專利名稱：使用纓桃分離物提供抗氧化的、植物性或營(yíng)養(yǎng)性益處的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種方法，該方法使用具有營(yíng)養(yǎng)性(nutraceutical)或植物性(phytoceutical)的櫻桃分離物以便提供益處。
本發(fā)明也涉及一種方法，該方法根據(jù)需要用一種來(lái)自櫻桃的組合物抑制活的生物學(xué)材料的氧化。詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及作為食物增補(bǔ)劑或食品添加劑的一種化合物或一種組合物。最好是一種含有花色素苷、生物類(lèi)黃酮及酚類(lèi)的混合物的組合物。
許多來(lái)源于植物的化合物，作為它們通過(guò)維持低水平的活性氧中間體而作為細(xì)胞的抗氧化劑、通過(guò)抑制前列腺素的合成而作為抗炎劑或作為與細(xì)胞增殖有關(guān)的酶的抑制劑的能力，也可以賦予食物重要的、好的、藥理學(xué)或“營(yíng)養(yǎng)性”特性。這些活性在改善慢性疾病中可能是重要的，所述疾病包括癌癥、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病(Kinsella等，F(xiàn)ood Tech.85-89(1993))。因此，就天然產(chǎn)品而言，食物增補(bǔ)劑/食品行業(yè)和營(yíng)養(yǎng)品公司有機(jī)會(huì)使用這些化合物，所述化合物不僅能夠象合成的抗氧化劑一樣有效地提高食品的穩(wěn)定性而且也能夠給消費(fèi)者提供明顯的健康益處。
通常認(rèn)為櫻桃具有有益于健康的性質(zhì)。優(yōu)選的櫻桃是歐洲酸櫻桃(Prunus Cerasus L.)(薔薇科)MONTMORENCY栽培品種，MONTMORENCY在美國(guó)是商業(yè)種植的主要的酸櫻桃。為了挑戰(zhàn)MONTMORENCY單種栽培，在1984年將一種新的栽培品種BALATON酸櫻桃(Ujferbertoi furtos)引進(jìn)美國(guó)，并在密歇根洲、猶他洲和威斯康顯洲試驗(yàn)。BALATON產(chǎn)生的果實(shí)較MONTMORENCY產(chǎn)生的果實(shí)顏色深。
最近的結(jié)果顯示，花色素苷如矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷具有強(qiáng)的抗氧化活性(Tsuda，T.等，J.Agric.Food Chem.422407-2410(1994))。加入抗氧化劑是增加食物產(chǎn)品的貯存期限的常用方法之一，認(rèn)為產(chǎn)品的貯存期限與脂質(zhì)的過(guò)氧化有關(guān)。天然的抗氧化劑在防止癌發(fā)生中可以起到一個(gè)重要的作用。食物抗氧化劑可以有效地對(duì)抗有生命體系中的過(guò)氧化損害(Halliwell，B.和J.M.C.Gutteridge，“生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的自由基”。Oxford University Press，New York 416-494(1989)；Osawa，T.等，“食物抗氧化劑在防御氧化損害中的作用。關(guān)于抗引起突變和抗癌發(fā)生的機(jī)理”；Kuroda，Y.；Shankel，D.M.，Waters，M.D.編著；Plenum Publishing.New York139-153(1990))。
早期的研究已經(jīng)表明MONTMORENCY櫻桃含有花色素苷矢車(chē)菊色素-3-龍膽二糖苷和矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷(Li，K.C.等，J.Am.Chem.Soc.78979-980(1956))。在七種酸櫻桃品種中有六種也發(fā)現(xiàn)了矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖基蕓香糖苷(Harborne，J.B.等，Phytochemistry 3453-463(1964))。Dekazos(Dekazos，E.D.，J.Food Sci.35237-241(1970))報(bào)道在MONTMORENCY櫻桃中的花色素苷色素為與矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷、矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷及矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷一起的芍藥花青素-3-蕓香糖苷、芍藥花青素和矢車(chē)菊色素?？墒牵b定矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖基蕓香糖苷以及矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷及矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷為酸櫻桃中的主要的色素。用HPLC保留值，Chandra等(Chandra，A等，J.Agric.Food Chem.40967-969(1992))報(bào)道在密歇根洲種植的MONTMORENCY櫻桃中矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷及矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷分別是主要的和次要的花色素苷。類(lèi)似地檢測(cè)到在MONTMORENCY櫻桃中矢車(chē)菊色素-3-木糖基蕓香糖苷為次要的色素(Shrikhande，A.J.和F.J.Francis，J.Food Sci.38649-651(1973))。
在先有技術(shù)中，首先通過(guò)吸附所述色素在一根AMBERLITEXAD-2(Sigma Chemicals)柱上實(shí)現(xiàn)從BALATON和MONTMORENCY櫻桃汁生產(chǎn)純的花色素苷(

圖1化合物1-3)(Chardra，A.等，J.Agric.Food Chem.411062-1065(1993))。用水洗脫該柱直到洗脫液的pH接近7.0。用MeOH洗脫與其它酚類(lèi)一起吸附的色素。分別用C-18MPLC和HPLC分離和純化產(chǎn)生的粗花色素苷，以便提供光譜研究用的純的花色素苷。純化500mg來(lái)自AMBERLITE XAD-2的粗MONTMORENCY花色素苷產(chǎn)生60mg純花色素苷1-3，相比之下，來(lái)自BALATON為391.43mg。該研究指出源于MONTMORENCY、由XAD-2獲得的粗花色素苷含有高百分比的其它有機(jī)化合物。AMBERLITE XAD-2不允許再生樹(shù)脂。從未因任何目的嘗試使用類(lèi)黃酮、異黃酮類(lèi)、酚類(lèi)和花色素苷的粗混合物。美國(guó)專利號(hào)5,266,685(Garbutt)、5,665,783(Katzakian等)及5,817,354(Mozaffar)描述了各種吸附樹(shù)脂及它們?cè)诜蛛x無(wú)關(guān)產(chǎn)物時(shí)的用途。這些專利僅僅是使用吸附樹(shù)脂中現(xiàn)有技術(shù)一般水平的例證。
美國(guó)專利號(hào)5,503,867(Pleva)描述了碎肉中全磨碎的櫻桃和燕麥糠的用途。所使用的櫻桃的量為10到15％(重量)并且相信加入燕麥糠是為了抵償櫻桃中的果汁。無(wú)論如何，櫻桃肯定使肉具有風(fēng)味，然而該產(chǎn)品的可口性不能普遍被接受。這個(gè)專利并沒(méi)有描述營(yíng)養(yǎng)性或植物性益處。最近關(guān)于含有櫻桃組織的低脂牛肉末的穩(wěn)定性研究提示該植物源含有有效的抗氧化劑，其不僅抑制脂質(zhì)的過(guò)氧化而且也抑制在油炸食物期間雜環(huán)芳香胺及膽甾醇氧化產(chǎn)物的形成(Gomaa等，IFT Abstracts No.68E-7(1996))。為了解釋這些觀察的結(jié)果，而采用的假設(shè)是經(jīng)常在高等植物如櫻桃的液泡中發(fā)現(xiàn)的多酚如類(lèi)黃酮、花色素苷和花色素產(chǎn)生所述的抗氧化作用。
