專利名稱：聚羥基鏈烷酸酯,及其制備方法和微生物在其制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到制備新的聚羥基鏈烷酸酯(PHA)，例如，PHA的制備方法，以及微生物在其制備中的應(yīng)用。
長期以來，來自石油的合成聚合物用作塑料塑料等材料。最近，廢舊塑料的處理已成為一個嚴(yán)重的社會問題。這些合成的聚合物在用以代替金屬或玻璃材料時，有難以分解的優(yōu)點(diǎn)。然而，在大量的消耗和大量廢棄方面，對于廢物處理，這種難分解的特點(diǎn)使它們很容易積累，或當(dāng)燃燒它們時，可以增加二氧化碳的排出，和有毒物質(zhì)的生成，例如生成二噁英和內(nèi)分泌-破壞劑(endocrine-disruptor)，引起環(huán)境污染。在另一方面，使用微生物(下文稱為“微生物聚酯”)制備的聚羥基鏈烷酸酯類(PHAs)，以聚3-羥基丁酸(PHB)為代表，可以作為常規(guī)塑料用熔融工藝等做成各種類型的產(chǎn)物，而且，不象合成聚合物那樣，它可以用有機(jī)物分解。因此，微生物聚酯是可生物分解的，并且在報廢后可以與天然產(chǎn)物合在一起循環(huán)，不會象很多平常的合成聚合物那樣留在自然環(huán)境中引起污染。而且，因?yàn)槲⑸锞埘ゲ恍枰褵ば颍鼈冞€對空氣污染和全球變暖的防護(hù)很有效。這樣，它們可用作能夠使環(huán)境完善的塑料。另外，該微生物聚酯還可以用作醫(yī)用軟薄膜(日本專利申請延遲公開第5-159，日本專利申請延遲公開第6-169980，日本專利申請延遲公開第6-169988，日本專利申請延遲公開第6-225921等等)。
在此以前，已經(jīng)報告過各種細(xì)菌在細(xì)胞中生產(chǎn)和積累PHB或其它羥基鏈烷酸共聚物(“生物降解塑料手冊”，生物降解塑料學(xué)會出版，NTS股份有限公司發(fā)行，P178-197，(1995))。眾所周知，這種微生物PHAs可以根據(jù)生產(chǎn)它的微生物類型，培養(yǎng)基的成分，培養(yǎng)條件等等的不同，有各種不同的組成和結(jié)構(gòu)，直到最近，還在進(jìn)行關(guān)于控制其成分和結(jié)構(gòu)以改進(jìn)PHA的性質(zhì)的研究。
例如，據(jù)報導(dǎo)，真養(yǎng)產(chǎn)堿菌H16(ATCC 17699號)和它的突變體菌株，根據(jù)培養(yǎng)基碳源成分的不同比例，生產(chǎn)出3-羥基丁酸(3HB)和3-羥基戊酸(3HV)的共聚物(日本專利公布號6-15604，日本專利公布號7-14352，日布號8-19227等)。
日本專利申請延遲公開5-74492揭示了一種用甲基細(xì)菌屬，副球菌屬，產(chǎn)堿菌屬或菊苣假單胞菌接觸含有3到7個碳原子的伯醇生產(chǎn)3HB和3HV的共聚物的方法。
日本專利申請延遲公開5-93049和日本專利申請延遲公開7-26506揭示了用油酸或橄欖油作為碳源培養(yǎng)豚鼠氣單胞菌制備出3HB和3-羥基己酸(3HHx)二組分共聚物。
日本專利申請延遲公開9-191893揭示，在葡萄糖酸和1，4-丁二醇作為碳源的培養(yǎng)基中，食酸叢毛單胞菌IFO 13852生產(chǎn)出含有3HB和4-羥基丁酸單體單元的聚酯。
還有，近年來，關(guān)于具有至多含有12個碳原子的中等鏈長(簡寫為mcl)的3-羥基鏈烷酸酯(3HA)組成的PHA的研究很活躍。合成的途徑可以簡單地分成二類，其特別的例子示于下面的(1)和(2)中。
(1)用β-氧化的合成日本專利號2642937揭示，含有6到12個碳原子的3-羥基鏈烷酸酯單體單元的PHA可以用脂肪族烴作為碳源提供的食油假單胞菌ATCC 29347制備。此外，在“應(yīng)用環(huán)保微生物”雜志，58(2)，746(1992)也報告，食樹脂假單胞菌生產(chǎn)具有3-羥基丁酸，3-羥基己酸，3-羥基辛酸和3-羥基癸酸，其單體單元比例為1∶15∶75∶9的聚酯，用辛酸作為單一的碳源，并且還生產(chǎn)出具有3-羥基丁酸，3-羥基己酸，3-羥基辛酸和3-羥基癸酸(質(zhì)量比為8∶62∶23∶7)作為單元的聚酯，用己酸作為單一碳源。在這里，假定3HA單體單元的鏈長長于起始的脂肪酸，使用脂肪酸合成的途徑將在下面(2)中敘述。
(2)用脂肪酸合成途徑的合成這是在生物高分子雜志，16(3)，119(1994)報告的，用菊苣假單胞菌61-3菌株生產(chǎn)了由3-羥基鏈烷酸組成的聚酯，例如，3-羥基丁酸，3-羥基己酸，3-羥基辛酸，3-羥基癸酸和3-羥基十二烷酸和3-羥基鏈烯酸，例如3-羥基-5-順-壬烯二酸，3-羥基-5-順-十二烯酸，用葡萄糖酸鈉作為單一碳源。
用這種方法，PHA的生物合成通常是由用作為培養(yǎng)基的“D-3-羥酰CoA”在細(xì)胞中產(chǎn)生的各種不同代謝途徑的中間體完成的。
在這里，“CoA”的意思是“輔酶A”。而且，正如上述(1)早先的工藝所描述的，PHA的生物合成是由在“β-氧化循環(huán)”中產(chǎn)生的“D-3-羥酰輔酶A”進(jìn)行的，在這種情況下，起始物質(zhì)是脂肪酸，例如將辛酸和壬酸用作碳源。
用這種“β-氧化循環(huán)”方法合成PHA的反應(yīng)如下所示。 另一方面，正如在(2)的早先的工藝中描述的，在PHA的生物合成是用糖類例如葡萄糖等時，生物合成是用由“D-3-羥基?；?ACP”作為起始物質(zhì)，在“脂肪酸合成途徑”中轉(zhuǎn)化的“D-3-羥基?；o酶A”進(jìn)行的。
在這里，“ACP”的意思是“?；d體蛋白”。
同時，正如先前所描述的，上述(1)和(2)二者所述合成的PHA，是由具有側(cè)鏈烷基單體單元構(gòu)成的。然而，象這樣的微生物PHA的應(yīng)用的范圍很廣，例如用作功能性聚合物，如所預(yù)期的那樣，在側(cè)鏈上引入各種取代基的PHA(例如苯基)，是非常有用的。就這樣的PHA的合成而論，如用β-氧化合成關(guān)于在側(cè)鏈上具有芳香基等的PHA，在“高分子” 雜志，24，p5256-5260(1991)中的一個報告中被發(fā)現(xiàn)。特別地，報告了用食油假單胞菌生產(chǎn)的聚酯，含有3-羥基-戊酸，3-羥基-庚酸，3-羥基-壬酸，3-羥基-十一烷酸和3-羥基-5-苯基戊酸(數(shù)量比為0.6∶16.0∶41.1∶1.7∶40.6)作為單元，其數(shù)量為每升培養(yǎng)溶液(對細(xì)胞質(zhì)量干重量的比例是31.6％)中含有160mg，使用5-苯基戊酸和壬酸(摩爾比為2∶1，總濃度為10mmol/L)作為培養(yǎng)基，另外，生產(chǎn)的聚酯還含有3-羥基-己酸，3-羥基-辛酸，3-羥基-癸酸和3-羥基-5-苯基戊酸(數(shù)量比為7.3∶64.5∶3.9∶24.3)作為單元，其數(shù)量為每升培養(yǎng)溶液(對細(xì)胞質(zhì)量干重量的比例是39.2％)中含有200mg，使用5-苯基戊酸和壬酸(摩爾比為1∶1，總濃度為10mol/L)作為培養(yǎng)基。可以相信，在這個報告中的PHA基本的合成方法是用β-氧化途徑，因?yàn)閷?shí)際上使用了壬酸和辛酸。
如上所述，在微生物PHA中，那些組成/結(jié)構(gòu)的不同品種可以通過改變生產(chǎn)它們的微生物，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件得到，但是，如果考慮到將微生物PHA作為塑料使用，其性質(zhì)尚不能令人滿意。為了更進(jìn)一步擴(kuò)展微生物PHA的應(yīng)用范圍，更廣泛地研究將其性質(zhì)改進(jìn)是很重要的，而且，為此目的，開發(fā)和研究含有各種不同結(jié)構(gòu)的單體單元的微生物PHA，其制備工藝和能生產(chǎn)出希望的PHA的微生物是最基本的。
另一方面，先前所述的在側(cè)鏈上含有引進(jìn)的取代基的PHA類型是根據(jù)其性質(zhì)引進(jìn)期望的取代基，因此使它可能具有作為“功能性聚合物”的預(yù)期的改進(jìn)，這種聚合物具有的非常有用的功能和性質(zhì)是由于引進(jìn)類似取代基以及其性質(zhì)所產(chǎn)生的，極好的PHA的開發(fā)和研究提供了如此的功能性和相互間可相容的生物降解性，其制備工藝和可以制備預(yù)期的PHA的微生物是十分重要的難題。
這種含有在側(cè)鏈上引進(jìn)取代基的PHA的另一個實(shí)例包括側(cè)鏈上含有上述苯基，和更多的苯氧基的PHA。
另一個苯基的例子，是在“高分子”雜志，29，1762-1766(1996)報告的食油假單胞菌生產(chǎn)的PHA，包括3-羥基-5-(4-toryl)戊酸作為單體單元，通過含有5-(4-toryl)戊酸(5-(4-甲基苯基)戊酸)作為培養(yǎng)基的培養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)。
此外，“高分子”雜志，32，2889-2895(1999)報告過，食油假單胞菌生產(chǎn)的PHA，包括3-羥基-5-(2，4-二硝基苯基)戊酸和3-羥基-5-(4-硝基苯基)戊酸單體單元，通過含有5-(2，4-二硝基苯基)戊酸和壬酸作為培養(yǎng)基的培養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)。
另外，作為苯氧基的例子，在“高分子化學(xué)物理”雜志，195，1665-1672(1994)報告過，食油假單胞菌生產(chǎn)的PHA，包括3-羥基-5-苯氧基戊酸和3-羥基-9-苯氧基壬酸單體，通過11-苯氧基十一烷酸培養(yǎng)。
還有，“高分子”雜志，29，3432-3435(1996)報告過，食油假單胞菌用于生產(chǎn)PHA，生產(chǎn)了包括由6-苯氧基己酸培養(yǎng)的3-羥基-4-苯氧基丁酸和3-羥基-6-苯氧基己酸單體的PHA，包括由8-苯氧基辛酸培養(yǎng)的3-羥基-4-苯氧基丁酸，3-羥基-6-苯氧基己酸和3-羥基-8-苯氧基辛酸單體的PHA，以及包括由11-苯氧基十一烷酸培養(yǎng)的3-羥基-5-苯氧基戊酸和3-羥基-7-苯氧基庚酸單體的PHA。報告中的聚合物產(chǎn)率示于表1。
另外，在加拿大“微生物”雜志，41，32-43(1995)上，報告了用食油假單胞菌ATCC 29347和惡臭假單胞菌KT 2442成功地生產(chǎn)出PHA包括3-羥基-對-氰基苯氧基己酸或3-羥基-對-硝基苯氧基己酸作為單體單元，用辛酸和對-氰基苯氧基己酸或?qū)?硝基苯氧基己酸為培養(yǎng)養(yǎng)。
在日本專利2989175中，報告了用惡臭假單胞菌合成了一些聚合物，一種是由3-羥基-5-(一氟代苯氧基)戊酸酯(3H5(MFP)P)或3-羥基-5-(二氟代苯氧基)戊酸酯(3H5(DFP))為單元的均聚物和一種至少含有3H5(MFP)P單元或3H5(DFP)P單元的共聚物；合成這些聚合物的假單胞菌類；和采用的菊苣假單胞菌生產(chǎn)上述聚合物的方法。
這些生產(chǎn)都是通過下述“二階段培養(yǎng)”完成的。
培養(yǎng)時間第一階段，24小時；第二階段，96小時各階段的培養(yǎng)基和產(chǎn)生的聚合物示于下。
(1)產(chǎn)生的聚合物3H5(MFP)P均聚物第一階段培養(yǎng)基檸檬酸，酵母提取物第二階段培養(yǎng)基一氟代苯氧基十一烷酸(2)產(chǎn)生的聚合物3H5(DFP)P均聚物第一階段培養(yǎng)基檸檬酸，酵母提取物第二階段培養(yǎng)基二氟代苯氧基十一酸(3)產(chǎn)生的聚合物3H5(MFP)P共聚物第一階段培養(yǎng)基辛酸或壬酸，酵母提取物第二階段培養(yǎng)基一氟代苯氧基十一烷酸(4)產(chǎn)生的聚合物3H5(DFP)P共聚物第一階段培養(yǎng)基辛酸或壬酸，酵母提取物第二階段培養(yǎng)基二氟代苯氧基十一酸作為其效果，具有取代基的中等長度鏈長的脂肪酸具有可以被合成為側(cè)鏈頂端可以被一到二個氟原子取代的苯氧基的聚合物，可以達(dá)到立構(gòu)規(guī)整性和抗水性，而且保持高熔點(diǎn)和好的加工性能。
另外，期望含有環(huán)己基單體單元的PHA顯示出聚合物性質(zhì)不同于含有正脂肪族羥基鏈烷酸單元的那些PHA，用食油假單胞菌生產(chǎn)的例子已被報告過(高分子，30，1611-1615(1997))。
根據(jù)這個報告，當(dāng)食油假單胞菌在含有壬酸(下文中記作NA)和環(huán)己基丁酸(下文中記作CHBA)或環(huán)己基戊酸(下文中記作CHVA)共存的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，獲得的PHA含有環(huán)己基單元和由壬酸得到的單元(每一個的比率不知道)。
關(guān)于產(chǎn)率，報告過在培養(yǎng)基總濃度為20mmol/L時的CHBA和NA的數(shù)量比，得到的結(jié)果示于表2。
然而，在這個實(shí)例中，每份培養(yǎng)溶液的聚合物產(chǎn)率是不夠的，而且得到的PHA本身含有脂肪族鏈烷酸和其單體單元共存。
由此可見，在這種情況下生產(chǎn)出在側(cè)鏈上引進(jìn)不同取代基的PHA，正如在早先的報告中所述的食油假單胞菌實(shí)例中所看到的那樣，其所使用的方法中，鏈烷酸酯含有引進(jìn)的取代基，它不僅可用作聚合物的原料而且還作為生長的碳源。
然而，對于含有引進(jìn)取代基的鏈烷酸酯不僅用作聚合物的原料而且還作為生長的碳源的方法，如所期待的，能源的供應(yīng)是基于通過β-氧化由這種鏈烷酸酯產(chǎn)生的乙?；o酶A，而且，在這種方法中，只有鏈長具有一定長度的培養(yǎng)基才能通過β-氧化產(chǎn)生乙?；o酶A，這就限制了可用作PHA培養(yǎng)基的鏈烷酸酯，這是一個大難題。另外，通常，由于鏈長依次減少二個亞甲基鏈長的培養(yǎng)基，可以通過β-氧化新產(chǎn)生，并且，它們作為PHA的單體單元被俘獲，這樣，合成的PHA通常是不同鏈長的單體單元構(gòu)成的共聚物，鏈長依次相差二個亞甲基。在上述報告的實(shí)例中，共聚物是由三種單體單元構(gòu)成的，它們是產(chǎn)生于培養(yǎng)基8-苯氧基辛酸的3-羥基-8-苯氧基辛酸，3-羥基-6-苯氧基己酸和3-羥基-4-苯氧基丁酸，它們是產(chǎn)生于代謝產(chǎn)物的副產(chǎn)物。在這方面，如果要獲得由簡單的單體單元構(gòu)成的PHA，那使用這種方法就是相當(dāng)困難的。因此，對于一種方法，假定其能源供應(yīng)是基于β-氧化產(chǎn)生的乙?；o酶A，微生物的生長是緩慢的，而PHA的合成就需要很長時間，PHA的合成產(chǎn)率是很低的，這也是個主要困難。
基于這些原因，除了引進(jìn)取代基的鏈烷酸酯外，在中等鏈長的脂肪酸培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物和以象辛酸和壬酸那樣的酸作為生長的碳源，隨后萃取出PHA的方法被認(rèn)為是有效的。
然而，根據(jù)本發(fā)明人的研究，用β-氧化的途徑，使用中等鏈長的脂肪酸如辛酸和壬酸作為生長的碳源合成的PHA是不純的，聚合物的50％或更多是由產(chǎn)生于碳源(例如，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸等)的mcl-3HA單體單元組成。當(dāng)它們是單一組分時，這些mcl-3HA單元使得聚合物在室溫下膠黏，而且，如果它們與大量的本發(fā)明的PHA共存，則聚合物的玻璃化溫度(Tg)非常低。這樣，為了得到室溫下的硬聚合物，不希望mcl-3HA單體單元共存。還有，眾所周知，這種葡萄糖苷鏈結(jié)構(gòu)會影響由側(cè)鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的分子內(nèi)或分子間的相互作用，并且影響到結(jié)晶度和定向。為了達(dá)到改進(jìn)聚合物性質(zhì)和增加聚合物功能的目的，這些mcl-3HA單體單元的共存已經(jīng)上升為主要難題。解決這個難題的方法包括提供一個精制工藝，為了得到由只含有特定的取代基的單體單元構(gòu)成的PHA，分離/除去“不想要的”單體單元，如由生長碳源產(chǎn)生的mcl-3HA單體單元。但是，困難在于操作復(fù)雜，并且產(chǎn)率是不可避免的明顯減少。而更嚴(yán)重的問題是，如果希望的單體單元和不希望的單體單元形成共聚物，很難只除去不希望的單體單元。特別地，在目的是合成含有由不飽和烴，酯基，芳香基，氰基，硝基，由鹵代烴得到基團(tuán)，含有環(huán)氧的基團(tuán)等引進(jìn)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)中得到的基團(tuán)的單體單元的PHA的情況下，mcl-3HA單體單元通常與希望的單體單元形成共聚物，而且在PHA合成后，除去mcl-3HA單體單元非常的困難。
本發(fā)明解決了上述難題，并且提供了包括在側(cè)鏈上含有取代基的各種各樣結(jié)構(gòu)的單體單元的PHA，它作為設(shè)備材料，醫(yī)療材料等是有用的，在用微生物生產(chǎn)這種PHA的方法中，不希望的單體單元的共存被減少，希望的PHA能夠以很高的純度得到并且還有很高的產(chǎn)率。本發(fā)明還提供能夠高純、高效合成PHA的菌株。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供的聚羥基鏈烷酸酯具有的單體單元組成可用通式(1)表示AmB(1-m)(1)此處，A代表通式(2)，B是選自通式(3)或通式(4)所代表的單體單元構(gòu)成的組中的至少一個基團(tuán)，m的值是0.01或大于或小于1 式中n的值是0到10，k的值是3或5，R是選自通式(5)到(7)所表示的基團(tuán)構(gòu)成的組中的至少一個基團(tuán)， 在式(5)中R1是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的基組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中R2是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；
在式(7)中R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；條件是R不在下列選擇之列當(dāng)在通式(2)中選擇一種基團(tuán)作為R時式(5)的基團(tuán)中R1是H和q＝2，R1是H和q＝3，以及R1是-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2是一個鹵素原子和r＝2，條件是，從通式(3)或(4)中提供二個成分作為B，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和式(7)中的基團(tuán)R3是H和s＝1，以及R3是H和s＝2；和在通式(2)中選擇二種基團(tuán)作為R，式(6)的二種基團(tuán)的組合中R2是一個鹵素原子和r＝2，和R2是一個鹵素原子和r＝4，從通式(3)或(4)中選擇提供一個成分作為B。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供5-(4-三氟甲基苯基)戊酸的分子式(21)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的方法，包括培養(yǎng)能夠在含有鏈烷酸酯的培養(yǎng)基中由鏈烷酸酯合成聚羥基鏈烷酸酯的微生物的步驟，其單體單元用式(1)表示AmB(1-m)(1)此處，A代表通式(2)，B是選自通式(3)或通式(4)所代表的單體單元構(gòu)成的組中的至少一個基團(tuán)，m的值是0.01或大于或小于1 式中n的值是0到10，k的值是3或5，R是選自通式(5)到(7)所表示的基團(tuán)構(gòu)成的組中選擇的至少一個基團(tuán)， 在式(5)中R1是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中R2是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；在式(7)中R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；條件是R不在下列選擇之列當(dāng)在通式(2)中選擇一種基團(tuán)作為R時
式(5)的基團(tuán)中R1是H和q＝2，R1是H和q＝3，以及R1是-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2是一個鹵素原子和r＝2，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和式(7)中的基團(tuán)R3是H和s＝1，以及R3是H和s＝2；和在通式(2)中選擇二種基團(tuán)作為R，式(6)中R2是一個鹵素原子和r＝2。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的一種方法，包括培養(yǎng)一種能夠利用含有鏈烷酸酯和糖類的培養(yǎng)基中的鏈烷酸酯生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的一種方法，包括培養(yǎng)一種能夠利用含有鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)基中的鏈烷酸酯生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的一種方法，包括培養(yǎng)一種能夠利用含有鏈烷酸酯和一種帶有TCL環(huán)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中的鏈烷酸酯生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的微生物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的一種方法，其中微生物的培養(yǎng)至少有二個步驟一步是在含有鏈烷酸酯和聚胨培養(yǎng)基中，下一步是在含有鏈烷酸脂和丙酮酸或它的鹽，并且限制氮源中。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供菊苣假單胞菌H45，F(xiàn)ERM BP-7374。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種新的細(xì)菌菌株菊苣假單胞菌YN2，F(xiàn)ERMBP-7375。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種新的細(xì)菌菌株惡臭假單胞菌P91，F(xiàn)ERM BP-7373。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供一種新的菌株jessenii假單胞菌P161，F(xiàn)ERM BP-7376。
正如上面表述的，本發(fā)明提供了新的聚羥基鏈烷酸酯和新的取代鏈烷酸作為原始材料，以及新的能夠在細(xì)胞中生產(chǎn)并積累新的聚羥基鏈烷酸酯的微生物，也提供了用這種微生物生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯的方法。據(jù)此，該聚羥基鏈烷酸酯用作功能聚合物，在其中引進(jìn)各種官能團(tuán)可以非常高效地和高純度地生產(chǎn)，因此，它可以如所期望地用于每一個領(lǐng)域。如設(shè)備和醫(yī)療材料。


圖1是測定的在實(shí)施例1中合成的3HFPV的核磁共振譜曲線。
圖2是測定的在實(shí)施例6中得到的PHA的1H核磁共振譜曲線。
圖3是測定的在實(shí)施例6中得到的PHA的13C核磁共振譜曲線。
圖4是測定的在實(shí)施例7中得到的5-(4-氟代苯氧基)戊酸的核磁共振譜曲線。
圖5是在實(shí)施例8中得到的構(gòu)成PHA的單體單元甲基酯化成分的氣相色譜-質(zhì)譜(聯(lián)用)法總離子色譜(TIC)曲線。
圖6A和6B是在實(shí)施例8中得到的構(gòu)成PHA的單體單元甲基酯化成分在TIC上的質(zhì)譜峰曲線。
圖7A和7B是在實(shí)施例8中得到的構(gòu)成PHA的單體單元酯化成分在TIC上的質(zhì)譜曲線。
圖8是在實(shí)施例9中得到的構(gòu)成PHA的單體單元的甲基酯化成分的TIC曲線。
圖9是在實(shí)施例10中得到的構(gòu)成PHA的單體單元的甲基酯化成分的TIC曲線。
圖10是在實(shí)施例11中得到的構(gòu)成PHA的單體單元的甲基酯化成分的TIC曲線。
圖11A和11B是5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸的總離子色譜(TIC)(圖11A)和它的質(zhì)譜圖(圖11B)曲線。
圖12A和12B是實(shí)施例14中得到的PHA共聚物甲基化成分的分析結(jié)果。圖12A是PHA共聚物甲基化成分的總離子色譜(TIC)，而圖12B是含有的3-羥基-5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸的質(zhì)譜峰(大約36.5分)，它是在TIC上的目標(biāo)單元；圖13A和13B是實(shí)施例15中得到的PHA共聚物甲基化成分的分析結(jié)果。圖13A是PHA共聚物甲基化成分的總離子色譜(TIC)，而圖13B是含有3-羥基-5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸的質(zhì)譜峰(大約36.5分)，它是在TIC上的目標(biāo)單元；圖14是在實(shí)施例30中得到的PHA的1H-NMR譜曲線；圖15是在實(shí)施例34中得到的PHA的1H-NMR譜曲線；
圖16是4-(4-氟代苯氧基)丁酸的1H-NMR譜曲線；圖17是4-(4-氟代苯氧基)丁酸的13C-NMR譜曲線；圖18是在實(shí)施例41中從YN2菌株的培養(yǎng)細(xì)胞中回收的PHA甲醇分解后氣相色譜-質(zhì)譜(聯(lián)用)法測定的數(shù)據(jù)曲線。
圖19是在實(shí)施例41中從YN2菌株的培養(yǎng)微生物細(xì)胞中回收的PHA的1H-NMR譜曲線。
圖20是4-(3-氟代苯氧基)丁酸的的1H-NMR譜曲線。
圖21是4-(3-氟代苯氧基)丁酸的的13C-NMR譜曲線。
圖22是在實(shí)施例47中從YN2菌株的培養(yǎng)細(xì)胞中回收的甲醇分解的PHA的氣相色譜-質(zhì)譜(聯(lián)用)法譜數(shù)據(jù)曲線。
圖23是在實(shí)施例47中從YN2菌株的培養(yǎng)微生物細(xì)胞中回收的PHA的1H-NMR譜曲線。
圖24是在實(shí)施例53中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖25是在實(shí)施例53中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖26是在實(shí)施例54中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖27是在實(shí)施例54中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖28是在實(shí)施例55中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖29是在實(shí)施例55中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖30是在實(shí)施例55中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸甲酯(3HFPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖31是在實(shí)施例56中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖32是在實(shí)施例56中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖33是在實(shí)施例56中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸甲酯(3HFPV)的質(zhì)譜曲線。
圖34是在實(shí)施例57中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖35是在實(shí)施例57中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖36是在實(shí)施例57中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸甲酯(3HFPV)的質(zhì)譜曲線。
圖37是在實(shí)施例57中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸甲酯(3HFPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖38是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸酯的質(zhì)譜曲線。
圖39是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸酯的質(zhì)譜曲線。
圖40是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸酯的質(zhì)譜曲線。
圖41是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖42是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基庚酸甲酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖43是在實(shí)施例58中由GC-MS測定得到的3-羥基-9-苯氧基壬酸甲酯(3HPxN)的質(zhì)譜曲線。
圖44是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖45是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的甲基3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖46是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的甲基3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖47是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖48是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基十二烷酸酯的質(zhì)譜曲線。
圖49是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖50是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖51是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基庚酸甲酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖52是在實(shí)施例59中由GC-MS測定得到的3-羥基-9-苯氧基壬酸甲酯(3HPxN)的質(zhì)譜曲線。
