專(zhuān)利名稱(chēng)：含有通過(guò)肽配體連接的多個(gè)免疫原性成分的hbv核心抗原顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特征在于多種免疫原特異性的乙型肝炎病毒(“HBV”)核心抗原顆粒。更具體而言，本發(fā)明涉及含有通過(guò)配體與之交聯(lián)的免疫原、表位或其他相關(guān)結(jié)構(gòu)的HBV核心抗原顆粒，這些配體是可與HBV核心蛋白選擇性結(jié)合的HBV衣殼結(jié)合肽。這些顆?？捎米鞑煌庖咴员砦?包括HBV衣殼結(jié)合肽)的輸送系統(tǒng)，它們也通過(guò)阻斷HBV核心蛋白與HBV表面蛋白之間的相互作用有利地抑制并干擾HBV病毒裝配。不同免疫原的混合物、HBV衣殼結(jié)合肽配體或兩者可與同一HBV核心顆粒交聯(lián)。產(chǎn)生的這些多成分或多價(jià)HBV核心顆?？捎欣赜糜谥委熀皖A(yù)防疫苗和組合物中，以及診斷組合物和使用它們的方法中。
背景技術(shù)：
臨床免疫治療方案的前沿包括患者對(duì)傳染性病原體和其他威脅健康的因素的免疫。盡管免疫劑很多，但接種最多只能引起部分免疫，這需要經(jīng)常的重復(fù)免疫。對(duì)于多種常規(guī)單價(jià)或多價(jià)疫苗是這樣。甚至在這些疫苗中，能引起對(duì)多種免疫原免疫的單劑接種體的數(shù)量是有限的。此外，病原體中的抗原性變異可限制常規(guī)疫苗的效能。
由于這些障礙，所以工作集中于提高免疫系統(tǒng)對(duì)特定免疫原應(yīng)答的方法學(xué)。為此，通過(guò)將免疫原與乙型肝炎病毒(“HBV”)核心顆粒(也稱(chēng)為核殼)連接產(chǎn)生了免疫原性偶聯(lián)物，試圖通過(guò)操作HBV核心抗原的依賴(lài)T細(xì)胞和不依賴(lài)T細(xì)胞的決定簇，提高連接的免疫原的免疫原性。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,818,527和R.Ulrich等人，“乙型肝炎病毒的核心顆粒作為外源表位的載體”，病毒研究進(jìn)展(Adv.Virus.Res.)，50，141-82(1998)。目的表位免疫原性的提高也可通過(guò)雜合病毒顆粒形成蛋白實(shí)現(xiàn)，該蛋白至少包含一部分天然發(fā)生的病毒顆粒形成蛋白，例如HBV表面抗原，和一個(gè)或多個(gè)目的表位位點(diǎn)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,965,140。從這些工作中可以看出，HBV的蛋白質(zhì)已用作為免疫系統(tǒng)遞呈目的免疫原的平臺(tái)。
乙型肝炎病毒是一種血液傳播的病毒，含有小的、部分雙鏈的DNA基因組，帶有四種大量重疊的開(kāi)放閱讀框，由含有HBV核心蛋白(“HBcAg”)的內(nèi)部核殼，、病毒聚合酶和病毒DNA組成，周?chē)呛蠬BV表面抗原(“HBsAg”)的包膜。病毒包膜含有三種不同的但是相關(guān)的表面抗原蛋白長(zhǎng)(L)、中(M)和短(S)表面抗原蛋白，它們共有一種普通的羧基端區(qū)，但具有不同的氨基端，這是由于在連續(xù)開(kāi)放閱讀框內(nèi)不同位點(diǎn)處使用不同的起始三聯(lián)體引起的。
長(zhǎng)多肽(L多肽)由pre-S1、pre-S2和S區(qū)組成。它是完整閱讀框的產(chǎn)物，包含位于氨基端的108個(gè)氨基酸(或199個(gè)，取決于病毒亞型)的pre-S1結(jié)構(gòu)域，隨后是55個(gè)氨基酸的pre-S2結(jié)構(gòu)域，和226個(gè)氨基酸的短多肽(S多肽)區(qū)。中等長(zhǎng)度多肽(M多肽)在其氨基端具有pre-S2結(jié)構(gòu)域，隨后是S區(qū)，而最豐富的形式-S多肽只含S區(qū)。pre-S區(qū)被認(rèn)為在病毒裝配和附著于宿主細(xì)胞中都起重要作用。病毒中HBsAg的S形式多于M和L形式，并存在糖基化和非糖基化兩種形式[V.Bruss和D.Ganem，“包膜蛋白在乙型肝炎病毒裝配中的作用”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88，1059-63(1991)；V.Bruss等人，“乙型肝炎病毒大包膜蛋白的跨膜拓?fù)鋵W(xué)的翻譯后改變”，EMBOJ.，13，2273-79(1994)；A.R.Neurath等人，“乙型肝炎病毒上宿主細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)的鑒定和化學(xué)合成”，細(xì)胞(Cell)，46，429-36(1986)；K.Ueda等人，“乙型肝炎病毒的三種包膜蛋白形成丹氏粒所需的大S、中S和主要S蛋白”，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，65，3521-29(1991)]。核心的外表面與包膜的內(nèi)表面之間的特異相互作用可能引導(dǎo)病毒的正確裝配并穩(wěn)定產(chǎn)生的顆粒。
HBV核心蛋白能在大腸桿菌中高效表達(dá)[M.Pasek等人，“乙型肝炎病毒基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)”，自然(Nature)，282，575-79(1979)]，在其中它裝配為兩種大小的二十面體外殼，分別含有180個(gè)(T＝3)或240個(gè)(T＝4)亞基[R.A.Crowther等人，“經(jīng)電子顯微術(shù)確定的乙型肝炎病毒核心顆粒的三維結(jié)構(gòu)”，細(xì)胞，77，943-50(1994)]。這些亞基聚簇為二聚體，每個(gè)二聚體形成突出于外殼表面的刺突。利用電子顯微術(shù)和圖像處理，最近以7.4的分辨率由6000個(gè)以上單個(gè)顆粒的圖像制作了T＝4外殼圖譜[B.Bottcher等人，“用電子顯微術(shù)確定乙型肝炎病毒核心蛋白折疊”，自然，386，88-91(1997)]。這顯示了多肽鏈的折疊，其主要是α-螺旋，不同于以前的病毒衣殼。每個(gè)二聚體刺突由一對(duì)長(zhǎng)α-螺旋發(fā)夾構(gòu)成，其中每一個(gè)來(lái)自于二聚體中的每個(gè)單體[Bottcher等人(1997)；J.E Conway等人，“用電子顯微術(shù)顯示乙型肝炎病毒中的4-螺旋束”，自然，386，91-94(1997)]。在折疊上添加氨基酸序列的編號(hào)方案[Bottcher等人(1997)]使HBV核心蛋白的主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)置于氨基酸78-82周?chē)鶾J.Salfeld等人，“乙型肝炎病毒核心抗原和E抗原的抗原決定簇和功能域”，病毒學(xué)雜志，63，798-808(1989)；M.Sallberg等人，“乙型肝炎核心抗原單克隆抗體的線性結(jié)合位點(diǎn)的表征”，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志(J.Med.Virol.)，33，248-52(1991)]，位于刺突的頂端。
抑制HBV病毒裝配的物質(zhì)包括可與HBV核心抗原結(jié)合，從而阻斷HBV核心蛋白與HBV表面蛋白之間相互作用的物質(zhì)。PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/18818和M.R.Dyson和K.Murray，“參與復(fù)雜蛋白質(zhì)裝配的相互作用的肽抑制劑的選擇乙型肝炎病毒核心與表面抗原的結(jié)合”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，92，2194-98(1995)中描述了一些這樣的HBV衣殼結(jié)合肽。
從下面的公開(kāi)內(nèi)容中可以看出，HBV衣殼結(jié)合肽可有利地用作構(gòu)建HBV核心抗原顆粒的配體，其特征在于引起對(duì)一種或多種免疫原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)提供可引起對(duì)一種或多種成分免疫原的增強(qiáng)的免疫原性的HBV核心抗原顆粒解決了上述問(wèn)題。除了通過(guò)遺傳操作編碼序列或通過(guò)多肽合成可連接于或插入HBV核心抗原多肽的免疫原性結(jié)構(gòu)域或表位外，這些多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒還包含通過(guò)配體-可與HBV核心抗原顆粒選擇性結(jié)合的肽一與之交聯(lián)的免疫原、表位或其他有關(guān)結(jié)構(gòu)。這些顆粒可用作多種免疫原性表位(包括HBV衣殼結(jié)合肽)的輸送系統(tǒng)，其本身通過(guò)阻斷HBV核心蛋白和HBV表面蛋白之間的相互作用抑制并干擾HBV病毒裝配。產(chǎn)生的多成分或多價(jià)HBV核心顆?？捎欣赜糜谥委熀皖A(yù)防性疫苗和組合物中，以及診斷組合物和使用它們的方法中。
本發(fā)明可使不同免疫原的混合物、HBV衣殼結(jié)合肽配體或此兩者與同一HBV核心顆粒交聯(lián)。產(chǎn)物是為T(mén)細(xì)胞的有效刺激物并且是免疫學(xué)多價(jià)的一種顆粒。因此，一種抗原遞呈細(xì)胞能刺激具有不同特異性的多種B細(xì)胞克隆的增殖。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示含有多種衣殼結(jié)合免疫原的HBV核心抗原顆粒的結(jié)構(gòu)?！耙職そY(jié)合免疫原”包含至少一種HBV衣殼結(jié)合肽成分和至少一種免疫原性成分。每種衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽與HBV核心抗原顆粒連接。
圖2是概括了多種HBV核心抗原融合蛋白的表格，這些蛋白也可以作為HBV核心抗原顆粒，多種免疫原可以通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽與之連接。