需要尤其用作食物增補(bǔ)劑/營(yíng)養(yǎng)或食品添加劑的源于天然櫻桃的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種方法，該方法提供給活的哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)性或植物性益處，包括抗氧化的益處，該方法包括
喂給哺乳動(dòng)物一種由櫻桃分離的組合物，該組合物選自花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物，所喂給的量能給哺乳動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)或植物性能。
本發(fā)明涉及一種抑制需要此處理的活的生物材料中氧化的方法，該方法包括提供一種選自由櫻桃分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物的組合物給活的生物材料，所提供的量能夠在活的生物材料中抑制氧化。
術(shù)語(yǔ)“活的生物材料”意指在培養(yǎng)基中的活的組織，在動(dòng)物或人的體外或體內(nèi)的活的組織。
術(shù)語(yǔ)“花色素苷”意指在櫻桃中賦予顏色的化合物。從本申請(qǐng)的目的出發(fā)，該定義也包括苷元矢車(chē)菊色素。
術(shù)語(yǔ)“生物類(lèi)黃酮”意指櫻桃中含有的異黃酮和類(lèi)黃酮化合物。
術(shù)語(yǔ)“酚類(lèi)”涉及具有苯基并具有一個(gè)或多個(gè)羥基的來(lái)自櫻桃的化合物。
術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)性”意指對(duì)活的哺乳動(dòng)物有好處，以維生素的方式影響哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期的健康。
術(shù)語(yǔ)“植物性(產(chǎn)品)”意指一種源于植物的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可提供營(yíng)養(yǎng)性。目的因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于食品或作為象防止活組織中氧化的抗氧化劑一樣的食物增補(bǔ)劑或營(yíng)養(yǎng)劑的天然來(lái)源的櫻桃組合物。通過(guò)參考以下說(shuō)明和附圖該目的及其它目的將變得顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示從BALATON和MONTMORENCY櫻桃中分離的、精選的花色素苷(著色劑)的結(jié)構(gòu)。苷元矢車(chē)菊色素在3位有一個(gè)羥基。
圖2和圖3為顯示從櫻桃中分離的主要生物類(lèi)黃酮的圖。
圖4顯示從酸櫻桃中分離的、精選的酚類(lèi)。
圖5顯示從櫻桃中分離花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)方法的步驟。
圖6為示意圖，顯示在圖5所示的方法中可能使用的設(shè)備。
圖7為曲線圖，顯示花色素苷和商業(yè)上的抗氧化劑在脂質(zhì)體模式體系中的抗氧化功效。通過(guò)加入亞鐵離子引發(fā)氧化反應(yīng)。在試驗(yàn)化合物存在下，熒光的衰變速率減慢。對(duì)照品不含有加入的Fe2+和含有Fe2+不含有加入的試驗(yàn)化合物。其它樣品含有Fe2+和2μM的試驗(yàn)化合物。
圖8為曲線圖，顯示分離的化合物1-4、7和8與商業(yè)上的抗氧化劑TBHQ及BHT在10μM濃度時(shí)的抗氧化活性。數(shù)據(jù)為雙份實(shí)驗(yàn)的平均值。化合物1為柚苷元(R1-OH，R4-OH和R6-OH；R2、R3、R5和R7-H)?；衔?為染料木黃酮(圖3)?；衔?為綠原酸?；衔?為五羥黃酮3-鼠李糖苷(圖2)。化合物7為染料木黃酮7-葡萄糖苷(圖3)。化合物8為6，7-二甲氧基-5，8，4’-三羥基黃酮(圖2)。
圖9為曲線圖，顯示分離的化合物1、3和4(圖4)與一些商業(yè)上的抗氧化劑在20μM濃度下的抗氧化活性。化合物2的抗氧化活性是在100μM下測(cè)量的。通過(guò)作為時(shí)間函數(shù)的熒光強(qiáng)度的減少監(jiān)測(cè)過(guò)氧化速率。相對(duì)強(qiáng)度為在所給出的時(shí)間的熒光強(qiáng)度以測(cè)定開(kāi)始時(shí)的初始熒光強(qiáng)度除。數(shù)值為雙份測(cè)量的平均值。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述一種優(yōu)選的生產(chǎn)作為一種組合物的包含源于櫻桃的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物的方法，該方法包括提供一種含有源于櫻桃的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的水溶液；從該水溶液中將花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)轉(zhuǎn)移到樹(shù)脂表面；用洗脫劑洗脫樹(shù)脂表面以便從樹(shù)脂表面移去花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)；并且分離洗脫劑和花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。
詳細(xì)地說(shuō)，一種優(yōu)選的生產(chǎn)作為一種組合物的源于櫻桃的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的方法提供第一批櫻桃，其中的櫻桃為新鮮的或快速冷凍并解凍；破壞櫻桃并使果肉與果汁分離；從果肉中將花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)提取進(jìn)入水溶液；從含有從果肉分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的水溶液中將花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)轉(zhuǎn)移到吸附樹(shù)脂顆粒上；用低級(jí)鏈烷醇洗滌該樹(shù)脂顆粒以便從樹(shù)脂顆粒上移去花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)；分離低級(jí)鏈烷醇與花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)；第二批櫻桃用分離后的鏈烷醇和移去了花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的樹(shù)脂顆粒重復(fù)以上步驟。
另外，用于該方法的優(yōu)選可供消費(fèi)的組合物以混合物的形式包含干燥的由櫻桃分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物；和食品級(jí)的載體，其中所述混合物與載體的重量比在大約0.1比100和100比0.1之間。
最后，提供一種優(yōu)選的抑制哺乳動(dòng)物中的氧化的方法，該方法包括喂給哺乳動(dòng)物一種可供消費(fèi)的組合物，所述組合物以混合物的形式包含干燥的由櫻桃分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物；和食品級(jí)的載體，其中所述混合物與載體的重量比在大約0.1比100和100比0.1之間。最好該組合物含有至少一部分干燥的櫻桃果肉。