圖53是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖54是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖55是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖56是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖57是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基十二酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖58是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖59是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖60是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基庚酸甲酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖61是在實(shí)施例60中由GC-MS測定得到的3-羥基-9-苯氧基壬酸甲酯(3HPxN)的質(zhì)譜曲線。
圖62是在實(shí)施例61中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖63是在實(shí)施例61中由GC-MS測定得到的3-羥基-4-苯氧基丁酸甲酯(3HPxB)的質(zhì)譜曲線。
圖64是在實(shí)施例61中由GC-MS測定得到的3-羥基-6-苯氧基己酸甲酯(3HPxHx)的質(zhì)譜曲線。
圖65是在實(shí)施例61中由GC-MS測定得到的3-羥基-8-苯氧基辛酸甲酯(3HPxO)的質(zhì)譜曲線。
圖66是在實(shí)施例62中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖67是在實(shí)施例62中由GC-MS測定得到的3-羥基-4-苯氧基丁酸甲酯(3HPxB)的質(zhì)譜曲線。
圖68是在實(shí)施例62中由GC-MS測定得到的3-羥基-6-苯氧基己酸甲酯(3HPxHx)的質(zhì)譜曲線。
圖69是在實(shí)施例62中由GC-MS測定得到的3-羥基-8-苯氧基辛甲酸酯(3HPxO)的質(zhì)譜曲線。
圖70是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖71是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖72是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖73是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基-4-苯氧基丁酸甲酯(3HPxB)的質(zhì)譜曲線。
圖74是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基-6-苯氧基己酸甲酯(3HPxHx)的質(zhì)譜曲線。
圖75是在實(shí)施例63中由GC-MS測定得到的3-羥基-8-苯氧基辛酸甲酯(3HPxO)的質(zhì)譜曲線。
圖76是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖77是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖78是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖79是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖80是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基十二酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖81是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖82是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基-4-苯氧基丁酸甲酯(3HPxB)的質(zhì)譜曲線。
圖83是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基-6-苯氧基己酸甲酯(3HPxHx)的質(zhì)譜曲線。
圖84是在實(shí)施例64中由GC-MS測定得到的3-羥基-8-苯氧基辛酸甲酯(3HPxO)的質(zhì)譜曲線。
圖85是在實(shí)施例65中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖86是在實(shí)施例65中由GC-MS定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖87是在實(shí)施例65中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖88是在實(shí)施例65中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸加酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖89是在實(shí)施例65中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基己酸甲酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖90是在實(shí)施例66中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸加酯的質(zhì)譜曲線。
圖91是在實(shí)施例66中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖92是在實(shí)施例66中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基己酸加酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖93是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖94是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖95是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖96是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖97是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基十二酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖98是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖99是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖100是在實(shí)施例67中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基庚酸甲酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖101是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖102是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖103是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖104是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基十二烷酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖105是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖106是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖107是在實(shí)施例68中由GC-MS測定得到的3-羥基-7-苯氧基己甲酸酯(3HPxHp)的質(zhì)譜曲線。
圖108是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖109是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖110是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖111是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖112是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基十二烷酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖113是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖114是在實(shí)施例69中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖115是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基己酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖116是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖117是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖118是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基十二烷酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖119是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基十二碳烯酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖120是在實(shí)施例70中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯氧基戊酸甲酯(3HPxV)的質(zhì)譜曲線。
圖121是在實(shí)施例71中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖122是在實(shí)施例71中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖123是在實(shí)施例71中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯基戊酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖124是在實(shí)施例72中由GC-MS定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖125是在實(shí)施例72中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯基戊酸甲酯(3HPV)的質(zhì)譜曲線。
圖126是在實(shí)施例73中由GC-MS測定得到的3-羥基丁酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖127是在實(shí)施例73中由GC-MS測定得到的3-羥基辛酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖128是在實(shí)施例73中由GC-MS測定得到的3-羥基癸酸甲酯的質(zhì)譜曲線。
圖129是在實(shí)施例73中由GC-MS測定得到的3-羥基-5-苯基戊酸甲酯(3HPV)的質(zhì)譜曲線。
優(yōu)選具體實(shí)施例的詳細(xì)說明為了解決上述難題，本發(fā)明者等人全力以赴地完成了對能夠生產(chǎn)PHA并在細(xì)胞中積累它的改進(jìn)的微生物的研究和用改進(jìn)的微生物生產(chǎn)希望的PHA的方法的研究，主要的目標(biāo)是發(fā)展在側(cè)鏈上含有取代或未取代的苯氧基，苯基和環(huán)己基的PHA，它可作為設(shè)備材料和醫(yī)療材料，這些本發(fā)明都已經(jīng)完成。
本發(fā)明的聚羥基鏈烷酸酯，其特征在于具有式(1)所表示的組成的單體單元。
AmB(1-m)(1)(此處，A代表通式(2)，B是從通式(3)或通式(4)所代表的單體單元構(gòu)成的組中選擇的至少一個基團(tuán)，m的值是0.01或大于或小于1)。 (式中，n的值為0到10，k的值是3或5，R是選自由通式(5)到(7)所表示的基團(tuán)組成的組中的至少一個或多個基團(tuán)。) (在式(5)中，R1是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中，R2是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；在式(7)中，R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；其中，當(dāng)選定一種基團(tuán)時，作為通式(2)中的R，式(5)的基團(tuán)中R1＝H和q＝2，R1＝H和q＝3，以及R1＝-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2＝鹵素原子和r＝2，[然而，作為上述B，只從通式(3)或(4)提供的二個組中選擇]，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和在式(7)中的基團(tuán)R3＝H和s＝1，以及R3＝H和s＝2被從選擇對象中排除，和當(dāng)選擇二種基團(tuán)時，在式(6)中R2＝鹵素原子和r＝2和4的二種基團(tuán)的組合[然而，作為上述的B，只有從式(3)或(4)中選擇一種]被從選擇對象中排除)。
在這里，本發(fā)明的聚羥基鏈烷酸酯可以包括由式(2)所代表的二種以上的單體單元。但是，考慮到聚合物的功能和性質(zhì)，優(yōu)選地設(shè)計是包括適當(dāng)數(shù)量的單體單元。通常，作為希望的單體單元的原料，使用多達(dá)五種的鏈烷酸酯，通過β-氧化部分鏈烷酸酯新產(chǎn)生了鏈長依次減少二個亞甲基單元，新生成的“繼代”培養(yǎng)基，正如先前所述，它們被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，由式(2)所代表的大約十種或少一些的單體單元被包括在PHA中，而這足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所預(yù)期的目的。因此，如果要求精確控制功能和性質(zhì)，具有更多種單體單元的構(gòu)型也是可能的。
另外，關(guān)于R1，R2，R3的取代位置，對于任意的鄰、間或?qū)ξ?，和對于R3在環(huán)己基上的第一位置來看，可以構(gòu)成含有相應(yīng)的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯，但是如果對于任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，有利的構(gòu)成是取代成分在間位或?qū)ξ簧稀?br> 另外，本發(fā)明的聚羥基鏈烷酸酯的生產(chǎn)方法是用微生物生產(chǎn)含有如式(1)所代表的單體單元成分的聚羥基鏈烷酸酯，其特征在于微生物和鏈烷酸酯一起培養(yǎng)，而且聚羥基鏈烷酸酯從有機(jī)物細(xì)胞中被提取，以得到含有如式(1)所代表的單體單元成分的聚羥基鏈烷酸酯。
AmB(1-m)(1)(此處，A代表通式(2)，B是從通式(3)或通式(4)所代表的單體單元構(gòu)成的組中選擇的至少一個基團(tuán)，m的值是0.01或大于或小于1)。 (式中，n的值為0到10，k的值是3或5，R是由通式(5)到(7)所代表的組中的至少一個或多個基團(tuán))。 (在式(5)中，R1是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中，R2是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；在式(7)中，R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；其中，當(dāng)選定一種基團(tuán)時，作為通式(2)中的R，式(5)基團(tuán)中R1＝H和q＝2，R1＝H和q＝3，以及R1＝-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2＝鹵素原子和r＝2，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和在式(7)中的基團(tuán)R3＝H和s＝1，以及R3＝H和s＝2；被從選擇對象中排除，和當(dāng)選擇二種基團(tuán)時，在式(6)中R2＝鹵素原子和r＝2二種基團(tuán)的組合被從選擇對象中排除)。
在這里，本發(fā)明的聚羥基鏈烷酸酯可以包括由式(2)所代表的二種以上的單體單元，但是，考慮到所須聚合物的功能和性質(zhì)，優(yōu)選的合成應(yīng)使單體單元的數(shù)量適當(dāng)。通常，當(dāng)使用至多達(dá)五種的鏈烷酸酯作為希望的培養(yǎng)基的原料時，通過β-氧化部分鏈烷酸酯新產(chǎn)生了鏈長依次減少二個亞甲基單元的“繼代”培養(yǎng)基，正如先前所述，它們被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，在PHA中包括至多達(dá)到十種式(2)所表示的單體單元，而這足以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所預(yù)期的目的。因此，如果要求精確地控制功能和性質(zhì)，可足以完成培養(yǎng)包括更多種的單體單元。
還有，關(guān)于R1’R2，R3的取代位置，對于在任意的鄰、間或?qū)ξ?，并且，對于在環(huán)己基上的R3的第一的位置而言，可以構(gòu)成含有相應(yīng)的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯，但是，如果任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上都沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，有利的構(gòu)成是取代基在間位或?qū)ξ簧稀?br> 另外，本發(fā)明致力于研究得到希望的PHA的方法，使具有少量或沒有與其共存的不希望有的單體，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中被培養(yǎng)時，培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有作為唯一碳源的鏈烷酸酯是PHA和糖類的原材料，可以生產(chǎn)出僅有少量或沒有與其共存的不希望的單體單元的PHA，這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
也就是說，本發(fā)明生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的方法是，用微生物生產(chǎn)含有式(23)所表示的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法，其特征在于，采用一種方法，將能用通式(22)所表示的鏈烷酸酯合成聚羥基鏈烷酸酯的微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的聚羥基鏈烷酸酯含有式(23)所表示的單體單元，而培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有唯一碳源是式(22)所示的鏈烷酸酯和多糖。 (在上式中，R至少是一個或更多由式(24)所表示的基團(tuán)，R‘是一個或更多選自在式(22)中選出的基團(tuán)，在選出基團(tuán)中的t-2基團(tuán)，在選出基團(tuán)中的t-4基團(tuán)，在選出基團(tuán)中的t-6基團(tuán)。這里t-2，t-4，t-6可以是1或更大的整數(shù)。) (在上式中，R4代表一個飽和或不飽和的苯基，一個飽和或不飽和的苯氧基，和一個飽和或不飽和的環(huán)己基，而t表示一個1到8范圍內(nèi)的獨(dú)立整數(shù)。)在這里，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)時，可以用多于一種的式(22)所代表的鏈烷酸酯，但是，考慮到所需聚合物的功能和性質(zhì)優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)臄?shù)量。通常，當(dāng)將多達(dá)五種的由式(22)所表示的鏈烷酸酯的單體單元作為原材料時，如上所述，通過β-氧化部分鏈烷酸新產(chǎn)生了鏈長依次減少二個亞甲基單元的“繼代”培養(yǎng)基，它被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，在PHA中就會包括，例如，多達(dá)十種由式(2)所表示的鏈烷酸酯單體單元，而且，這個所希望的上述目的足以實(shí)現(xiàn)。因此，如果要求精確地控制功能和性質(zhì)，可以使用多種鏈烷酸酯。
在上述R4基團(tuán)上的取代基包括鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，-C3F7等。關(guān)于R4的取代位置，對于任意的鄰位、間位和對位，和對于在環(huán)己基的情況下的第一位置，可以得到含有相應(yīng)的單體單元構(gòu)成的聚羥基鏈烷酸酯，但是，如果任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，取代基應(yīng)在間位或?qū)ξ簧稀?br> 另外，對于糖類，例如葡萄糖，果糖，甘露糖等均可以使用。
而且，本發(fā)明人致力于研究生產(chǎn)希望的PHA的方法，使其僅有少量或沒有不希望的單體單元與其共存，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中被培養(yǎng)時，培養(yǎng)培養(yǎng)基中只含有作為唯一碳源的鏈烷酸酯是PHA和聚胨的原材料，可以生產(chǎn)出僅有少量或沒有不希望的單體與其共存的的PHA，這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
也就是說，本發(fā)明生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的方法是，用微生物生產(chǎn)含有式(23)所表示的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法，其特點(diǎn)在于，采用一種方法，能用通式(22)所表示的鏈烷酸酯合成聚羥基鏈烷酸酯的微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述的聚羥基鏈烷酸酯含有式(23)所表示的單體單元，所述的培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有唯一碳源為式(22)所示的鏈烷酸酯和多糖。 (在上式中，R至少是一個或多個由式(24)所表示的基團(tuán)，R‘是一個或多個選自式(22)中的基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-2基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-4基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-6基團(tuán)。這里t-2，t-4，t-6可以是1或更大的整數(shù)。) (在上式中，R4代表一個飽和或不飽和的苯基，一個飽和或不飽和的苯氧基，和一個飽和或不飽和的環(huán)己基，而t表示一個1到8范圍內(nèi)的整數(shù)。)在這里，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)時，可以用多于一種的式(22)所代表的鏈烷酸酯，但是，考慮到所須聚合物的功能和性質(zhì)，優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)臄?shù)量。通常，當(dāng)將至多五種的由式(22)所表示的鏈烷酸酯用作希望的單體單元的原材料時，如上所述，通過β-氧化部分鏈烷酸新產(chǎn)生了鏈長減少二個亞甲基單元的“繼代”培養(yǎng)基，它們被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，在PHA中包括，例如，多到十種由式(2)所表示的鏈烷酸酯單體單元，而且，這個所希望的上述目的足以實(shí)現(xiàn)。因此，如果要求精確控制功能和性質(zhì)，可以使用多種鏈烷酸酯。
在上述R4基團(tuán)上的取代基包括鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，-C3F7等。關(guān)于R4的取代位置，在任意的鄰位、間位和對位，和，在環(huán)己基的情況下的第一位置，可以得到含有相應(yīng)的單體單元構(gòu)成的聚羥基鏈烷酸酯，但是，如果任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，取代基應(yīng)在間位或?qū)ξ簧稀?br> 而且，本發(fā)明人致力于研究生產(chǎn)希望的PHA的方法，使僅有少量或沒有與其共存的不希望的單體單元，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中被培養(yǎng)時，培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有作為唯一碳源的鏈烷酸酯是PHA和TCA循環(huán)有關(guān)的有機(jī)酸的原材料，可以生產(chǎn)出僅有少量或沒有與其共存的不希望的單體的PHA，這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
也就是說，本發(fā)明生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的方法是，用微生物生產(chǎn)含有式(23)所表示的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法，其特征在于，采用一種方法，將能用式(23)所表示的鏈烷酸酯合成聚羥基鏈烷酸酯的微生物，在培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)培養(yǎng)基包括鏈烷酸和只與TCA循環(huán)連用的有機(jī)酸作為碳源，而不是以下式(22)所表示的鏈烷酸酯，所述的聚羥基鏈烷酸酯含有式(23)所示的單體單元。 (在上式中，R至少是一個或多個由式(24)所表示的基團(tuán)，R‘是一個或多個選自式(22)中的基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-2基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-4基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-6基團(tuán)。這里t-2，t-4，t-6可以是1或更大的整數(shù)。) (在上式中，R4代表一個飽和或不飽和的苯基，一個飽和或不飽和的苯氧基，和一個飽和或不飽和的環(huán)己基，而t表示一個1到8范圍內(nèi)的整數(shù)。)在這里，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)時，可以用多于一種的式(22)所代表的鏈烷酸酯，但是，考慮到所須聚合物的功能和性質(zhì)，優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)臄?shù)量。通常，當(dāng)將多達(dá)五種由式(22)所表示的鏈烷酸酯用作希望的單體單元的原材料時，如上所述，通過β-氧化部分鏈烷酸新產(chǎn)生了鏈長減少二個亞甲基單元的“繼代”培養(yǎng)基，它被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，在PHA中就會包括，例如，多到十種由式(2)所表示的鏈烷酸酯單體單元，而且，這個所希望的上述目的足以實(shí)現(xiàn)。因此，如果要求精確控制功能和性質(zhì)，可以使用多種鏈烷酸酯。
在上述R4基團(tuán)上的取代基包括鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，-C3F7等。關(guān)于R4的取代位置，在任意的鄰位、間位和對位，和在環(huán)己基的情況下的第一位置，可以得到的含有相應(yīng)的單體單元構(gòu)成的聚羥基鏈烷酸酯，但是，如果任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上都沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，取代基應(yīng)在間位或?qū)ξ簧稀?br> 還有；對于TCA循環(huán)連用有機(jī)酸，本身就存在于TCA循環(huán)中的有機(jī)酸，例如檸檬酸，琥珀酸，富馬酸，蘋果酸及其鹽類，存在于TCA循環(huán)的主流中的有機(jī)酸，例如乳酸，丙酮酸及其鹽類均適宜使用。
而且，本發(fā)明人致力于研究生產(chǎn)希望的PHA的方法，使僅有少量或沒有與其共存的不希望的單體單元，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物在培養(yǎng)培養(yǎng)基中被培養(yǎng)時，至少有二個步驟第一步在含有作為唯一碳源的鏈烷酸酯是PHA和聚胨的原料的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有鏈烷酸酯和丙酮酸或其鹽類作為底部碳源的培養(yǎng)培養(yǎng)基中并在限氮條件下培養(yǎng)，可以生產(chǎn)出僅有少量或沒有與其共存的不希望的單體的PHA。
