專利名稱：聚谷氨酸－喜樹(shù)堿結(jié)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含分別與喜樹(shù)堿和生物活性喜樹(shù)堿類似物共價(jià)結(jié)合的聚谷氨酸聚合物的組合物。本發(fā)明還涉及此種組合物的制備方法和藥物用途。
背景技術(shù)：
喜樹(shù)堿是一種不溶于水的旋光性生物堿，從喜樹(shù)(Camptothecaacuminata)獲得。20(S)-喜樹(shù)堿和20(S)-喜樹(shù)堿類似物是細(xì)胞毒性劑，據(jù)認(rèn)為其作用原理是穩(wěn)定DNA的磷酸二酯主鏈中的一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I-誘導(dǎo)的單鏈斷裂，從而阻止重新連接。這導(dǎo)致復(fù)制期間雙鏈DNA斷裂的產(chǎn)生，若不修復(fù)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡。20(S)-喜樹(shù)堿和許多20(S)-喜樹(shù)堿類似物不溶于水。這些藥物當(dāng)中有許多表現(xiàn)出對(duì)人體癌細(xì)胞系和動(dòng)物(活)體內(nèi)異種移植物(xenografts)的優(yōu)異抗腫瘤活性。然而，它們不溶于水的特性使這些藥物難以給藥。另外，20(S)-喜樹(shù)堿及其類似物的藥理學(xué)上重要的內(nèi)酯環(huán)在人體血漿清蛋白存在下不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致該活性藥物轉(zhuǎn)化為與該清蛋白結(jié)合的鈍化羧酸酯形式?？朔?0(S)-喜樹(shù)堿及其類似物的此種藥物和藥代動(dòng)力學(xué)缺陷的一種途經(jīng)是使它們共價(jià)鍵合到諸如聚乙二醇之類的中性聚合物上(例如參見(jiàn)下面的參考文獻(xiàn)1和2)。利用這種方法，大多數(shù)活性喜樹(shù)堿的水中溶解度可得到改善，以致該結(jié)合的聚合物可溶解在含水介質(zhì)中以非經(jīng)腸方式給藥。
目前，仍然需要一種新聚合物結(jié)合物，其每個(gè)聚合物鏈能增溶較大量20(S)-喜樹(shù)堿或20(S)-喜樹(shù)堿類似物，從而減少給定劑量活性藥物給藥時(shí)所需要的聚合物總質(zhì)量。另外，仍然存在著對(duì)這樣一種新聚合物結(jié)合物的需要，即，它具有20(S)-喜樹(shù)堿的未結(jié)合水溶性藥物前體及其類似物所不具備的作為抗腫瘤劑的獨(dú)特性質(zhì)。
背景出版物1.U.S.Patent No.5,646,1592.Greenwald et al.，Bioorg.Med.Chem.6551-562(1998)3.U.S.Patent No.5,545,8804.Conover et al.Cancer Chemother.Pharmacol.42407-414(1998)5.PCT Application WO 99/178046.Hesswijk et al.J.Cont.Re.1312(1985)7.U.S.Patent No.5,880,1318.U.S.Patent No.5,892,0439.U.S.Patent No.5,837,67310.U.S.Patent No.5,854,00611.U.S.Patent No.5,340,81712.U.S.Patent No.4,943,57913.Singer et al.，Ann.NY Acad.Sci.922136-150(2000)發(fā)明詳述定義本文所使用的術(shù)語(yǔ)“聚谷氨酸”或“聚谷氨酸聚合物”包括聚(1-谷氨酸)、聚(d-谷氨酸)、聚(d1-谷氨酸)、聚(1-γ谷氨酸)、聚(d-γ谷氨酸)和聚(d1-γ谷氨酸)。優(yōu)選的是，該聚谷氨酸聚合物包含的氨基酸殘基中至少50％是谷氨酸，更優(yōu)選100％是谷氨酸。聚谷氨酸聚合物可被天然存在或化學(xué)改性的氨基酸，優(yōu)選親水氨基酸，取代最高達(dá)50％，只要當(dāng)結(jié)合到治療劑上時(shí)該取代的聚谷氨酸聚合物具有比未結(jié)合的治療劑改進(jìn)的水中溶解度和/或改進(jìn)的效果，且優(yōu)選是非致免疫的。
按本文所描述的方法制備結(jié)合物中所使用的聚谷氨酸聚合物的分子量通常大于5000D(道爾頓)，優(yōu)選20kD～80kD，更優(yōu)選25kD～60kD(按粘度測(cè)定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將懂得，當(dāng)用其他方法測(cè)定時(shí)，分子量數(shù)值可能不同。這些其他方法包括，例如凝膠滲透、小角光散射、多角度激光散射、折光指數(shù)和它們的組合。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“PG”是指聚谷氨酸聚合物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“喜樹(shù)堿”是指20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物?！癈PT”是指具有如下結(jié)構(gòu)的20(S)-喜樹(shù)堿 其中R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H。