用于本發(fā)明的櫻桃可以是甜的或酸的。酸櫻桃除了含有其它的有機(jī)酸以外還含有高水平的蘋(píng)果酸，蘋(píng)果酸使酸櫻桃具有酸味。該方法分離蘋(píng)果酸和其它含有機(jī)酸的糖，可將它們用于食品以便提供酸味和風(fēng)味。最優(yōu)選的是BALATON和MONTMORENCY櫻桃。
分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物可用作一種天然的營(yíng)養(yǎng)性/食物增補(bǔ)劑。關(guān)于這一點(diǎn)，可以用粉末、液體或固體的形式提供所述分離的混合物。例如，該混合物可以為可復(fù)制的粉末組合物，例如當(dāng)用水、牛奶或其它類(lèi)似的液體復(fù)制時(shí)，將提供一種飲料?；蛘?，該混合物可以為固態(tài)如片劑、凝膠膠囊、軟凝膠等。另外，也可將該混合物摻入食料中。
通常，可以用一種形式提供混合物以便所述混合物的含量占總組合物重量的約0.01％到50％，優(yōu)選約0.1％到30％，更優(yōu)選約0.5％到25％。
作為一個(gè)例子，當(dāng)以片劑的形式提供所述混合物時(shí)，該片劑可以提供花色素苷和生物類(lèi)黃酮的日劑量大約在0.1mg到300mg之間，希望從1到200mg，優(yōu)選60-100mg的日劑量。一百顆櫻桃提供60到100mg的花色素苷。可以按照0.1到50mg的日劑量提供酚類(lèi)(圖4)。一百顆櫻桃提供1-50mg的酚類(lèi)。通過(guò)分離單體化合物并將它們混合在一起可以調(diào)節(jié)花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的天然混合物。也可以以等劑量的液體形式提供該組合物。
樹(shù)脂具有吸附花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的表面。一類(lèi)優(yōu)選的吸附樹(shù)脂為由苯乙烯和二乙烯基苯組成的聚合交聯(lián)樹(shù)脂，例如AMBERLITE系列的樹(shù)脂，如AMBERLITE XAD-4和AMBERLITEXAD-16，商業(yè)上可從Rohm&Haas Co.，Philadelphia.PA獲得。按照本發(fā)明適合使用的其它聚合交聯(lián)的苯乙烯和二乙烯基苯吸附樹(shù)脂為Dow Chemical Company，Midland，Michigan等生產(chǎn)的XFS-4257、XFS-4022、XUS-40323及XUS-40322。
優(yōu)選使用商業(yè)上可獲得的、政府批準(zhǔn)的(當(dāng)要求時(shí))苯乙烯-二乙烯基-苯(SDVB)交聯(lián)共聚物樹(shù)脂(例如AMBERLITE XAD-16)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，將商業(yè)上從Rohm和Haas Company獲得并描述于美國(guó)專利號(hào)4,297,220中的AMBERLITE XAD-16作為所述樹(shù)脂使用。該樹(shù)脂是非離子的疏水、交聯(lián)聚苯乙烯二乙烯基苯吸附樹(shù)脂。AMBERLITE XAD-16具有大網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)既具有連續(xù)的聚合物相又具有連續(xù)的多孔相。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明所使用的樹(shù)脂的粒徑在100-200微米范圍內(nèi)。
預(yù)期，其它吸附劑，如那些AMBERLITE XAD吸附劑系列中含有疏水大網(wǎng)絡(luò)樹(shù)脂珠粒、粒徑在100-200微米范圍內(nèi)的吸附劑，在本發(fā)明的方法中也將是有效的。此外，不同種類(lèi)的AMBERLITE也適宜用于本發(fā)明，如AMERCHROM CG系列的吸附劑，其粒徑在100-200微米范圍內(nèi)。優(yōu)選AMBERLITE XAD-16，因?yàn)樗梢灾貜?fù)使用多次(超過(guò)100次)?？墒牵瑢?duì)食品而言，預(yù)期在本發(fā)明中使用政府批準(zhǔn)的樹(shù)脂將認(rèn)為是重要的和/或理想的。
可以使用任何溶劑以移去吸附的花色素苷、生物類(lèi)黃酮及酚類(lèi)。優(yōu)選含有1到4個(gè)碳原子的低級(jí)鏈烷醇而最優(yōu)選乙醇，因?yàn)樗慌鷾?zhǔn)用于食品。典型地，乙醇與水共沸，可是可以使用無(wú)水乙醇。使含有櫻桃中蘋(píng)果酸和糖的水通過(guò)所述柱。收集這些水并且可以用于食品中作為調(diào)味劑。
優(yōu)選由BALATON和MONTMORENCY櫻桃中分離花色素苷、生物類(lèi)黃酮及酚類(lèi)。櫻桃組合物的內(nèi)容部分顯示于1997年2月12日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/799,788中和部分顯示于1998年12月11日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)60/111,945中。正如這些申請(qǐng)中所述，在密歇根洲和美國(guó)，Montmorency(歐洲酸櫻桃(Prunus cerasus))種占酸櫻桃栽培品種的95％以上。可是，在幾個(gè)密歇根洲果園正種植Balaton酸櫻桃(P.Cerasus)，一種新的酸櫻桃栽培品種以便代替Montmorency。這種櫻桃具有較高含量的花色素苷并且認(rèn)為是一種更好的品種。已經(jīng)報(bào)道過(guò)Montmorency和Balaton酸櫻桃的花色素苷含量(Wang等，1997；Chandra等，1993)?？墒?，以前未進(jìn)行過(guò)Balaton酸櫻桃中其它酚類(lèi)化合物的詳細(xì)研究。早期的研究顯示MONTMORENCY櫻桃含矢車(chē)菊色素-3-龍膽二糖苷和矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷(Li，K.C.等，J.Am.Chem.Soc.78979-980(1956))。在七種酸櫻桃品種中有六種也發(fā)現(xiàn)了矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖基蕓香糖苷(Harbone，J.B.等，Phytochemistry 3453-463(1964))。Dekazos(Dekazos，E.D.，J.Food Sci.35237-241(1970))報(bào)道在MONTMORENCY櫻桃中花色素苷色素為與矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷、矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷及矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷一起的芍藥花青素-3-蕓香糖苷、芍藥花青素和矢車(chē)菊色素。可是，矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖基蕓香糖苷以及矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷和矢車(chē)菊色素-3-蕓香糖苷在酸櫻桃中被證明是主要的色素。采用HPLC保留值，Chandra等(Chandra，A等，J.Agric.Food Chem.40967-969(1992))報(bào)道，在密歇根洲種植的MONTMORENCY櫻桃中矢車(chē)菊色素-3-槐糖苷和矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷分別是主要的和次要的花色素苷。類(lèi)似地，已查明矢車(chē)菊色素-3-木糖基蕓香糖苷是MONTMORENCY櫻桃中較小量的色素(Shrikhande，A.J.和F.J.Francis，J.Food Sci.38649-651(1973))。