也就是說，本發(fā)明生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的方法是，用微生物生產(chǎn)含有式(23)所表示的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的方法，其特點(diǎn)在于，采用一種方法，將能用式(22)所表示的鏈烷酸酯合成聚羥基鏈烷酸酯的微生物，至少用二個步驟培養(yǎng)，第一步在含有作為唯一碳源的是以下面的通式(22)所表示的鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有作為唯一碳源的是用通式(22)所表示的鏈烷酸酯和丙酮酸及其鹽類的培養(yǎng)培養(yǎng)基中并且在限氮的條件下培養(yǎng)。 (在上式中，R至少是一個或多個由式(24)所表示的基團(tuán)，R‘是一個或更多選自式(22)中的基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-2基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-4基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-6基團(tuán)。這里t-2，t-4，t-6可以是1或更大的整數(shù)。) (在上式中，R4代表一個飽和或不飽和的苯基，一個飽和或不飽和的苯氧基，和一個飽和或不飽和的環(huán)己基，而t表示一個1到8范圍內(nèi)的整數(shù)。)在這里，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)時，可以用多于一種的式(22)所代表的鏈烷酸酯，但是，考慮到所須聚合物的功能和性質(zhì)，優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)臄?shù)量。通常，當(dāng)將多達(dá)五種由式(22)所表示的鏈烷酸用作希望的單體單元的原材料時，如上所述，通過β-氧化部分鏈烷酸新產(chǎn)生了鏈長減少二個亞甲基單元的“繼代”培養(yǎng)基，它被捕獲作為PHA的單體單元。這樣，在PHA中包括，例如，多到十種由式(2)所表示的鏈烷酸酯單體單元，而且，這個所希望的上述目的足以實(shí)現(xiàn)。因此，如果要求精確控制功能和性質(zhì)，可以使用多種鏈烷酸酯。
在上述R4基團(tuán)上的取代基包括鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，-C3F7等。關(guān)于R4的取代位置，(可以是)在任意的鄰位、間位和對位，在對于環(huán)己基的情況下的第一位置，可以得到的含有相應(yīng)的單體單元構(gòu)成的聚羥基鏈烷酸酯，但是，如果任何異構(gòu)體在功能和性質(zhì)上都沒有顯著的差別的話，對產(chǎn)率或在聚合物上容易被俘獲來說，取代基應(yīng)在間位或?qū)ξ簧稀?br> 另外，本發(fā)明涉及的新菌株，其特征在于，具有合成含有式(22)所代表的鏈烷酸酯單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的合成體系。 (在上式中，R至少是一個或多個由式(24)所表示的基團(tuán)，R‘是一個或多個選自式(22)中的基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-2基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-4基團(tuán)，選出基團(tuán)中的t-6基團(tuán)。這里t-2，t-4，t-6可以是1或更大的整數(shù)。) (在上式中，R4代表一個飽和或不飽和的苯基，一個飽和或不飽和的苯氧基，和一個飽和或不飽和的環(huán)己基，而t表示一個1到8范圍內(nèi)的獨(dú)立整數(shù)。)在上述R4基團(tuán)上的取代基包括鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，-C3F7等。
在下文中，將說明本發(fā)明的新型聚羥基鏈烷酸酯。
本發(fā)明的一種新型聚羥基鏈烷酸酯是式(8)中的任一種 它含有3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸單體單元。此外，還有如式(9)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-5-(4-三氟代甲苯基)戊酸單體單元。
另外，若用微生物生產(chǎn)本發(fā)明的新PHA時，培養(yǎng)基材是5-(4-三氟代甲苯基)戊酸，如下化學(xué)式(21) 該培養(yǎng)基材料本身是一個新化合物。再者，還有式(10)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸單體單元。再者，還有式(11)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元。再者，還有式(12)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-4-(4-氟代苯氧基)丁酸單體單元。再者，還有式(13)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-4-(3-氟代苯氧基)丁酸單體單元。再者，還有式(14)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-4-苯氧基丁酸單體單元。此處，除了式(14)的3-羥基-4-苯氧基丁酸單體單元外，至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。 (其中，n為0-10)(k為3或5)再者，還有式(15)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-5-苯氧基丁酸單體單元。此處，除了式(15)的3-羥基-5-苯氧基戊酸作為單體單元外，至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。 (其中，n為0-10)(k為3或5)再者，還有式(16)的聚羥基鏈烷酸酯。 它含有3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元。此處，除了式(16)的3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元外，聚羥基鏈烷酸酯至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。并且三組分體系單體單元除外。 (其中，n為0-10)(k為3或5)再者，還有式(8)和(16)的聚羥基鏈烷酸酯。 它們含有3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸和3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元。
再者，還有式(15)和(17)的聚羥基鏈烷酸酯。 它們含有3-羥基-5-苯氧基戊酸和3-羥基-7-苯氧基庚酸單體單元。此處除了式(15)和(17)所表示的3-羥基-5-苯氧基戊酸和3-羥基-7-苯氧基庚酸作為單體單元以外，至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。 (其中，n為0-10)(k為3或5)再者，還有式(14)，(18)和(19)的聚羥基鏈烷酸酯。 它們含有3-羥基-4-苯氧基丁酸，3-羥基-6-苯氧基己酸和3-羥基-8-苯氧基辛酸單體單元。此處除了式(14)，(18)和(19)所表示的3-羥基-4-苯氧基丁酸，3-羥基-6-苯氧基己酸和3-羥基-8-苯氧基辛酸單體單元以外，至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。 (其中，n為0-10)(k為3或5)再者，還有式(15)，(17)和(20)的聚羥基鏈烷酸酯。 它們含有3-羥基-5-苯氧基戊酸，3-羥基-7-苯氧基庚酸和3-羥基-9-苯氧基壬酸單體單元。此處除了式(15)，(17)和(20)所表示的3-羥基-5-苯氧基戊酸，3-羥基-7-苯氧基庚酸和3-羥基-9-苯氧基壬酸單體單元以外，至少還含有式(3)或式(4)所示的一種或多種的單體單元。 (其中，n為0-10)(k為3或5)在下文中，將說明聚羥基鏈烷酸酯的制備方法。
本發(fā)明人成功地獲得了微生物，用這種微生物可在含有式(25)所示的5-(4-氟代苯基)戊酸(FPVA)的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生產(chǎn)含有式(8)所示的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸(3HFPV)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明的聚羥基鏈烷酸酯的生產(chǎn)方法，其特征在于，有一個培養(yǎng)微生物的步驟，用該微生物可以在含有式(25)所示的FPVA培養(yǎng)培養(yǎng)基中使用YFPVA生產(chǎn)含式(8)所示的3HFPV單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種生產(chǎn)方法的特征在于，在含有式(25)所示的FPVA和糖類的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
再者，另一種生產(chǎn)方法的特征在于，在含有式(25)所示的FPVA和聚胨的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
再者，另一種生產(chǎn)方法的特征在于，在含有式(25)所示的FPVA和TCA循環(huán)連用的有機(jī)酸的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
另外，另一個生產(chǎn)方法的特征在于，微生物的培養(yǎng)至少用二個步驟完成，第一步在含有以式(25)所表示的FPVA和聚胨的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有式(22)所表示的FPVA和丙酮酸及其鹽類的培養(yǎng)培養(yǎng)基中并且在限氮的條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人已成功地獲得了能夠生產(chǎn)含有式(9)的3-羥基-5-(4-三氟代甲苯基)戊酸(3HCF3PV)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的微生物，微生物是在含有式(21)的5-(4三氟代甲苯基)戊酸(CF3PVA)的培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的生產(chǎn)方法包括，在含有CF3PVA的培養(yǎng)培養(yǎng)基中，用式(21)所示的CF3PVA培養(yǎng)能生產(chǎn)的含式(9)3HCF3PV單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的微生物。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(21)的CF3PVA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(21)的CF3PVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(21)的CF3PVA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(21)的CF3PVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(21)的CF3PVA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(26)的4-(4-硝基苯氧基)丁酸(NO2PxBA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(10)的3-羥基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸(3HNO2PxB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(26)的NO2PxBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用NO2PxBA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(10)表示的3HNO2PxB單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(26)的NO2PxBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(26)的NO2PxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(26)的NO2PxBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段培養(yǎng)方法培養(yǎng)該微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(26)的NO2PxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有NO2PxBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(27)的4-(4-氰基苯氧基)丁酸(CNPxBA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(11)的3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸(3HCNPxB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有CNPxBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物可以由結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA制備含有結(jié)構(gòu)式(11)表示的3HCNPxB單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(27)的CNPxBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(28)的4-(4-氟苯氧基)丁酸(FPxBA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(12)的3-羥基-4-(4-氟苯氧基)丁酸(3HFPxB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用FPxBA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(12)表示的3HFPxB單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(28)的FPxBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(29)的4-(3-氟苯氧基)丁酸(mFPxBA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(13)的3-羥基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用mFPxBA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(13)表示的3HmFPxB單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(29)的mFPxBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(31)的5-苯戊酸(PVA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(30)的3-羥基-5-苯戊酸(3HPV)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(31)的PVA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用PVA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(30)的3HPV單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(31)的PVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(31)的PVA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(31)的PVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(31)的PVA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(33)的6-苯基己酸(PHxA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(32)的3-羥基-6-苯基己酸(3HPHx)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(33)的PHxA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用PHxA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(32)的3HPHx單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(33)的PHxA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(33)的PHxA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(33)的PHZA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(33)的PHxA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(34)的4-苯氧基丁酸(PxBA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(14)的3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用FPxBA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(14)表示的3HPxB單體單元的聚羥基鏈烷酸脂酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后在含有結(jié)構(gòu)式(34)的PxBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(35)的5-苯氧基戊酸(PxVA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(15)的3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用FxVA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(15)表示的3HPxV單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(35)的PxVA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(36)的5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(16)的3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(36)的FPxVA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用FPxVA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(16)的3HFPxV單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(36)的FPxVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(36)的FPxVA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段培養(yǎng)方法培養(yǎng)該微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(36)的FPxVA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(36)的FPxVA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在含有結(jié)構(gòu)式(38)的4-環(huán)己基丁酸(CHBA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備含有結(jié)構(gòu)式(37)的3-羥基-4-環(huán)己基丁酸(3HCHB)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(38)的CHBA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中該微生物使用CHBA可以制備含有結(jié)構(gòu)式(37)的3HCHB單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(38)的CHRA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(38)的CHBA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段培養(yǎng)方法培養(yǎng)該微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(38)的CHBA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接著在含有結(jié)構(gòu)式(38)的CHBA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，其中在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)表示的5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)和5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(8)和(16)表示的3-羥基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(8)和(16)表示的3HFPV和3HFPxV的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
此外，另一種制造方法是其特征在于在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)的FPVA和FPxVA以及聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)的FPVA和FPxVA，以及與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在分別含有結(jié)構(gòu)式(25)和(36)表示的FPVA和FPxVA以及丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人還成功地獲得微生物，當(dāng)其在含有結(jié)構(gòu)式(39)的7-苯氧基庚酸(PxHpA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可以制備含有分別由結(jié)構(gòu)式(15)和(17)表示的3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。 本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于微生物在含有結(jié)構(gòu)式(39)的PxHpA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，使用PxHpA可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(15)和(17)的3HPxV和3HPxHp的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(39)的PxHpA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(39)的PxHpA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(39)的PxHpA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(39)的PxHpA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人還成功地獲得微生物，當(dāng)其在含有結(jié)構(gòu)式(40)的8-苯氧基辛酸(PxOA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(14)、(18)和(19)表示的3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(40)的PxOA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，使用PxOA可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(14)、(18)和(19)表示的3HPxB、3HPxHx和3HPxO的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(40)的PxOA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(40)的PxOA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(40)的PxOA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(40)的PxOA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明人成功地獲得微生物，當(dāng)其在含有結(jié)構(gòu)式(41)的11-苯氧基十一酸(PxUDA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(15)、(17)和(20)表示的3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)、3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
本發(fā)明聚羥基鏈烷酸酯的制造方法的特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(41)的PxUDA和糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，使用PxUDA可以制備分別含有結(jié)構(gòu)式(15)、(17)和(20)表示的3HPxv、3HPxHp和3HPxN的單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
另外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(41)的PxUDA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于在含有結(jié)構(gòu)式(41)的PxUDA和與三羧酸循環(huán)相關(guān)的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
此外，另一種制造方法是其特征在于通過至少二階段的培養(yǎng)方法培養(yǎng)微生物首先在含有結(jié)構(gòu)式(41)的PxUDA和聚胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在含有結(jié)構(gòu)式(41)的PxUDA和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中在氮限制條件下培養(yǎng)。
此外，適合用于制備本發(fā)明如上所述的聚羥基鏈烷酸酯的四種新菌株包括菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2、FERM BP-7375、菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)H45、FERM BP 7374，惡臭假單胞菌P91、FERMBP-7373，和jessenii假單胞菌P161、FERM BP-7376。
本發(fā)明的PHA是那些用作裝置和醫(yī)學(xué)材料等等的含有在側(cè)鏈上帶取代基的各種結(jié)構(gòu)的單體單元的PHA，特別是那些在側(cè)鏈上有上述取代的或未取代的苯氧基、苯基和環(huán)己基的PHA。另外，本發(fā)明的方法使用微生物能夠制備高純度和高產(chǎn)率的所需的PHA。而且，本發(fā)明可以提供能夠有效合成高純度PHA的菌株。通常，本發(fā)明的PHA具有R形式且是全同立構(gòu)聚合物。
<包含在三羧酸循環(huán)中的糖和有機(jī)酸不同于常規(guī)技術(shù)>
制備本發(fā)明PHA的一種方法是其特征在于當(dāng)培養(yǎng)微生物時，除了加入引入所需單體單元的鏈烷酸酯外，在培養(yǎng)基中只加入不是鏈烷酸酯的包含在三羧酸循環(huán)中的糖(糖類)或有機(jī)酸(有機(jī)酸類)作為碳源，所以用微生物制備的和在微生物中積聚的PHA具有極高含量所需的單體單元或者只具有所需的單體單元。除了鏈烷酸酯，僅僅將包含在三羧酸循環(huán)中的糖或有機(jī)酸作為碳源加入培養(yǎng)基，達(dá)到了易于選擇這些特殊的單體單元的效果。
即，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用包含在三羧酸循環(huán)中的糖或有機(jī)酸作為共存的底物進(jìn)行培養(yǎng)，并與鏈烷酸酯一起引入所需的單體單元時，與常規(guī)的方法(使用mcl-鏈烷酸酯例如壬酸酯或辛酸酯作為共存的底物)相比，可以制備特別高產(chǎn)率和純度的所需PHA，而且還發(fā)現(xiàn)使用乙酰輔酶A作制備微生物的碳源和能源的培養(yǎng)法達(dá)到了這些效果，所述的微生物制備方法不是β氧化法而且已經(jīng)達(dá)到了本發(fā)明的目的。
