專利名稱：石蓮花多糖的制作方法
石蓮花(Echevaria glsuca)是一種野生或人工栽培的肉質(zhì)景天科常綠植物，最先發(fā)現(xiàn)其提取的混合組分具有高效降血糖功能(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?7100285.1)。經(jīng)長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究與臨床發(fā)現(xiàn)，其有效組分中富含多糖，即石蓮花多糖(Echevaria glaucapolysaccharides)，簡(jiǎn)稱EGP，現(xiàn)就EGP的提取分離，純化和保肝以及抗動(dòng)脈硬化(降血脂的功能)，人群實(shí)驗(yàn)降低體脂肪(減肥)的效果，闡述如下1、EGP的提取方法現(xiàn)將石蓮花的根、莖、葉乃至全株或從石蓮花原粉(按中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?7100285.1方法提取)中分別用不同的方法提取石蓮花多糖(EGP)。1.1實(shí)施例1取洗凈的鮮石蓮花全株1kg，粉碎后，用石油醚(30-60)回流脫脂2h，殘?jiān)糜?升無離子水，煮沸0.5h，過濾，殘?jiān)^續(xù)重復(fù)上述操作3次，合并4次濾液，濃縮至小體積，加氯仿(A、R)至分層，沉淀?xiàng)壍鞍祝蠈尤芤簼饪s至小體積，加無水酒精濃度調(diào)至95％，沉淀EGP，過濾，沉淀干燥。粗EGP產(chǎn)量2.196g，收率2％。(見附

圖1-1)。1.2實(shí)施例2取石蓮花原粉200g溶于2升無離子水，加熱煮沸5分鐘，過濾，濾液濃縮至小體積，再用3％的三氯乙酸(V/V)沉淀蛋白，靜置后離心，以200mol/L NaoH中和后，透析，濃縮，加放3倍體積乙醇，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，干燥，得到粗石蓮花多糖(EGP)19.6g，為灰棕色粉末。取10g粗EGP溶于100ml無離子水中，進(jìn)行DEAE-Cellulose柱層析(CI型，90cm×3.0cm)先用水洗脫，再以0.2mol/L NaCL梯度洗脫，水洗脫部分得到3.5g，NaCL洗脫部分得到6.02g，將9.52gEGP再經(jīng)Sepharose 4B柱層析(50cm×2.0cm)，用0.05mol/L Nacl洗脫，得到純化的EGP占98g，產(chǎn)率為69.8％。1.3實(shí)施例3取60g石蓮花原粉，加入無離子水100ml，加熱煮沸10分鐘，冷卻，過濾，保留，濾渣，重復(fù)上述操作2次，合并3次濾液濃縮至一定體積用酒精調(diào)至70％，沉淀蛋白、蛋白多糖、多糖，過濾，濾液再調(diào)至95％的酒精濃度，沉淀粗多糖，過濾，合并沉淀，烤干，得2.196gEGP，收率為10％。(見附圖1-2)1.4實(shí)施例4
為了日常保健和用藥劑量的方便，現(xiàn)按實(shí)施例1-3內(nèi)容中收率關(guān)系，鮮石蓮花、干石蓮花、石蓮花原粉、粗EGP、EGP重量關(guān)系對(duì)照表匯總于后(見表1-1)表1-1 不同季節(jié)采摘時(shí)，其含水量不同，這里的重量取平均值。1.5實(shí)施例5取實(shí)施例3提取的粗EGP7mg配以43mg褐藻酸鈉和150mg螺旋藻粉制粒后壓片(200mg/片)或灌裝膠囊(200mg/粒)，每日3片或3粒膠囊作為人群實(shí)驗(yàn)藥品使用。2、EGP的抗肝炎功能1.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1動(dòng)物昆明小鼠(體重18-22g)北京大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑四氯化碳(A、R)、市售純香油，配成5％四氯化碳的香油溶液。2.1.3試驗(yàn)灌胃樣品取1粗EGP、EGP各50mg分別加100ml蒸餾水，濃度均為0.5mg/ml，每只小鼠灌胃(PO)0.15mg/0.3ml/日，共灌胃9天。2.2方法與結(jié)果2.2.1對(duì)四氯化碳所致的小鼠GPT升高的保護(hù)作用將小鼠隨機(jī)分組，對(duì)照組給蒸餾水，四氯化碳組和實(shí)驗(yàn)組分高低劑量給3實(shí)驗(yàn)第3、6、9天注射(ip)5％四氯化碳香油溶液，灌胃9天，第10天斷頭取血，以常規(guī)方法測(cè)定谷一丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)。2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2-1所示表2-1