“20(S)-喜樹(shù)堿類似物”是指這樣的生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物，其中上式所示喜樹(shù)堿結(jié)構(gòu)上的一個(gè)或多個(gè)R基團(tuán)不是氫。例如參見(jiàn)，Wang等人，《Med.Res.Rev.(醫(yī)學(xué)研究評(píng)論)》17367～425(1997)；Labergne和Bigg，《Bull.Cancer(癌癥通報(bào))》(巴黎)151～8(1998)；以及本文的表2。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物”或“PG-喜樹(shù)堿”是指共價(jià)鍵合到20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物上的聚谷氨酸聚合物，其中的鍵合可以通過(guò)聚谷氨酸的羧酸基團(tuán)與治療劑的官能團(tuán)之間的直接鍵，或者通過(guò)雙官能間隔基實(shí)現(xiàn)間接連接。優(yōu)選的間隔基是在循環(huán)中對(duì)水解相對(duì)穩(wěn)定的、可生物降解的并且當(dāng)從結(jié)合物上裂解下來(lái)時(shí)是無(wú)毒的。要知道，合適的間隔基應(yīng)不干擾結(jié)合物的抗腫瘤效果。間隔基的例子包括氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)、-[NH-(CHR’)p-CO]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈，n是1～10的整數(shù)，最優(yōu)選1～3；p是1～10的整數(shù)，最優(yōu)選1～3；通式為-[O-(CHR’)p-CO]n-的羥基酸，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈，n是1～10的整數(shù)，最優(yōu)選1～3；p是1～10的整數(shù)，最優(yōu)選1～3(例如，2-羥基乙酸、4-羥基丁酸)；二醇、氨基硫醇、羥基硫醇、氨基醇以及這些的組合。目前優(yōu)選的間隔基是氨基酸，更優(yōu)選天然存在的氨基酸，更優(yōu)選甘氨酸。治療劑可通過(guò)任何連接方法連接到該聚合物或間隔基上，只要能生成可生物裂解鍵(即，在對(duì)應(yīng)于活動(dòng)物生物體內(nèi)的條件下可借助酶催或非酶催機(jī)理裂解的鍵)。優(yōu)選的鍵的例子包括酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰氧基烷基醚、酰氧基烷基硫醚、酰氧基烷基酯、酰氧基烷基酰胺、酰氧基烷氧羰基、酰氧基烷基胺、酰氧基烷基酰胺、酰氧基烷基氨基甲酸酯、酰氧基烷基氨磺酰、縮酮、縮醛、二硫鍵、硫酯、N-酰胺、烷氧羰氧基烷基、脲和N-磺?；鶃啺彼狨?N-sulfonylimidate)。目前最優(yōu)選的是酰胺和酯鍵。
生成這些鍵的方法是有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的且可見(jiàn)諸于，例如標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)如March，《高等有機(jī)化學(xué)》，WileyInterscience(1992)。
喜樹(shù)堿在PG上的加載程度可表示為每個(gè)聚谷氨酸聚合物鏈的(喜樹(shù)堿)分子數(shù)目，或優(yōu)選地，作為結(jié)合物總重量的百分?jǐn)?shù)(“％加載”)。對(duì)于給定結(jié)合物和給定用途，最佳加載度可根據(jù)所要求的結(jié)合物性質(zhì)(例如，水中溶解度、療效、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、毒性和劑量要求)憑經(jīng)驗(yàn)確定。
PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物的加載百分?jǐn)?shù)可按照下文“制備方法”一節(jié)所描述的方法測(cè)定。
喜樹(shù)堿或喜樹(shù)堿類似物必須能夠通過(guò)在該天然分子上已經(jīng)存在的官能團(tuán)連接到聚合物上，或者可通過(guò)合成有機(jī)化學(xué)中熟知的程序引入，但不得改變藥劑的活性。在下面給出的例子中以及如表3所示，喜樹(shù)堿當(dāng)處于未結(jié)合形式時(shí)為相對(duì)不溶于水的，而經(jīng)過(guò)結(jié)合之后，則表現(xiàn)出在溶解度上的大大改善。然而，即便水溶性類似物和藥物前體(例如，氨基酸酯)，在它們結(jié)合到聚谷氨酸上之后預(yù)期也將表現(xiàn)出許多優(yōu)點(diǎn)(例如，藥代動(dòng)力學(xué)和在作用部位的保持性均比未結(jié)合的藥劑改善，效果提高)。
