機(jī)組成與形成鏈間二硫鍵的至少一條重鏈半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合。
12.依據(jù)權(quán)利要求2的特異結(jié)合GPIIb/IIIa的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，抑制血纖蛋白原與GPIIb/IIIa的結(jié)合，抑制血小板聚集。
13.依據(jù)權(quán)利要求12的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中說的抗體或抗原結(jié)合片段特異結(jié)合αvβ3。
14.依據(jù)權(quán)利要求13的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或抗原結(jié)合片段與GPIIb/IIIa和/或αvβ3的結(jié)合受到7E3競(jìng)爭(zhēng)地抑制。
15.依據(jù)權(quán)利要求14的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)血清半衰期。
16.依據(jù)權(quán)利要求15的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或抗原結(jié)合片段用與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段基本上相同的親和力結(jié)合GPIIb/IIIa和/或αvβ3。
17.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
18.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
19.依據(jù)權(quán)利要求18的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的人源化7E3或其抗原結(jié)合片段是嵌合7E3抗體或其嵌合抗原結(jié)合片段。
20.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成是親水聚合物基團(tuán)。
21.依據(jù)權(quán)利要求20的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的親水聚合物基團(tuán)是線性或支化聚烷烴乙二醇鏈，碳水化合物鏈，氨基酸鏈或聚乙烯基吡咯烷酮鏈，其中所說的親水聚合物基團(tuán)具有分子量約800到約120,000道爾頓。
22.依據(jù)權(quán)利要求21的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的親水聚合物基團(tuán)是線性或支化聚烷烴乙二醇鏈，具有分子量大于2,000道爾頓。
23.依據(jù)權(quán)利要求20的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的親水聚合物基團(tuán)是線性或支化聚烷烴乙二醇鏈，或是被烷基基團(tuán)，C6-C40脂肪酸基團(tuán)，C6-C40脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)基團(tuán)或磷脂基團(tuán)取代的線性或支化取代聚乙二醇鏈。
24.依據(jù)權(quán)利要求23的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的親水聚合物基團(tuán)是末端被烷基基團(tuán)，C6-C40脂肪酸基團(tuán)，C6-C40脂肪酸酯基團(tuán)，脂質(zhì)基團(tuán)或磷脂基團(tuán)取代的線性或支化聚烷烴乙二醇鏈。
25.依據(jù)權(quán)利要求24的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的取代基是棕櫚?；?。
26.依據(jù)權(quán)利要求23的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
27.依據(jù)權(quán)利要求23的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與所說的抗體或抗原結(jié)合片段的至少一個(gè)羧基末端共價(jià)結(jié)合。
28.依據(jù)權(quán)利要求27的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab。
29.依據(jù)權(quán)利要求28的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的Fab是非染色質(zhì)肽酶片段。
30.依據(jù)權(quán)利要求27的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的羧基末端是重鏈的羧基末端。
31.依據(jù)權(quán)利要求30的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包括每個(gè)獨(dú)立地與半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)到約四個(gè)其他有機(jī)組成。
32.依據(jù)權(quán)利要求31的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中重鏈包括所說的半胱氨酰殘基。
33.依據(jù)權(quán)利要求26的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合。
34.依據(jù)權(quán)利要求33的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中重鏈包括所說的半胱氨酰殘基。
35.依據(jù)權(quán)利要求34的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab’，所說的有機(jī)組成與形成鏈間二硫鍵的至少一條重鏈半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合。
36.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成是線性或支化C6-C40的脂肪酸。
37.依據(jù)權(quán)利要求36的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
38.依據(jù)權(quán)利要求37的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與所說的抗體或抗原結(jié)合片段的至少一個(gè)羧基末端共價(jià)結(jié)合。
39.依據(jù)權(quán)利要求38的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab。
40.依據(jù)權(quán)利要求38的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包括每個(gè)獨(dú)立地與半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)到約四個(gè)其他有機(jī)組成。
41.依據(jù)權(quán)利要求37的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成與至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合。
42.依據(jù)權(quán)利要求41的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab’，所說的有機(jī)組成與形成鏈間二硫鍵的至少一條重鏈半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合。
43.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成是線性或支化C6-C40的脂肪酸酯。
44.依據(jù)權(quán)利要求43的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
45.依據(jù)權(quán)利要求44的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與所說的抗體或抗原結(jié)合片段的至少一個(gè)羧基末端共價(jià)結(jié)合。
46.依據(jù)權(quán)利要求45的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab。
47.依據(jù)權(quán)利要求45的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包括每個(gè)獨(dú)立地與半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)到約四個(gè)其他有機(jī)組成。