*與5％CCL4組比較從表2-1中可見，CCL4組與對(duì)照組比較升高133％，而PO給予粗EGP(64×9、32×9mg/kg×d)加5％CCL4與對(duì)照組比較，GPT分別僅升高56％和68％，表明EGP能明顯對(duì)抗由CCL4引起的肝炎，起到消炎保肝作用。3、EGP抗動(dòng)脈硬化(降血脂)功能本發(fā)明的EGP可明顯降低高脂血癥大鼠血清游離膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、β-脂蛋白含量，降低高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇含量，并可防止高膽固醇引起的小鼠高膽固醇血癥的形成。高脂血癥作為動(dòng)脈硬化、冠心病的危險(xiǎn)因素之一。也是作為衡量動(dòng)脈硬化的標(biāo)準(zhǔn)。3.1材料與方法3.1.1動(dòng)物 昆明種小鼠，體重18~25g，北京大學(xué)動(dòng)物學(xué)部，雄性。高膽固醇小鼠模型的形成用常規(guī)方法。Wistar大鼠，雌雄兼有，體重200~250g。高脂血癥大鼠喂以高膽固醇飼料(配方4％膽固醇、10％豬油、0.2％甲基硫氧嘧啶及89％基礎(chǔ)飼料)。3.1.2藥品與試劑粗EGP及其精品由北京泰達(dá)士經(jīng)貿(mào)公司生物化學(xué)所提供。洋地黃皂甙(杭州第一制藥廠)。肝素、高碘酸鈉、4-甲基硫化尿嘧啶均為分析純，膽固醇(Merck)公司。3.1.3儀器721型分光光度計(jì)3.1.4方法用乙醇提取、高鐵-硫酸顯色法測(cè)定血清總膽固醇(TC)含量。用洋地黃皂甙沉淀法測(cè)定血清游離膽固醇(FreeCh)及膽固醇(chE)。用正庚烷—異內(nèi)醇混合液提取法測(cè)定血清甘油三酯(TG)。用肝素—錳比濁法測(cè)定血清β脂蛋白(β-Lp)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1粗EGP與EGP對(duì)高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇含量的影響3.2.1.1 EGP降血脂作用的時(shí)效關(guān)系取健康雄性小鼠52只，隨機(jī)分成5組，1組為正常對(duì)照組，其余4組在禁食16h后，每鼠一次靜脈注射75％蛋黃乳劑0.5ml，以形成高膽固醇血癥，其中1組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。另外3組為給藥組，在給蛋黃乳劑后第13，16，19h分別注射EGP 10mg/kg，高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在乳劑注射后第20h，由眶靜脈取血，3組給藥組分別在注射后1，4，7h取血，然后測(cè)定血清TC。如表3-1所示，粗EGP后1h，血清TC已有所降低，4h降TC作用最強(qiáng)，7h作用已減弱。
表3-1 EGP對(duì)小鼠血清TG降血脂作用的時(shí)效關(guān)系
1)P＞0.052)P＜0.05與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較3.2.1.2 EGP降血脂作用的量效關(guān)系3.2.1.2.1對(duì)高膽固醇血癥小鼠的治療作用取健康小鼠47只，隨機(jī)分成5組，1組為正常對(duì)照組，1組為高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，其余3組為給藥組。禁食16h后靜脈注射75％蛋黃乳劑0.5ml/只，16h后高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)對(duì)照組靜脈注射生理鹽水，每只0.5ml，給藥組注射EGP，劑量組注射分別為3，6，10mg/kg。注射后4h，自眶靜脈取血，測(cè)血清TC。結(jié)果(見表3-2)表明EGP需較大劑量(10mg/kg)方可對(duì)抗已形成的高膽固醇血癥。
表3-2 EGP對(duì)小鼠血清TC降血脂作用的量效關(guān)系(x±SD)