發(fā)明詳述為了更全面地了解此處所述的本發(fā)明，下面給出了詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一種以上的免疫原的混合物和一種或多種HBV衣殼結(jié)合肽配體可以與同一HBV核心顆粒交聯(lián)。此外，同一免疫原的多個(gè)拷貝可以與一種HBV衣殼結(jié)合肽連接，并與HBV核心顆粒上的不同位置交聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒特別可用于誘導(dǎo)抗所有成分免疫原的抗體。
HBV衣殼結(jié)合肽連接免疫原與HBV核心抗原顆粒的用途可增強(qiáng)免疫原遞呈，而不會(huì)通過(guò)變性、構(gòu)象破壞或其他去穩(wěn)定影響破壞免疫原的免疫原性或穩(wěn)定性。例如，HBV衣殼結(jié)合肽連接體可降低成分免疫原彼此干擾致使功能物質(zhì)丟失的危險(xiǎn)。結(jié)果是，HBV核心抗原顆粒引發(fā)對(duì)成分免疫原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此，如果單劑施用每種免疫原，則可能用比需要的更少的接種次數(shù)和/或更少的接種體達(dá)到希望的治療或預(yù)防作用。
免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽與HBV核心抗原顆粒的連接也可允許遞呈大小、構(gòu)象和性質(zhì)不同的免疫原。因此，本發(fā)明允許在一種疫苗或組合物中包含可用于在特定個(gè)體中引發(fā)廣譜免疫或治療的免疫原組合。免疫原可與HBV衣殼結(jié)合肽連接，從而摻入HBV核心抗原顆粒中的免疫原包括含有一種或多種免疫、免疫原性或抗原表位的任何分子。這些表位在自然中可以是線性、構(gòu)象性、單個(gè)或混合的。
更具體而言，免疫原可選自能引發(fā)免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。這些物質(zhì)包括但不限于抗原、抗原決定簇、蛋白質(zhì)、糖蛋白、抗體、抗體片段、肽、模擬抗原或抗原決定簇的肽模擬位(mimotopes)、多肽、糖肽、糖類(lèi)、寡糖、多糖、寡核苷酸和多核苷酸。免疫原也可以是變應(yīng)原、毒素或內(nèi)毒素。
這些物質(zhì)也包括針對(duì)于或來(lái)源于不同病原體如病毒、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、真菌、噬菌體、原生動(dòng)物和植物的物質(zhì)。這些病毒包括反轉(zhuǎn)錄病毒，包括1型和2型人類(lèi)免疫缺陷病毒和T細(xì)胞白血病病毒；皰疹病毒，如1型和2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和EB病毒；正粘病毒，如A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒；副粘病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹樣病毒、流行性腮腺炎病毒和副流感病毒；嗜肝DNA病毒，如乙型肝炎病毒；黃病毒，如丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒和蜱傳腦炎病毒；細(xì)小核糖核酸病毒，如腸道病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒；披膜病毒，如風(fēng)疹病毒；彈狀病毒，如狂犬病病毒；腺病毒、埃博拉病毒；桿狀病毒；漢坦病毒；乳多空病毒，如人乳頭瘤病毒；細(xì)小病毒；DNA病毒；RNA病毒；RNA腫瘤病毒、如腫瘤病毒；和痘病毒，如痘苗病毒。另外，免疫原也可以是針對(duì)于或來(lái)源于芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸細(xì)菌(Entero bacteria)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、李斯特菌屬(Listeria)、分支桿菌屬(Mycoplasma)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Straphylococcus)、真細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、奈瑟球菌屬(Neisseria)或沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)的免疫原。免疫原也可選自人類(lèi)免疫缺陷病毒的下列表位GELDRWEKI(gag)；ELDKWAS(gp40)；IGPGRAFYTTKN(V3環(huán))；ELDKWA(gp41)和DRFYKTLRA(gp41)。
可與HBV衣殼結(jié)合肽連接，從而摻入HBV核心抗原顆粒中的糖蛋白包括，例如，抗體、來(lái)源于或類(lèi)似于動(dòng)物細(xì)胞的表面成分或如引起腦膜炎的病毒或細(xì)菌的糖肽，或這些部分的片段。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，免疫原的大小不應(yīng)大到其功能基團(tuán)可干擾HBV衣殼結(jié)合肽連接體。HBV核心抗原蛋白由于其顆粒性質(zhì)，HBV核心抗原蛋白組成了一種可向免疫系統(tǒng)遞呈類(lèi)似或不同類(lèi)型的多種免疫原的有利平臺(tái)。根據(jù)本發(fā)明，利用HBV衣殼結(jié)合肽作為配體將希望的免疫原與HBV核心顆粒連接進(jìn)一步突出了這一優(yōu)點(diǎn)。這些顆粒含有90或120個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)-衣殼刺突，每一個(gè)均由HBV核心抗原二聚體組成(見(jiàn)圖1)。因此，多個(gè)免疫原可通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽作為配體與HBV核心抗原顆粒物理連接。產(chǎn)生的顆粒能誘導(dǎo)對(duì)所有成分免疫原的免疫應(yīng)答。
HBV核心抗原多肽的重組編碼序列在合適的微生物、動(dòng)物或植物系統(tǒng)中表達(dá)后，可形成HBV核心抗原顆粒。參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，紐約(1989)。欲表達(dá)的多肽可包含全長(zhǎng)HBV核心抗原序列，或其突變、衍生物、截短或部分，它們保留有在表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞中以顆粒形式裝配的能力。生產(chǎn)這些HBV核心抗原顆粒的重組方法在本領(lǐng)域中眾所周知。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,710,463。
此外，也可用化學(xué)合成法生產(chǎn)HBV核心抗原多肽。根據(jù)HBV抗原多肽的氨基酸序列，可用固相合成法進(jìn)行化學(xué)合成[R.B.Merrifield，F(xiàn)ed.Proced.，21，412(1964)；R.B.Merrifield，生物化學(xué)(Biochemistry)，3，1385-90(1964)和D.R.Milich等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，139，1223-31(1987)]。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于突變或變異的HBV核心抗原序列可影響與結(jié)合或配體肽的反應(yīng)，所以本發(fā)明同樣適用于自然變體或通過(guò)操作編碼序列或其他方法引入HBV核心抗原亞基或相應(yīng)結(jié)合或配體肽中的突變。對(duì)于肽結(jié)合至關(guān)重要的核心蛋白殘基的突變用來(lái)測(cè)定核心蛋白折疊的方法已應(yīng)用于利用低溫顯微術(shù)在SLLGRMKGA-一種可抑制與L-HBsAg結(jié)合的HBV衣殼結(jié)合肽-上定位結(jié)合位點(diǎn)。該方法顯示在T＝3和T＝4外殼中與刺突頂端結(jié)合的肽[B.Bottcher等人，“阻斷乙型肝炎病毒裝配的肽通過(guò)低溫顯微術(shù)、誘變和轉(zhuǎn)染的分析”，EMBO J.，17，6839-45(1998)]。圖像分析顯示，肽結(jié)合位點(diǎn)位于刺突頂端，在為多肽折疊提出的編號(hào)方案[Bottcher等人(1997)]中對(duì)應(yīng)于氨基酸78-82區(qū)域中的殘基。有兩個(gè)酸性殘基(glu77和asp78)接近核心蛋白頂端，選擇的結(jié)合肽含有兩個(gè)保守的堿性殘基。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中任一個(gè)酸性殘基突變?yōu)楸彼?，大大降低了肽?duì)改變的核心外殼的親和力，由此證明了這些帶相反電荷的殘基在結(jié)合反應(yīng)中的重要性。將天冬氨酸78改變?yōu)楸彼崾褂H和力降低160倍，將谷氨酸77改變?yōu)楸彼崾褂H和力降低1000倍。這表明HBV核心抗原蛋白上的這兩個(gè)或任一個(gè)殘基可為HBV衣殼結(jié)合肽提供至少部分結(jié)合位點(diǎn)。
這些結(jié)果也說(shuō)明了刺突頂端區(qū)域中HBV核心抗原的氨基酸序列對(duì)于配體結(jié)合的重要性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，來(lái)源于某些HBV株的HBV核心抗原可能需要突變以使特定配體-免疫原肽有效結(jié)合，或需要選擇和改變配體的變體以有效結(jié)合特異的HBV核心抗原變體。HBV核心抗原融合蛋白根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽與免疫原連接的HBV核心抗原顆粒可以是通過(guò)遺傳融合技術(shù)展示一種或多種免疫原的HBV核心抗原顆粒。在一種這樣的技術(shù)中，將有關(guān)編碼序列摻入攜帶HBV核心抗原多肽序列的質(zhì)?；蚱渌d體中的適當(dāng)位置中。