48.依據(jù)權(quán)利要求44的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成與至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合。
49.依據(jù)權(quán)利要求48的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab’，所說的有機(jī)組成與形成鏈間二硫鍵的至少一條重鏈半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合。
50.依據(jù)權(quán)利要求16的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成是脂質(zhì)或磷脂。
51.依據(jù)權(quán)利要求50的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成分別由下列結(jié)構(gòu)式表示，包括-O-CH2-CH(R)-CH2-R’和-NH-CH2-CH2-O-P(O-)(O)-O-CH2-CH(R)-CH2-R’；其中，R和R’每個(gè)獨(dú)立地是-OH，或是表示為-X-Y的基團(tuán)，其中-X是-O-，-O-C(O)-，-S-，-O-S(O)2-O-，-NH-C(O)-或-O-CH＝CH-，Y是飽和或不飽和的C6到約C40的烴基基團(tuán)團(tuán)，其中R和R’不都是-OH。
52.依據(jù)權(quán)利要求51的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
53.依據(jù)權(quán)利要求52的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中有機(jī)組成與所說的抗體或抗原結(jié)合片段的至少一個(gè)羧基末端共價(jià)結(jié)合。
54.依據(jù)權(quán)利要求53的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab。
55.依據(jù)權(quán)利要求53的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，進(jìn)一步包括每個(gè)獨(dú)立地與半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合的一個(gè)到約四個(gè)其他有機(jī)組成。
56.依據(jù)權(quán)利要求52的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的有機(jī)組成與至少一個(gè)半胱氨酰殘基的側(cè)鏈硫原子共價(jià)結(jié)合。
57.依據(jù)權(quán)利要求56的修飾抗原結(jié)合片段，其中所說的抗原結(jié)合片段是Fab’，所說的有機(jī)組成與形成鏈間二硫鍵的至少一條重鏈半胱氨酰殘基的硫原子結(jié)合。
58.一種抑制患者血栓癥的方法，包括給所說的患者服用有效量的權(quán)利要求12的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段。
59.依據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)血清半衰期。
60.依據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段進(jìn)一步特異結(jié)合αvβ3。
61.依據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
62.依據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
63.一種抑制人體內(nèi)脈管干預(yù)過程后器官狹窄和/或再狹窄的方法，包括給所說的人服用有效量的權(quán)利要求12的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段。
64.依據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)血清半衰期。
65.依據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段進(jìn)一步特異結(jié)合αvβ3。
66.依據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
67.依據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
68.一種預(yù)防人體內(nèi)局部缺血的方法，包括給所說的人服用有效量的權(quán)利要求12的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段。
69.依據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)血清半衰期。
70.依據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段進(jìn)一步特異結(jié)合αvβ3。
71.依據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
72.依據(jù)權(quán)利要求70的方法，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
73.一種抑制人體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移的方法，包括給所說的人服用有效量的權(quán)利要求12的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段。
74.依據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)血清半衰期。
75.依據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段進(jìn)一步特異結(jié)合αvβ3。
76.依據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
77.依據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
78.依據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所說的修飾抗體抑制αvβ3調(diào)節(jié)的血管生成和/或血小板調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)移。
79.一種抑制人體內(nèi)由配體與表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上的GPIIb/IIIa，αvβ3和/或Mac-I的結(jié)合調(diào)節(jié)的過程的方法，包括給所說的人服用有效量的權(quán)利要求2的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段。
80.一種抑制人體內(nèi)血管生成的方法，包括給所說的人服用特異結(jié)合αvβ3的有效量的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段，修飾包括與所說的抗體或抗原結(jié)合片段共價(jià)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)有機(jī)組成。
81.依據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段的特點(diǎn)在于，與未修飾抗體或抗原結(jié)合片段相比具有增加的體內(nèi)半衰期。
82.依據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段進(jìn)一步特異結(jié)合GPIIb/IIIa。
83.依據(jù)權(quán)利要求82的方法，其中所說的修飾抗體或修飾抗原結(jié)合片段特點(diǎn)在于，與未修飾抗體相比具有降低的免疫原性。
84.依據(jù)權(quán)利要求83的方法，其中所說的抗體或片段是從下列組中選取的，包括7E3，人源化7E3，和它們的抗原結(jié)合片段。
全文摘要
公開了具有改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)屬性的修飾抗體?？贵w與一種或多種從包括GPIIb/IIIa，α
文檔編號(hào)C07K16/28GK1406138SQ99815156
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期1999年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月3日
發(fā)明者喬治·A·海維訥, 羅伯特·W·威伯 申請(qǐng)人:塞恩托科公司