1)P＞0.053)P＜0.01與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較3.2.1.2.2對(duì)高膽固醇血癥形成的預(yù)防作用取健康小鼠72只，隨機(jī)分成9組，1組高膽固醇血癥組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，1組為正常對(duì)照組，4組EGP組，3組粗EGP組，計(jì)9組，每組8只，禁食4h后，高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)對(duì)照注射生理鹽水0.5ml/只，給EGP藥組注射劑量分別為6，10，14，18mg/kg，給粗EGP注射組劑量分別為6，10，14mg/kg，注射后2h，給藥組及高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)對(duì)照組靜脈注射75％蛋黃乳劑0.5ml/只，20h后自眶靜脈取血，測(cè)定血清TC。表3-3指出小劑量的EGP、粗EGP即可對(duì)抗高膽固醇血癥的形成，其作用強(qiáng)度EGP＞粗EGP。
表3-3 EGP、粗EGP對(duì)小鼠高膽固醇血癥形成的預(yù)防作用
1)P＞0.052)P＜0.053)P＜0.01與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較3.2.2 EGP、粗EGP對(duì)正常小鼠血清膽固醇含量的影響取健康小鼠31只，隨機(jī)分成3組，禁食12h后，1組為對(duì)照組，其余3組分別注射EGP、粗EGP各10mg/kg，注射后4h自眶靜脈取血，測(cè)定血清TC。結(jié)果(見表3-4)表明10mg/kg EGP、粗EGP均不降低正常小鼠血清TC。
表3-4 EGP與粗EGP對(duì)小鼠血清TC含量的影響(x±SD)
1)P＞0.05 與正常對(duì)照組比較3.2.3 EGP、粗EGP對(duì)高血脂癥大鼠血脂含量的影響取健康大鼠43只，隨機(jī)分成4組。1組正常對(duì)照組，1組高脂血癥對(duì)照組(HI)，其余2組為給藥組。正常對(duì)照組及高脂血癥對(duì)照組每天上午注射生理鹽水0.6ml/只，其余各給藥組注射劑量分別為EGP 20mg/kg、粗EGP 30mg/kg，下午除對(duì)照組外，均用高脂肪膽固醇飼料飼養(yǎng)，連續(xù)8d。第9天禁食12h后，心臟穿刺取血。測(cè)TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp。表3-5表明EGP、粗EGP使進(jìn)食高脂肪膽固醇飼料大鼠血清中TC、Free Ch、ChE、TG、β-Lp含量明顯降低。表3-5 EGP、粗EGP對(duì)高血脂癥大鼠血清TC、Free Ch、ChE、TG和β-Lp含量的影響(x±SD)
1)P＞0.052)P＜0.053)P＜0.01與III對(duì)照組比較3.4 附圖簡(jiǎn)要說明圖1是從鮮石蓮花生產(chǎn)其粗多糖的工藝流程圖2是從石蓮花原粉生產(chǎn)其粗多糖的工藝流程圖3是人群實(shí)驗(yàn)組體脂肪分布4是血糖值與GOT、GPT、γ-GTP關(guān)系5是從體脂肪下降觀察服用EGP的效果圖6是從體脂肪觀察服用EGP降GOT的效果圖7是從體脂肪觀察服用EGP降GPT的效果圖8是從體脂肪觀察服用EGP降γ-GTP的效果圖9是從飲酒量水平觀察服用EGP降γ-GTP的效果圖10是人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象每周飲酒水平分布11是人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象的動(dòng)脈硬化分布12是從動(dòng)脈硬化癥觀察服用EGP降體脂肪的效果圖13是從動(dòng)脈硬化觀察服用EGP降低γ-GTP的效果圖14是從動(dòng)脈硬化觀察服用EGP降低TC的效果3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論根據(jù)損傷反應(yīng)學(xué)說，動(dòng)脈硬化首先是高血脂使動(dòng)脈內(nèi)膜受到損傷而引起。動(dòng)脈硬化癥的發(fā)生和發(fā)展，隨血脂含量的增加而危險(xiǎn)性增大，血清中的TC、β-Lp和TG是冠心病的促進(jìn)因子。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，EGP、粗EGP可有效地阻止小鼠實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥的形成，并且可使進(jìn)食高脂飼料大鼠血清TC、Tree Ch、ChE、TG、β-Lp含量較對(duì)照組明顯降低，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了EGP有肯定抗動(dòng)脈硬化、降血脂效果。