在本發(fā)明的方法中，利用糖化合物例如葡萄糖、果糖、甘露糖等等作為微生物生長的底物，且制備的PHA是與糖共在的用于引入所需的單體單元的鏈烷酸酯，所以不包含或包含少量的來源于糖例如葡萄糖等等單體單元。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的方法實(shí)質(zhì)上在結(jié)構(gòu)和效果方面不同于常規(guī)的用微生物制備PHA的方法，常規(guī)方法中使用糖本身例如葡萄糖等等作為引入PHA的單體單元的原始底物。
<聚胨不同于常規(guī)技術(shù)>
制備本發(fā)明PHA的一種方法是其特征在于當(dāng)培養(yǎng)微生物時，除了加入引入所需單體單元的鏈烷酸酯原料外，僅僅將作為碳源的聚胨(不同于鏈烷酸酯)加入培養(yǎng)基中，以便用微生物制備的和在微生物中積聚的PHA具有極高含量所需的單體單元或者只具有所需的單體單元。僅僅將作為碳源的聚胨(不同于鏈烷酸酯)加入培養(yǎng)基中可以達(dá)到易于選擇這些特殊單體單元的效果。
在微生物制備PHA中利用聚胨的例子有日本專利申請公開號5-49487、5-64591、5-214081、6-145311、6-284892、7-48438、8-89264、9-191893和11-32789公開了當(dāng)用微生物制備PHA時，培養(yǎng)基中允許含有聚胨。然而，在預(yù)培養(yǎng)，即細(xì)胞生長的初期，所有這些利用了聚胨，并且在預(yù)培養(yǎng)過程中沒有包含產(chǎn)生PHA單體單元的底物。而且，沒有在使用細(xì)胞制備PHA的階段利用聚胨的例子。相反，本發(fā)明是與引入所需的單體單元的鏈烷酸酯一起，并且用僅僅共存的聚胨作為碳源(不同于鏈烷酸酯)來制備和積聚PHA，以及生長細(xì)胞。因此，本發(fā)明使用聚胨的制備方法在結(jié)構(gòu)和效果方面完全不同于常規(guī)使用聚胨的例子。而且，現(xiàn)有技術(shù)也沒有提到選擇能達(dá)到本發(fā)明效果的特殊的單體單元，且沒有指出在用微生物制備的PHA組成中選擇特殊的單體單元如本發(fā)明的取代基苯氧基、苯基和環(huán)己基的作用。
以下將更詳細(xì)說明本發(fā)明的PHA、制備方法和微生物。
<提供PHA單體單元的途徑>
首先是詳細(xì)說明“脂肪酸合成途徑”，一種提供混入所需的PHA中的mcl-3HA單體單元的途徑。
對于糖例如葡萄糖等等是底物的情況，細(xì)胞組分所需的鏈烷酸酯是由“脂肪酸合成途徑”生物合成的，其中通過“糖酵解途徑”由糖產(chǎn)生的乙酰輔酶A是起動物質(zhì)。如下所述，脂肪酸合成包括全程合成途徑和碳-鏈延伸途徑。
1)全程合成途徑這些途徑是用兩種酶乙酰輔酶A羧化酶(EC6.4.1.2)和脂肪酸合酶(E.C.2.3.1.85)催化的。乙酰輔酶A羧化酶是插入輔酶R中的酶，和最終催化作用下列反應(yīng)由乙酰輔酶A制備丙二酰基輔酶A。這些反應(yīng)如下
脂肪酸合酶也是催化遷移-脫碳-還原-脫水-還原的反應(yīng)循環(huán)的酶。整個反應(yīng)表示如下
根據(jù)酶的類型，反應(yīng)產(chǎn)物可以是游離酸、輔酶A衍生物或?；d體蛋白衍生物。
下面，分別用下列化學(xué)式(42)和(43)表示乙酰輔酶A和丙二?；o酶A。
另外，輔酶A代表輔酶A且由下列化學(xué)式(44)表示。 在這些反應(yīng)途徑內(nèi)，如下所述路徑產(chǎn)生“右旋3-羥?；?酰基載體蛋白(ACP)”，其是用于PHA生物合成的單體底物的中間物。另外如下列化學(xué)反應(yīng)式所示，這些途徑最后擴(kuò)展到重復(fù)加入兩種碳原子的棕櫚酸鹽中。因此，用于PHA生物合成的單體底物是七個具有雙數(shù)碳原子的“右旋3-羥酰基-?；d體蛋白(ACP)”、從“右旋3-羥丁?；??；d體蛋白(ACP)”到“右旋3-羥棕櫚?；??；d體蛋白(ACP)”。 2)碳-鏈延伸途徑這些途徑廣泛地分為兩種途徑一種途徑是將丙二?；o酶A加入到酰基?；d體蛋白中，其最后變?yōu)榫哂醒由靸蓚€碳原子(和CO2)的碳鏈的酰基?；d體蛋白(稱為途徑A)，而另一個途徑是將乙酰輔酶A加入到酰基輔酶A中，其最后變?yōu)榫哂醒由靸蓚€碳原子的碳鏈酰基輔酶A(稱為途徑B)。以下將說明每個途徑。
途徑AR-CO-ACP+丙二?；?ACP→R-CO-CK2-CO-ACP+CO2R-CO-CH2-CO-ACP→R-CHOH-CH2-CO-ACP→R-CH＝CH-CO-ACP→R-CH2-CH2-CO-ACP途徑B
R-CO-CH2-CO-CoA→R-CHOH-CH2-CO-CoA→
R-CH＝CH-CO-CoA→R-CH2-CH2-CO-CoA在或者途徑A或B中，人們認(rèn)為生產(chǎn)出的“右旋3-羥?；?輔酶A”或者“右旋3-羥酰基-ACP”作為中間物，而利用“右旋3-羥?；?輔酶A”作為用于PHA合成的單體底物，同時利用“右旋3-羥?；?ACP”作為用于PHA合成的單體底物，之后通過ACP-輔酶A轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)換成“右旋3-羥酰基-輔酶A”。
在糖例如葡萄糖等等用作底物的情況下，人們認(rèn)為在微生物的細(xì)胞內(nèi)經(jīng)由如上所述“糖酵解途徑”和“脂肪酸合成途徑”產(chǎn)生mcl-3HA單體單元。在包含在三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸用作底物的情況下，直接通過丙酮酸酯脫氫酶由丙酮酸生產(chǎn)出乙酰輔酶A。三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸例如蘋果酸通過蘋果酸酯脫氫酶，接著由乙酰輔酶A通過上述反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸。草酰乙酸通過磷酸烯醇丙酮酸羧激酶產(chǎn)生磷酸烯醇丙酮酸，其依次由丙酮酸激酶、接著由乙酰輔酶A催化通過上述反應(yīng)制備丙酮酸。人們認(rèn)為這些反應(yīng)制備的乙酰輔酶A通過“脂肪酸合成途徑”制備mcl-3HA單體單元。
在這些情況下，人們認(rèn)為mcl-鏈烷酸酯例如辛酸酯、壬酸酯等等，或具有在末端加入的不同于直線脂肪族烷基的官能團(tuán)的鏈烷酸酯例如5-苯基戊酸酯、5-(4-氟苯基)戊酸酯、6-苯基己酸酯、4-苯氧基丁酸酯、和4-環(huán)己基丁酸酯由輔酶A-連接酶(EC 6.2.1.3等等)，接著“右旋3-羥?；?輔酶A”作用轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊妮o酶A衍生物，成為由許多引起β氧化作用的酶生物直接合成PHA的單體底物。
簡言之。經(jīng)由很多酶促反應(yīng)階段(即間接地)制備由包含在三羧酸循環(huán)中的糖或有機(jī)酸產(chǎn)生mcl-3HA單體單元，但是mcl-鏈烷酸酯可完全直接地產(chǎn)生mcl-3HA單體單元。
下面將描述引起微生物生長的乙酰輔酶A的產(chǎn)生。在該方法中，除了引入所需的單體單元的鏈烷酸酯外，同時存在mcl-鏈烷酸酯，這些鏈烷酸酯經(jīng)過β-氧化作用途徑制備乙酰輔酶A。通常，與具有龐大的取代基的鏈烷酸酯(具有取代基例如苯基、苯氧基、環(huán)己基等等的鏈烷酸酯)比較，認(rèn)為在β-氧化作用途徑中mcl-鏈烷酸酯對許多酶具有較高的底物親合力，因此通過與mcl-鏈烷酸酯同時存在可有效地制備乙酰輔酶A。為此，利用乙酰輔酶A作為能源和碳源有利于微生物生長。
然而，因?yàn)閙cl-鏈烷酸酯途徑經(jīng)由β-氧化作用直接變?yōu)镻HA的單體單元，所以嚴(yán)重的問題是制備的PHA除了所需的單體單元外也含有許多mcl-3HA單體單元。
為了解決這些問題，可取的方法是不選擇mcl-鏈烷酸酯，而是有效地選擇可以提供乙酰輔酶A或能源和碳源的這種底物，和允許與所需的鏈烷酸酯共同存在。如上所述，乙酰輔酶A可以是通過脂肪酸合成途徑形成的PHA的單體單元，但是與β-氧化作用中的mcl-鏈烷酸酯相比較，這些方法是有許多階段的間接法。因此，通過選擇培養(yǎng)條件例如底物濃度以產(chǎn)生乙酰輔酶A，空巖實(shí)現(xiàn)在PHA中不慘合或減少mcl-3HA含量的制備方法。
另外，通常使用的制備方法是在第一階段進(jìn)行培養(yǎng)使微生物生長，而在第二階段加入到只有所需的鏈烷酸酯作為碳源的培養(yǎng)基中。在這種情況下，ATP需要?；o酶A連接酶(是使鏈烷酸酯轉(zhuǎn)化為?；o酶A的β-氧化作用途徑的起始酶)。因此，本發(fā)明人的研究提供了更有效的制備方法的結(jié)果能夠用作能源的底物，微生物也共同存在于第二階段，然后完成本發(fā)明。
作為在本發(fā)明方法中能有效地提供?；o酶A或能源和碳源的底物，只要化合物不經(jīng)歷β-氧化作用途徑而產(chǎn)生?；o酶A或能源和碳源，根據(jù)作為所用菌株的底物的用途，可以使用或適當(dāng)選擇任何一種化合物，例如醛糖包括甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖，糖醇例如甘油、赤蘚醇、和木糖醇，醛糖酸例如葡萄糖酸，糖醛酸例如葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，糖例如包括麥芽糖、蔗糖和乳糖的二醣類，另外包含在三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸例如乳酸、丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和它們的鹽，此外來源于天然產(chǎn)物的培養(yǎng)基成分例如聚胨、牛肉浸膏和酪蛋白氨基酸等等。而且，如果它們的組合產(chǎn)生少量的與mcl-3HA的混合物，那么也可以選擇使用兩種或更種化合物。
<微生物>
在本發(fā)明背景中提到報道了在細(xì)胞PHA內(nèi)制備和積聚的微生物，該P(yáng)HA含有下列單體單元例如3-羥基-4-苯氧基丁酸鹽、3-羥基-5-氟苯氧基戊酸酯、3-羥基-6-氰基苯氧基己酸酯、3-羥基-6-硝基苯氧基己酸酯、3-羥基-7-氟苯氧基庚酸酯的，例如在高分子，29卷，3432-3435頁(1996)，Can.J.Microbiol.41卷，32-43頁(1995)，日本專利號2989175中描述的食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorance)和惡臭假單胞菌等等。然而，沒有報道過制備和積聚含有3-羥基-4-苯氧基丁酸鹽單體單元的細(xì)胞PHA的微生物，其中該單體單元具有取代基例如氟、氰基、硝基、在高分子，32卷，2889-2895頁(1999)中報道了在含有5-(2，4-二硝基苯基)戊酸酯和作為底物的壬酸酯(nonanoate)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorance)可以制備含有3-羥基-5-(2，4-二硝基苯基)戊酸酯和3-羥基-5-(4-硝基苯基)戊酸酯的單體單元的PHA。然而，沒有報道過在細(xì)胞內(nèi)制備和積聚含有3-羥基-苯基鏈烷酸酯的單體單元的PHA的微生物，其中該單體單元具有取代基例如氟、三氟甲基。因此，通過篩選能夠?qū)⑦@些新單體單元摻入PHA中的微生物可以達(dá)到本發(fā)明的目的。
以前沒有報道過本發(fā)明的新型微生物能夠在細(xì)胞內(nèi)制備和積聚含有來源于鏈烷酸酯的新單體單元的PHA(使用鏈烷酸酯作為底物)。發(fā)明人通過篩選發(fā)現(xiàn)了具有這種新型酶促反應(yīng)的微生物。本發(fā)明的新型微生物是菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株YN2(FERM BP-7375)、菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)菌株H45(FERM BP-7374)、惡臭假單胞菌菌株P(guān)91(FERM BP7373)和jessenii假單胞菌菌株P(guān)161(FERM BP-7376)。除了這些微生物外，使用鏈烷酸酯作為底物，通過培養(yǎng)菌株例如菊苣假單胞菌種可以獲得在本發(fā)明制備PHA的方法中使用的微生物。
下面將給出有關(guān)菌株YN2、H45、P91、和P161的詳細(xì)資料。
<菌株YN2的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)>
(1)形態(tài)學(xué)性能細(xì)胞的形狀和大小棒狀，0.8μm×1.5-2.0μm細(xì)胞的多形性陰性移動性能動的孢子形成陰性革蘭氏染色陰性菌落形狀圓形的；整個平滑的邊緣；低凸面的；光滑表面；有光澤的；半透明的(2)生理學(xué)的性能過氧化氫酶；陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化(未引起發(fā)酵)
硝酸鹽還原作用陰性吲哚制備陽性從葡萄糖產(chǎn)酸陰性精氨酸二水解酶陰性脲酶陰性七葉苷(6-β-葡萄糖苷)水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King的B瓊脂上熒光顏料的制備陽性在4％ NaCl中的生長陽性的(生長差)聚-β-羥基丁酸酯積聚陰性(*)吐溫80水解陽性(*)用蘇丹黑染色在營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)的菌落來測定。
(3)底物同化作用葡萄糖陽性左旋阿拉伯糖陽性右旋甘露糖陰性右旋甘露糖醇陰性正乙酰-右旋葡萄糖胺陰性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性二蘋果酸陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性<菌株H45的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)>
(1)形態(tài)學(xué)性能細(xì)胞的形狀和大小棒狀，0.8μm×1.0-1.2μm細(xì)胞的多形性陰性移動性能動的孢子形成陰性革蘭氏染色陰性菌落形狀圓形的；整體平滑的邊緣；低凸面的；光滑表面；有光澤的；奶油色的(2)生理學(xué)的性能過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化硝酸鹽還原作用陰性吲哚制備陰性從葡萄糖產(chǎn)酸陰性精氨酸二水解酶陰性脲酶陰性七葉苷(6-β-葡萄糖苷)水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King的B瓊脂上制備的熒光顏料陽性在4％ NaCl中的生長陰性聚β-聚羥基丁酸酯積聚陰性(3)同化底物的能力葡萄糖陽性左旋阿拉伯糖陰性右旋甘露糖陽性右旋甘露糖醇陽性正乙酰-右旋葡萄糖胺陽性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性二蘋果酸陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性<菌株P(guān)91的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)>
(1)形態(tài)學(xué)性能細(xì)胞的形狀和大小棒狀，0.6μm×1.5μm細(xì)胞的多形性陰性移動性能動的孢子形成陰性革蘭氏染色陰性菌落形狀圓形的；整體平滑的邊緣；低凸面的；光滑表面；有光澤的；奶油色的(2)生理學(xué)的性能過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化硝酸鹽還原作用陰性吲哚制備陰性從葡萄糖產(chǎn)酸陰性精氨酸二水解酶陽性脲酶陰性七葉苷(6-β-葡萄糖苷)水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King的B瓊脂上制備的熒光顏料陽性(3)底物同化作用葡萄糖陽性左旋阿拉伯糖陰性右旋甘露糖陰性右旋甘露糖醇陰性正乙酰-右旋葡萄糖胺陰性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性消旋蘋果酸陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性<菌株P(guān)161的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)>
(1)形態(tài)學(xué)性能細(xì)胞的形狀和大小球狀的，Φ0.6μm棒狀，0.6μm×1.5-2.0μm細(xì)胞的多形性細(xì)長的形狀移動性能動的孢子形成陰性革蘭氏染色陰性菌落形狀圓形的；整體平滑的邊緣；低凸面的；光滑表面；淺黃色(2)生理學(xué)的性能過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O(shè)/F試驗(yàn)氧化硝酸鹽還原作用陽性吲哚制備陰性從葡萄糖產(chǎn)酸陰性精氨酸二水解酶陽性脲酶陰性七葉苷(6-β-葡萄糖苷)水解陰性明膠水解陰性β-半乳糖苷酶陰性在King的B瓊脂上制備的熒光顏料陽性(3)底物同化作用葡萄糖陽性左旋阿拉伯糖陽性右旋甘露糖陽性右旋甘露糖醇陽性正乙酰-右旋葡萄糖胺陽性麥芽糖陰性葡糖酸鉀陽性正癸酸鹽陽性己二酸鹽陰性消旋蘋果酸鹽陽性檸檬酸鈉陽性乙酸苯酯陽性根據(jù)這些細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)，并參考Bergey細(xì)菌分類學(xué)手冊(1卷(1984))和Bergey細(xì)菌學(xué)簽定手冊(第9版本(1994))，顯示菌株YN2和H45屬于菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)，而菌株P(guān)91屬于惡臭假單胞菌。因此，這些菌株被稱為菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株YN2、菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)菌株H45、和惡臭假單胞菌菌株P(guān)91。
另一方面，顯示菌株P(guān)161屬于菊苣假單胞菌種(菊苣假單胞菌sp.)，但是從它的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)上不能確定它的分類位置。然后，根據(jù)遺傳學(xué)的性質(zhì)分類，確定了菌株P(guān)161的16s核蛋白體編碼區(qū)域的脫氧核糖核酸順序(SEQ IDNo1)以檢測與菊苣假單胞菌種的已知微生物的16s核糖核酸編碼區(qū)域的脫氧核糖核酸順序的同種性。結(jié)果表明在菌株P(guān)161和jessenii假單胞菌兩者之間的脫氧核糖核酸順序有非常高的同種性。而且，發(fā)現(xiàn)在System.Appl.Microbiol.，20卷，137-149頁(1997)和System.Appl.Microbiol.，22卷，45-58頁(1999)中描述的jessenii假單胞菌的細(xì)菌學(xué)上的性質(zhì)與菌株P(guān)161的性質(zhì)有高的相似性。因?yàn)閺倪@些結(jié)果可以得出菌株P(guān)161應(yīng)該屬于jessenii假單胞菌是合理的，所以菌株P(guān)161被稱為jessenii假單胞菌菌株P(guān)161。
菌株YN2、H45、P91和P161已經(jīng)保藏在國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究院(National Institute of Bioscience and Human-Technology)(專利微生物貯藏中心)，工業(yè)科學(xué)技術(shù)代理機(jī)構(gòu)，國際貿(mào)易與工業(yè)部，保藏號分別為“FERMBP-7375”、“FERM BP-7374”、“FERM BP-7373”和“FERM BP-7376”。
<培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)>
按照本發(fā)明，在含有用于引入所需的單體單元的鏈烷酸酯和生長的底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些微生物可以制備所需的PHA。這些PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
對于在制備本發(fā)明PHA的方法中使用的用于如細(xì)胞原種制備培養(yǎng)基來說，為了保持細(xì)胞的數(shù)量和活性，可以使用任何一種培養(yǎng)基，例如常見的天然培養(yǎng)基和補(bǔ)充有營養(yǎng)物的合成培養(yǎng)基，重要它他們對微生物的生長或存在沒有不良影響。根據(jù)使用的微生物，適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)條件例如溫度、通風(fēng)、攪拌等等。
在使用微生物制備和積聚PHA的情況下，含有用于引入所需的單體單元的鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基等等可以用作制備PHA的培養(yǎng)基。
對于在上述的培養(yǎng)法中使用的無機(jī)培養(yǎng)基來說，可以使用任何一種培養(yǎng)基，只要它們含有讓微生物生長的成分例如磷源(例如磷酸鹽)、氮源(例如銨鹽、硝酸鹽)等等。例如，無機(jī)培養(yǎng)基可以包括MSB培養(yǎng)基、E培養(yǎng)基(J.Biol.Chem.21897-106(1956))和M9培養(yǎng)基等等。
在本發(fā)明實(shí)施例中使用的M9培養(yǎng)基的組成如下Na2HPO46.2gKH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl1.0g(每升培養(yǎng)基，pH 7.0)例如，培養(yǎng)條件可以包括在15-40℃且優(yōu)選20-35℃的需氧條件下振蕩培養(yǎng)和攪拌培養(yǎng)。
培養(yǎng)步驟可以利用通常微生物培養(yǎng)法使用的任何一種方法，例如分批培養(yǎng)、流動分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和反應(yīng)器模式培養(yǎng)、而且可以采取連結(jié)這些方法的多個步驟的多步驟方法。
對于各自生長的底物來說，具體的培養(yǎng)步驟描述如下<培養(yǎng)基mcl-鏈烷酸酯>
例如作為兩階段培養(yǎng)的方法，即第一階段培養(yǎng)是在含具有6-12個碳原子的第一鏈烷酸酯(例如辛酸酯和壬酸酯)和第二鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基等等中進(jìn)行，直到對數(shù)生長期后期到靜止期，其中第一鏈烷酸酯作為生長底物，數(shù)量為0.1％-0.2％(按重量計算)，而第二鏈烷酸酯用于引入所需的單體單元，數(shù)量為0.01％-0.5％(按重量計算)；而在第二階段，通過離心沉淀等等收集完成第一階段培養(yǎng)之后的細(xì)胞，接著在含有第二鏈烷酸酯(數(shù)量為0.01％-0.5％(按重量計算))和沒有氮源的無機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們，并且在完成培養(yǎng)之后，采集細(xì)胞以提取所需的PHA。
另外，另一種方法是通過提供數(shù)量為0.1％-0.2％(按重量計算)的具有6-12碳原子的第一鏈烷酸酯例如辛酸酯和壬酸酯，和數(shù)量為0.01％-0.5％(按重量計算)的引入所需單體單元的第二鏈烷酸酯，來進(jìn)行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期后期到靜止期時收集細(xì)胞以提取所需的PHA。
在此方法中，將作為生長底物的mcl-鏈烷酸酯加入到培養(yǎng)基中，獲得的PHA是混有大量單體單元的PHA，該單體單元來源于作為生長底物加入的mcl-鏈烷酸酯。這種PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
<培養(yǎng)基糖>
例如作為兩階段培養(yǎng)的方法，即第一階段培養(yǎng)是在含有糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基等等中進(jìn)行，直到對數(shù)生長期后期到靜止期，其中該糖作為生長底物，數(shù)量為0.1％-0.2％(按重量計算)，而鏈烷酸酯用于引入所需的單體單元，數(shù)量為0.01％-0.5％(按重量計算)；而在第二階段，通過離心沉淀等等收集完成第一階段培養(yǎng)之后的細(xì)胞，接著在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的糖、0.01％-0.5％(按重量計算)的鏈烷酸酯且沒有氮源的無機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們，并且在完成培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞以提取所需的PHA。
另外，另一種方法是通過提供數(shù)量為0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和數(shù)量為0.01％-0.5％(按重量計算)的引入所需單體單元的鏈烷酸酯來進(jìn)行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期后期到靜止期期間收集細(xì)胞以提取所需的PHA。
在這些情況下，可根據(jù)引入所需單體單元的鏈烷酸酯的類型、微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法合理選擇加入到培養(yǎng)基中的糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)的濃度，雖然可以選擇加入量，但是培養(yǎng)基中糖的含量通常約為0.1％-2.0％(按重量計算)。另一方面，根據(jù)微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法也可合理選擇作為原料的鏈烷酸酯的濃度，雖然可以選擇加入的濃度，但是培養(yǎng)基中鏈烷酸酯的含量通常約為0.01％-0.5％(按重量計算)。因此，在含有糖(例如葡萄糖、甘露糖、果糖等等)和鏈烷酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，可以制備和積聚所需的PHA，其中除了預(yù)期的單體單元外，可引入少量或根本沒有其它的單體單元。這些PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
<培養(yǎng)基聚胨>
例如作為兩階段培養(yǎng)的方法，即第一階段是在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的的聚胨和0.1％-0.5％(按重量計算)的引入所需單體單元的鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基等等中進(jìn)行培養(yǎng)，直到對數(shù)生長期后期到靜止期；而在第二階段，通過離心沉淀等等收集完成第一階段培養(yǎng)之后的細(xì)胞，接著在含有0.01％-0.5％(按重量計算)的鏈烷酸酯且沒有氮源的無機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們，并且在完成培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞并提取所需的PHA。
另外，另一種方法是通過提供0.1％-0.2％(按重量計算)的聚胨和0.01％-0.5％(按重量計算)的引入所需單體單元的鏈烷酸酯來進(jìn)行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期后期到靜止期期間收集細(xì)胞并提取所需的PHA。
在這些情況下，可根據(jù)引入所需單體單元的鏈烷酸酯的類型、微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法合理選擇加入到培養(yǎng)基中的聚胨的濃度，雖然可以選擇加入量，但是培養(yǎng)基中聚胨的含量通常約為0.1％-2.0％(按重量計算)。對于聚胨來說，也可以視情況而定使用任何一種市售的聚胨，也就是說培養(yǎng)微生物通常使用的聚胨等等。另一方面，根據(jù)微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法也可合理選擇作為原料的鏈烷酸酯的濃度，雖然可以選擇加入的濃度，但是培養(yǎng)基中鏈烷酸酯的含量通常約為0.01％-0.5％(按重量計算)。因此，通過在含有聚胨和鏈烷酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，可以制備和積聚所需的PHA，其中除了預(yù)期的單體單元外，可引入少量或完全不引入其它單體單元。這些PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
<培養(yǎng)基三羧酸循環(huán)的有酸>
例如作為兩階段培養(yǎng)的方法，即第一階段是在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的包含在三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等等及其鹽)和0.01％-0.5％(按重量計算)鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基等等中進(jìn)行培養(yǎng)，直到對數(shù)生長期后期到靜止期，其中有機(jī)酸作為生長底物，而鏈烷酸酯用于引入所需的單體單元，和在第二階段，通過離心沉淀等等收集第一階段培養(yǎng)完成之后的細(xì)胞，接著在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的三羧酸循環(huán)的有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等等及其鹽)、0.01％-0.5％(按重量計算)的鏈烷酸酯且沒有氮源的無機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們，并且在完成培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞并提取所需的PHA。
另外，另一種方法是通過提供0.1％-2.0％(按重量計算)的三羧酸循環(huán)的有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等等及其鹽)和0.01％-0.5％(按重量計算)的用于引入所需單體單元的鏈烷酸酯來進(jìn)行培養(yǎng)，在對數(shù)生長期后期到靜止期期間收集細(xì)胞并提取所需的PHA。
在這些情況下，根據(jù)用于引入所需單體單元的鏈烷酸酯的類型、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法，合理選擇加入到培養(yǎng)基中的三羧酸循環(huán)的有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等等)的濃度，雖然可以選擇加入量，但是培養(yǎng)基中有機(jī)酸的含量通常約為0.1％-2.0％(按重量計算)。另一方面，根據(jù)微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法也可合理選擇作為原料的鏈烷酸酯的濃度，雖然可以選擇加入的濃度，但是培養(yǎng)基中鏈烷酸酯的含量通常約為0.01％-0.5％(按重量計算)。因此，通過在含有三羧酸循環(huán)的有機(jī)酸(例如乳酸、丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等等及其鹽)和鏈烷酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，可以制備和積聚所需的PHA，其中除了預(yù)期的單體單元外，可引入少量或根本不引入其它單體單元。這些PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