在“標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件”下進(jìn)行的反應(yīng)是在偶合劑和催化劑存在下、在-20℃～150℃，優(yōu)選0℃～70℃，更優(yōu)選0℃～30℃的溫度、在惰性溶劑(例如，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮)中進(jìn)行的。當(dāng)然，所用溫度將取決于諸如治療劑的穩(wěn)定性和連接基團(tuán)的反應(yīng)性之類的因素。合適的偶合劑乃是合成有機(jī)化學(xué)中熟知的，包括但不限于，碳化二亞胺、氯甲酸烷基酯和三乙胺、吡啶鎓鹽-三丁胺、二氯磷酸苯酯、2-氯-1，3，5-三硝基苯和吡啶，二-2-吡啶基碳酸酯、聚苯乙烯基二苯膦、(三甲基甲硅烷基)乙氧基乙炔、三氟甲磺酸1，1’-羰基雙(3-甲基咪唑鎓)鹽、偶氮二羧酸二乙酯和三苯膦、N，N’-羰基二咪唑、甲磺酰氯、新戊酰氯等。適合醇偶聯(lián)的催化劑包括，例如4-N，N-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷并吡啶。本文使用的術(shù)語(yǔ)“惰性溶劑”是指在與反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)描述的反應(yīng)條件下呈惰性的溶劑，例如包括苯、甲苯、乙腈、四氫呋喃(“THF”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)、氯仿(“CHCl3”)、二氯甲烷(或“CH2Cl2”)、二乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、二噁烷、吡啶、二甲氧基乙烷、叔丁基甲基醚等。除非另行指出，本發(fā)明反應(yīng)中使用的溶劑是惰性溶劑。
若多個(gè)官能團(tuán)存在于喜樹(shù)堿上，則選擇性地將特定官能團(tuán)連接在聚谷氨酸聚合物上，通常將要求使用適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基團(tuán)”或“封閉基團(tuán)”是指任何當(dāng)鍵合到化合物的一個(gè)或多個(gè)羥基、巰基、氨基或羧基基團(tuán)上時(shí)能防止在這些在基團(tuán)上發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，且保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)或酶催步驟脫除而重建原來(lái)的羥基、巰基、氨基或羧基基團(tuán)。一般內(nèi)容可參見(jiàn)Greene和Wuts的《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》1999(John Wiley and Sons，紐約)。
具體使用何種可脫除保護(hù)基團(tuán)并不重要，而優(yōu)選的可脫除的羥基保護(hù)基團(tuán)包括傳統(tǒng)取代基，如烯丙基、芐基、乙?；?、氯乙酰基、硫代芐基、亞芐基(benzylidine)、苯甲酰甲基、叔丁基-二苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、MOM(甲氧基甲基)、MEM(2-甲氧基乙氧基甲基)以及任何其他能用化學(xué)方法引入到羥基官能團(tuán)上且隨后在與產(chǎn)物本性相容的溫和條件下通過(guò)化學(xué)或酶催方法選擇性脫除的基團(tuán)。
優(yōu)選的可脫除的氨基保護(hù)基團(tuán)包括傳統(tǒng)取代基，如叔丁氧羰基(t-BOC)、芐氧羰基(CBz)、芴基甲氧羰基(FMOC)、烯丙基氧羰基(ALOC)、三氯乙氧羰基(TROC)等，它們均可通過(guò)與產(chǎn)物本性相容的傳統(tǒng)條件脫除。優(yōu)選的羧基保護(hù)基團(tuán)包括酯，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等的酯，它們均可通過(guò)與產(chǎn)物本性相容的溫和水解條件脫除。
專用語(yǔ)表1中作為范例結(jié)合物給出本發(fā)明的某些PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物的專用名。表1所用專用名也可結(jié)合

圖1加以理解。
表1化合物PG結(jié)合物1 PG-CPT(20-連接的)2 PG-(10-OAc-CPT)(20-連接的)3 PG-(10-OH-CPT)(20-連接的)4 PG-甘氨酰-CPT(20-連接的)(甘氨酰＝gly)5 PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT(20-連接的)6 PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT(20-連接的)7PG-丙氨酰-CPT(20-連接的)8 PG-β-丙氨酰-CPT(20-連接的)9 PG-(4-NH-丁酰)-CPT(20-連接的)10 PG-(2-O-乙酰)-CPT(20-連接的)11 PG-(4-O-丁酰)-CPT(20-連接的)12 PG-(β-谷氨酰)-CPT(20-連接的)13 PG-(10-O-CPT)(10-連接的)14 PG-甘氨酰-(10-O-CPT)(10-連接的)