使用術(shù)語(yǔ)“載體”或“填充劑”意指一種組合物，加入載體或填充劑以便增加源于櫻桃的純化組成的組合物體積。最好是干燥的櫻桃果肉。這些載體包括含有任何可食用淀粉的材料、蛋白質(zhì)如脫脂干燥乳。在該組內(nèi)有面粉、糖、大豆粗粉、麥芽糖糊精和各種調(diào)味品如鹽、胡椒、香料和藥草。填充劑使用量為該混合物的約10-6和106重量份之間。
按照食品的活性成分大約在0.1和10mg/g之間的量將該組合物加入食品。所述量的選擇最好不影響食品的味道并且又能產(chǎn)生最有益的結(jié)果。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的一樣，所述食品可以是高水分(濕的)或低水分(干的)。當(dāng)用作食物增補(bǔ)劑時(shí)，片劑含有0.1到1g的活性成分。一種特定的食品為熟肉和其它預(yù)制食品，其中所述組合物給食品提供抗氧化性質(zhì)和任選的顏色。該組合物可以作為一種調(diào)味品分散到預(yù)制食品上以便提供營(yíng)養(yǎng)性或植物性益處。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了植物化學(xué)品的提取和分離方法(Chandra，A等，J.Agric.Food Chem.411062(1992)；Wang，H.等，J.Agric.Food Chem.452556-2560(1997))以及迅速篩選抗氧化活性的方法(Arora，A.和G.M.Strasburg，J.Amer.Oil Chem.Soc.741031-1040(1997))。利用這些方法鑒別和鑒定源于BALATON和MONTMORENCY櫻桃的抗氧化化合物。連續(xù)用己烷、乙酸乙酯和甲醇提取榨汁后的櫻桃組織。在篩選試驗(yàn)中甲醇和乙酸乙酯部分皆顯示強(qiáng)的抗氧化活性。通過(guò)硅膠真空液相色譜法進(jìn)一步純化乙酸乙酯部分得到四個(gè)亞部分，用制備性反相HPLC進(jìn)一步將顯示最強(qiáng)的抗氧化活性的亞部分分成七個(gè)部分。附圖2和3顯示由BALATON櫻桃分離出的生物類(lèi)黃酮。因此在酸櫻桃中有許多類(lèi)似的或同系的化合物。
鑒別兩種新的酚類(lèi)化合物為I)1-(3’-4’-二羥基肉桂?；?-2，3-二羥基環(huán)戊烷和II)1-(3’-4’-二羥基肉桂?；?-2，5-二羥基環(huán)戊烷。
由櫻桃水果的乙酸乙酯提取物中分離的并用光譜方法鑒定的其它化合物包括1-(3’-甲氧基，4’-羥基肉桂?；?奎尼酸、2-羥基-3-(2’-羥基苯基)丙酸、2-羥基-3-(2’-羥基苯基)丙酸甲酯、D(+)-蘋(píng)果酸、β-谷甾醇和β-谷甾醇葡萄糖苷。附圖4顯示一些分離得到的酚類(lèi)。也鑒別和完全鑒定由果汁部分獲得的花色素苷成分(Chandra，A.等，J.Agric.Food Chem.411062(1992)；Wang，H.等，J.Agric.Food Chem.452556-2560(1997))；該結(jié)果表明這些化合物具有有效的抗氧化活性。
正如附圖4所示，化合物 可以以一種異構(gòu)體或一種純的形式存在，其中R1和R2選自羥基和氫并且R1和R2之一為羥基。該化合物也可為上述化合物的異構(gòu)體，其中R1為羥基而R2為氫。該化合物的特定異構(gòu)體為1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，5-二醇，可由酸櫻桃中將其分離為一種純化合物。所述化合物也可以是以上化合物的異構(gòu)體，其中R1為氫及R2為羥基。該化合物的特定異構(gòu)體為1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，3-二醇，可由酸櫻桃中將其分離為一種純化合物。
本發(fā)明也涉及一種抑制需要此處理的材料中氧化的方法，該方法包括以抑制所述材料氧化的量，提供給該材料從酸櫻桃中分離的一種化合物或一種異構(gòu)體的混合物，并且以以下結(jié)構(gòu)式的純的形式提供 其中R1和R2選自羥基或氫并且R1和R2之一為羥基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法使用上述化合物的異構(gòu)體，其中R1為羥基而R2為氫。該化合物的特定異構(gòu)體為1-(3’，4’-二羥基肉桂酰基)-環(huán)戊-2，5-二醇，可由酸櫻桃中以一種純化合物形式分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用上述化合物的異構(gòu)體，其中R1為氫而R2為羥基。該化合物的特定異構(gòu)體為1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，3-二醇，可由酸櫻桃中作為一種純化合物形式分離。還有另一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括使用所述異構(gòu)體的混合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含可從酸櫻桃中分離作為一種純化合物的1-(3’，4’-二羥基肉桂酰基)-環(huán)戊-2，3-二醇或它與1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，5-二醇一起作為一種混合物；以及用于該化合物的一種無(wú)毒性的載體或填充劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含可從酸櫻桃中分離作為一種純化合物的1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，5-二醇或它與1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，3-二醇一起作為一種混合物；以及用于該化合物的一種無(wú)毒性的載體或填充劑。所述組合物可以另外含有其它抗氧化劑如加入純化合物中的源于櫻桃的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。另外，在該組合物中使用的載體或填充劑是適于動(dòng)物或人類(lèi)使用的。
所述組合物由本發(fā)明的抗氧化劑和一種特定的、可食用填充劑組成，該填充劑的量為每份發(fā)明物約0.1到30份，當(dāng)導(dǎo)入一種可氧化的材料時(shí)，本發(fā)明的產(chǎn)物抑制該材料的氧化。含有本發(fā)明抗氧化劑的組合物可以制成任何適宜的固態(tài)或液態(tài)劑型并且用作營(yíng)養(yǎng)性/食物增補(bǔ)劑。通常，所選擇的劑型以純化合物、以含有兩種異構(gòu)體的混合物或以與其它抗氧化劑的混合物形式提供1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，5-二醇或1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，3-二醇的日劑量。本發(fā)明以一種組合物、混合物形式或以純化的形式用作一種抗炎劑，或用于治療慢性疾病，用于預(yù)防疾病、改善疾病的影響或刺激免疫反應(yīng)以便更有效地同疾病斗爭(zhēng)。詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明以一種組合物、混合物形式或以純化的形式可用于預(yù)防或治療各種類(lèi)型的疾病，所述疾病可能部分或全部由自由基引起。
正如以上所述，本發(fā)明的組合物可以另外包括一種或多種選自花色素苷、矢車(chē)菊色素、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物的抗氧化劑。優(yōu)選從櫻桃中，尤其BALATON和MONTMORENCY櫻桃中分離花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述花色素苷選自矢車(chē)菊色素-3-2”- 吡喃葡萄糖基-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素 吡喃葡萄糖苷及其混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物類(lèi)黃酮為7-甲氧基-5，8，4’-三羥基黃酮。