為提高HBV核心抗原多肽的表達(dá)水平而與大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的融合證明，抗原的前兩個(gè)氨基酸替換為11個(gè)氨基酸的序列(8個(gè)來(lái)自于β-半乳糖苷酶的氨基端，另外3個(gè)殘基來(lái)源于基因融合中引入的連接序列的翻譯)對(duì)于產(chǎn)物易于回收、抗原性或形態(tài)學(xué)沒(méi)有不利影響[S.Stahl等人，“乙型肝炎病毒核心抗原。在大腸桿菌中的合成及在診斷中的應(yīng)用”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，79，1606-10(1982)；B.J.Cohen和J.E.Richmond，“在大腸桿菌中合成的乙型肝炎核心抗原的電子顯微鏡觀察”，自然，296，677-78(1982)]。
在本發(fā)明中有用的HBV核心抗原融合蛋白可以如S.J.Stahl和K.Murray，“與乙型肝炎病毒核心抗原的肽融合體的免疫原性”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，86，6283-87(1989)所述產(chǎn)生。此外，也用大量病毒編碼序列舉例說(shuō)明了多肽序列與HBV核心抗原主要片段的融合而產(chǎn)生高免疫原性顆粒，如圖2所示。包括具有高免疫原性的顆粒產(chǎn)物，它是通過(guò)痘苗病毒載體表達(dá)通過(guò)七肽連接序列與HBV核心抗原多肽氨基端之前的前核序列的六個(gè)氨基酸融合的VP1肽(殘基142-160)而產(chǎn)生的[B.E.Clarke等人，“與乙型肝炎核心蛋白融合后肽表位的免疫原性提高”，自然，330，381-84(1987)]。其他有用的HBV核心抗原融合蛋白參見(jiàn)Ulrich等人(1998)。
一系列其他融合蛋白的特征在于HBV核心抗原多肽羧基端的富含精氨酸區(qū)域被替換為其他的編碼序列。包含HBV表面抗原的免疫顯性a區(qū)(殘基111-165)、pre-S1和pre-S2表位和人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白的不同片段的肽與HBV核心抗原多肽的殘基144相連。全都在大腸桿菌中高效表達(dá)，產(chǎn)生顯示與HBV核心抗原本身基本相同的形態(tài)學(xué)的顆粒產(chǎn)物[Stahl和Murray，1989]。產(chǎn)物顯示HBV核心抗原的抗原反應(yīng)性，類(lèi)似于在殘基144處截短的HBV核心抗原多肽制劑，其檢測(cè)也顯示HBV e抗原反應(yīng)性，而全長(zhǎng)HBV核心抗原顯示極低的這種活性。具有來(lái)源于HBV表面抗原的殘基111-156或111-165的融合蛋白不顯示明顯的HBV表面抗原反應(yīng)性，此結(jié)果與該主要表位的構(gòu)象依賴(lài)性或序列被埋于顆粒內(nèi)的可能性一致。然而，對(duì)融合蛋白的免疫原性反應(yīng)反映了其不同的成分表位。
對(duì)HBV表面抗原的免疫應(yīng)答是復(fù)雜的，除了位于L-HBsAg的pre-S1和pre-S2區(qū)和主要免疫顯性a區(qū)中的表位外，許多可變亞型決定簇已分配給HBV表面抗原的短或S多肽的其他區(qū)[G.L.Le Bouvier，“澳抗的異源性”，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)，123，671-75(1971)；W.H.Bancroft等人，“乙型肝炎抗原其他抗原決定簇的檢測(cè)”，免疫學(xué)雜志，109，842-48(1972)；A.-M.Courouce-Pauty P.V和Holland，“研討會(huì)A2總結(jié)HBsAg及其亞型”，《病毒性肝炎》，G.N.Vyas，S.N.Cohen和R.Schmid編(Philadelphia，USAFranklin Institute Press)，649-54(1978)]。對(duì)從不同亞型血清中克隆的HBV DNA測(cè)定的HBV表面抗原編碼序列顯示相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列不同。然而，明顯重要的殘基的特異單突變不能實(shí)現(xiàn)從一種血清學(xué)亞型(y)到另一種(d)的轉(zhuǎn)變，但其他單突變誘導(dǎo)由同一分子顯示的y和d反應(yīng)性和免疫原性的逐漸改變[P.G.Ashton-Rickardt和K.Murray，“改變乙型肝炎病毒表面抗原免疫學(xué)亞型的突變和抗原與免疫原測(cè)定之間的差異”，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，29，204-14(1989)]。在構(gòu)象敏感的免疫顯性a區(qū)內(nèi)或接近其進(jìn)行有關(guān)突變，全都處于在與上述HBV核心抗原融合中使用的HBV核心抗原的片段內(nèi)。
突變對(duì)誘導(dǎo)的抗體的亞型特異性的影響提示融合蛋白也可提供一種改變對(duì)目的表位應(yīng)答的特異性的方法，特別是當(dāng)其依賴(lài)于構(gòu)象時(shí)。因此在HBcS111-156中的該殘基處進(jìn)行模擬天然逃避突變體的甘氨酸145精氨酸的突變和向其他帶正電或負(fù)電的殘基(賴(lài)氨酸和谷氨酸)的突變，以進(jìn)行體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的比較研究[A.L.L.Shiau和K.Murray，“與病毒核心抗原融合的乙型肝炎表面抗原的突變表位誘導(dǎo)可與天然表面抗原反應(yīng)的抗體”，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志51，159-66(1997)]。全部都在大腸桿菌中高效表達(dá)，產(chǎn)生預(yù)期的顯示強(qiáng)HBV核心抗原性的顆粒產(chǎn)物，全都可在兔中誘導(dǎo)高效價(jià)的抗HBV核心抗原的抗體。
象其親本蛋白HBcS111-156一樣，3個(gè)殘基145突變體在固相放射免疫測(cè)定(AUSRIA；Abbott Laboratories)中或溶液中的抗體沉淀測(cè)定中顯示與HBV表面抗原的抗體有最小的相互作用。然而，在變性條件下酰胺凝膠電泳后，在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中它們都顯示與兔抗HBV表面血清有強(qiáng)反應(yīng)[A.L.Shiau，“乙型肝炎病毒核心抗原及其衍生物的免疫學(xué)方面”，博士論文，愛(ài)丁堡大學(xué)，UK.(1993)]。當(dāng)在包被有HBV核心抗原的抗體的固相上捕獲時(shí)，高濃度的親本和突變蛋白也與HBV表面抗原的抗體有弱陽(yáng)性反應(yīng)，這可能是由于顆粒的某些破壞使抗HBsAg分子可以接近[Shiau和Murray，1997]。
用被免疫的兔檢測(cè)對(duì)融合蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)，以及抗體產(chǎn)生。用免疫后不同時(shí)間采取的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行基于由接觸HBV核心抗原引起的[3H]-胸苷摻入的增殖測(cè)定，或用融合蛋白進(jìn)行免疫。在所有情況中均發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)反應(yīng)，融合蛋白顯示比HBV核心抗原更高的刺激指數(shù)，而如預(yù)期的，HBV表面抗原是一種較差的刺激物。用與[125I]-HBV表面抗原的雙抗體放射免疫沉淀測(cè)定[C.J.Burrell等人，“用雙抗體放射免疫測(cè)定法快速檢測(cè)乙型肝炎表面抗原”，醫(yī)學(xué)病毒學(xué)雜志，3，1926(1978)]測(cè)定血樣中的抗-HBs，顯示預(yù)期的與HBcS111-156的陽(yáng)性反應(yīng)。精氨酸突變體在該測(cè)定中也產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，盡管略低于其親本分子，谷氨酸突變體獲得弱反應(yīng)，但賴(lài)氨酸突變體均未獲得。因此，結(jié)果表明，含有精氨酸145突變體的融合蛋白(稱(chēng)為HBcS145K)是一種強(qiáng)T細(xì)胞刺激物，可誘導(dǎo)具有廣泛反應(yīng)特異性的抗體。
進(jìn)行HBV表面抗原多肽不同部分包括殘基145突變體與HBV核心抗原多肽的另一組融合，以研究不同其他成分的總體大小和數(shù)量和位置對(duì)產(chǎn)物免疫原性的影響[Shiau(1993)]。圖2顯示這些構(gòu)建體，與其他融合一樣，全都產(chǎn)生顯示HBV核心抗原形態(tài)學(xué)的顆粒產(chǎn)物，盡管在HBV核心抗原氨基端與HBcS111-156片段的融合不能令人滿意，產(chǎn)生可形成不溶性聚集物的產(chǎn)物。
這組產(chǎn)物，象先前與HBcS111-156片段的產(chǎn)物一樣，在固相上或溶液中顯示與HBV表面抗原的抗體有較弱的或沒(méi)有反應(yīng)，但當(dāng)被固相上的HBV核心抗原的抗體捕獲時(shí)，它們顯示類(lèi)似的與HBV表面抗原的抗體反應(yīng)性，并且略高(約2倍)，這些融合體除HBcS111-156之外還帶有pre-S1和pre-S2片段。對(duì)于全部融合蛋白，淋巴細(xì)胞增殖抑制的刺激指數(shù)均較高，包含pre-S片段及天然或突變HBcS111-156序列的融合蛋白產(chǎn)生更強(qiáng)的反應(yīng)。在雙抗體放射免疫沉淀測(cè)定中，在HBc144和HBcS111-156序列之間含有pre-S1和pre-S2序列(野生型或突變體)產(chǎn)生比缺乏pre-S片段的融合體更高的抗體水平，但在HBc144和pre-S序列之間引入第二個(gè)HBcS111-156序列不引起任何反應(yīng)的再次增強(qiáng)。在脯氨酸144處與HBV核心抗原肽結(jié)合的最長(zhǎng)的這些序列-165個(gè)氨基酸-對(duì)融合蛋白的產(chǎn)量或物理性質(zhì)沒(méi)有明顯的不利影響。