15 PG-(9-NH-CPT)(9-連接的)16 PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)(9-連接的)17 PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)(20-連接的)18 PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)(20-連接的)19 PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)(20-連接的)優(yōu)選實(shí)施方案描述附圖簡(jiǎn)述圖1顯示表1中列舉的PG-喜樹(shù)堿(PG-CPT)結(jié)合物的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述A.結(jié)合物本發(fā)明涵蓋的藥物活性聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物，可用通式I表征 其中PG是聚谷氨酸聚合物；X是單鍵、氨基?；B接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羥基?；B接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；喜樹(shù)堿是20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物；m是5～65的正整數(shù)；喜樹(shù)堿-X通過(guò)酯或酰胺鍵共價(jià)連接到所述聚合物的羧基基團(tuán)上；n是1～10，最優(yōu)選1～3的整數(shù)；以及p是1～10，最優(yōu)選1～3的整數(shù)；并用具體結(jié)構(gòu)式II～VII表示 其中R1、R2、R3和R4各自是氫；或R1是-NH2，且R2、R3和R4各自是氫；或R1是-NO2，且R2、R3和R4各自是氫；或R1、R3和R4各自是氫且R2是-OH；或R1、R3和R4各自是氫且R2是-O-C(O)-CH3；或R1和R3各自是氫且R4是-Si二甲基叔丁基和R2是-OH。
其中Y是N或O； 以及 其中Y是N或O；R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；R1是-NH2或H；R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；R3是-H或烷基；以及
R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指脂族烴基團(tuán)。該烷基基團(tuán)具有1～20個(gè)碳原子(不論在本文中何處出現(xiàn)，諸如“1～20”烷基基團(tuán)是指在給定范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)；例如，“1～20個(gè)碳原子”是指，烷基基團(tuán)可由1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等，直至并包括20個(gè)碳原子組成，盡管這一定義也覆蓋那些本文中沒(méi)有明確指定數(shù)值范圍的術(shù)語(yǔ)“烷基”的情況)。更優(yōu)選的是，它具有1～10個(gè)碳原子的“中級(jí)”烷基。最優(yōu)選的是，它是具有1～4個(gè)碳原子的“低級(jí)”烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基。烷基基團(tuán)可以是取代或未取代的。當(dāng)被取代時(shí)，取代基基團(tuán)優(yōu)選是一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)并獨(dú)立地選自羥基、烷氧基、巰基、烷硫基、氰基、鹵素、羰基、硝基和氨基的基團(tuán)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“三烷基甲硅烷基”是指基團(tuán)-Si(烷基)3，其中使用的“烷基”按上面的規(guī)定。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案包含一種PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物，與未結(jié)合喜樹(shù)堿或喜樹(shù)堿類似物相比，這種結(jié)合物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性、提高的水中溶解度、較低毒性和較高最大耐受劑量(MTD)。與未結(jié)合藥劑相比，此種結(jié)合物預(yù)期還將表現(xiàn)出獨(dú)特的藥代動(dòng)力學(xué)特性(例如，提高的滲透性和在腫瘤組織中的保持性、活性劑的持續(xù)釋放、長(zhǎng)生物學(xué)半衰期)并使藥物的內(nèi)酯環(huán)形式穩(wěn)定化，已知這對(duì)于其活性具有至關(guān)重要的作用。另外，還預(yù)期，通過(guò)結(jié)合到PG的多個(gè)可用結(jié)合部位上使高度不可溶喜樹(shù)堿類似物增溶的能力將擴(kuò)大本來(lái)可能具有高活性但由于其溶解度問(wèn)題目前尚無(wú)法使用的臨床上有用的喜樹(shù)堿類似物的范圍。參考上面的結(jié)構(gòu)式，由通式II和通式VI代表的PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物是目前最優(yōu)選的，其中R1、R2、R3和R4各自是氫；R1、R3和R4各自是氫，R2是-OH或-O-C(O)-CH3；R1是-NH2，R2、R3和R4各自是氫；以及由通式IV代表的結(jié)合物。