<培養(yǎng)基聚胨+丙酮酸及其鹽>
例如作為兩階段培養(yǎng)的方法，即第一階段是在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的的聚胨和0.01％-0.5％(按重量計算)的用于引入所需單體單元的鏈烷酸酯的無機(jī)培養(yǎng)基等等中進(jìn)行培養(yǎng)，直到對數(shù)生長期后期到靜止期；而在第二階段，通過離心沉淀等等收集第一階段完成培養(yǎng)之后的細(xì)胞，接著在含有0.1％-2.0％(按重量計算)的作為生長底物的丙酮酸及其鹽、0.01％-0.5％(按重量計算)的鏈烷酸酯、且沒有氮源的無機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們，并且在完成培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞并提取所需的PHA。
在這些情況下，可根據(jù)用于引入所需單體單元的鏈烷酸酯的類型、微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法，合理選擇加入到培養(yǎng)基中的聚胨和丙酮酸或其鹽的濃度，雖然可以選擇加入量，但是在所有情況下在培養(yǎng)基中聚胨和丙酮酸的含量通常約為0.1％-2.0％(按重量計算)。另一方面，根據(jù)微生物的屬和種、細(xì)胞密度或培養(yǎng)方法也可合理選擇作為原料的鏈烷酸酯的濃度，雖然可以選擇加入的濃度，但是培養(yǎng)基中鏈烷酸酯的含量通常約為0.01％-0.5％(按重量計算)。因此，通過分兩階段利用含有聚胨和鏈烷酸酯的培養(yǎng)基，以及含有丙酮酸或及其鹽和鏈烷酸酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，可以制備和積聚所需的PHA，其中除了引入預(yù)期的單體單元外，可引入或根本不引入其它單體單元。這些PHA通常是只有R-形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
<PHA回收>
為了從本發(fā)明方法中的細(xì)胞中回收PHA，用有機(jī)溶劑例如氯仿進(jìn)行通常的抽取是最方便的，但是在難以使用有機(jī)溶劑的情況下，也可以利用通過除去不是PHA的細(xì)胞組分的方法收集PHA，即用去垢劑例如十二烷基磺酸鈉(SDS)等等處理，用酶例如溶菌酶等等處理，用化學(xué)藥品例如乙二胺四乙酸、次氯酸鈉、氨等等處理。
<分子量>
利用上述方法可以獲得本發(fā)明的PHA。為了使聚合物具有穩(wěn)定的物理性能例如玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度、軟化點(diǎn)、熔點(diǎn)、結(jié)晶性、取向(這些物理性能是由組成聚合物的單體單元決定的)，最好是PHA具有至少大約10,000以上的數(shù)均分子量。本發(fā)明的PHA具有大約20,000或更高的數(shù)均分子量，因此可以充分地表現(xiàn)出聚合物的穩(wěn)定物理性能。從處理例如溶解方法方便的觀點(diǎn)考慮，PHA優(yōu)選具有最多大約200,000，最優(yōu)選不超過100,000的數(shù)均分子量。如上所述，這些PHA通常是只有R形式，且是全同立構(gòu)聚合物。
在細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)微生物，通過微生物制備和積聚PHA，和從細(xì)胞中回收PHA并不局限于如上所述的方法。例如，除了如上所述四種菌株外，在制備本發(fā)明PHA的方法中使用的微生物可以利用具有與這四種菌株有相似制備本發(fā)明PHA能力的微生物。
例如這些PHA可以用于裝置和醫(yī)療材料等等，以及通常的塑料應(yīng)用中。那些具有氟原子、三氟甲基特別是具有氟原子、三氟甲基等作為取代基引入預(yù)計有優(yōu)良的生物相容性，因此應(yīng)用于醫(yī)療用途。而且，由于含有氟原子、三氟甲基基團(tuán)等，它們預(yù)計有耐水作用，也可以應(yīng)用于各領(lǐng)域中的耐水處理。特別是利用由脂肪族聚酯得到的可生物降解性也可以應(yīng)用于臨時的耐水處理。
實(shí)施例實(shí)施例1
首先根據(jù)“大分子”，29，1762-1766(1996)和27，45-49(1994)描述的方法，通過Grignard反應(yīng)合成培養(yǎng)基FPVA。將5-溴戊酸溶解在無水四氫呋喃(THF)中，在氬氣氛下，于-20℃滴加3摩爾/升甲基鎂化氯THF溶液。攪拌約15分鐘后，再滴加1-溴-4-氟苯和鎂的THF溶液并加入0.1摩爾/升Li2CuCl4THF溶液(溫度保持在-20℃)。使反應(yīng)溶液恢復(fù)到室溫，進(jìn)一步攪拌過夜。然后將溶液倒入在冰上冷卻的20％硫酸溶液中并攪拌?；厥账畬?，用鹽飽和，用乙醚萃取。萃取后，再用100毫升脫離子水萃取，向其中加入50克氫氧化鉀，用20％硫酸溶液酸化萃取液，回收沉淀物。
用核磁共振設(shè)備(FT-NMRBruker DPX400)在下列條件下分析沉淀物核素1H和13C；溶劑重質(zhì)氯仿(含TMS)。結(jié)果示于圖1和表3中。
實(shí)施例2在200毫升含0.1％壬酸和0.1％FPVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株H45細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.2％FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果示于表4中。
實(shí)施例3在200毫升含0.1％壬酸和0.1％FPVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株YN2細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.2％FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用直徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果示于表5中。
實(shí)施例4在200毫升含0.1％壬酸的M9培養(yǎng)基中接種菌株P(guān)91細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.1％壬酸和0.1％FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用直徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果示于表6中。
實(shí)施例5在200毫升含0.1％壬酸的M9培養(yǎng)基中接種菌株P(guān)161細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.1％壬酸和0.1％FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用直徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體的甲基酯。結(jié)果示于表7中。
實(shí)施例6將100毫升用菌株H45獲得的PHA溶解在1毫升氯仿中，加入正己烷直到它們渾濁。離心渾濁液并回收，真空干燥沉淀物。再將它們?nèi)芙庠?毫升氯仿中，加入正己烷，重復(fù)回收沉淀物的過程3次。
根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的沉淀物后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體的甲基酯。正如表8所示的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉淀物是PHA，其單體單元僅由3HFPV組成。
另外，使用核磁共振設(shè)備(FT-NMRBruker DPX400)在下列條件下進(jìn)行分析核素1H和13C；溶劑重質(zhì)氯仿(含TMS)。結(jié)果示于圖2、表9、圖3和表10中。
實(shí)施例7(合成FPxVA)將240毫升脫水丙酮倒入三頸圓底燒瓶中后，加入碘化鈉(0.06摩爾)，碳酸鉀(0.11摩爾)和4-氟苯酚(0.07摩爾)并徹底攪拌。在氮?dú)夥障拢蛉芤褐械渭?-溴乙基戊酸酯(0.06摩爾)，在60±5℃下回流，并反應(yīng)24小時。反應(yīng)后，用一個蒸發(fā)器濃縮反應(yīng)溶液至干，并將其再溶解在二氯甲烷中。加入水并分離溶液。用無水硫酸鎂脫水有機(jī)層，用一個蒸發(fā)器濃縮至干。
向反應(yīng)物中加入熱甲醇，使其溶解，緩慢冷卻并再沉淀，獲得5-(4-氟苯氧基)乙基戊酸酯。此時，5-溴乙基戊酸酯的產(chǎn)率為68摩爾％。
將獲得的反應(yīng)物(酯)溶解在乙醇-水(9.1(v/v))中，結(jié)果是5重量％。加入10倍摩爾量的氫氧化鉀，使其在0-4℃下反應(yīng)4小時，水解成酯。
將反應(yīng)溶液倒入10體積的0.1摩爾/升鹽酸溶液中，過濾回收沉淀物。在室溫下真空干燥回收的沉淀物(反應(yīng)物)36小時。將獲得的干物質(zhì)溶解在少量的熱乙醇中，逐漸冷卻溶液，再沉淀，在室溫下真空干燥24小時，獲得目的化合物5-(4-氟苯氧基)戊酸。用5-溴乙基戊酸酯獲得的該化合物的產(chǎn)率為49摩爾％。
在下列條件下，通過NMR分析獲得的化合物<設(shè)備>
FT-NMRBruker DPX4001H共振頻率400MHZ<測定條件>
核素1H溶劑CDCl3參比值含毛細(xì)管的TMS/CDCl3溫度:室溫光譜圖示于圖4，鑒定結(jié)果示于表11。
上述結(jié)果證實(shí)了一定能合成要求的FPxVA。
實(shí)施例8(用菌株P(guān)91制備PHA)在200毫升含0.1重量％壬酸和0.1重量％FPxVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株P(guān)91細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.1重量％壬酸和0.1重量％FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重凍干的顆粒后，將該顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA并稱重。產(chǎn)率示于表12中。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，轉(zhuǎn)化為聚苯乙烯基準(zhǔn))進(jìn)行測定。分子量示于表13中。
另外，在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用GC-MS進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。TIC和每個峰的質(zhì)譜示于圖5-圖7A和7B中。所示的峰(1)代表3-羥甲基庚酸酯，峰(2)代表3-羥甲基辛酸酯，峰(3)代表3-羥甲基壬酸酯，和峰(4)代表3-羥基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述結(jié)果說明獲得的聚合物是含3-羥基庚酸，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸和3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸單元的PHA。
實(shí)施例9(用菌株YN2(1)制備PHA)除了用菌株YN2代替菌株P(guān)91外，采用與實(shí)施例8描述的相同步驟制備PHA，并進(jìn)行各種分析。產(chǎn)率示于表12中，分子量示于表13中，GC-MS的TIC示于圖8中。所示的峰(1)代表3-羥甲基庚酸酯，峰(2)峰代表3-羥甲基辛酸酯，峰(3)代表3-羥甲基壬酸酯，和峰(4)代表3-羥基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述結(jié)果說明獲得的聚合物是含3-羥基庚酸，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸和3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸單元的PHA。
實(shí)施例10(用菌株P(guān)161制備PHA)除了用菌株P(guān)161代替菌株P(guān)91外，采用與實(shí)施例8描述的相同步驟制備PHA，并進(jìn)行各種分析。產(chǎn)率示于表12中，分子量示于表13中，GC-MS的TIC示于圖9中。所示的峰(1)代表3-羥甲基庚酸酯，峰(2)峰代表3-羥甲基辛酸酯，峰(3)代表3-羥甲基壬酸酯，和峰(4)代表3-羥基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述結(jié)果說明獲得的聚合物是含3-羥基庚酸，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸和3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸單元的PHA。
實(shí)施例11(用菌株H45制備PHA)除了用菌株H45代替菌株P(guān)91外，采用與實(shí)施例8描述的相同步驟制備PHA，并進(jìn)行各種分析。產(chǎn)率示于表12中，分子量示于表13中，GC-MS的TIC示于圖10中。所示的峰(1)代表3-羥甲基庚酸酯，峰(2)峰代表3-羥甲基辛酸酯，峰(3)代表3-羥甲基壬酸酯，和峰(4)代表3-羥基-4-(4-氟苯氧基)甲基戊酸酯。
上述結(jié)果說明獲得的聚合物是含3-羥基庚酸，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸和3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸單元的PHA。
實(shí)施例12(用菌株YN2(2)制備PHA)在200毫升含0.1重量％己酸和0.1重量％FPxVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株YN2細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。72小時后，離心收集細(xì)胞，將其懸浮在200毫升含0.1重量％己酸和0.1重量％FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。30小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
按與實(shí)施例8描述的相同步驟萃取PHA，并進(jìn)行各種分析。產(chǎn)率示于表12中，分子量示于表13中。GC-MS分析的結(jié)果表明按該方法獲得的PHA具有下列組成3-羥基丁酸8.1％3-羥基己酸51.2％
3-羥基辛酸1.3％3-羥基癸酸7.0％3-羥基十二酸10.6％未鑒定的物質(zhì)9.9％3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸11.9％上述結(jié)果說明獲得的聚合物是含3-羥基-4-(4-氟苯氧基)戊酸單元的PHA。
實(shí)施例13(合成TFMPVA)首先根據(jù)“大分子”，29，1762-1766(1996)和27，45-49(1994)描述的方法，合成培養(yǎng)基TFMPVA。將5-溴戊酸溶解在無水四氫呋喃(THF)中，在氬氣氛下，于-20℃滴加3摩爾/升甲基鎂化氯THF溶液。攪拌約15分鐘后，再滴加1-溴-4-三氟苯和鎂的THF溶液并加入0.1摩爾/升Li2CuCl4的THF溶液(溫度保持在-20℃)。使反應(yīng)溶液恢復(fù)到室溫，進(jìn)一步攪拌過夜。然后將溶液倒入在冰上冷卻的20％硫酸溶液中并攪拌?；厥账畬?，用鹽飽和，用乙醚萃取。萃取后，再用100毫升脫離子水萃取，向其中加入50克氫氧化鉀，用20％硫酸溶液酸化萃取液，回收沉淀物。
用常規(guī)方法甲基酯化回收的化合物，并用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MC，Shimadzu GC-MS QP-5050，柱DB-WAXETR(30米×0.32毫米×0.5微米)(J&W股份有限公司制造))。TIC(總離子色譜)和質(zhì)譜示于圖11A和11B中。這些結(jié)果表明合成了目的物TFMPVA。
實(shí)施例14(用菌株H45制備聚合物)在200毫升含0.1％壬酸和0.1％TFMPVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株H45細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.2％TFMPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA并稱重。產(chǎn)率示于表14中。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，轉(zhuǎn)化為聚苯乙烯基準(zhǔn))進(jìn)行測定。所示的Mn＝64000和Mw＝110000。
在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法，柱DB-WAXERT(30米×0.32毫米×0.5微米))進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。TIC(總離子色譜)和代表目的物單元3-羥基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸的一個峰(靠近36.5′)的質(zhì)譜分別示于圖12A和12B中。PHA各單元的TIC面積比示于表15中。
上述結(jié)果說明按本發(fā)明任一方法制備的PHA是含3-羥基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸單體單元的PHA。
實(shí)施例15(用菌株P(guān)91制備聚合物)在200毫升含0.1％壬酸和0.1％TFMPVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株P(guān)91細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。30小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.1％TFMPVA和0.05％壬酸但不含氮源(NH4Cl)的N9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。30小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA并稱重。
產(chǎn)率示于表16中。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLgel MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，轉(zhuǎn)化為聚苯乙烯基準(zhǔn))進(jìn)行測定。示出的Mn＝69000和Mw＝120000。
在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法，柱DB-WAXERT(30米×0.32毫米×0.5微米))進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。TIC(總離子色譜)和代表目的物單元3-羥基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸的一個峰(靠近36.5′)的質(zhì)譜分別示于圖13A和13B中。PHA各單元的TIC面積比示于表17中。
上述結(jié)果說明按本發(fā)明任一方法制備的PHA是含3-羥基-5-(4-三氟甲基苯基)戊酸單體單元的PHA。
實(shí)施例16在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株YN2細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。40小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干獲得一種凍干的顆粒。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌28小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果，正如表18所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源可以獲得高產(chǎn)率的含3HPV(它是由要求的PVA產(chǎn)生的單體單元)的PHA。
實(shí)施例17在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株YN2細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。40小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果，正如表19所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源可以獲得高產(chǎn)率的含3HPV(它是由要求的PVA產(chǎn)生的單體單元)的PHA。
實(shí)施例18在200毫升含0.5％D-甘露糖或0.5％D-果糖和0.1％PVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株YN2細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。在D-甘露糖體系中100小時和在D-果糖體系中40小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-甘露糖或0.5％D-果糖和0.1％PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果，正如表20所示的，D-甘露糖和D-果糖作為碳源使用時與D-葡萄糖一樣有效，可以獲得高產(chǎn)率的3HPV(它是由要求的PVA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例19在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PVA的M9培養(yǎng)基中接種菌株P(guān)161細(xì)胞，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖合培養(yǎng)。40小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器進(jìn)行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。在根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果，正如表21所示的，采用D-葡萄糖作為碳源可以獲得高產(chǎn)率的3HPV(它是由要求的PVA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例20在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％FPVA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株YN2細(xì)胞48小時。離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％FPVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)40小時。離心分離收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果示于表22中。正如表22所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3-羥基-5-(4-氟苯基)戊酸(它是由要求的PVA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例21在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PHxA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株P(guān)161細(xì)胞48小時。離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PHxA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)40小時。離心分離收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯。結(jié)果示于表23中。正如表23所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3-羥基-6-苯基己酸(它是由要求的PHxA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例22在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株YN2細(xì)胞48小時。離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)40小時。離心分離收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。結(jié)果示于表24中。正如表24所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3-羥基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例23在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株H45細(xì)胞48小時。離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)40小時。離心分離收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。結(jié)果示于表25中。正如表25所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3-羥基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例24在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株P(guān)161細(xì)胞48小時。離心收集細(xì)胞，將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％PxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)40小時。離心分離收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。結(jié)果示于表25中。正如表25所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3-羥基-4-苯氧基丁酸(它是由要求的PxBA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例25
在200毫升含0.5％D-葡萄糖或0.1％正壬酸和0.1％CHBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃和125轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u合培養(yǎng)菌株YN2細(xì)胞40小時。離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌28小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮溶液，僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解由此獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。結(jié)果示于表27中。正如表27所示的，采用D-葡萄糖作為生長用的碳源進(jìn)行培養(yǎng)可以獲得高產(chǎn)率的3HCHB(它是由要求的CHBA產(chǎn)生的單體單元)比例高的PHA。
實(shí)施例26(用菌株YN2制備聚-3-羥基-5-苯基戊酸)將生長在M9瓊脂培養(yǎng)基中的菌株YN2的菌落在總共4種類型的培養(yǎng)基中(每種培養(yǎng)基200毫升)接種，并在30℃下培養(yǎng)24小時，瓊脂培養(yǎng)基含0.1％壬酸(下文稱為NA)，所述類型的培養(yǎng)基包括(1)含0.5％酵母提取物(DIFCO，下文稱為YE)和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，(2)含0.5％牛肉提取物(DIFCO，下文稱為BE)和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，(3)含0.5％酪蛋白氨基酸(DIFCO，下文稱為CA)和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(4)含0.5％聚胨(Wako Jun-yaku，下文稱為PP)和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基。從每種培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重從每種培養(yǎng)基中收集的凍干顆粒并將其懸浮在100毫升氯仿中，在55℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾每種萃取溶液并用蒸發(fā)器濃縮。在冷卻甲醇中再沉淀濃縮的溶液，獲得聚合物，在真空、室溫下干燥聚合物并稱重。所得產(chǎn)率示于表28中。