也以部分及多個(gè)全長(zhǎng)拷貝將丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白(HCc)與在纈氨酸149處截短的HBV核心抗原多肽融合[A.Yoshikawa等人，“與丙型肝炎病毒核心蛋白的部分拷貝嵌合的乙型肝炎病毒核心顆?！?，病毒學(xué)雜志，67，6064-70(1993)]。帶有HCc殘基39-75的融合顯示微不足道的抗原性，但殘基1-91或180個(gè)氨基酸的全序列產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，而通過(guò)短接頭添加另外拷貝(可達(dá)4個(gè))的1-180序列可使抗原性幾乎算術(shù)提高。電子顯微鏡檢顯示，帶有一個(gè)拷貝的HCc殘基1-91的融合體形成形態(tài)學(xué)上相當(dāng)于HBV核心抗原多肽的顆粒，但3個(gè)全長(zhǎng)HCc拷貝大大扭曲了這種結(jié)構(gòu)，該產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)水解極敏感，但是產(chǎn)生保留有HBV核心抗原性的物質(zhì)。盡管大多數(shù)融合蛋白含有720個(gè)以上的其他氨基酸，但對(duì)HBV核心抗原類(lèi)型顆粒的限制似乎較少。
已在關(guān)于與HBcAg的融合位點(diǎn)對(duì)免疫原性的作用的其他研究中使用了PreS序列。Borisova等人(1989)制備融合體，其中pre-S1片段(殘基20-68，20-69或69-106)或完整的pre-S2與在脯氨酸144處截短的HBV核心抗原連接，或插入全長(zhǎng)HBV核心抗原序列內(nèi)的該位點(diǎn)。在這些和類(lèi)似的含有牛白血病病(BLV)包膜蛋白的殘基56-103或HIV跨膜蛋白(gp41)的殘基78-129的結(jié)構(gòu)中，與HBV核心抗原融合的序列被認(rèn)為暴露于顆粒表面，均報(bào)道有抗原性和免疫原性，富含精氨酸的C端結(jié)構(gòu)域顯然有較低的不利作用。
F.Schodel等人，“插入乙型肝炎病毒核心顆粒中的異源表位的位置決定其免疫原性”，病毒學(xué)雜志，6，106-14(1992)研究了當(dāng)pre-S1或pre-S2片段在全長(zhǎng)HBV核心抗原氨基端(或直接或通過(guò)前核序列部分)或截短的HBV核心抗原的羧基端連接時(shí)，融合位置對(duì)抗原性的影響和在近交系小鼠中的免疫應(yīng)答；另一種結(jié)構(gòu)在HBV核心抗原的殘基75和83之間有一個(gè)pre-S1片段，并在截短的羧基端處(脯氨酸156)有pre-S2片段。
全面分析顯示，通過(guò)短前核序列與HBV核心抗原氨基端融合的pre-S1序列具有抗原性，但直接與氨基端融合沒(méi)有，盡管這兩者具有相同的HBV核心抗原免疫原性，通過(guò)前核序列融合刺激更強(qiáng)的抗pre-S1應(yīng)答。在截短的HBV核心抗原端的pre-S2序列有類(lèi)似程度的抗原性和免疫原性，但內(nèi)部融合以替換殘基76-82(包含主要HBV核心抗原表位)的pre-S1序列有比N端融合大大提高的抗原性和明顯提高的免疫原性。如預(yù)期的，內(nèi)部融合蛋白中HBV核心抗原性和免疫原性大大降低。HBV核心抗原的內(nèi)部序列(殘基78-82)替換為含有免疫顯性a表位的HBV表面抗原片段也產(chǎn)生顯示陽(yáng)性HBV核心抗原性和免疫原性的產(chǎn)物[G.Borisova等人，“攜帶乙型肝炎表面抗原的免疫顯性區(qū)的雜種乙型肝炎病毒核殼”，病毒學(xué)雜志，67，3696-3701(1993)]。
作為上述融合蛋白的另一種選擇，或一種補(bǔ)充，免疫原性成分可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)連接方法與HBV核心抗原連接。
Bottcher等人(1997)提出的HBV核心抗原氨基酸序列在物理結(jié)構(gòu)上的重疊有助于解釋在或靠近HBV核心抗原羧基端融合的序列的低抗原性，因?yàn)檫@些序列可能埋藏于HBV核心抗原顆粒內(nèi)，而N端融合可得益于可彎曲的連接序列，而使免疫原遠(yuǎn)離刺突底部相對(duì)封閉的空間。免疫顯性HBV核心抗原表位[殘基78-82；Salfeld等人，(1989)]在刺突頂部的定位表明該位置對(duì)HBV衣殼結(jié)合肽-免疫原的插入或連接有吸引力。原則上，可同時(shí)使用所有這些位置來(lái)增加特定HBV核心抗原顆粒存在的表位的數(shù)量和/或多樣性。用來(lái)連接免疫原與HBV核心抗原顆粒的HBV衣殼結(jié)合肽如上所述，可以用為HBV衣殼結(jié)合肽的配體將目的免疫原與HBV核心顆粒連接。這些HBV衣殼結(jié)合肽是分離、純化的肽。這些HBV衣殼結(jié)合肽通過(guò)阻斷HBV核心蛋白與HBV表面蛋白之間的相互作用而有利地抑制并干擾HBV病毒裝配。
優(yōu)選地，HBV衣殼結(jié)合肽包括肽、片段、類(lèi)似物及其同系物，其長(zhǎng)度為約2～20個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地，肽長(zhǎng)度為約3～15個(gè)氨基酸。這些肽包括下表中列出的肽，及其片段和類(lèi)似物。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”是指比原始肽更短，但保留了基本類(lèi)似于原始肽的生物活性的氨基酸序列。這種片段至少為2個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
在此使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指肽氨基酸序列的變異，其一般可包括只有1個(gè)到約4個(gè)氨基酸改變的類(lèi)似物。類(lèi)似物的其他例子包括與此處例舉的肽有較少氨基酸變異的肽。特別是，含有保守氨基酸置換-即其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的置換-的肽構(gòu)成類(lèi)似物。
遺傳編碼的氨基酸一般分為4個(gè)家族(1)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電極性甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)共同歸類(lèi)為芳族氨基酸。對(duì)于HBV衣殼結(jié)合肽，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸可能是有益的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地評(píng)估這種改變的影響。
術(shù)語(yǔ)“同系物”包括在氨基酸水平上共有至少60％同一性，優(yōu)選地75％同一性，并與參照肽有基本上類(lèi)似的生物活性的肽片段。這些優(yōu)選的百分?jǐn)?shù)反映了較小的肽大小。
有用的HBV衣殼結(jié)合肽包括基于Dyson和Murray(1995)公開(kāi)的肽的HBV衣殼結(jié)合肽。隨機(jī)誘變?nèi)诤鲜删wB1中側(cè)翼為肽LLGRMK的殘基，并在為獲得可結(jié)合具有提高的親和力的抗原的衍生物的生物淘篩反應(yīng)中對(duì)HBV核心抗原重新選擇后，合成這些肽。高分辨率電子低溫顯微鏡檢證明，這些HBV衣殼結(jié)合肽在HBV核心蛋白外殼的刺突頂端結(jié)合。通過(guò)在存在或不存在肽的情況下，用含有HBV基因組的從頭到尾二聚體的復(fù)制型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通透性肝細(xì)胞瘤Hep G2細(xì)胞，檢測(cè)感染的細(xì)胞中這些肽對(duì)HBV核心抗原與HBV表面抗原蛋白之間相互作用的抑制作用。參見(jiàn)Bottcher等人(1998)。
攜帶LLGRMK序列的HBV衣殼結(jié)合肽以劑量依賴(lài)的方式降低了轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)中HBV的產(chǎn)量，其相對(duì)效率反映肽抑制溶液中HBV核心抗原與L-HBV表面抗原之間反應(yīng)的IC50值。
HBV衣殼結(jié)合肽優(yōu)選地具有低于約10μM，優(yōu)選地低于5μM，更優(yōu)選地低于約2μM，最優(yōu)選地低于約0.5μM的半數(shù)最大濃度(IC50)。優(yōu)選的肽包括但不限于SLLGRMKG(β-A)C，RSLLGRMKGA，HRSLLGRMKGA和RSLLGRMKGA(β-A)C，或由其衍生的肽。此外，這種肽可以是肽ALLGRMKG，其抑制長(zhǎng)乙型肝炎病毒表面抗原(LHBsAg)與HBcAg之間的相互作用，半數(shù)最大濃度(IC50)為10.0μM。
HBV衣殼結(jié)合肽舉例如下，其中KDRel(nM)代表HBV核心抗原與攜帶gpIII蛋白氨基端區(qū)肽序列的fd融合噬菌體之間反應(yīng)的相對(duì)解離常數(shù)[參見(jiàn)Dyson和Murray(1995)]序列KDRel(nM)ADGALLGRMKGA152±5ADGALLGRMKPA767±8ADGSLLGRMKPA322±50ADGALLGRMKRA181±12ADGTLLGRMKLA20±2ADGSLLGRMKGA1.7±0.3ADRSLLGRMKGA1.09±0.02
ADGSRSSLLGRMKGA1.96±0.32ADGAHSSLLGRMKGA1.72±0.17ADGHRSSLLGRMKGA1.40±0.13ADGPRSSLLGRMKGA0.84±0.07ADGAHRSLLGRMKGA0.94±0.12ADGYQRSLLGRMKGA0.88±0.08ADGTQRSLLGRMKGA0.84±0.06ADGMHRSLLGRMKGA0.55±0.03.