含有本發(fā)明抗氧化劑或本發(fā)明化合物的組合物可以加入食品中作為一般的抗氧化食品添加劑。該食品添加劑尤其可以包括作為純化合物或作為包含兩種異構(gòu)體的混合物的1-(3’，4’-二羥基肉桂酰基)-環(huán)戊-2，3-二醇或1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，5-二醇。該食品添加劑可以另外包含其它選自花色素苷、矢車(chē)菊色素、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物的抗氧化劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述花色素苷選自矢車(chē)菊色素-3-2” 吡喃葡萄糖基-6”-o--L-鼠李糖基 D-吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素 吡喃葡萄糖苷及其混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物類(lèi)黃酮為7-甲氧基-5，8，4’-三羥基黃酮。優(yōu)選從櫻桃，尤其BALATON和MONTMORENCY櫻桃中分離花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。含有本發(fā)明抗氧化劑或本發(fā)明化合物的組合物可以是一般的抗氧化食品添加劑，可將該添加劑加入到食品中，所述食品為高水分(潮濕的)或低水分(干燥的)食品、新鮮的或未烹調(diào)的食品、熟化的或烹調(diào)的食品。當(dāng)加入到含有脂質(zhì)的食品中時(shí)，該抗氧化化合物或組合物抑制脂質(zhì)氧化并且因此抑制酸敗的發(fā)展。在烹調(diào)前將該組合物加到食用肉中抑制雜環(huán)芳香胺(HAA)的形成，雜環(huán)芳香胺在烹調(diào)時(shí)產(chǎn)生并且已經(jīng)證實(shí)是致癌的物質(zhì)。
實(shí)施例1和2正如附圖5所示，在一個(gè)工業(yè)用的WARING混合器中將個(gè)體速凍(“IQF”)的櫻桃(該櫻桃已經(jīng)去核)解凍并混合。以10,000rpm離心該混合物并且傾去果汁。用乳酪布進(jìn)一步擠壓殘余物即果肉以便移去額外的果汁。
在15℃凍干所述果肉。在AMBERLITE XAD-16 HP樹(shù)脂上處理果汁產(chǎn)生櫻桃酸性物質(zhì)、花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。用乙醇(1-2L)，然后用水(6L)洗滌1kg所述XAD-16樹(shù)脂。在裝入帶有棉塞的玻璃柱(10ID×90cm長(zhǎng))之前使該XAD-16樹(shù)脂在水中靜置1小時(shí)。在裝入欲分離的果汁之前用水(2L)洗滌該填充柱。每次純化800ml果汁。將果汁加到柱表面上并且使其不流動(dòng)而沉降。然后用水洗脫并且棄去開(kāi)始的1L洗脫液。收集接著的2L洗脫液，因?yàn)槠浜袔嵛兜臋烟夜撍嵛妒且蚱浜性从跈烟业奶O(píng)果酸和糖。然后在BALATON櫻桃果汁的情況下，另外用4L水洗柱而對(duì)于MONTMORENCY櫻桃果汁另外用5 L水洗柱。一旦收集了櫻桃果汁，棄去用水洗脫的其余洗脫液。然后用乙醇(1.3-1.5L)洗脫該柱并收集合有花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的紅色溶液(700-800ml)。然后，在重復(fù)所述過(guò)程多次(超過(guò)100次)之前放干柱子并用10L水洗滌。在真空(20毫托)下蒸發(fā)該紅色醇溶液除去乙醇并且用50ppm的抗壞血酸穩(wěn)定該水溶液并在10℃凍干。收集并儲(chǔ)存該紅色粉末。實(shí)施例1的結(jié)果
實(shí)施例2的結(jié)果
優(yōu)選將實(shí)施例1和2的紅色粉末與作為載體的干燥果肉混合并制片成1到1000mg的包括該載體的片子(一個(gè)成人的日劑量)。
可以將各種食品等級(jí)的酸加入到分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮及酚類(lèi)中以便預(yù)防分解。最好不要加入調(diào)味劑。優(yōu)選抗壞血酸(維生素C)?？梢栽诟稍镌摍烟一衔锴盎蚝蠹尤胨鏊?。
對(duì)于小規(guī)模的處理，可以利用凍干除去水分。對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)，優(yōu)選在一個(gè)空氣循環(huán)烤箱中干燥。
實(shí)施例3正如附圖6所示，提供一個(gè)敞口的容器10，其帶有一根進(jìn)口管線11和一根出口管線12，它們的閥門(mén)分別為13和14。在該敞口的容器10中提供樹(shù)脂珠15。將水引入容器10，然后通過(guò)出口管線12轉(zhuǎn)移并棄去。將如實(shí)施例1中一樣的櫻桃果汁(沒(méi)有果肉或核)引入到容器10中并且讓其停留25分鐘。水和果汁的溫度在約20℃到30℃之間。然后通過(guò)出口管線12轉(zhuǎn)移含有蘋(píng)果酸和糖的櫻桃果汁殘余物并將其保留作為食品調(diào)味劑。然后再用來(lái)自于進(jìn)口管線11的水洗滌容器中的樹(shù)脂15并通過(guò)出口管線12轉(zhuǎn)移并棄去。用通過(guò)進(jìn)口管線11引入的95％乙醇提取在樹(shù)脂顆粒上的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)。從容器10中移去含有花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的乙醇。從花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)中除去乙醇并在氮?dú)庀驴焖俑稍?。然后如?shí)施例1一樣，優(yōu)選將得到的粉末與干燥的櫻桃果肉或其它載體混合。用水洗滌該樹(shù)脂顆粒，然后該樹(shù)脂和乙醇可以循環(huán)多次。
實(shí)施例4在各種條件下，在水溶液中用抗氧化活性的熒光測(cè)定方法試測(cè)源于櫻桃的乙酸乙酯粗提物(含有花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi))。首先描述該熒光測(cè)定方法。
因?yàn)樾枰Y選大量的化合物或提取物的抗氧化活性，所以要求采用一個(gè)模型系統(tǒng)，該模型系統(tǒng)可以適度地表現(xiàn)單獨(dú)的所述組合物或在食物產(chǎn)品中的組合物的結(jié)構(gòu)和功能特征。該試驗(yàn)也必須靈敏、迅速和經(jīng)濟(jì)。使用一種基于熒光的測(cè)定方法評(píng)估抗氧化功效(Arora，A.和G.M.Strasburg，J.Am.Chem.Soc.1996)。制備由1-硬脂?；?2-亞油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸組成的大單室囊泡，該單室囊泡十分類(lèi)似于生物膜的性質(zhì)，而生物膜是過(guò)氧化的主要位點(diǎn)之一。將一種熒光探針即1，6-二苯基己三烯丙酸，加入該膜中以便極性首基固定該探針在水性界面附近，而疏水部分平行于脂肪酸鏈。該探針與過(guò)氧化期間產(chǎn)生的自由基反應(yīng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間降低。用一種過(guò)氧化引發(fā)劑(如亞鐵金屬離子或自由基發(fā)生劑AAPH(氮雜雙-[2-脒基丙烷鹽酸鹽])引發(fā)該反應(yīng)并且在存在或缺乏待測(cè)抗氧化組合物的情況下，測(cè)定熒光降低的動(dòng)力學(xué)。測(cè)定一種給定濃度的化合物目前僅僅需要21分鐘，僅僅消耗幾微克脂質(zhì)并且可以容易地用一個(gè)簡(jiǎn)單的熒光計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