按下列方法分析制備的PHA組成。在25毫升的蛋植物型燒瓶中，將大約10毫克的PHA溶解在2毫升的氯仿中，向其中加入2毫升含3％硫酸的甲醇溶液。在100℃下回流加熱混合物3.5小時，發(fā)生反應(yīng)。在反應(yīng)完成后，向流出物中加入10毫升脫離子水，劇烈搖晃10分鐘。它們被分成兩層，取出較低的氯仿層，用硫酸鎂脫水，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI法，0.32毫米×30米柱(J&W，DB-WAX))進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)PHA單體單元含有96％3-羥基-5-苯基戊酸單元和4％3-羥基丁酸單元。
結(jié)果表明本發(fā)明任一實(shí)施方式都能制得高產(chǎn)率的3-羥基-5-苯基戊酸單元比例高的PHA。
實(shí)施例27(用菌株YN2制備聚-3-羥基-4-環(huán)己基丁酸)將生長在M9瓊脂培養(yǎng)基中的菌株YN2的菌落在2種類型的培養(yǎng)基中(每種培養(yǎng)基200毫升)接種，并在30℃下培養(yǎng)24小時，瓊脂培養(yǎng)基含0.1％NA，所述類型的培養(yǎng)基包括(1)含0.5％YE和0.1％4-環(huán)己基丁酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(2)含0.5％PP和0.1％4-環(huán)己基丁酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基。從每種培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重從每種培養(yǎng)基中收集的凍干顆粒并將其懸浮在100毫升氯仿中，在55℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾每種萃取溶液并用蒸發(fā)器濃縮。在冷卻甲醇中再沉淀濃縮的溶液，獲得聚合物，在真空、室溫下干燥聚合物并稱重。所得產(chǎn)率示于表29中。
按與實(shí)施例26相同的方法分析制備的PHA組成。發(fā)現(xiàn)PHA單體單元含有97％3-羥基-4-環(huán)己基丁酸單元和3％3-羥基丁酸單元。
結(jié)果表明本發(fā)明任一實(shí)施方式都能制得高產(chǎn)率的3-羥基-4-環(huán)己基丁酸單元比例高的PHA。
實(shí)施例28(用菌株YN2制備聚-3-羥基-5-苯氧基戊酸)將生長在M9瓊脂培養(yǎng)基中的菌株YN2的菌落在2種類型的培養(yǎng)基中(每種培養(yǎng)基200毫升)接種，并在30℃下培養(yǎng)24小時，瓊脂培養(yǎng)基含0.1％NA，所述類型的培養(yǎng)基包括(1)含0.5％YE和0.1％5-苯氧基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(2)含0.5％PP和0.1％5-苯氧基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基。從每種培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重從每種培養(yǎng)基中收集的凍干顆粒并將其懸浮在100毫升氯仿中，在55℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾每種萃取溶液并用蒸發(fā)器濃縮。在冷卻甲醇中再沉淀濃縮的溶液，獲得聚合物，在真空、室溫下干燥聚合物并稱重。所得產(chǎn)率示于表30中。
按與實(shí)施例26相同的方法分析制備的PHA組成。發(fā)現(xiàn)PHA單體單元含有95％3-羥基-5-苯氧基戊酸單元和5％3-羥基丁酸單元。
結(jié)果表明本發(fā)明任一實(shí)施方式都能制得高產(chǎn)率的3-羥基-5-苯氧基戊酸單元比例高的PHA。
實(shí)施例29(用菌株H45制備聚-3-羥基-5-苯基戊酸)將生長在M9瓊脂培養(yǎng)基中的菌株YN2的菌落在4種類型的培養(yǎng)基中(每種培養(yǎng)基200毫升)接種，并在30℃下培養(yǎng)24小時，瓊脂培養(yǎng)基含0.1％NA，所述類型的培養(yǎng)基包括(1)含0.5％YE和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(2)含0.5％谷氨酸鈉(Kishida Kagaku，下文稱為SG)和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，(3)含0.5％CA和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(4)含0.5％PP和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基。從每種培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重從每種培養(yǎng)基中收集的凍干顆粒并將其懸浮在100毫升氯仿中，在55℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾每種萃取溶液并用蒸發(fā)器濃縮。在冷卻甲醇中再沉淀濃縮的溶液，獲得聚合物，在真空、室溫下干燥聚合物并稱重。所得產(chǎn)率示于表31中。
按與實(shí)施例26相同的方法分析制備的PHA組成。發(fā)現(xiàn)PHA主要是3-羥基-5-苯基戊酸的均聚物。
結(jié)果表明本發(fā)明任一實(shí)施方式都能制得高產(chǎn)率的3-羥基-5-苯基戊酸單元比例高的PHA。
實(shí)施例30(用菌株P(guān)161制備聚-3-羥基-5-苯基戊酸)將生長在M9瓊脂培養(yǎng)基中的菌株P(guān)161的菌落在4種類型的培養(yǎng)基中(每種培養(yǎng)基200毫升)接種，并在30℃下培養(yǎng)24小時，瓊脂培養(yǎng)基含0.1％NA，所述類型的培養(yǎng)基包括(1)含0.5％YE和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(2)含0.5％SG和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，(3)含0.5％BE和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基，和(4)含0.5％PP和0.1％5-苯基戊酸的M9液態(tài)培養(yǎng)基。從每種培養(yǎng)基中離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
稱重從每種培養(yǎng)基中收集的凍干顆粒并將其懸浮在100毫升氯仿中，在55℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾每種萃取溶液并用蒸發(fā)器濃縮。在冷卻甲醇中再沉淀濃縮的溶液，獲得聚合物，在真空、室溫下干燥聚合物并稱重。所得產(chǎn)率示于表32中。
按與實(shí)施例26相同的方法分析制備的PHA組成。發(fā)現(xiàn)PHA含有97％3-羥基-5-苯基戊酸單元和3％3-羥基丁酸單元。
結(jié)果表明本發(fā)明任一實(shí)施方式都能制得高產(chǎn)率的3-羥基-5-苯基戊酸單元比例高的PHA。
實(shí)施例31將菊苣假單胞菌菌株YN2在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，搖動速率為125轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間為72小時，移出2毫升培養(yǎng)液在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％NO2PxBA的M9培養(yǎng)基中進(jìn)一步進(jìn)行搖動培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，搖動速率為125轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間為72小時。離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)48小時。離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR在下列條件下分析由此制備的PHA<分析器>
FT-NMRBruker DPX400共振頻率1H＝400 Mhz<分析條件>
需分析的核素1H溶劑CDCl3參比值密封在毛細(xì)管中的TMS/CDCl3溫度室溫圖14示出了1H-NMR光譜圖，表33示出了光譜圖的鑒定結(jié)果，表34示出了3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元的組成。正如表33所示的，PHA是用化學(xué)式(45)代表的物質(zhì)，含有3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元。 根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，除了3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元外，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。結(jié)果示于表34中。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，轉(zhuǎn)化為聚苯乙烯基準(zhǔn))進(jìn)行測定，PHA的數(shù)均分子量(Mn)為81900，重均分子量(Mw)為226200。
實(shí)施例32將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％NO2PxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。45小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR在實(shí)施例31的條件下分析由此制備的PHA。
結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表35所示。
根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表35中。
實(shí)施例33將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％聚胨和0.1％NO2PxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。21小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％丙酮酸鈉和0.1％NO2PxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例31的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表36所示。
根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表36中。
實(shí)施例34首先將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)，然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。47小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在下列條件下測定獲得的PHA
<測定儀器>
FT-NMRBruker DPX400共振頻率1H＝400 Mhz<測定條件>
測定核素1H測定溶劑CDCl3參比值；密封在毛細(xì)管中的TMS/CDCl3測定溫度室溫圖15示出了1H-NMR光譜圖，表37示出了其相應(yīng)的結(jié)果，表38示出了PHA所含的3-羥基-4-(氰基苯氧基)丁酸單體單元的組成。正如表37所示的，PHA是用化學(xué)式(46)代表的物質(zhì)，含有3-羥基-4-(氰基苯氧基)丁酸單體單元。 另外，根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除了3-羥基-4-(硝基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表38中。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑(氯仿，折合聚苯乙烯)測定PHA的分子量，獲得Mn＝58200，Mw＝108100。
實(shí)施例35首先將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)，然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxA的M9培養(yǎng)基中，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。47小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例34的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表39所示。
根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和除了3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表39中。
實(shí)施例36將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例34的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表40所示。
另外，根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表40中。
實(shí)施例37將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％D-葡萄糖和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例34的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表41所示。
另外，根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，然后用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表41中。
實(shí)施例38將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％聚胨和0.1％CNPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。23小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％丙酮酸鈉和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例34的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表42所示。
另外，根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表42中。
實(shí)施例39將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞在200毫升含0.5％聚胨和0.1％CNPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，并在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。23小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有0.5％丙酮酸鈉和0.1％CNPxBA但不含氮源(NH4Cl)，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)NMR分析在實(shí)施例34的條件下測定獲得的PHA。結(jié)果證實(shí)PHA是含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的PHA，如表43所示。
另外，根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物和鑒定除3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元外的單體單元。結(jié)果示于表43中。
實(shí)施例40(合成4-(4-氟苯氧基)丁酸)按下列合成方法制備一種新型化合物，4-(4-氟苯氧基)丁酸。
向一個有四開口的圓底燒瓶中倒入240毫升無水丙酮，加入15.2克(0.11摩爾)碳酸鉀，在氮?dú)夥障聰嚢琛Ｏ蛟撊芤褐屑尤?.0克(0.06摩爾)碘化鈉和7.9克(0.07摩爾)4-氟苯酚，在室溫、氮?dú)夥障聫氐讛嚢?。然后加?1.7克(0.06摩爾)4-溴乙基丁酸酯，在65℃下回流加熱24小時。
在上述反應(yīng)完成后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑丙酮，將其殘留物再溶解在氯仿中。加入水進(jìn)行相分離，收集有機(jī)層。用無水硫酸鎂脫水有機(jī)層后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去氯仿。然后，用真空泵干燥獲得14.0克粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸酯(氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計GC-MS Shimadzu QP-5050，GC-MS峰比純度用EI法為65.2％)。在下列的酯水解反應(yīng)中使用未經(jīng)純化的制成的粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸。
將制成的粗4-(4-氟苯氧基)乙基丁酸酯溶解在300毫升乙醇-水(1∶9(v/v))的混合溶液中，在冰冷卻下(0-4℃)在4小時內(nèi)，向反應(yīng)物中加入大約10倍摩爾當(dāng)量的氫氧化鉀。將混合物倒入3升0.1摩爾/升鹽酸中，使其沉淀。過濾沉淀物，分離，用真空泵進(jìn)行干燥，獲得粗4-(4-氟苯氧基)丁酸。
將所得到的粗4-(4-氟苯氧基)丁酸(沉淀物)溶解在少量的熱甲醇中，逐漸冷卻到再結(jié)晶。用真空泵干燥過濾的再結(jié)晶產(chǎn)物，獲得目的化合物，4-(4-氟苯氧基)丁酸。在一系列的過程中，按4-溴甲基丁酸酯原料計的產(chǎn)率為52.7％。
為了證實(shí)制成的化合物是目的物4-(4-氟苯基)丁酸，用下列測定裝置在下列測定條件下進(jìn)行NMR分析，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。
<測定裝置>
ET-NMRBruker DPX 400<測定條件>
共振頻率1H400 Mhz13C 100 Mhz測定核素1H，13C使用的溶劑CDCl3參比值毛細(xì)管密封的TMS/CDCl3測定溫度室溫圖16和17分別示出了測定的1H-NMR光譜特征和13C-NMR光譜特征。表44和45示出了圖16和17示出的NMR光譜每種信號的對應(yīng)分析結(jié)果。對應(yīng)的分析結(jié)果證實(shí)所得到的化合物是目的物4-(4-氟苯氧基)丁酸。
實(shí)施例41首先將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞(FERM BP-7375)在10亳升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖動培養(yǎng)72小時。然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基(不含元機(jī)氮源，NH4Cl)中，以125轉(zhuǎn)/分鐘連續(xù)搖動培養(yǎng)。45小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。46小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
根據(jù)常規(guī)方法甲醇分解獲得的PHA，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，EI方法)進(jìn)行分析，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。圖18示出了測定的GC-MS光譜數(shù)據(jù)，上部特征示出了GC光譜，下部特征示出了對應(yīng)于GC光譜上主峰的MS光譜。該結(jié)果表明獲得的PHA含主要組分3-羥基-4-(4-氟苯氧基)丁酸單體單元，另外，還含有少量的六種單體單元。可以用下列化學(xué)式(47)表示。 此外，通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑(氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定PHA的分子量。
表46示出了鑒定結(jié)果，平均分子量，以及凍干顆粒的產(chǎn)率和回收的聚合物。表明獲得的PHA是含3-羥基-4-(4-氟苯氧基)丁酸(3HpFPxB)單體單元。此外，同樣地，萃取的PHA包括主要組分3HpFPxB單元，但是，它們是含多于一種單體單元組分的混合物，所述單體單元選自由3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十二碳烯酸組成的組。測定的分子量(按數(shù)均分子量計)為Mn＝42400，另一方面，Mw＝90600(按重均分子量計)。
按與實(shí)施例40相同的測定裝置和測定條件通過NMR分析測定PHA。測定的1H-NMR光譜特征示于圖19。表47示出了圖19所示的NMR光譜主峰各種信號的對應(yīng)分析結(jié)果。該對應(yīng)的分析結(jié)果證實(shí)獲得的PHA含主要組分3HpFPxB單元。
實(shí)施例42將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞； FERM BP-7374在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖動培養(yǎng)72小時。然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。45小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在含有0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。46小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表48中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA是含3HpFPxB單體單元的PHA。萃取的PHA主要由主要組分3HpFPxB組成。認(rèn)為是含多于一種化合物的混合物，所述化合物選自由3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十二碳烯酸組成的組。
實(shí)施例43將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。96小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。 64小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表49中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HpFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例44將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)、96小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表50中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HpFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例45將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)、24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表51中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HpFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例46將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％pFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表52中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HpFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例47(合成4-(3-氟苯氧基)丁酸)按下列合成方法制備一種新型化合物，4-(3-氟苯氧基)丁酸。
向一個有四頸圓底燒瓶中倒入240毫升無水丙酮，加入15.2克(0.11摩爾)碳酸鉀，在氮?dú)夥障聰嚢?。向該溶液中加?.0克(0.06摩爾)碘化鈉和7.9克(0.07摩爾)3-氟苯酚，在室溫、氮?dú)夥障聫氐讛嚢杌旌衔?。然后加?1.7克(0.06摩爾)4-溴乙基丁酸酯，在65℃下回流加熱24小時。
在上述反應(yīng)完成后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾掉溶劑丙酮，將其殘留物溶解在氯仿中。加入水進(jìn)行相分離，收集有機(jī)層。用無水硫酸鎂脫水有機(jī)層后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸餾掉氯仿。然后，用真空泵干燥獲得14.0克粗4-(3-氟苯氧基)乙基丁酸酯(純度87.9％，GC-MS峰比，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計GC-MS ShimadzuQP-5050，按EI方法測定)。接著對獲得的未經(jīng)純化的粗4-(3-氟苯氧基)乙基丁酸酯進(jìn)行酯水解。
將3.0克由此獲得的粗酯溶解在100毫升乙醇-水(1∶9(v/v))的混合溶液中，向反應(yīng)物中加入大約10倍過摩爾當(dāng)量的氫氧化鉀，使混合物在室溫下反應(yīng)4小時。將反應(yīng)混合物倒入200毫升0.1摩爾/升鹽酸水溶液中，使其沉淀。過濾沉淀物，分離，用真空泵進(jìn)行干燥，獲得粗4-(4-氟苯氧基)丁酸。
將由此獲得的粗4-(3-氟苯氧基)丁酸(沉淀物)溶解在少量的熱甲醇中，逐漸冷卻到再結(jié)晶。用真空泵干燥過濾的再結(jié)晶產(chǎn)物，獲得目的化合物，4-(3-氟苯氧基)丁酸。
用3.0克粗酯獲得的4-(3-氟苯氧基)丁酸的產(chǎn)率為2.4克。整個過程中按4-溴甲基丁酸酯原料計的總產(chǎn)率為93.2％。
為了證實(shí)目的化合物4-(3-氟苯氧基)丁酸，用下列測定裝置和下列測定條件進(jìn)行NMR分析，鑒定獲得的化合物的結(jié)構(gòu)。
<測定裝置>
FT-NRBruker DPX 400<測定條件>
共振頻率1H400MHZ13C 100MHZ測定核素1H和13C使用的溶劑CDCl3參比值毛細(xì)管密封的TMS/CDCl3測定溫度室溫圖20和21分別示出了測定的1H-NMR光譜特征和13C-NMR光譜特征。表53和54示出了圖20和21示出的NMR光譜每種信號的對應(yīng)分析結(jié)果。根據(jù)該分析結(jié)果(測量)，證實(shí)獲得的化合物是目的物4-(3-氟苯氧基)丁酸。
實(shí)施例48將菊苣假單胞菌菌株YN2細(xì)胞(FERM BP-7375)在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖動培養(yǎng)72小時。然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA的M9培養(yǎng)基中，以125轉(zhuǎn)/分鐘連續(xù)搖動培養(yǎng)。45小時后，離心收集細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA但不含無機(jī)氮源，NH4Cl的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。47小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
將由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定PHA單體單元的甲基酯化產(chǎn)物。圖22示出了測定的GC-MS光譜數(shù)據(jù)，上部特征示出了GC光譜，下部特征示出了對應(yīng)于GC光譜上斌峰的MS光譜。該結(jié)果表明獲得的PHA含主要組分3-羥基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)單體單元，另外，還含有少量的6種單體單元，可以用下列化學(xué)式(48)表示。 此外，通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑(氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定PHA的分子量。
表55示出了鑒定結(jié)果，平均分子量，以及凍干顆粒的產(chǎn)率和回收的聚合物。表明獲得的PHA是含3-羥基-4-(3-氟苯氧基)丁酸(3HmFPxB)單體單元。此外，同樣地，萃取的PHA包括主要組分3HmFPxB單元，認(rèn)為它們是含多于一種單體單元組分的混合物，所述單體單元選自由3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十二碳烯酸組成的組。測定的分子量為數(shù)均分子量Mn＝34500和重均分子量Mw＝75200。
按與實(shí)施例47相同的測定裝置和測定條件通過NMR分析測定PHA。測定的1H-NMR光譜特征示于圖23。表56示出了圖23所示的NMR光譜主峰各種信號的對應(yīng)分析結(jié)果(測量)。根據(jù)分析結(jié)果(測量)，證實(shí)獲得的化合物含主要組分3HmFPxB單元。