這些肽，其模擬L HBsAg的胞質(zhì)區(qū)，通過(guò)從絲狀噬菌體上展示的隨機(jī)六肽文庫(kù)中篩選而鑒定，其在溶液中對(duì)HBV核心抗原的親和力以噬菌體結(jié)合的形式測(cè)定。下列有關(guān)的肽(以下列出)也是HBV衣殼結(jié)合肽的例子，IC50μM值代表以半數(shù)最大水平抑制L HBsAg與HBV核心抗原結(jié)合所需的肽濃度，N/D代表未觀察到抑制，β-A代表β-丙氨酸[Dyson和Murray(1995)]序列 IC50μMALLGRMKG 11.0±0.8LLGRMKG 46.2±7.4LGRMKG 980±157GRMKG N/DLLGRM N/DCLLGRMKC 652±74ALLPRMKG N/DSLLGRMKG 6.4±0.7SLLGRMK 40.7±4.8SLLGRMKGA2.4±0.2GSLLGRMKGA 0.79±0.23DGSLLGRMKGAA 3.0±0.4ADGSLLGRMKGAAG 4.5±0.8ACSLLGRMKG 26.2±5.0SLLGRMKG(β-A)C 1.8±0.4RSLLGRMKGA 0.29±0.02HRSLLGRMKGA 0.50±0.04MHRSLLGRMKGA 0.80±0.10RSLLGRMKGA(β-A)C0.29±0.03MHRSLLGRMKGAG(β-A)GC3.80±0.69.
HBV衣殼結(jié)合肽、片段、及其類(lèi)似物和同系物，可用作使免疫原與HBV核心抗原顆粒結(jié)合的配體，優(yōu)選地用常規(guī)合成技術(shù)如化學(xué)合成技術(shù)合成。此外，技術(shù)人員利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法如t-BOC化學(xué)法使用自動(dòng)肽合成儀可合成任何肽。參見(jiàn)，例如，L.A.Carpino，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)79，4427(1957)。肽也可通過(guò)蛋白質(zhì)的化學(xué)切割或其他方法制備。分離這些肽，使得當(dāng)化學(xué)合成時(shí)其基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)試劑，或通過(guò)蛋白質(zhì)的化學(xué)切割獲得。
此外，可通過(guò)常規(guī)遺傳工程技術(shù)如重組DNA技術(shù)，通過(guò)在宿主微生物或細(xì)胞中克隆表達(dá)一種帶有所選擇的肽的編碼序列的DNA片段，在編碼該肽的核酸序列所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中制備HBV衣殼結(jié)合肽。當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，在適當(dāng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，可用常規(guī)方法從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中純化這些肽。分離重組肽，使在通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，這些肽基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基。這些肽的編碼序列可以合成制備，或通過(guò)已知技術(shù)由病毒RNA產(chǎn)生，或從可獲得的含cDNA質(zhì)粒中產(chǎn)生。
為在本發(fā)明的方法中使用，可將上述肽設(shè)計(jì)為通常已知的或另外的構(gòu)建體，以提高肽的產(chǎn)量，或其與HBV核心抗原的結(jié)合。例如，這些肽任選地可與蛋白質(zhì)或肽融合配偶體融合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計(jì)與一種選擇的融合配偶體如另一種肽結(jié)合的肽，或給予它希望的特征的其他肽或蛋白質(zhì)。
在不同微生物和細(xì)胞包括如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌(Streptomyces)、酵母屬(saccharomyces)、哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞中克隆表達(dá)HBV衣殼結(jié)合肽的系統(tǒng)及其合適的載體已知，并可從未公開(kāi)及公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)室和保藏所獲得，及從供應(yīng)商處獲得。
無(wú)論是重組產(chǎn)生還是合成產(chǎn)生，HBV衣殼結(jié)合肽可用常規(guī)純化方法純化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定為了希望的用途使用肽所需的適當(dāng)純度水平。
應(yīng)當(dāng)理解，HBV衣殼結(jié)合肽接頭的選擇一定程度上取決于構(gòu)成HBV核心抗原顆粒的特定核心抗原多肽的性質(zhì)。例如，不同原始病毒株的HBV核心抗原顆粒可能需要不同的HBV衣殼結(jié)合肽配體，這是因?yàn)槲挥诨蚩拷囟℉BV核心抗原多肽的配體結(jié)合部位的氨基酸序列不同。HBV衣殼結(jié)合肽與免疫原的連接HBV衣殼結(jié)合肽可與目的免疫原連接，通過(guò)肽鍵形成衣殼結(jié)合免疫原。當(dāng)免疫原本身是一種肽時(shí)，通常通過(guò)一次合成，或通過(guò)在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)一種肽的相應(yīng)編碼序列方便地實(shí)現(xiàn)，該肽含有與免疫原序列連接的HBV衣殼結(jié)合序列，通常且優(yōu)選地是通過(guò)2-5個(gè)(通常3個(gè))甘氨酸殘基連接，以使這種較長(zhǎng)的肽的兩種成分之間有一定程度的彈性。此外，肽可與免疫原交聯(lián)。
肽的結(jié)合成分與免疫原之間的連接方向可影響用于交聯(lián)衣殼結(jié)合免疫原與HBV核心抗原顆粒的最終步驟的效率。此外，在欲與HBV核心抗原顆粒交聯(lián)的大量衣殼結(jié)合免疫原中，可將一種特定免疫原置于與之連接的肽的氨基端，而將另一種免疫原置于與之連接的肽的羧基端。在某些情況中，將相同或不同的免疫原置于HBV衣殼結(jié)合肽的每一端可能是有利的。欲與特定HBV核心抗原顆粒交聯(lián)的HBV衣殼結(jié)合肽-免疫原復(fù)合物組織中的這些變化有利地提供了高度多成分或多價(jià)的HBV核心抗原顆粒。見(jiàn)圖1。
因此，欲與HBV核心抗原顆粒交聯(lián)的衣殼結(jié)合免疫原的方向?qū)τ诋a(chǎn)生的顆料的最終免疫原性或多價(jià)是重要的。當(dāng)免疫原位于HBV衣殼結(jié)合肽的氨基端時(shí)，預(yù)期有較高的免疫原性或多價(jià)性。具有較大靈活性的這種方向?qū)τ谳^大的免疫原也是優(yōu)選的。衣殼結(jié)合免疫原與HBV核心抗原顆粒的連接可用常規(guī)交聯(lián)劑將衣殼結(jié)合免疫原與HBV核心抗原交聯(lián)。這些交聯(lián)劑包括，例如，多功能交聯(lián)劑，如戊二醛、丁二醛、辛二醛和乙二醛。其他交聯(lián)劑在《Pierce目錄與手冊(cè)》，Pierce化學(xué)公司，Rockford，IIlinois(1997)中列出。其他交聯(lián)劑包括如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)，其連接相鄰的伯氨基和羧基，形成酰胺鍵。當(dāng)加入衣殼結(jié)合免疫原/HBV核心抗原顆粒混合物中時(shí)，這些試劑將肽的賴(lài)氨酸成分與相鄰的HBV核心抗原的天冬氨酸或谷氨酸共價(jià)交聯(lián)。
也應(yīng)當(dāng)理解，與特定HBV核心抗原顆粒連接的不同免疫原的比例當(dāng)然可隨用于連接衣殼結(jié)合免疫原與HBV核心抗原顆粒的混合物中各種免疫原的相對(duì)比例而不同。根據(jù)本發(fā)明的治療組合物本發(fā)明也提供可用于個(gè)體治療或預(yù)防處理的組合物，其含有此處公開(kāi)的多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒。任何個(gè)體，包括人和其他哺乳動(dòng)物，以及任何動(dòng)物，均可用此處公開(kāi)的HBV核心抗原顆粒處理。治療組合物包含藥學(xué)有效量的HBV核心抗原顆粒，即，對(duì)一種或多種傳染劑免疫或經(jīng)施用一定時(shí)間治療個(gè)體一種或多種病癥有效的量。預(yù)防組合物包含預(yù)防有效量的HBV核心抗原顆粒，即，經(jīng)施用一定時(shí)間預(yù)防個(gè)體的一種或多種病癥有效的量。
如果HBV核心抗原顆粒含有不同類(lèi)型的多種免疫原，可用含有它們的組合物和疫苗在個(gè)體中引發(fā)對(duì)每種成分免疫原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。如果HBV核心抗原顆粒含有相同類(lèi)型的多種免疫原，可用含有它們的組合物和疫苗在個(gè)體中引發(fā)對(duì)相同免疫原的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。后一種組合物和疫苗特征在于較常規(guī)單一治療增強(qiáng)的單價(jià)和能力。
含有本發(fā)明的多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒的組合物可單獨(dú)施用，或作為藥用或預(yù)防制劑的部分，含或不含佐劑，包括控制釋放的制劑。它們還可包含適于為治療這些感染而施用的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。合適的藥學(xué)可接受的載體是生理學(xué)惰性和/或無(wú)毒性的。本領(lǐng)域已知多種載體，可根據(jù)希望的用途選用。典型的載體包括但不限于無(wú)菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、明礬、氧化鋁、氫氧化鋁、peptin、花生油、橄欖油、芝麻油和水。另外，載體或稀釋劑可包括延時(shí)物質(zhì)，如單獨(dú)的或與石蠟一起的單硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油。另外，也可使用常規(guī)緩釋聚合物制劑，包括如可溶性玻璃。
潛在地，含有多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒的組合物可含有其他治療或預(yù)防劑。例如，這些組合物可含有在感染的治療或預(yù)防中有用的多種試劑的“雞尾酒混合物”。一種這樣的雞尾酒混合物可含有其他試劑如干擾素、核苷類(lèi)似物和/或N-乙酰-半胱氨酸。
任選地，含有免疫原性HBV核心抗原顆粒的組合物可進(jìn)一步含有免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，如在進(jìn)一步誘導(dǎo)患者的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答中有用的佐劑或細(xì)胞因子。這些調(diào)節(jié)劑包括常規(guī)的基于明礬的佐劑，或胞壁酰二肽、防腐劑、化學(xué)穩(wěn)定劑或其他抗原性蛋白質(zhì)。一般而言，為測(cè)定最佳制劑在希望用途中的效能，穩(wěn)定劑、佐劑和防腐劑等是合適的。合適的防腐劑可包括氯氧基丁炔醇(chloryl butynol)、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒(méi)食子酸丙酯(propyl gallade)、對(duì)羥基苯甲酸脂、甘油和苯酚。