按照MacDonald等描述的方法(MacDonald，R.C.等，Biochim.Biophys.Acta 1061297-303(1991))由1-硬脂?；?2-亞油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸制備大單室囊泡(LUVs)。簡(jiǎn)單地將脂質(zhì)溶解在氯仿中并且使用一個(gè)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器使其干燥成一層薄膜。將干燥的膜重新懸浮在水性緩沖液中并且使用Liposofast脂質(zhì)體擠壓機(jī)(Avestin，Inc.，Ottawa，Canada)將其重復(fù)地?cái)D壓通過(guò)100nm孔徑的聚碳酸酯濾膜。用冷凍-斷裂(freeze-fracture)掃描電子顯微鏡證實(shí)囊泡大小的均一性(80-100nm)和單室性。在制備期間將所述熒光探針二苯基己三烯丙酸(DPH-PA)按照1∶350(探針∶脂質(zhì))的摩爾比率加入到該囊泡中。為了進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)，將含有DPH-PA的LUVs按照100μM的終濃度懸浮在100mM NaCl、pH7.0的50mM tris-HEPES緩沖液中。該熒光探針在384nm被激發(fā)并在423nm監(jiān)測(cè)發(fā)射。由于加入了亞鐵離子或自由基發(fā)生劑AAPH，LUVs中的脂質(zhì)氧化受到抑制；通過(guò)DPH-PA的熒光強(qiáng)度的降低監(jiān)測(cè)該過(guò)程，其熒光強(qiáng)度的降低是由于與經(jīng)21分鐘產(chǎn)生的自由基反應(yīng)所導(dǎo)致的。使用作為時(shí)間函數(shù)的熒光強(qiáng)度降低的曲線測(cè)定脂質(zhì)氧化的動(dòng)力學(xué)。該結(jié)果顯示用乙酸乙酯提取的粗花色素苷在抑制氧化方面是有效的。
可以使用溶劑提取的花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)；可是，由于該產(chǎn)品將作為一種食品并且因?yàn)橘M(fèi)用的原因這并不是優(yōu)選的。當(dāng)使用優(yōu)選的吸附樹(shù)脂時(shí)，這一步是不必要的。也可以用色譜法分離和重組成分；可是，對(duì)于本發(fā)明的目的而言，這就太昂貴了，因?yàn)樗婕案邏阂合嗌V法。
實(shí)施例5用Arora和Strasburg設(shè)計(jì)的方法測(cè)定櫻桃花色素苷的抗氧化活性。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，熒光探針將降解，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的下降。因此，在抗氧化劑存在下，熒光衰變的速度將降低。實(shí)驗(yàn)顯示花色素苷1-3和苷元矢車(chē)菊色素的抗氧化活性與商業(yè)上的抗氧化劑丁基化的羥基茴香醚(BRA)和丁基化的羥基甲苯(BHT)相比更有利(圖7)。這些櫻桃化合物也顯示較α-生育酚更好的抗氧化活性。在2mM濃度下，含有生育酚的樣品的過(guò)氧化程度與未加抗氧化劑的含F(xiàn)e+2樣品的過(guò)氧化程度沒(méi)有差別(圖7)。
花色素苷的苷元矢車(chē)菊色素比它的葡萄糖苷更有效，提示花色素苷的抗氧化活性是歸因于它們的苷元部分?；ㄉ剀?-3分別含有3、2和1個(gè)糖殘基，這解釋了所觀察到的花色素苷1的抗氧化活性最低。在C3位的糖殘基的數(shù)量似乎對(duì)抗氧化活性是十分的重要。在C3位的糖單元的數(shù)量越少抗氧化活性越高。據(jù)報(bào)道芳氧基的穩(wěn)定性影響化合物的抗氧化活性并且可能引起助氧化作用。因此，矢車(chē)菊色素的抗氧化活性可能取決于它的芳氧基的穩(wěn)定性。在花色素苷和矢車(chē)菊色素的B環(huán)上的鄰-二羥基取代對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)生的自由基是重要的，該自由基是通過(guò)3’和4’-OH部分產(chǎn)生的。在花色素苷中的鄰-二羥基也有可能螯合金屬離子并因此防止鐵引起的脂質(zhì)過(guò)氧化。
在矢車(chē)菊色素的制備中，在80℃，用3NHCl(20mL)攪拌含有1-3的花色素苷混合物(500mg)10小時(shí)。與花色素苷的制備一樣，在XAD-4柱上純化該反應(yīng)混合物。蒸發(fā)矢車(chē)菊色素的甲醇溶液至干，得到紅色的非結(jié)晶性粉末(190mg)并且使用前在-30℃儲(chǔ)存。
在抗氧化測(cè)定中，將緩沖液儲(chǔ)存在Chelex 100中以便移去金屬離子。在真空下干燥含有5M1-硬脂酰基-2-亞油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL)和15nM熒光探針3-(對(duì)-(6-苯基)-1，3，5-己三烯基)苯基丙酸(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)的混合物。將產(chǎn)生的薄膜懸浮在500L的緩沖液(NaCl，0.15M；EDTA0.1mM；MOPS 10mM)中并且使其在一個(gè)EtOH-干冰浴中經(jīng)受10次凍-融循環(huán)。然后用Liposofast脂質(zhì)體擠壓機(jī)(Avestin，Inc.，Ottawa，Canada)使懸浮液通過(guò)100nm孔徑的聚碳酸酯膜29次。將產(chǎn)生的脂質(zhì)體(20nM)懸浮在2mL的緩沖液(100mM NaCl，50mM HEPES，pH7.0)中。通過(guò)加入4nM的Fe+2引發(fā)過(guò)氧化。在2-M濃度下測(cè)定花色素苷、BHT、棓酸丙酯和-生育酚(維生素E)。對(duì)照樣品不含F(xiàn)e+2或試驗(yàn)化合物。用SLM4800分光熒光計(jì)(SLM Instruments，Urbana，IL)監(jiān)測(cè)有或沒(méi)有試驗(yàn)化合物，隨后立即加入Fe+2的脂質(zhì)懸浮液的熒光強(qiáng)度21分鐘。通過(guò)以t＝0分鐘的熒光值除以給定時(shí)間點(diǎn)的熒光值來(lái)測(cè)定相對(duì)熒光值。結(jié)果顯示于圖7中。由酸櫻桃中分離的花色素苷(圖1的1-3)和矢車(chē)菊色素在體外呈現(xiàn)可與商業(yè)產(chǎn)品相比的抗氧化活性。在2-mM濃度下，花色素苷1-3及其苷元矢車(chē)菊色素對(duì)脂質(zhì)的過(guò)氧化抑制分別為39、70、75和57％。在2-mM濃度下，1-3和矢車(chē)菊色素的抗氧化活性可與叔丁基氫醌和丁基化羥基甲苯相比并且優(yōu)于維生素E。
實(shí)施例6和7用與實(shí)施例5相同的方法，檢測(cè)如圖2、3和4所示精選的化合物的抗氧化活性。結(jié)果顯示于圖8和9中。對(duì)于實(shí)施例6，下列化合物的抗氧化活性顯示于圖8中化合物1＝柚苷元化合物2＝染料木黃酮化合物3＝綠原酸化合物4＝五羥黃酮3-鼠李糖苷化合物5＝莰非醇3-蕓香糖苷化合物6＝3’-甲氧基莰非醇3-蕓香糖苷化合物7＝染料木黃酮7-葡萄糖苷化合物8＝5，8，4’-三羥基-6，7-二甲氧基黃酮對(duì)于實(shí)施例7，下列化合物的抗氧化活性顯示于圖9中化合物1＝綠原酸甲酯化合物2＝2-羥基-3-(鄰-羥基苯基)-丙酸化合物3＝1-(3’-4’-二羥基肉桂?；?-2，5-二羥基-環(huán)戊烷化合物4＝1-(3’-4’-二羥基肉桂酰基)-2，3-二羥基-環(huán)戊烷在圖9中，將抗氧化化合物1、2、3和4(如圖4所示)與各種抗氧化劑相比較。測(cè)試的抗氧化劑為咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、對(duì)-羥基肉桂酸和商業(yè)上可獲得的抗氧化劑叔丁基氫醌(TBHQ)和丁基化羥基甲苯(BHT)。