該結(jié)合物中使用的聚谷氨酸聚合物應(yīng)可溶于水、可生物降解和基本不導(dǎo)致免疫。本發(fā)明范圍所涵蓋的聚谷氨酸聚合物已在上面做了描述(參見(jiàn)“定義”)。聚谷氨酸聚合物的分子量一般大于5000D，優(yōu)選20kD～80kD，更優(yōu)選25kD～60kD(按粘度測(cè)定)。目前最優(yōu)選的是分子量介于30kD～50kD的聚(L-谷氨酸)聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將懂得，當(dāng)采用其他方法測(cè)定時(shí)，該分子量數(shù)值可能不同。這些其他方法包括，例如凝膠滲透、小角光散射、多角度激光散射、折光指數(shù)和它們的組合。
對(duì)于本發(fā)明的直接結(jié)合物而言，加載百分?jǐn)?shù)優(yōu)選介于約7％～約20％，更優(yōu)選約10％～約17％，進(jìn)一步優(yōu)選約12％～約15％。就通過(guò)氨基酸連接基間接地連接到PG上的結(jié)合物來(lái)說(shuō)，加載百分?jǐn)?shù)優(yōu)選介于約7％～約50％，優(yōu)選約15％～約38％，最優(yōu)選約20％～約38％。
B.制備方法本發(fā)明聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物可通過(guò)將生物活性喜樹(shù)堿化合物直接或間接連接到聚谷氨酸聚合物上來(lái)制備。任何喜樹(shù)堿化合物均可使用，只要它包含或者通過(guò)官能化，優(yōu)選通過(guò)酯或酰胺鍵，而帶上可連接到PG的γ-羧酸酯基上的基團(tuán)。例如參見(jiàn)，Wang等人，《Med.Res.Rev.(醫(yī)學(xué)研究評(píng)論)》17367～425(1997)；Labergne和Bigg，《Bull.Cancer(癌癥通報(bào))》(巴黎)151～8(1998)；以及下表2。于是，20(S)-喜樹(shù)堿和生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物可通過(guò)喜樹(shù)堿核的20(S)-羥基基團(tuán)，或者通過(guò)類似物的另一種可用官能團(tuán)，連接到PG上。
一般來(lái)說(shuō)，直接連接的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的制備程序是，將喜樹(shù)堿和聚谷氨酸溶解在二甲基甲酰胺或其他惰性溶劑中，使該溶液冷卻并在冷卻的混合物中加入偶合劑和過(guò)量胺堿，例如，二甲氨基吡啶。令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用雙(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯(BOP-Cl)或碘化2-氯甲基吡啶鎓作為偶合劑能制備20(S)-喜樹(shù)堿或20(S)-喜樹(shù)堿類似物含量比本領(lǐng)域此前已知的數(shù)值顯著提高(即，約10％～20％范圍的加載百分?jǐn)?shù))的結(jié)合物。這一發(fā)現(xiàn)之所以特別重要是因?yàn)?，它提供一種活性藥物與PG聚合物的摩爾比大大提高的組合物，因而可減少對(duì)患者施用給定劑量藥物時(shí)所需要的聚合物總質(zhì)量。此種結(jié)合物的其他有利和新穎特征將在本申請(qǐng)的其他地方討論。
讓反應(yīng)混合物溫?zé)岵嚢枰欢巫阋允狗磻?yīng)進(jìn)行到完成約70％的時(shí)間。形成的結(jié)合物可這樣離析出來(lái)通過(guò)加入過(guò)量體積的鹽水溶液(例如，NaCl、KCl、NH4Cl)，優(yōu)選10～15％鹽溶液，同時(shí)在0℃～10℃之間將反應(yīng)混合物冷卻從而將其從溶液中沉淀出來(lái)，然后收集質(zhì)子化形式的固體結(jié)合物。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，必須從結(jié)合物中去除未反應(yīng)喜樹(shù)堿，以確保本發(fā)明組合物的高效果、最低毒性。未反應(yīng)喜樹(shù)堿或其他雜質(zhì)可通過(guò)用可溶解未反應(yīng)喜樹(shù)堿或其他雜質(zhì)(但不溶解結(jié)合物)的有機(jī)溶劑，例如，1～3％甲醇-二氯甲烷、1～3％甲醇-氯仿、氯仿、二氯乙烷等洗滌該固體結(jié)合物，從而將其萃取出來(lái)。一般而言，未反應(yīng)喜樹(shù)堿在結(jié)合物產(chǎn)物中的存在可按如下程序檢測(cè)在2％甲醇-二氯甲烷中用超聲波處理結(jié)合物3小時(shí)，然后通過(guò)薄層色譜法(TLC)分析有機(jī)萃取物中的喜樹(shù)堿。結(jié)合物的1H NMR譜提供有關(guān)喜樹(shù)堿是否共價(jià)鍵合到PG上的證據(jù)(見(jiàn)表3某些選擇的范例結(jié)合物的NMR分析數(shù)據(jù))。