可根據(jù)希望的反應(yīng)水平確定這些組合物的適當(dāng)含量。通常，含有免疫原性HBV核心抗原顆粒的組合物可含有約5μg～200μg顆粒。這些組合物可以以一次或一系列接種施用，例如，以2～6個(gè)月的間隔接種3次。也可由經(jīng)治醫(yī)生判斷確定合適的劑量，當(dāng)作為單一治療施用時(shí)，應(yīng)考慮如患者健康狀態(tài)、體重或年齡，以及成分免疫原的常規(guī)劑量等因素。待患者病癥改善或接觸特定病原體的可能性增加后，如必要時(shí)可施用維持劑量的含有免疫原性HBV核心抗原顆粒的組合物。隨后，施用的劑量或頻率或此兩者可減為能保持希望的作用的水平。此時(shí)，應(yīng)停止治療。但是，個(gè)體在不希望的特定病癥復(fù)發(fā)后可能需要長(zhǎng)期的斷續(xù)治療。
含有多成分或多價(jià)HBV核心抗原顆粒的組合物可通過(guò)任何合適的途徑施用，例如，腸胃外施用，特別是肌內(nèi)或皮下，以及口服。也可利用其他途徑，如肺、鼻、耳、肛門(mén)、皮膚、眼、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜、舌下、皮下和顱內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性HBV核心抗原顆?？梢栽贖BV感染個(gè)體的活性治療中使用，以抑制、降低或減緩體內(nèi)病毒的增殖。治療組合物包含能抑制或防止或使病毒裝配機(jī)制失效的免疫原性HBV核心抗原顆粒。可配制這些治療組合物，使之含有載體或稀釋劑，和本發(fā)明的一種或多種免疫原性HBV核心抗原顆粒。對(duì)于其他組合物，以上討論了這些載體和稀釋劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能鑒別。
可制備含有免疫原性HBV核心抗原顆粒作為活性成分的組合物或疫苗，以配制為液體溶液或懸液形式的可注射的組合物或疫苗。也可制備在注射前適于以液體溶解或懸浮的固體形式。在某些實(shí)施方案中，制劑也可以是乳化的或在脂質(zhì)體中封裝的，或?yàn)榭扇苄圆Ａ?，以便逐漸釋放和/或延時(shí)釋放。此外，制劑也可以是氣霧劑或噴霧形式。它們也可以包含于透皮貼劑中?；钚猿煞挚梢耘c任意量的藥學(xué)可接受的并與活性成分相容的賦形劑混合。這些賦形劑包括，例如，弗氏不完全佐劑、細(xì)菌脂多糖、離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、胞壁酰二肽、卵磷脂、緩沖物、基于纖維素的物質(zhì)和聚乙二醇。
方便地，含有根據(jù)本發(fā)明的HBV核心抗原顆粒的疫苗可以是含有大量不同免疫原的組合疫苗。這些疫苗包括，例如，含有針對(duì)下列兩種或多種疾病的免疫原的組合疫苗白喉、破傷風(fēng)、非細(xì)胞性百日咳、嗜血桿菌流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒或肺炎球菌性肺炎。其他疫苗包括在國(guó)際旅游前進(jìn)行個(gè)體接種的疫苗。這些疫苗包括，例如，含有針對(duì)下列兩種或多種疾病的免疫原的組合疫苗黃熱病、瘧疾、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、傷寒、腦膜炎球菌性腦炎或霍亂。
也可在免疫治療方案中用含有根據(jù)本發(fā)明的HBV核心抗原顆粒的組合物使個(gè)體對(duì)一種或多種變應(yīng)原脫敏，如動(dòng)物變應(yīng)原、昆蟲(chóng)變應(yīng)原、植物變應(yīng)原、空氣變應(yīng)原和吸入變應(yīng)原。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，可以用HBV核心抗原顆粒產(chǎn)生抗目的免疫原的抗體，以在免疫治療或診斷中使用。例如，可以分離在接種了HBV核心抗原顆粒的個(gè)體中產(chǎn)生的抗體，并以純化的形式使用。此外，也可通過(guò)常規(guī)技術(shù)用來(lái)源于個(gè)體的這些抗體或B細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法本發(fā)明的HBV核心抗原顆粒也可以多種常規(guī)測(cè)定形式中使用，特別是用于診斷感染或接觸傳染物的免疫測(cè)定形式。當(dāng)本發(fā)明的構(gòu)建體的HBV衣殼結(jié)合肽成分與診斷標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記、毒素或另一種蛋白質(zhì)或肽結(jié)合時(shí)，得到這種應(yīng)用。例如，HBV衣殼結(jié)合肽可與常規(guī)標(biāo)記結(jié)合，在接觸與特定HBV核心抗原結(jié)合肽連接的免疫原后，這些標(biāo)記能單獨(dú)或與其他組合物或化合物一起提供可檢測(cè)信號(hào)，而表明樣品中目標(biāo)分析物的存在。這些可檢測(cè)標(biāo)記可選自診斷測(cè)定領(lǐng)域技術(shù)人員周知的且易于獲得的大量組合物。
因此本發(fā)明不被特定測(cè)定形式的選擇所限制，并且認(rèn)為其包括本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的測(cè)定形式。為方便起見(jiàn)，可以以試劑盒的形式提供測(cè)定試劑。這些試劑盒包括預(yù)吸附有本發(fā)明的HBV核心抗原顆粒的微量滴定板，多種稀釋液和緩沖液，用于檢測(cè)特異結(jié)合的衣殼結(jié)合肽免疫原的標(biāo)記偶聯(lián)物及其他信號(hào)產(chǎn)生試劑，如酶底物、輔因子和生色團(tuán)。其他成分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定。
此外，根據(jù)本發(fā)明的HBV核心抗原顆?？稍谀壳坝糜诓≡w檢測(cè)的免疫學(xué)診斷檢測(cè)中使用，即放射免疫測(cè)定或ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可將欲檢測(cè)是否存在多種免疫原的抗體的樣品與含有不同免疫原性成分、含有可檢測(cè)標(biāo)記的HBV衣殼結(jié)合免疫原的HBV核心抗原顆粒接觸一段足夠的時(shí)間，以使該樣品中的所有抗體均與一種或多種HBV衣殼結(jié)合免疫原形成復(fù)合物。然后可用檢測(cè)方法檢測(cè)衣殼結(jié)合免疫原與該樣品中的抗體形成的復(fù)合物。然后可根據(jù)每種成分免疫原對(duì)樣品進(jìn)行第二輪篩選，以鑒定樣品中抗體的特異性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可將欲檢測(cè)是否存在特異免疫原的抗體的樣品與含有特異免疫原作為免疫原性性成分、含有可檢測(cè)標(biāo)記的HBV衣殼結(jié)合免疫原的HBV核心抗原顆粒接觸一段足夠的時(shí)間，以使該樣品中的所有抗體均與一種或多種HBV衣殼結(jié)合免疫原形成復(fù)合物。由于HBV核心抗原顆粒證明特異免疫原為高價(jià)，這種診斷測(cè)定的特征在于比常規(guī)測(cè)定更高的敏感性。
實(shí)施例為了更全面地理解此處所述的本發(fā)明，敘述了下列實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例只是為了說(shuō)明目的，而絕不應(yīng)看作是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1HBV核心抗原制劑HBV核心抗原(aa3-183)或C端截短的HBV核心抗原(aa3-148)在大腸桿菌中的表達(dá)和純化如Dyson和Murray(1995)所述進(jìn)行。蛋白質(zhì)制劑貯存于4℃下，在含TBS、蔗糖(20％)和NaN3(0.02％)的緩沖液中作為蔗糖梯度級(jí)分。該制劑在這種形式下至少可穩(wěn)定6個(gè)月。HBV衣殼結(jié)合肽與HBV核心抗原的化學(xué)交聯(lián)用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)(均購(gòu)自Pierce Europe B.V)將HBV衣殼結(jié)合肽MHRSLLGRMKGA(Albachem，愛(ài)丁堡大學(xué))與HBV核心抗原顆粒交聯(lián)。這些試劑連接相鄰的伯氨基和羧基，形成酰胺鍵[Staros等人，“N-羥基磺基琥珀酰亞胺對(duì)水溶性碳二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)的增強(qiáng)”，分析生物化學(xué)(Analyticai Biochem.)156，220-22(1986)]。當(dāng)加入HBV衣殼結(jié)合肽/HBV核心抗原混合物時(shí)，它們將肽的賴(lài)氨酸與相鄰的HBV核心抗原的天冬氨酸或谷氨酸共價(jià)交聯(lián)，使其分子量提高。
更具體而言，在肽MHRSLLGRMKGA(1mM)存在或不存在下，截短的HBV核心抗原(15μg)在含有磷酸鉀(25mM，pH7)、NaCl(150mM)、EDC(1.8mM)和磺基-NHS(1.8mM)的緩沖液(30μl)中在室溫下溫育。18小時(shí)后，如述[Sambrook等人(1989)]經(jīng)SDS-PAGE(15％w/v)分析該反應(yīng)。向肽-HBV核心抗原顆粒復(fù)合物中加入EDC和磺基-NHS導(dǎo)致在對(duì)HBV核心抗原級(jí)分的SDS-PAGE上發(fā)生相當(dāng)于約1kd的條帶移位。盡管在不同條件下電泳反應(yīng)物，但未獲得50％以上的移位蛋白帶產(chǎn)量。這與一種肽相一致，該肽可與接近局部2倍軸的HBV核心抗原二聚體結(jié)合，從而在空間上阻斷了其他肽與2倍相關(guān)位點(diǎn)的結(jié)合。
實(shí)施例2HBV核心抗原制劑除了在實(shí)施例1中制備的兩種HBV核心抗原樣品外，還如Stahl和Murray(1989)所述制備了含有HBV pre-S1序列1-36或HBV表面抗原序列111-156或111-165的HBV核心抗原樣品，所含的這些序列通過(guò)短接頭肽序列與截短的HBV核心抗原多肽(在殘基144處截短)連接。HBV衣殼結(jié)合肽與HBV核心抗原的化學(xué)交聯(lián)通過(guò)固相合成制備的下列衣殼結(jié)合免疫原從愛(ài)丁堡大學(xué)的Albachem獲得AS-151GSLLGRMKGA GGG LDPAFRGAS-152GSLLGRMKGA GGG EQKLISEEDLAS-163LDPAFR GG GSLLGRMKGAAS-164EQKLISEEDL GG GSLLGRMKGA，其中序列GSLLGRMKGA是HBV衣殼結(jié)合肽，序列LDPAFR是HBV pre-S1表位或免疫原，序列EQKLISEEDL是myc癌基因或免疫原。這些肽和基本HBV衣殼結(jié)合肽GSLLGRMKGA以不同濃度分開(kāi)或一起與HBV核心抗原顆粒結(jié)合，并如實(shí)施例所述用EDC或磺基-NHS交聯(lián)。產(chǎn)生的HBV核心抗原顆粒的性質(zhì)在SDS存在下通過(guò)丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析產(chǎn)物，隨后用考馬斯藍(lán)染色，并用抗HBV核心抗原顆粒或變性HBV表面抗原顆粒的單克隆抗體和多克隆兔血清進(jìn)行Western印跡分析。可使用針對(duì)HBV pre-S1表位和myc癌基因表位之每一個(gè)的單克隆抗體。它們分別是單克隆抗體18/7[K.H.Heermann等人，病毒學(xué)雜志52，396-402(1984)]和單克隆抗體9E10[Invitrogen，目錄號(hào)#R950-25]。
這些實(shí)驗(yàn)證明，所有交聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)物都與針對(duì)連接反應(yīng)組分中每種組成表位的抗體有陽(yáng)性反應(yīng)。用通過(guò)配體肽的氨基或羧基端連接的免疫原可獲得陽(yáng)性反應(yīng)。