采用Fe+2引起的脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定方法檢測(cè)抗氧化活性獲得顯示于圖8和9中的數(shù)據(jù)。為了制備在Fe+2引起的脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定方法中使用的底物，在真空下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥含有5μmol 1-硬脂酰基-2-亞油?；?sn-甘油-3-膽堿磷酸(從Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，Alabama獲得)和0.015μmol的熒光探針3-(對(duì)-(6-苯基)-1，3，5-己三烯基)苯基丙酸(從Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon獲得)的混合物。將產(chǎn)生的脂質(zhì)膜懸浮在1000μL(實(shí)施例6)和500μL(實(shí)施例7)的溶液中，該溶液含有0.15M NaCl、0.1mM EDTA、和0.01M4-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖劑。用CHELEX100(從Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri獲得)以5g/100mL緩沖劑的濃度預(yù)處理MOPS緩沖劑以便除去任何微量的金屬離子。然后，用干冰/乙醇浴使該懸浮液經(jīng)受10次凍-融循環(huán)。然后用Liposofast擠壓機(jī)(Avestin，Inc.，Ottawa，Canada)使脂質(zhì)-緩沖劑懸浮液通過(guò)100nm孔徑的聚碳酸酯膜29次以便產(chǎn)生單室脂質(zhì)體。
為了進(jìn)行Fe+2引起的脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定，用CHELEX100處理的緩沖劑(對(duì)于實(shí)施例6，含有100mM NaCl、50mM N-2-羥基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)緩沖劑(pH7.0)，對(duì)于實(shí)施例7，含有200mMNaCl、100mM HEPES緩沖劑(pH7.0))將20μL等份的上述脂質(zhì)體懸浮液稀釋到2mL，在室溫下溫育5分鐘，隨后在分光熒光計(jì)的恒溫比色杯儲(chǔ)蓄器中保持在23℃溫育另外5分鐘。在缺乏或存在任何試驗(yàn)化合物的情況下，通過(guò)加入20μL0.5 mM的FeCl2使Fe+2終濃度為0.5μM引發(fā)過(guò)氧化。對(duì)照樣品不含有Fe2+或任何試驗(yàn)化合物。用熒光分光熒光計(jì)(從SLM Instruments，Inc.，Urbana，Illinois獲得的SLM4800)以384nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在21分鐘內(nèi)每3分鐘測(cè)量一次這些脂質(zhì)體溶液的熒光強(qiáng)度。相對(duì)熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間降低顯示了過(guò)氧化速度。用以下公式計(jì)算抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的百分率(PI)PI＝{[(Frel)Pl-(Frel)Fe]/[(Fref)c-(Frel)Fe]}×100其中(Frel)Pl為Fe(II)和試驗(yàn)樣品在21分鐘時(shí)段結(jié)束時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，(Fref)c為對(duì)照樣品在21分鐘時(shí)段結(jié)束時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，而(Frel)Fe為含有Fe(II)的樣品在21分鐘時(shí)段結(jié)束時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度(Arora et 41.(1997).J.Amer.Oil Chem.Soc.741031-1040)。
對(duì)于實(shí)施例6，在10μM濃度下測(cè)定化合物1、2、3、4、7和8的抗氧化活性。類(lèi)黃酮對(duì)Fe+2脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用歸因于它們螯合Fe+2形成惰性絡(luò)合物的能力，所述惰性絡(luò)合物不能夠引發(fā)過(guò)氧化(Afanas’ev etal.，1989)。另外，認(rèn)為類(lèi)黃酮的Fe+2絡(luò)合物保留它們的自由基清除活性，因此可以在脂質(zhì)過(guò)氧化中清除自由基中間體。類(lèi)黃酮也可以象自由基清除劑一樣起作用。正如圖8所示，在研究的10μM濃度下，化合物8(5，8，4’-三羥基-6，7-二甲氧基黃酮)的抗氧化活性優(yōu)于1、2、4和7的抗氧化活性。
較早的報(bào)道提示，對(duì)于類(lèi)黃酮有效自由基清除而言，認(rèn)為B環(huán)上鄰-二羥基(Bors等，1990)、C環(huán)3位羥基(Afana’s等，1989；Mora等，1990)及與4-氧代官能基共軛的C2-C3雙鍵(Bors等，1990)的存在是必需的。即使化合物8沒(méi)有3-羥基并且在B環(huán)上只有一個(gè)羥基，化合物8的抗氧化活性也高于五羥黃酮3-鼠李糖苷。五羥黃酮3-鼠李糖苷除了含有一個(gè)3-羥基和與4-氧代官能基共軛的C2-C3雙鍵外，在B環(huán)上含有鄰-二羥基?；衔?抗氧化活性的升高可能是由于該羥基和在A環(huán)上的兩個(gè)甲氧基。Arora等(1997)報(bào)道7，8-二羥基黃酮與五羥黃酮顯示相似的抗氧化活性，雖然它在B環(huán)上和在3位缺少任何取代。
在圖9中，化合物3和4在大單室囊泡中抑制Fe+2引起的脂質(zhì)過(guò)氧化活性在20μM下大約為80％?；衔?顯示大約50％的抑制活性?？墒牵词乖?00μM濃度下測(cè)試，化合物2不顯示抗氧化活性。測(cè)定結(jié)果也顯示與阿魏酸相比對(duì)-羥基肉桂酸是一種弱抗氧化劑。可是，咖啡酸類(lèi)似物，化合物3和4在該測(cè)定中顯示出最高的抗氧化活性。TBHQ和BHT抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的百分率在20μM濃度下＞90％。該測(cè)定顯示咖啡酸是最好的抗氧化劑，隨后是化合物4、化合物3、綠原酸和綠原酸甲酯。
實(shí)施例8測(cè)試實(shí)施例1和2的組合物的抗氧化性質(zhì)并且發(fā)現(xiàn)它們可與實(shí)施例5相比。
抗氧化劑化合物的潛在用途是減少或消除細(xì)胞氧化的損害、清除自由基以減少細(xì)胞死亡、減少動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈硬化、減少心臟病發(fā)作的發(fā)生率、減少與關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)有關(guān)的疼痛的發(fā)病率及減慢衰老。
以上描述僅打算作為本發(fā)明的例證并且本發(fā)明僅受此后附帶的權(quán)利要求書(shū)的限制。
權(quán)利要求
1.一種給活的哺乳動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)性(nutraceutical)或植物性(phytoceutical)益處包括抗氧化益處的方法，該方法包括以提供給所述哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)性或植物性的量，喂給哺乳動(dòng)物一種自櫻桃分離的組合物，所述組合物選自花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人類(lèi)并且以預(yù)制食品的方式提供所述組合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物是干燥的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物是干燥的并且含有食品級(jí)的載體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體為干燥的櫻桃果肉。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物含有一種載體并且組合物與載體的比率在0.1比100和100比0.1之間。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物為液態(tài)。