為測(cè)定加載到聚合物上的藥物量，一部分直接結(jié)合的PG-喜樹(shù)堿在堿存在下進(jìn)行水解，結(jié)果釋放出被結(jié)合的喜樹(shù)堿，這同時(shí)也將內(nèi)酯環(huán)打開(kāi)而成為游離羧酸鹽。酸化以使羧酸鹽重新閉環(huán)成為內(nèi)酯后，萃取出釋放出的喜樹(shù)堿。采用薄層色譜法(TLC)和1H NMR技術(shù)對(duì)如此獲得的喜樹(shù)堿與喜樹(shù)堿的純真樣品進(jìn)行比較。根據(jù)從萃取物中回收到的喜樹(shù)堿數(shù)量和產(chǎn)物結(jié)合物的重量計(jì)算出加載百分?jǐn)?shù)。該加載百分?jǐn)?shù)也可通過(guò)測(cè)定PG-喜樹(shù)堿的紫外吸收度，并從喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出喜樹(shù)堿含量來(lái)確定。就典型而言，該測(cè)定是在364nm進(jìn)行的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員卻能夠僅憑常規(guī)實(shí)驗(yàn)就確定出該測(cè)定的最佳波長(zhǎng)。當(dāng)存在多個(gè)可用于連接的官能團(tuán)時(shí)，某一藥物的特定基團(tuán)在聚谷氨酸聚合物上的選擇性連接要求根據(jù)這些基團(tuán)的不同反應(yīng)性采取適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)。適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)的非限定性例子是乙?；１绢I(lǐng)域已知的其他適宜保護(hù)基團(tuán)例如描述在Greene和Wuts，(《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》1999(JohnWiley and Sons，紐約))中。
20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿用諸如醋酐之類的活性?；o體在吡啶堿存在下進(jìn)行處理能給出唯一在10-羥基基團(tuán)的反應(yīng)。該10-乙酰氧基衍生物隨后通過(guò)20(S)-羥基連接到PG上。之所以選擇乙酸酯作為保護(hù)基團(tuán)是因?yàn)?，預(yù)期它將在體內(nèi)水解并且是可藥用的。替代地，10-羥基基團(tuán)在結(jié)合到PG上之前可用可脫除的保護(hù)基團(tuán)(例如BOC)保護(hù)，隨后再用三氟乙酸處理實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)(參見(jiàn)下文實(shí)例3)。在沒(méi)有保護(hù)基團(tuán)的情況下，20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿與PG采用碘化氯甲基吡啶鎓/4-二甲氨基吡啶/PG-H在二甲基甲酰胺中的反應(yīng)能得到作為唯一產(chǎn)物的PG-(10-O-CPT)。
20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿在直接結(jié)合條件下(碘化氯甲基吡啶鎓和4-二甲氨基吡啶)在PG上的偶聯(lián)，發(fā)生在芳族A-環(huán)雜原子取代基上，在此種情況下生成PG-9-NH-CPT作為唯一產(chǎn)物。該結(jié)果是根據(jù)20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿與Boc-L-谷氨酸α-叔丁酯的類似偶聯(lián)結(jié)果推斷的，后面的偶聯(lián)所獲產(chǎn)物的1H NMR譜顯示對(duì)應(yīng)于20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿芳族質(zhì)子的信號(hào)的特征位移，而對(duì)應(yīng)于內(nèi)酯乙基質(zhì)子的信號(hào)則未發(fā)生位移。
本發(fā)明涵蓋的PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物也可通過(guò)在20(S)-喜樹(shù)堿或20(S)-喜樹(shù)堿類似物與PG聚合物的α-或γ-羧基基團(tuán)之間插入一個(gè)雙官能連接基來(lái)制備。優(yōu)選的連接基是天然存在的氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸或羥基酸，更優(yōu)選甘氨酸連接基。采用此種連接基能提供一種其20(S)-喜樹(shù)堿及其類似物的加載百分?jǐn)?shù)比直接結(jié)合物更高的高效結(jié)合物。間接結(jié)合物的一般制備方法是按照已知程序(例如參見(jiàn)，美國(guó)專利5,646,159和Greenwald等人，《Bioorg.Med.Chem.》6551～562(1998)制備20(S)-喜樹(shù)堿或所要求的20(S)-喜樹(shù)堿類似物的氨基酸酯或羥基酯，并在標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件下分別通過(guò)氨基酸的氨基基團(tuán)或羥基酸的羥基基團(tuán)偶聯(lián)到PG的α-或γ-羧基基團(tuán)上，從而分別生成酰胺或酯鍵。