實(shí)施例49將菊苣假單胞菌菌株H45細(xì)胞；FERM BP-7374在10毫升含0.5％D-葡萄糖的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖動培養(yǎng)72小時。然后移出2毫升培養(yǎng)液加入到200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA的M9培養(yǎng)基中，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。45小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在含有0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。47小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表57中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA是含3HmFPxB單體單元的PHA。萃取的PHA主要由主要組分3HmFPxB組成。認(rèn)為是含多于一種化合物的混合物，所述化合物選自由3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十二碳烯酸組成的組。
實(shí)施例50將菊苣假單胞菌H45在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。96小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表58中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HmFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例51將菊苣假單胞菌YN2在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表59中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HmFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例52將菊苣假單胞菌H45在200毫升含0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將其再懸浮在200毫升含有0.5％D-葡萄糖和0.1％mFPxBA但不含無機(jī)氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘搖合培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。萃取后，用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物。然后僅回收沉淀物并真空干燥獲得PHA。
對由此獲得的PHA進(jìn)行甲醇分解，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050，EI方法)分析產(chǎn)物，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表60中示出了鑒定結(jié)果，獲得的重量和凍干顆粒的產(chǎn)率。由此獲得的PHA主要含3HmFPxB單體單元的PHA。
實(shí)施例53<用菌株YN2制備含HFPxV的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％聚胨(Wzko純化學(xué)股份有限公司)和0.1％5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。27小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，然后稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表61中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，分子量和單體單元的分析結(jié)果。按GC-MS總離子色譜的面積比(TIC)計算單體單元的比例。由3-羥基丁酸甲酯和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS獲得的光譜示于圖24和25中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-(4-氟苯氧基)戊酸制備含3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
實(shí)施例54<用菌株YN2制備含HFPV的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％聚胨(Wzko純化學(xué)股份有限公司)和0.1％5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。27小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，然后稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表62中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，分子量和單體單元的分析結(jié)果。按GC-MS總離子色譜的面積比(TIC)計算單體單元的比例。由3-羥基丁酸甲酯和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS獲得的光譜示于圖26和27中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-(4-氟苯氧基)戊酸制備含3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
實(shí)施例55<用菌株YN2制備含HFPxV的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％FPxBA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。62小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并凍干。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表63中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，分子量和單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯(3HFPxV)的GC-MS測定獲得的質(zhì)譜示于圖28-30中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-(4-氟苯氧基)戊酸制備含3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)的PHA共聚物。
實(shí)施例56<用菌株YN2制備含HFPV的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。62小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表64中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖31-33中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-(4-氟苯基)戊酸制備含3-羥基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)的PHA共聚物。
實(shí)施例57<用菌株YN2制備含HFPV單元和HGPxV的PHA(采用葡萄糖二步培養(yǎng))>
分別制備含0.5％葡萄糖和0.1％5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)，和含0.5％葡萄糖和0.1％5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)的兩種M9培養(yǎng)基。將菌株YN2在200毫升的各種M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。94小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，將這兩種培養(yǎng)液一起再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖，0.1％FPVA和0.1％FPxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表65中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由GC-MS測定獲得的3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)甲酯和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(3HFPxV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖34-37中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-(4-氟苯基)戊酸和5-(4-氟苯氧基)戊酸制備含3-羥基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)單元和3-羥基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的PHA共聚物。
實(shí)施例58<用菌株YN2制備含HPxN，HPxHp單元和HPxV的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％聚胨(Wako純化學(xué)股份有限公司)和0.1％11-苯氧基十一烷酸(PxUDA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在室溫(23℃)下攪拌72小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA，然后稱重PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表66中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基-辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖38-43中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基11-苯氧基十一烷酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三種單元的PHA共聚物。
實(shí)施例59<用菌株YN2制備含HPxN單元。HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用葡萄糖兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％11-苯氧基十一癸酸(PxUDA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxUDA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，然后稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GP；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表67中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖44-52中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基11-苯氧基十一烷酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三種單元的PHA共聚物。
實(shí)施例60<用菌株H45制備含HPxN單元，HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用葡萄糖兩步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％11-苯氧基十一烷酸(PxUDA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxUDA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，然后稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表68中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基-十二烷酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖53-61中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基11-苯氧基十一烷酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)，3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羥基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)三種單元的PHA共聚物。
實(shí)施例61<用菌株YN2制備含HPxO單元，HPxHx單元和HPxB單元的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％聚胨(Wako純化學(xué)股份有限公司)和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表69中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖62-65中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基8-苯氧基辛酸制備含3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)三種單元的的PHA共聚物。
實(shí)施例62<用菌株H45制備含HPxO單元，HPxHx單元和HPxB單元的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％聚胨(Wako純化學(xué)股份有限公司)和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表70中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)進(jìn)行和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖66-69中。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基8-苯氧基辛酸制備含3-強(qiáng)擊機(jī)-4-苯氧基丁酸(3HPxB)，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的PHA共聚物。
實(shí)施例63<用菌株YN2制備含HPxO單元，HPxHx單元和HPxB單元的PHA(采用葡萄糖一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxOA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表71中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羥基-8-苯氧基辛酸甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖70-75中。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基8-苯氧基辛酸制備含3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)三種單元的PHA共聚物。
實(shí)施例64<用菌株H45制備含HPxO單元，HPxHx單元和HPxB單元的PHA(采用葡萄糖兩步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞，將它們再懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxOA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，然后進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。24小時后，離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表72中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯，3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯和3-羥基-8-苯氧基辛酸甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖76-84中。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基8-苯氧基辛酸制備含3-羥基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)，3-羥基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羥基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的PHA共聚物。
實(shí)施例65<用菌株YN2制備含HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％聚胨(Wako純化學(xué)股份有限公司)和0.1％7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表73中示出了細(xì)菌細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜示于圖85-89中。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基7-苯氧基庚酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
實(shí)施例66<用菌株H45制備含HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用聚胨一步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％聚胨(Wako純化學(xué)股份有限公司)和0.1％7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥和稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)PLGEL MICED-C(5微米)，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分。將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表74中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖90-92示出了分別由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基7-苯氧基庚酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
實(shí)施例67<用菌株YN2制備含HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用葡萄糖兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxHpA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，24小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表75中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖93-100分別示出了由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基7-苯氧基庚酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的PHA共聚物。
實(shí)施例68<用菌株H45制備含HPxHp單元和HPxV單元的PHA(采用葡萄糖兩步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％7-苯氧基己酸(PxHpA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。64小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％葡萄糖和0.1％PxHpA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，24小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，然后稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表76中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖101-107分別示出了由3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯，3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基7-苯氧基庚酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羥基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)兩種單元的PHA共聚物。
實(shí)施例69<用菌株YN2制備含PHPxV單元的PHA(采用蘋果酸鈉兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％蘋果酸鈉和0.1％5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。60小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％蘋果酸鈉和0.1％PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，24小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & WInc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表77中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖103-114分別示出了由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯和3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-苯氧基戊酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)單元的PHA共聚物。
實(shí)施例70<用菌株H45制備含HPxV單元的PHA(采用蘋果酸鈉兩步培養(yǎng))>
將菌株H45在200毫升含0.5％蘋果酸鈉和0.1％5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。60小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％蘋果酸鈉和0.1％PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，24小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表78中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖115-120分別示出了由3-羥基己酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯，3-羥基十二烷酸甲酯，3-羥基十二碳烯酸甲酯和3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株H45和培養(yǎng)基5-苯氧基戊酸制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)單元的PHA共聚物。
實(shí)施例71<用菌株YN2制備含HPV單元的PHA(采用果糖兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％果糖和0.1％5-苯基戊酸(PVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。120小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％果糖和0.1％PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，50小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表79中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖121-123分別示出了由3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯和3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-苯基戊酸制備含3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)單元的PHA共聚物。
實(shí)施例72<用菌株YN2制備含HPV單元的PHA(采用甘露糖兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％甘露糖和0.1％5-苯基戊酸(PVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。43小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％甘露糖和0.1％PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，91小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表80中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖124-125分別示出了由3-羥基辛酸甲酯和3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-苯基戊酸制備含3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)單元的PHA共聚物。
實(shí)施例73<用菌株YN2制備含HPV單元的PHA(采用乳酸兩步培養(yǎng))>
將菌株YN2在200毫升含0.5％乳酸鈉和0.1％5-苯基戊酸(PVA)的M9培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。46小時后，離心收集細(xì)胞，將它們在懸浮在200毫升含0.5％乳酸鈉和0.1％PxVA但不含氮源(NH4Cl)的M9培養(yǎng)基中，進(jìn)一步在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)，28小時后，用冷卻甲醇洗滌一次，凍干并稱重。
將凍干的顆粒懸浮在100毫升氯仿中，在60℃下攪拌24小時萃取聚合物。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得聚合物，稱重聚合物。
通過凝膠滲透色譜(GPC；Toso/HCL-8020，柱聚合物實(shí)驗(yàn)/PLGEL/MICED-C/5微米，溶劑氯仿，折合成聚苯乙烯分子量)測定獲得的聚合物的分子量。
按下列方法分析獲得的聚合物的單元組分將5毫克聚合物試樣倒入25毫升圓底燒瓶中，加入2毫升氯仿和2毫升含硫酸(3％，v/v)的甲醇。在100℃下回流混合物3.5小時，進(jìn)一步加水進(jìn)行分離。借助于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050，柱DB-WAXETR(J & W Inc.)，EI方法)分析有機(jī)層，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。表81中示出了細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，單體單元的分析結(jié)果。此外，圖126-129分別示出了由3-羥基丁酸甲酯，3-羥基辛酸甲酯，3-羥基癸酸甲酯和3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的GC-MS獲得的質(zhì)譜。
結(jié)果表明可用菌株YN2和培養(yǎng)基5-苯基戊酸制備含3-羥基-5-苯基戊酸(3HPV)單元的PHA共聚物。
實(shí)施例74
<用菌株YN2制備含HPxB單元的PHA(采用蘋果酸二鈉兩步培養(yǎng))>
將菊苣假單胞菌菌株YN2在200毫升的5種類型的M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種，每種培養(yǎng)培養(yǎng)基分別含0.1％4-苯氧基-正丁酸(PxBA)和任一種0.5％蘋果酸二鈉半水合物，L-谷氨酸鈉一水合物，D(+)-葡萄糖和正壬酸和聚胨(NihonSeiyaku)，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)。48小時后，離心收集細(xì)胞，用冷卻甲醇洗滌一次并真空干燥。
將這5種顆粒分別懸浮在20毫升氯仿中，在60℃下攪拌20小時萃取PHA。用孔徑為0.45微米的膜過濾器過濾萃取溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮濾液，在冷卻甲醇中再沉淀濃縮物，回收沉淀物，真空干燥獲得PHA。在按常規(guī)方法進(jìn)行甲醇水解后，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，Shimadzu QP-5050；EI方法)分析獲得的PHAs，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。結(jié)果在用蘋果酸二鈉作為生長碳源的情況下，如表82所示，獲得高產(chǎn)率的含高比例3-羥基-4-苯氧基-正丁酸(3HPxB)單元，由4-苯氧基-正丁酸產(chǎn)生的所需單元。此外，表83示出了在用蘋果酸二鈉情況下細(xì)胞和聚合物的產(chǎn)率，聚合物的組成。