如下所述，用普通HBV衣殼結(jié)合肽配體從包括與兩個(gè)或多個(gè)不同免疫原交聯(lián)的反應(yīng)中純化的HBV核心抗原顆粒制劑可與抗所有成分免疫原的抗體反應(yīng)。此外，用免疫原之一的特異性抗體沉淀的HBV核心抗原顆粒顯示與配體交聯(lián)步驟中使用的其他肽有交叉反應(yīng)性。
連接產(chǎn)物以蔗糖梯度超離心。用一種抗體-抗myc抗體沉淀，然后經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡分析。
用一種抗體如抗myc抗體沉淀的物質(zhì)在Western印跡中顯示與抗myc和抗pre-S1抗體有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)性。用另一種抗體-抗pre-S1抗體沉淀的產(chǎn)物也顯示同樣的交叉反應(yīng)性。
在攜帶不同免疫原的兩種HBV衣殼結(jié)合肽以不同比例混合以與核心顆粒結(jié)合并交聯(lián)的反應(yīng)中，SDS-PAGE和Western印跡分析顯示，用兩種單克隆抗體染色的相對(duì)強(qiáng)度反映了用于交聯(lián)的混合物中兩種免疫原的比例。
這些實(shí)驗(yàn)表明，由反應(yīng)產(chǎn)生的至少某些HBV核心顆粒與兩種免疫原共價(jià)連接。由于配體肽與HBV核心抗原顆粒(核殼)的頂端結(jié)合，這些制劑將顯示對(duì)兩種成分的強(qiáng)免疫原性，預(yù)計(jì)可在施用的個(gè)體中產(chǎn)生高抗體效價(jià)。
雖然我們?cè)谏衔闹袛⑹隽吮景l(fā)明的大量實(shí)施方案，但顯然能改變我們的基本結(jié)構(gòu)以提供利用本發(fā)明的方法的其他實(shí)施方案。因此應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍將由附加的權(quán)利要求書(shū)而不是由上文中以實(shí)施例形式提出的具體實(shí)施方案所限定。
序列表<110>BIOGEN，INCMurray，Kenneth<120>含有通過(guò)肽配體連接的多個(gè)免疫原性成分的HBV核心抗原顆粒<130>A067 PCT<140>PCT/US99/28755<141>1999-12-03<150>60/110，911<151>1998-12-04<160>47<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>1Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>2Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser1 5<210>3<211>12<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>3Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn1 5 10<210>4<211>6<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>4Glu Leu Asp Lys Trp Ala1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>5Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>6Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>7Leu Leu Gly Arg Met Lys1 5<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(9)<223>bAla<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>8Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Xaa Cys1 5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>bAla<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>9Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>10His Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>bAla<400>11Arg Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Xaa Cys1 5 10<210>12<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>12Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly1 5<210>13<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>13Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>14Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>15Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Pro Ala1 5 10<210>16<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>16Ala Asp Gly Ala Leu Leu Gly Arg Met Lys Arg Ala1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HBV衣殼結(jié)合肽<400>17Ala Asp Gly Thr Leu Leu Gly Arg 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權(quán)利要求
1.一種HBV核心抗原顆粒，其含有至少一種衣殼結(jié)合免疫原，該衣殼結(jié)合免疫原含有至少一種HBV衣殼結(jié)合肽成分和至少一種免疫原性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原位于該顆粒上，使得當(dāng)對(duì)個(gè)體施用該顆粒時(shí)，該免疫原性成分能引發(fā)免疫應(yīng)答。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽成分的任一氨基酸殘基與該顆粒連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)免疫原性成分的任一氨基酸殘基或其他殘基與該顆粒連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的HBV核心抗原顆粒，其中免疫原性成分的其他殘基是糖類(lèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽成分的氨基末端與該顆粒連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽成分的羧基末端與該顆粒連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述衣殼結(jié)合免疫原通過(guò)交聯(lián)劑與該顆粒交聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽成分直接連接或通過(guò)連接序列連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽成分的氨基端直接連接或通過(guò)連接序列連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽成分的羧基端直接連接或通過(guò)連接序列連接。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的HBV核心抗原顆粒，其中免疫原性成分通過(guò)交聯(lián)劑與HBV衣殼結(jié)合肽成分連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的HBV核心抗原顆粒，其中所述交聯(lián)劑是一種多功能交聯(lián)劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的HBV核心抗原顆粒，其中所述交聯(lián)劑是一種多功能交聯(lián)劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的HBV核心抗原顆粒，其中所述多功能交聯(lián)劑選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基-磺基琥珀酰亞胺。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分含有一個(gè)或多個(gè)選自免疫表位、免疫原性表位和抗原表位的表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的HBV核心抗原顆粒，其中所述表位選自線性表位、構(gòu)象性表位、單一表位和混合表位。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分選自抗原、變應(yīng)原、抗原決定簇、蛋白質(zhì)、糖蛋白、抗體、抗體片段、肽、模擬抗原或抗原決定簇的肽模擬位、多肽、糖肽、糖類(lèi)、寡糖、多糖、寡核苷酸和多核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分針對(duì)于或來(lái)源于選自病毒、寄生蟲(chóng)、分枝桿菌、細(xì)菌、桿菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、噬菌體、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的病原體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的HBV核心抗原顆粒，其中所述病毒選自反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、正粘病毒、副粘病毒、嗜肝DNA病毒、黃病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、乳多空病毒、腺病毒、桿狀病毒、漢坦病毒、細(xì)小病毒、腸道病毒、鼻病毒、腫瘤病毒、DNA病毒、RNA病毒、披膜病毒、彈狀病毒和痘病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的HBV核心抗原顆粒，其中所述病毒選自1型人類(lèi)免疫缺陷病毒、2型人類(lèi)免疫缺陷病毒、T細(xì)胞白血病病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹樣病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、黃熱病毒、瘧疾、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、腫瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒和痘苗病毒。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分針對(duì)于或來(lái)源于芽孢桿菌屬、腸細(xì)菌、梭狀芽胞桿菌屬、李斯特菌屬、分支桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、真細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、奈瑟球菌屬或沙門(mén)氏菌屬。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分針對(duì)白喉、破傷風(fēng)、非細(xì)胞性百日咳、嗜血桿菌流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、肺炎球菌性肺炎、黃熱病、瘧疾、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、傷寒、腦膜炎球菌性腦炎或霍亂。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的HBV核心抗原顆粒，其中所述免疫原性成分選自動(dòng)物變應(yīng)原、昆蟲(chóng)變應(yīng)原、植物變應(yīng)原、空氣變應(yīng)原和吸入變應(yīng)原。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中該HBV核心抗原是一種HBV抗原融合蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的HBV核心抗原顆粒，其中該HBV核心抗原融合蛋白含有免疫表位、免疫原性表位或抗原表位。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有與HBV核心抗原直接或通過(guò)連接序列融合的免疫表位、免疫原性表位或抗原表位。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有與HBV核心抗原羧基端直接或通過(guò)連接序列融合的免疫表位、免疫原性表位或抗原表位。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有與HBV核心抗原氨基端直接或通過(guò)連接序列融合的免疫表位、免疫原性表位或抗原表位。