4、EGP人群保肝、抗動(dòng)脈硬化、降體脂肪的減肥實(shí)驗(yàn)4.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法4.1.1人群實(shí)驗(yàn)組其對(duì)象為40歲至60歲(平均年齡52歲)的健康成人男性42名，女性2名，共44例。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢查肝功能與體脂肪每天飯前或飯后服用1片，EGP 3個(gè)月，每日3片，每月醫(yī)生問診1次，見表4-1指標(biāo)檢驗(yàn)生化指標(biāo)。谷氨酸草酰酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酸(GPT)、烏苷三磷酸酶(γ-GTP)和體脂肪。在服用EGP片前后比較上述肝功能與體脂肪的變化。
表4-1 服用EGP前后人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象的生化指標(biāo)變化一覽表 4.1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)肝功能(GOT、GPT、γ-GTP)指標(biāo)除正常外，均為異常，體脂肪除正常外，對(duì)瘦身、輕度肥胖、肥胖、超肥胖均屬超標(biāo)。4.1.4生化指標(biāo)處理方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05具有顯著意義。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1服用EGP前的狀況4.2.1.1人群實(shí)驗(yàn)組的具體對(duì)象的體脂肪為瘦身型占16％；正常型占18％；輕度肥胖型占43％；肥胖型占14％；超肥胖型占9％；肥胖型居多。見圖3。4.2.1. 2生化指標(biāo)主要是指肝功能與體脂肪值正常、異常。見表4-1。4.2.2服用EGP后的狀況4.2.2.1從血糖值變化觀察其效果從圖4血糖值跟GOT、GPT、γ-GTP的關(guān)系可見，高血糖組和正常血糖組隨著GOT、GPT、γ-GTP的降低而降低。4.2.2.2從體脂肪值的變化觀察服用EGP的效果現(xiàn)將肥胖、超肥胖(體脂肪在30％以上)組、輕度肥胖組(體脂肪在25％-29％)、正常和瘦身型組(體脂肪在24％以下)分成3個(gè)組，觀察體脂肪、GOT、GPT、γ-GTP的變化。4.2.2.2.1、3個(gè)組體脂肪值都下降，但在肥胖度亢進(jìn)時(shí)下降的幅度有增大的傾向，從體脂肪下降觀察服用EGP的效果(見圖5)。4.2.2.2.2、對(duì)GOT來說，輕度肥胖組可見變化略有上升，其它組都降低、以肥胖、超肥胖組降低幅度最大，從體脂肪下降觀察服用EGP降GOT的效果(見圖6)。4.2.2.2.3、GPT 3組都降低，但降低幅度從大到小依次為肥胖、超肥胖組、正常與瘦身型組、輕度肥胖型組，從體脂肪觀察服用EGP降GPT的效果(見圖7)。4.2.2.2.4、對(duì)γ-GTP來說3組都下降，但降低幅度從大到小依次排列如下肥胖、超肥胖型組、正常與瘦身型組，輕度肥胖組，從體脂肪觀察服用EGP降γ-GTP的效果(見圖8)。
體脂肪降低幅度大的組(相對(duì)值降低在10％以上)，同樣可觀察到GOT、GPT、γ-GTP的變化，對(duì)肥胖、超肥胖組下降的傾向幾乎是相同的，尤其是γ-GTP數(shù)值大幅度降低。見圖6、7、8所示。4.2.2.3從飲酒量水平觀察服用EGP的效果4.2.2.3.1、普通飲酒組每周飲10小瓶以下(二鍋頭白酒180ml/小瓶)的人群。4.2.2.3.2、多飲酒組每周超過10小瓶的飲酒人群(見圖9，從飲酒量水平觀察服用EGP降γ-GTP的效果)。