實(shí)施例75<用菌株YN2制備含HPxB單元的PHA(采用蘋果酸二鈉兩步培養(yǎng)大量培養(yǎng))>
將菊苣假單胞菌菌株YN2在200毫升含0.5％酵母提取物(OrientalYeast Industries)的M9培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種，在30℃下以125轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)作為種子培養(yǎng)物。在盛有5升M9培養(yǎng)基和50毫升種子細(xì)胞的10升振動發(fā)酵罐中接種并在2.5升/分鐘通風(fēng)、30℃下以80轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行搖動培養(yǎng)，所述M9培養(yǎng)基含有0.5％蘋果酸二鈉半水合物和0.1％4-苯氧基-正丁酸。39小時后，離心收集細(xì)胞。將該顆粒懸浮在120毫升大約1.7％次氯酸鈉溶液中，在4℃下?lián)u動2小時萃取PHA。離心收集PHA，干燥獲得56毫克PHA/升培養(yǎng)培養(yǎng)基。
在按常規(guī)方法進(jìn)行甲醇水解后，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用計(GC-MS，ShimadzuQP-5050；EI方法)分析獲得的PHA，鑒定甲基酯化的PHA單體單元。結(jié)果用4-苯氧基-正丁酸產(chǎn)生的所要求的單體單元，即3-羥基-4-苯氧基-正丁酸單元的組分比例(GC-MS，峰面積比)為99.7％。
序列表<110>Canon公司<120>聚羥基鏈烷酸酯、它的生產(chǎn)方法、和用于該方法的微生物。<130>4351009<160>1<210>1<211>1501<212>DNA<213>jessenii假單胞菌161菌株<400>1tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctg 60aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt 120ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc 180ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg 420cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg 480tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca 600ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa660atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca720ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa780acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt840tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca900caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac960atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca 1020tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct 1080tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg 1140gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc acaaaaccga 1260tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgct agtaatcgc 1320gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt 1440gattcatgac tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca 1500c 1501
表1
表2
CDW 細(xì)胞(干重)PDW聚合物(干重)產(chǎn)率 PDW/CDW(％)表3
表4菊苣假單胞菌(P.cichorii)菌株H45
表5菊苣假單胞菌(P.cichorii)菌株YN2
表6惡臭假單胞菌P91菌株
表7P.jessenii菌株P(guān)161
表8純化的PHA
表9(1H光譜測定法的結(jié)果)共振頻率40MHz
m多重峰，t三重峰，s單峰表10(碳13光譜測定法的結(jié)果)共振頻率100MHz
表11(1H核磁共振光譜鑒定的結(jié)果，參看圖4)
m多重峰，t三重峰，d雙峰表12(不同的微生物和制備PHA的產(chǎn)率)
表13(每種微生物制備的PHA的分子量)
表14
表15
表16
表17
表18
表19
表20
表21
表22
表23
表24
表25
表26
表27
表28
CDW細(xì)胞(干重)(毫克/升) PDW聚合物(干重)(毫克/升)產(chǎn)率PDW/CDW(％)
表29
CDW細(xì)胞(干重)(毫克/升)PDW聚合物(干重)(毫克/升)產(chǎn)率 PDW/CDW(％)表30
CDW細(xì)胞(干重)(毫克/升)PDW聚合物(干重)(毫克/升)產(chǎn)率 PDW/CDW(％)表31
CDW細(xì)胞(干重)(毫克/升)PDW聚合物(干重)(毫克/升)產(chǎn)率 PDW/CDW(％)
表32
CDW細(xì)胞(干重)(毫克/升)PDW聚合物(干重)(毫克/升)產(chǎn)率 PDW/CDW(％)表331H-核磁共振光譜特性曲線的鑒定結(jié)果(參看圖14)
表34
表35
表36
表371H-核磁共振光譜特性曲線的鑒定結(jié)果(參看圖15)
表38用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2制備的PHA
表39用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)H45制備的PHA
表40用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2制備的PHA
表41用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)H45制備的PHA
表42用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2制備的PHA
表43用菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)H45制備的PHA
表441H-核磁共振光譜(參看圖16)
表45碳-13核磁共振光譜(參看圖17)
表46用菌株YN2制備的含有3HpFPxB單元的PHA
表471H-核磁共振光譜(參看圖19)
表48通過培養(yǎng)菌株H45制備含有3HpFPxB單元的PHA
表49通過培養(yǎng)菌株YN2制備含有3HpFPxB單元的PHA
表50通過培養(yǎng)菌株H45制備含有3HpFPxB單元的PHA
表51通過培養(yǎng)菌株YN2制備含有3HpFPxB單元的PHA
表52通過培養(yǎng)菌株45制備含有3HpFPxB單元的PHA
表531H-核磁共振光譜(參看圖20)
表54碳-13核磁共振光譜(參看圖21)
表55用菌株YN2制備的含有3HpFPxB單元的PHA
表561H-核磁共振光譜(參看圖23)
表57用菌株H45制備的含有3HmFPxB單元的PHA
表58用菌株H45制備的含有3HmFPxB單元的PHA
表59用菌株YNZ制備的含有3HmFPxB單元的PHA
表60用菌株H45制備的含有3HmFPxB單元的PHA
表61
表62
表63
表64
表65
表66
表67
表68
表69
表70
表71
表72
表73
表74
表75
表76
表77
表78
表79
表80
表81
表82使用菌株YN2制備聚羥基鏈烷酸酯
*氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，TIC峰面積比，ND未檢出。
表83使用菌株YN2制備聚羥基鏈烷酸酯
權(quán)利要求
1.一種聚羥基鏈烷酸酯，具有通式(1)所表示的單體單元組成AmB(1-m)(1)其中A代表通式(2)，B至少選自由通式(3)或通式(4)所代表的單體單元組成的組中的至少一種，m的值是0.01或大于或小于1。 式中，n的值為0到10，k的值是3或5，R至少選自由通式(5)到(7)所表示的基團(tuán)組成的組中的至少一個基團(tuán) 在式(5)中，R1選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中，R2選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；在式(7)中，R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；條件是下列的R不在選擇之列當(dāng)在通式(2)中選擇一類基團(tuán)作為R時式(5)的基團(tuán)中R1＝H和q＝2，R1＝H和q＝3，以及R1＝-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2＝鹵素原子和r＝2，條件是從通式(3)或(4)中選擇兩個組分作為B，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和式(7)中的基團(tuán)R3是H和s＝1，以及R3是H和s＝2；當(dāng)在通式(2)中選擇兩類基團(tuán)作為R時將式(6)中R2＝鹵素原子和r＝2和4的兩類基團(tuán)組合，條件是從通式(3)或(4)中選擇一種組分作為B。
2.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(8)的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸單體單元。
3.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(9)的3-羥基-5-(4-三氟代甲苯基)戊酸單體單元。
4.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(10)的3-羥基-4-(4-硝基苯氧基)丁酸單體單元。
5.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(11)的3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單。
6.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(12)的3-羥基-4-(4-氟代苯氧基)丁酸單體單元。
7.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(13)的3-羥基-4-(3-氟代苯氧基)丁酸單體單元。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，包括式(14)的3-羥基-4-苯氧基丁酸單體單元。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，包括式(15)的3-羥基-5-苯氧基戊酸單體單元。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，包括式(16)的3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元，單體單元不是3組分體系。
11.一種聚羥基鏈烷酸酯，包括式(8)的3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸和式(16)的3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元外。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈酯，包括式(15)的3-羥基-5-苯氧基戊酸和式(17)的3-羥基-7-苯氧基庚酸單體單元。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，包括式(14)的3-羥基-4-苯氧基丁酸，式(18)的3-羥基-6-苯氧基己酸和式(19)的3-羥基-8-苯氧基辛酸單體單元。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的聚羥基鏈烷酸酯，包括式(15)的3-羥基-5-苯氧基戊酸，式(17)的3-羥基-7-苯氧基庚酸和式(20)的3-羥基-9-苯氧基壬酸單體單元。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項的聚羥基鏈烷酸酯，其中數(shù)均分子量為10000-200000。
16.式(21)的5-(4-三氟甲基苯基)戊酸。
17.聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含鏈烷酸酯的培養(yǎng)基中用鏈烷酸酯培養(yǎng)微生物的步驟，這種微生物能合成用通式(1)表示的聚羥基鏈烷酸酯單體單元AmB(1-m)(1)其中A代表通式(2)，B至少選自由通式(3)或通式(4)所代表的單體單元組成的組中的至少一種，m的值是0.01或大于或小于1。
式中，n的值為0到10，k的值是3或5，R至少選自由通式(5)到(7)所表示的基團(tuán)組成的組中的至少一個基團(tuán) 在式(5)中，R1選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；q是選自1到8的整數(shù)；在式(6)中，R2選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；r是選自1到8的整數(shù)；在式(7)中，R3是選自由氫原子(H)，鹵素原子，-CN，-NO2，-CF3，-C2F5，和-C3F7組成的組中的一個基團(tuán)；s是選自1到8的整數(shù)；條件是下列的R不在選擇之列當(dāng)在通式(2)中選擇一類基團(tuán)作為R時式(5)的基團(tuán)中R1＝H和q＝2，R1＝H和q＝3，以及R1＝-NO2和q＝2；式(6)的基團(tuán)中R2＝鹵素原子和r＝2，條件是從通式(3)或(4)中選擇兩個組分作為B，R2是-CN和r＝3，以及R2是-NO2和r＝3；和式(7)中的基團(tuán)R3是H和s＝1，以及R3是H和s＝2；當(dāng)在通式(2)中選擇兩類基團(tuán)作為R時將式(6)中R2＝鹵素原子和r＝2。
18.聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含鏈烷酸酯和糖類的培養(yǎng)基中用鏈烷酸酯培養(yǎng)微生物的步驟，這種微生物能制備聚羥基鏈烷酸酯。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中鏈烷酸酯用式(22)表示，聚羥基鏈烷酸酯包括式(23)的單體單元 其中R至少選自由通式(24)組成的組中任一基團(tuán) 其中R4代表取代或未取代的苯基，取代或未取代的苯氧基，或取代或未取代的環(huán)己基，和t是1-8的整數(shù) 其中R′至少選自由R基團(tuán)和通式(24)所代表的基團(tuán)組成的組中的基團(tuán)，R4與選擇的R相同，但是t比選擇的R的t短2倍并且不為0。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中微生物是在含式(22)的鏈烷酸酯和糖類的培養(yǎng)基中一步培養(yǎng)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中微生物至少是分兩步中培養(yǎng)的第一步驟是在含式(22)的鏈烷酸酯和糖類的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接著的一步是在含式(22)的鏈烷酸酯和糖類并在限氮條件下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中微生物是通過在含糖類的培養(yǎng)基中接種預(yù)培養(yǎng)的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中糖類至少選自由葡萄糖，果糖和甘露糖組成的組中的一種。
24.聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)基中用鏈烷酸酯培養(yǎng)微生物的步驟，這種微生物能制備聚羥基鏈烷酸酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中鏈烷酸酯用式(22)表示，聚羥基鏈烷酸酯包括式(23)的單體單元 其中R至少選自由通式(24)組成的組中任一基團(tuán) 其中R4代表取代或未取代的苯基，取代或未取代的苯氧基，或取代或未取代的環(huán)己基，和t是1-8的整數(shù) 其中R′至少選自由R基團(tuán)和通式(24)所代表的基團(tuán)組成的組中的基團(tuán)，R4與選擇的R相同，但是t比選擇的R的t短2倍并且不為0。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中微生物是在含式(22)的鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)基中一步培養(yǎng)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中微生物至少是分兩步中培養(yǎng)的第一步驟是在含式(22)的鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接著的一步是在含式(22)的鏈烷酸酯和糖類的培養(yǎng)基中并在限氮條件下培養(yǎng)。
28.聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含鏈烷酸酯和與TCA循環(huán)連用的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中用鏈烷酸酯培養(yǎng)微生物的步驟，這種微生物能制備聚羥基鏈烷酸酯。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中鏈烷酸酯用式(22)表示，聚羥基鏈烷酸酯包括式(23)的單體單元 其中R至少選自由通式(24)組成的組中任一基團(tuán) 其中R4代表取代或未取代的苯基，取代或未取代的苯氧基，或取代或未取代的環(huán)己基，和t是1-8的整數(shù) 其中R′至少選自由R基團(tuán)和通式(24)所代表的基團(tuán)組成的組中的基團(tuán)，R4與選擇的R相同，但是t比選擇的R的t短2倍并且不為0。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中微生物是在含式(22)的鏈烷酸酯和與TCA循環(huán)連用的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中一步培養(yǎng)的。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中微生物至少是分兩步中培養(yǎng)的第一步驟是在含式(22)的鏈烷酸酯和與TCA循環(huán)連用的有機(jī)酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接著的一步是在含式(22)的鏈烷酸酯和與TCA連用的有機(jī)酸培養(yǎng)基中并在限氮條件下培養(yǎng)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中與TCA連用的有機(jī)酸選自由乳酸，丙酮酸，檸檬酸，琥珀酸，富馬酸，蘋果酸和其鹽中的至少一種。
33.聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，其中微生物至少是分兩步中培養(yǎng)的第一步驟是在含式(22)的鏈烷酸酯和聚胨的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接著的一步是在含式(22)的鏈烷酸酯和丙酮酸或其鹽的培養(yǎng)基中并在限氮條件下培養(yǎng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的制備方法，其中鏈烷酸酯用式(22)表示，聚羥基鏈烷酸酯包括式(23)的單體單元 其中R至少選自由通式(24)組成的組中任一基團(tuán) 其中R4代表取代或未取代的苯基，取代或未取代的苯氧基，或取代或未取代的環(huán)己基，和t是1-8的整數(shù) 其中R′至少選自由R基團(tuán)和通式(24)所代表的基團(tuán)組成的組中的基團(tuán)，R4與選擇的R相同，但是t比選擇的R的t短2倍并且不為0。
35.根據(jù)權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項的方法，其中微生物是假單胞菌屬某種。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的制備方法，其中微生物至少是一種選自下列的菌株菊苣假單胞菌YN2，F(xiàn)ERM BP-7376，菊苣假單胞菌H45，F(xiàn)ERM BP-7374，惡臭假單胞菌P91，F(xiàn)ERM BP-7375和jessenii假單胞菌P161，F(xiàn)ERM BP-7376。
37.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(8)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(25)的5-(4-氟代苯基)戊酸的培養(yǎng)基中用5-(4-氟代苯基)戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
38.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(9)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(21)的5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸的培養(yǎng)基中用5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-(4-三氟代甲基苯基)戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
39.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(10)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(26)的4-(4-硝基苯基)丁酸的培養(yǎng)基中用4-(4-硝基苯基)丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-(4-硝基苯基)丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
40.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(11)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(27)的4-(4-氰基苯氧基)丁酸的培養(yǎng)基中用4-(4-氰基苯氧基)丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-(4-氰基苯氧基)丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
41.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(22)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(28)的4-(4-氟代苯氧基)丁酸的培養(yǎng)基中用4-(4-氟代苯氧基)丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-(4-氟代苯氧基)丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
42.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(13)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(29)的4-(3-氟代苯氧基)丁酸的培養(yǎng)基中用4-(3-氟代苯氧基)丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-(3-氟代苯氧基)丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
43.包括權(quán)利要求18，24，28和33任一項式(30)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(31)的5-苯基戊酸的培養(yǎng)基中用5-苯基戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-苯基戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
44.包括權(quán)利要求18，24，28和33任一項式(32)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(33)的6-苯基己酸的培養(yǎng)基中用6-己酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-6-苯基己酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
45.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(14)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(34)的4-苯氧基丁酸的培養(yǎng)基中用4-苯氧基丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-苯氧基丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
46.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(15)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(35)的5-苯氧基戊酸的培養(yǎng)基中用5-苯氧基戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
47.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(16)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(36)的5-(4-氟代苯氧基)戊酸的培養(yǎng)基中用5-(4-氟代苯氧基)戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
48.包括權(quán)利要求18，24，28和33任一項式(37)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(38)的4-環(huán)己基丁酸的培養(yǎng)基中用4-環(huán)己基丁酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-環(huán)己基丁酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
49.包括權(quán)利要求18，24，28和33任一項式(8)和(16)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(25)的5-(4-氟代苯基)戊酸和式(36)5-(4-氟代苯氧基)戊酸的培養(yǎng)基中用5-(4-氟代苯基)戊酸和5-(4-氟代苯氧基)戊酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-(4-氟代苯基)戊酸和3-羥基-5-(4-氟代苯氧基)戊酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
50.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(15)和(17)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(39)的7-苯氧基庚酸的培養(yǎng)基中用7-苯氧基庚酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-7-苯氧基庚酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
51.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(14)，(18)和(19)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(40)的8-苯氧基辛酸的培養(yǎng)基中用8-苯氧基辛酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-4-苯氧基丁酸，3-羥基-6-苯氧基己酸和3-羥基-8-苯氧基辛酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
52.包括權(quán)利要求17，18，24，28和33任一項式(15)，(17)和(20)單體單元的聚羥基鏈烷酸酯的制備方法，包括在含式(41)的11-苯氧基十一烷酸的培養(yǎng)基中用11-苯氧基十一烷酸培養(yǎng)微生物的步驟，用這種微生物能制備含3-羥基-5-苯氧基戊酸，3-羥基-7-苯氧基己酸和3-羥基-9-苯氧基壬酸單體單元的聚羥基鏈烷酸酯。
53.菊苣假單胞菌H45，F(xiàn)ERM BP-7374。
54.菊苣假單胞菌YN2，F(xiàn)ERM BP-7375。
55.惡臭假單胞菌P91，F(xiàn)ERM BP-7373。
56.jessenii假單胞菌P161，F(xiàn)ERM BP-7376。
全文摘要
一種聚羥基鏈烷酸酯,具有通式(1)所表示的單體單元組成:A
文檔編號C08G63/685GK1321695SQ0013765
公開日2001年11月14日 申請日期2000年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月27日
發(fā)明者本間務(wù), 小林登代子, 矢野哲哉, 小林辰, 今村剛士, 須田榮, 見目敬 申請人:佳能株式會社