8.權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)的方法，其中所述組合物是花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物分離自酸櫻桃。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物分離自甜櫻桃。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物分離自MONTMORENCY櫻桃。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物分離自BALATON櫻桃。
13.一種抑制需要此處理的活的生物材料中氧化的方法，該方法包括以抑制所述活的生物材料中氧化的量，提供給該活的生物材料一種選自由櫻桃分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物的組合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述活的生物材料是在喂給所述組合物的人體內(nèi)的。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述活的生物材料是在喂給所述組合物的動(dòng)物體內(nèi)的。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物是干燥的。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物是干燥的并且含有干燥的食品級(jí)載體。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述載體是干燥的櫻桃果肉。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物含有一種載體并且組合物與載體的比率在0.1比100和100比0.1之間。
20.權(quán)利要求13至19中任意一項(xiàng)的方法，其中所述組合物是花色素苷、生物類(lèi)黃酮和酚類(lèi)的混合物。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物分離自酸櫻桃。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物分離自甜櫻桃。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物分離自MONTMORENCY櫻桃。
24.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物分離自BALATON櫻桃。
25.一種抑制活的生物材料中氧化的方法，該方法包括給予該生物材料至少一種分離自櫻桃的化合物以便抑制氧化。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述材料是在喂給作為一種抗氧化劑的所述化合物的活的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述材料是在喂給作為一種抗氧化劑的所述化合物的作為哺乳動(dòng)物的人體內(nèi)的。
28.權(quán)利要求26或27中任意一項(xiàng)的方法，其中以預(yù)制食品的方式將所述化合物喂給該哺乳動(dòng)物。
29.一種給活的哺乳動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)性或植物性益處，包括抗氧化益處的方法，其中所述組合物存在于食品中并且維持食品的良好質(zhì)量，該方法包括a.將分離的花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物加到食品中以便提高食品的質(zhì)量以及貯存期限；和b.以食品的方式喂給哺乳動(dòng)物所述組合物，其中以提供給所述哺乳動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)性或植物性的量，提供食品形式的該組合物。
30.一種可由李屬(Prunus)獲得的并且以下式代表的純的形式的化合物或異構(gòu)體的混合物 其中R1和R2選自羥基和氫并且R1和R2之一為羥基。
31.權(quán)利要求30的化合物，其中R1為羥基而R2為氫。
32.權(quán)利要求30的化合物，其中R1為氫而R2為羥基。
33.權(quán)利要求30的化合物，其中所述化合物可由歐洲甜櫻桃(Prunus avium)、歐洲酸櫻桃(Prunus cerasus)及其混合物獲得。
34.作為一種純化合物由歐洲甜櫻桃、歐洲酸櫻桃或其混合物獲得的1-(3’，4’-二羥基肉桂?；?-環(huán)戊-2，3-二醇。
35.作為一種純化合物由歐洲甜櫻桃、歐洲酸櫻桃或其混合物獲得的1-(3’，4’-二羥基肉桂酰基)-環(huán)戊-2，5-二醇。
36.權(quán)利要求30到35中任意一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物還與無(wú)毒的載體混合。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中所述無(wú)毒的載體是適于人類(lèi)使用的。
38.權(quán)利要求30到37中任意一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物與一種或多種選自花色素苷、矢車(chē)菊色素、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)及其混合物的抗氧化劑混合。
39.權(quán)利要求37的化合物，其中所述花色素苷來(lái)自矢車(chē)菊色素-3-2”-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6”-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-6”-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、矢車(chē)菊色素-3-β-D-吡喃葡萄糖苷及其混合物。
40.權(quán)利要求37的化合物，其中所述生物類(lèi)黃酮為7-甲氧基-5，8，4’-三羥基黃酮。
41.在抑制氧化的方法中使用的、如權(quán)利要求30到39中任意一項(xiàng)所定義的化合物。
42.在抑制炎癥的方法中使用的、如權(quán)利要求30到39中任意一項(xiàng)所定義的化合物。
43.作為食物增補(bǔ)劑使用的、如權(quán)利要求30到39中任意一項(xiàng)所定義的化合物。
44.使用至少一種由櫻桃獲得的化合物來(lái)預(yù)防在活組織中的氧化。
45.使用至少一種由櫻桃獲得的花色素苷、生物類(lèi)黃酮或酚類(lèi)化合物來(lái)預(yù)防在活組織中的氧化。
全文摘要
描述了用櫻桃衍生物給哺乳動(dòng)物特別是人提供營(yíng)養(yǎng)性或植物性益處的方法。也描述了抑制活的生物材料中氧化的方法。在所述方法中使用源于櫻桃的花色素苷、生物類(lèi)黃酮、酚類(lèi)或它們的混合物的組合物。
文檔編號(hào)C07C69/732GK1334740SQ99816054
公開(kāi)日2002年2月6日 申請(qǐng)日期1999年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月11日
發(fā)明者M·G·奈爾, H·王, G·M·斯特拉斯布格, A·M·布雷恩, J·I·格雷 申請(qǐng)人:密執(zhí)安州大學(xué)