20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿通過(guò)連接到20(S)-羥基基團(tuán)上的甘氨酸連接基結(jié)合到PG上是這樣實(shí)現(xiàn)的20(S)-羥基喜樹(shù)堿用二碳酸二叔丁基酯和吡啶處理唯一地獲得相應(yīng)的10-O-Boc衍生物。后者用Boc-甘氨酸采用碳化二亞胺偶合劑(例如，二異丙基碳化二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺)和4-二甲氨基吡啶，進(jìn)行20-O-?；?。用三氟乙酸脫除這兩個(gè)Boc保護(hù)基團(tuán)，隨后與PG結(jié)合，結(jié)果獲得PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)。采用此種方法合成了PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)和PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)。
20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿通過(guò)連接在10-羥基基團(tuán)上的甘氨酸連接基結(jié)合到PG上是這樣實(shí)施的。20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿用Boc-甘氨酸和吡啶的對(duì)稱酐進(jìn)行處理，結(jié)果僅生成相應(yīng)的10-(N-Boc)-甘氨酸酯。后者用三氟乙酸處理而脫除N-Boc保護(hù)基團(tuán)。獲得的20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿的10-甘氨酸酯采用1，3-二異丙基碳化二亞胺和4-二甲氨基吡啶結(jié)合到PG上，結(jié)果生成PG-甘氨酰-(10-O-CPT)。
在甘氨酸的α-氨基酸基團(tuán)上偶聯(lián)的唯一性是根據(jù)20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿的10-甘氨酸酯與N-Boc-L-谷氨酸α-叔丁酯在相同反應(yīng)條件下的類似偶聯(lián)推斷的。后一反應(yīng)產(chǎn)物的1H NMR譜顯示對(duì)應(yīng)于20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿芳族質(zhì)子的特征信號(hào)的位移，然而對(duì)應(yīng)于內(nèi)酯乙基基團(tuán)質(zhì)子的信號(hào)則不發(fā)生位移。
20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿通過(guò)連接在9-氨基基團(tuán)上的甘氨酸連接基結(jié)合到PG上的頭兩個(gè)步驟可按照Wall等人，《J.Med.Chem.》362689-2700(1993)所描述的方法完成。20(S)-9-(甘氨酰氨基)喜樹(shù)堿的三氟乙酸鹽在PG上的結(jié)合是在二異丙基碳化二亞胺和二甲氨基吡啶存在下進(jìn)行的，結(jié)果生成PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)。
利用甘氨酰-甘氨酸(甘氨酰-甘氨酰；二甘氨酰)連接基使PG與20(S)-喜樹(shù)堿結(jié)合是這樣實(shí)現(xiàn)的首先，20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽與N-(叔丁氧羰基)甘氨酸在碳化二亞胺偶合劑存在下起反應(yīng)生成20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)-喜樹(shù)堿。后者隨后用三氟乙酸處理生成20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽。20-O-(甘氨酰-甘氨酰)-喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽隨后與聚-L-谷氨酸在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二異丙基碳化二亞胺存在下起反應(yīng)生成PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT。