30.根據(jù)權(quán)利要求25的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有截短的HBV核心抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求25的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有HBV表面抗原或其部分。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的HBV核心抗原顆粒，其中HBV核心抗原融合蛋白含有選自HBV表面抗原的pre-S1區(qū)、HBV表面抗原的pre-S2區(qū)、HBV表面抗原的免疫顯性a區(qū)及其部分的序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中該HBV核心抗原是全長(zhǎng)HBV核心抗原多肽或其部分、截短體、突變或衍生物，它們能以顆粒形式裝配。
34.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中所述HBV衣殼結(jié)合肽成分選自SLLGRMKGA、GSLLGRMKGA、DGSLLGRMKGAA、ADGSLLGRMKGAAG、SLLGRMKG(β-A)C、RSLLGRMKGA、HRSLLGRMKGA、ALLGRMKG、MHRSLLGRMKGA、RSLLGRMKGA(β-A)C和MHRSLLGRMKGAG(β-A)GC。
35.一種疫苗，其含有預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒。
36.一種藥用組合物，其含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒。
37.一種在個(gè)體中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包括以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量對(duì)該個(gè)體施用根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒的步驟。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中經(jīng)腸胃外途徑對(duì)個(gè)體施用HBV核心抗原顆粒。
39.一種提高免疫原的免疫原性的方法，其方法是將該免疫原通過(guò)HBV衣殼結(jié)合肽與HBV核心抗原顆粒連接。
40.根據(jù)權(quán)利要求1的HBV核心抗原顆粒，其中該衣殼結(jié)合免疫原含有一種診斷標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。
41.一種檢測(cè)樣品中免疫原的抗體存在與否的方法，其包括(a)使樣品與根據(jù)權(quán)利要求40的HBV核心抗原顆粒接觸一段足夠的時(shí)間，使得樣品中的所有抗體均與衣殼結(jié)合免疫原形成復(fù)合物；和(b)用檢測(cè)方法檢測(cè)衣殼結(jié)合免疫原與樣品中的抗體形成的復(fù)合物。
42.一種HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其含有至少一種衣殼結(jié)合肽成分和至少一種免疫原性成分。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽直接連接或通過(guò)連接序列連接。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽成分的氨基端直接連接或通過(guò)連接序列連接。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分與HBV衣殼結(jié)合肽成分的羧基端直接連接或通過(guò)連接序列連接。
46.根據(jù)權(quán)利要求42-44任一項(xiàng)的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分通過(guò)交聯(lián)劑與HBV衣殼結(jié)合肽成分交聯(lián)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述交聯(lián)劑是一種多功能交聯(lián)劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述多功能交聯(lián)劑選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基-磺基琥珀酰亞胺。
49.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分含有一個(gè)或多個(gè)選自免疫表位、免疫原性表位和抗原表位的表位。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述表位選自線性表位、構(gòu)象性表位、單一表位和混合表位。
51.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分選自抗原、變應(yīng)原、抗原決定簇、蛋白質(zhì)、糖蛋白、抗體、抗體片段、肽、模擬抗原或抗原決定簇的肽模擬位、多肽、糖肽、糖類(lèi)、寡糖、多糖、寡核苷酸和多核苷酸。
52.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分針對(duì)于或來(lái)源于選自病毒、寄生蟲(chóng)、分枝桿菌、細(xì)菌、桿菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、噬菌體、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的病原體。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述病毒選自反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、正粘病毒、副粘病毒、嗜肝DNA病毒、黃病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、乳多空病毒、腺病毒、桿狀病毒、漢坦病毒、細(xì)小病毒、腸道病毒、鼻病毒、腫瘤病毒、DNA病毒、RNA病毒、披膜病毒、彈狀病毒和痘病毒。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述病毒選自1型人類(lèi)免疫缺陷病毒、2型人類(lèi)免疫缺陷病毒、T細(xì)胞白血病病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹樣病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、黃熱病毒、瘧疾、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、腫瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒和痘苗病毒。
55.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分針對(duì)于或來(lái)源于芽孢桿菌屬、腸細(xì)菌、梭狀芽胞桿菌屬、李斯特菌屬、分支桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、真細(xì)菌、支原體、衣原體、螺旋體、奈瑟球菌屬或沙門(mén)氏菌屬。
56.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分針對(duì)白喉、破傷風(fēng)、非細(xì)胞性百日咳、嗜血桿菌流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、水痘、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、肺炎球菌性肺炎、黃熱病、瘧疾、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、傷寒、腦膜炎球菌性腦炎或霍亂。
57.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述免疫原性成分選自動(dòng)物變應(yīng)原、昆蟲(chóng)變應(yīng)原、植物變應(yīng)原、空氣變應(yīng)原和吸入變應(yīng)原。
58.根據(jù)權(quán)利要求42的HBV衣殼結(jié)合肽免疫原，其中所述HBV衣殼結(jié)合肽成分選自SLLGRMKGA、GSLLGRMKGA、DGSLLGRMKGAA、ADGSLLGRMKGAAG、SLLGRMKG(β-A)C、RSLLGRMKGA、HRSLLGRMKGA、ALLGRMKG、MHRSLLGRMKGA、RSLLGRMKGA(β-A)C和MHRSLLGRMKGAG(β-A)GC。
全文摘要
本發(fā)明涉及特征在于多種免疫原特異性的乙型肝炎病毒(“HBV”)核心抗原顆粒。更具體而言,本發(fā)明涉及含有通過(guò)配體與之交聯(lián)的免疫原、表位或其他相關(guān)結(jié)構(gòu)的HBV核心抗原顆粒,這些配體是可與HBV核心蛋白選擇性結(jié)合的HBV衣殼結(jié)合肽。這些顆?？捎米鞑煌庖咴员砦话℉BV衣殼結(jié)合肽的輸送系統(tǒng),它們也通過(guò)阻斷HBV核心蛋白與HBV表面蛋白之間的相互作用有利地抑制并干擾HBV病毒裝配。不同免疫原的混合物、HBV衣殼結(jié)合肽配體或兩者可與同一HBV核心顆粒交聯(lián)。產(chǎn)生的這些多成份或多價(jià)HBV核心顆?？捎欣赜糜谥委熀皖A(yù)防疫苗和組合物中,以及診斷組合物和使用它們的方法中。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1332749SQ99815261
公開(kāi)日2002年1月23日 申請(qǐng)日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月4日
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