從服用EGP片的前后γ-GTP值的變化如圖9可見，每周喝10小瓶以下的普通飲酒組的γ-GTP的平均值服用前60.4，而服用后γ-GTP下降至56.4。而每周喝10小瓶以上的多飲酒組，服用前γ-GTP平均值為208.5，服用后降至138.9，這就證明EGP片顯著地改善了肝功能。4.2.2.3.3、飲酒人群分布圖(見圖10，人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象每周飲酒水平分布圖)。4.2.2.4從動(dòng)脈硬化觀察服用EGP的效果見表4-1，從動(dòng)脈硬化觀察EGP雙向調(diào)節(jié)血糖的效果(見圖11，人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象動(dòng)脈硬化分布圖)，將人群實(shí)驗(yàn)對(duì)象動(dòng)脈硬化分成無、有傾向、有、亢進(jìn)四個(gè)組、動(dòng)脈硬化與血糖值、體脂肪、γ-GTP、TC乃至TG有關(guān)。4.2.2.4.1血糖值隨動(dòng)脈硬化變化的狀況無、有傾向、有動(dòng)脈硬化3個(gè)組降低可見，尤以有動(dòng)脈硬化組、統(tǒng)計(jì)值P＜0.05具有顯著意義。從動(dòng)脈硬化與亢進(jìn)組可見，血糖值反而升高(見圖12，從動(dòng)脈硬化癥觀察服用EGP降血糖的效果)。4.2.2.4.2體脂肪隨無動(dòng)脈硬化、有動(dòng)脈硬化傾向，有動(dòng)脈硬化3組變化而大幅降低，其P＜0.05。動(dòng)脈硬化亢進(jìn)組未見體脂肪變化反而上升。(見圖13，從動(dòng)脈硬化癥觀察服用EGP服用降體脂肪的效果)。4.2.2.4.3觀察無動(dòng)脈硬化、有動(dòng)脈硬化傾向、有動(dòng)脈硬化以及亢進(jìn)等4組降低γ-GTP、特別對(duì)有動(dòng)脈硬化具有顯著的意義，其P＜0.05，(見圖14，從動(dòng)脈硬化觀察服用EGP降低γ-GTP的效果)。4.2.2.4從TC來看，對(duì)無動(dòng)脈硬化、有動(dòng)脈硬化傾向、有動(dòng)脈硬化及亢進(jìn)4組具有對(duì)抗傾向，尤其有動(dòng)脈硬化具有顯著的意義P＜0.05，(見圖15，從動(dòng)脈硬化觀察服用可見EGP降TC的效果)。4.3結(jié)果討論綜上所述，隨著體脂肪降低，糖耐量趨于正常化，同時(shí)改善了胰島素的感受性，由于降低了肝功能GOT、GPT、γ-GTP的指標(biāo)，使肝功能轉(zhuǎn)為正常，服用EGP片后血糖值、肝功能、動(dòng)脈硬化、體脂肪均有明顯的改善，因此EGP具有預(yù)防內(nèi)臟胖肥、動(dòng)脈硬化、脂肪肝的效果。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種新近發(fā)現(xiàn)的石蓮花多糖(EGP)的最新功效，主要具有保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化，減肥等功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，從提取液中沉淀的石蓮花多糖(EGP)其中含蛋白多糖，將沉淀多糖的酒精濃度調(diào)為70-95％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，加熱煮沸溫度90-100℃，不低于90℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3述，加熱煮沸不僅起破壞細(xì)胞壁的作用，而且還可增大EGP或蛋白多糖的溶解度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，EGP與粗EGP(均含量蛋白多糖)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中它們之間無顯著差異。
6.本發(fā)明的EGP或粗EGP均具有保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、減肥(減體脂肪)攻效，均具有非常顯著的意義，其P＜0.01。
7.本發(fā)明，對(duì)食品、保健食品以及藥品臨床推薦EGP在7～30mg/日。
全文摘要
本發(fā)明涉及保健食品、醫(yī)藥品領(lǐng)域的功能型食品或藥品,還涉及到石蓮花多糖(EGP)的提取、分離、純化的操作技術(shù),EGP不僅具有原始石蓮花提取物的降血糖功效,而且本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了經(jīng)提取分離或純化的EGP都具有保肝、抗動(dòng)脈硬化、減肥等功效。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1355254SQ0013366
公開日2002年6月26日 申請(qǐng)日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者丁慶 申請(qǐng)人:丁慶