專利名稱：單一聚合度的古羅糖醛酸的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機聚合物，特別是涉及一種具有抗腫瘤活性的單一聚合度的古羅糖醛酸。
在一日本文獻(Preparation of two series of oligo-guluronic acids fromsodium alginate by acid hydrolysis and enzymatic degradation；Shimokawa-T；Yoshida-s；Takeuchi-T；Murata-K；Ishii-T；Kusakabe-I BioscienceBiotechnology and Biochemistry 60(9)1532-1534 1996)中公開了一種用鮑魚丙酮粉提取物制備古羅糖醛酸的方法，該鮑魚丙酮粉提取物中含有古羅糖醛酸裂合酶。這是一種應(yīng)用酸水解和酶解制備聚合度2～7的寡聚古羅糖醛酸的方法，其制備分離效果不佳。
本發(fā)明的目的是提供一種分離效果好的單一聚合度的古羅糖醛酸的制備方法，并且該產(chǎn)品具有抗腫瘤活性，可用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
一種單一聚合度的古羅糖醛酸的制備方法，包括使褐藻酸鈉溶于水，加入褐藻膠裂合酶進行反應(yīng)，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質(zhì)，將溶液調(diào)pH產(chǎn)生沉淀，離心除去上清液，沉淀物用堿溶液溶解并調(diào)pH到中性，加入乙醇產(chǎn)生沉淀，干燥后得到各單一聚合度的古羅糖醛酸混合物，再用離子交換色譜柱進行分離，將古羅糖醛酸混合物用洗脫液洗脫，分步收集洗脫液組分，分別加入乙醇進行沉淀，脫鹽后凍干，其特征是所述的將溶液調(diào)pH的范圍為2.5～3.2，所述的洗脫液為醋酸鈉的梯度洗脫液，所用的褐藻膠裂合酶是由弧菌產(chǎn)生的。
一種單一聚合度的古羅糖醛酸，其特征是具有抗腫瘤活性，用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的制備方法分離效率高，制出的各種單一聚合度的古羅糖醛酸具有不同程度的抗腫瘤活性，可用于開發(fā)成抗腫瘤藥物。
下面通過實施例說明本發(fā)明。
取5g褐藻酸鈉溶于100ml水，加入5單位(褐藻膠裂合酶的酶活力單位為每min使0.2％的褐藻膠溶液吸光度增加1所需的酶量為一個酶活單位。)由弧菌產(chǎn)生的褐藻膠裂合酶液，該酶的生產(chǎn)方法已在00111178.7號在先申請中敘述過了。在28℃下反應(yīng)，直到230nm吸光值不再變化，然后沸水浴加熱使酶失活，冷卻后離心去雜質(zhì)，將上清液調(diào)pH2.85，離心去掉上清液，沉淀用4mol/L的NaOH溶液調(diào)pH到7，加入乙醇使產(chǎn)品沉淀，干燥后得到不同聚合度的古羅糖醛酸混合物。用Q-sepharose fast flow陰離子交換色譜柱分離各單一聚合度的古羅糖醛酸。色譜柱先用0.1mol/L pH7.5的醋酸鈉緩沖液起始洗脫液平衡好，再將lg上述制備的古羅糖醛酸溶于起始緩沖液上色譜柱，用0.1～1的醋酸鈉梯度洗脫液洗脫，用230nm的紫外檢測器檢測洗脫下來的古羅糖醛酸含量，分步收集各洗脫組分，脫鹽后分別加入乙醇沉淀出古羅糖醛酸，干燥后得到2～12不同聚合度的古羅糖醛酸。
采用本方法可以制備出聚合度為2～12的古羅糖醛酸。這些寡糖用高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography HPAEC)檢測為單峰，說明為單一聚合度。
用噻唑藍(lán)(TTM)實驗方法測定了用本發(fā)明的方法制備的單一聚合度的古羅糖醛酸的抗腫瘤活性。實驗時將癌細(xì)胞以10％小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基配成104個/ml懸液，于37℃，5％CO2，100μl/孔(96孔板)撫育24h，各組對應(yīng)加古羅糖醛酸中的二糖和三糖，使其濃度分別為1，10，100ug/ml，空白組對應(yīng)加培養(yǎng)基，每組5個平行孔，培養(yǎng)24h后加入5mg/ml的TTM 20ul，培養(yǎng)4h，去上清液加150ul二甲基亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀測定570nm，(630nm為設(shè)定波長)吸光值。所用的癌細(xì)胞株為Ovcar-3人卵巢癌細(xì)胞。用此方法測得二聚古羅糖醛酸3個劑量組的抑瘤率分別為27.36％，39.45％，35.55％，三聚古羅糖醛酸3個劑量組的抑瘤率分別為55.34％，58.10％，32.81％。
權(quán)利要求
1.一種單一聚合度的古羅糖醛酸的制備方法，包括使褐藻酸鈉溶于水，加入褐藻膠裂合酶進行反應(yīng)，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質(zhì)，將溶液調(diào)pH，離心除去上清液，沉淀物用堿液溶解并調(diào)到pH值中性，加入乙醇使產(chǎn)品沉淀，干燥后用離子交換色譜分離各單一聚合度的古羅糖醛酸混合物，將古羅糖醛酸混合物用洗脫液洗脫，分步收集洗脫液組分，分別加入乙醇進行沉淀，脫鹽后凍干，其特征是所述的將溶液調(diào)pH范圍為2.5～3.2，所述的洗脫液為醋酸鈉的梯度洗脫液，所述的酶是由弧菌產(chǎn)生的專一性褐藻膠裂合酶。
2. 一種單一聚合度的古羅糖醛酸，其特征是具有抗腫瘤活性，用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的古羅糖醛酸的單一聚合度分別為2～12。
全文摘要
一種單一聚合度的古羅糖醛酸的制備方法,包括使褐藻酸鈉溶于水,加入褐藻膠裂合酶進行反應(yīng),用沸水浴加熱使酶失活,離心后除去沉淀雜質(zhì),將溶液調(diào)pH,離心除去上清液,沉淀物用堿液溶解并調(diào)到pH值中性,加入乙醇使產(chǎn)品沉淀,干燥后用離子交換色譜分離各單一聚合度的古羅糖醛酸混合物,用醋酸鈉的梯洗脫液洗脫,所述的將溶液調(diào)pH范圍為2.5～3.2,所述的酶是由弧菌產(chǎn)生的專一性褐藻膠裂合酶。本產(chǎn)品具有抗腫瘤活性,用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
文檔編號C08B37/00GK1341602SQ0011136
公開日2002年3月27日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月7日
發(fā)明者管華詩, 劉巖, 江曉路 申請人:青島海洋大學(xué)