利用甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰；三甘氨酰)連接基使PG與20(S)-喜樹(shù)堿結(jié)合是這樣實(shí)現(xiàn)的首先，((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)-甘氨酸與20-(S)喜樹(shù)堿在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二異丙基碳化二亞胺存在下起反應(yīng)生成20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)-甘氨酰)喜樹(shù)堿。20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)甘氨酰)喜樹(shù)堿隨后用三氟乙酸起處理生成20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽。后者與聚(L-谷氨酸)(956mg)在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二異丙基碳化二亞胺存在下起反應(yīng)生成PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT。
本發(fā)明PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物表現(xiàn)出抗各種腫瘤的抗腫瘤活性，包括人類肺癌、人類非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和黑瘤(參見(jiàn)實(shí)例20)。據(jù)信，這些結(jié)合物將具有廣譜抗哺乳動(dòng)物(包括人)癌癥的活性，包括固體腫瘤(例如，肺、卵巢癌、乳腺、胃腸、結(jié)腸、胰腺、膀胱、腎、前列腺、腦)以及各種造血系統(tǒng)癌(例如，Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血癥)。據(jù)信，這些結(jié)合物在治療抗藥性癌癥方面也十分有用。
包含本發(fā)明PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物的藥物組合物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些藥物組合物還包括任何有效地顯示(活)體內(nèi)抗腫瘤活性數(shù)量的結(jié)合物。醫(yī)學(xué)專業(yè)的臨床醫(yī)生將懂得，對(duì)病人給藥的劑量將隨著患者的年齡、體重和身體條件、給藥途經(jīng)、具體治療的癌癥、腫瘤發(fā)展階段等因素而不同。就任何特定對(duì)象而言，具體劑量服法(包括劑量和給藥次數(shù))應(yīng)當(dāng)由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生針對(duì)該病人酌定。設(shè)想該結(jié)合物的體內(nèi)給藥有效劑量(優(yōu)選非經(jīng)腸或靜脈給藥)每千克體重每日為約0.1～100毫克當(dāng)量(mg eq.)喜樹(shù)堿或喜樹(shù)堿類似物，優(yōu)選每千克體重每日為1～60毫克當(dāng)量喜樹(shù)堿或喜樹(shù)堿類似物。該藥物組合物包含藥用有效量的PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物，和可藥用載體或稀釋劑。有效量藥物組合物的確定則完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握的。治療用的可接受載體或稀釋劑乃是藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，例如描述在《Remington’sPharmaceutical Sciences》Mack出版公司(A.R.Gennaro主編，1985)。防腐劑、穩(wěn)定劑、染料或其他添加劑可加入到該藥物組合物中。本發(fā)明范圍還包括PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物與其他藥物一起給藥的組合療法，其它藥物包括但不限于其他抗腫瘤藥物，以及與放療相結(jié)合組合療法。
該藥物組合物可根據(jù)治療對(duì)象的具體條件配制，并可通過(guò)全身/局部給藥。配制技術(shù)和給藥可見(jiàn)諸于上面的《Remington’sPharmaceutical Sciences》。合適的途經(jīng)可包括口服、直腸、經(jīng)皮、陰道、經(jīng)粘膜或經(jīng)腸給藥；非經(jīng)腸給藥，包括肌肉、皮下、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接靜脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
用于注射，本發(fā)明藥物組合物可配制成水溶液，優(yōu)選配制成在生理學(xué)相容的緩沖液如生理鹽水緩沖液中的溶液。為了實(shí)施本發(fā)明，使用可藥用載體將本文公開(kāi)的藥物組合物配制成適合全身給藥的單位劑量形式，乃屬本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明將通過(guò)下面的實(shí)施例加以說(shuō)明，然而它們從任何意義上不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，用于制備結(jié)合物的聚谷氨酸的分子量系由供應(yīng)商(Sigma)，根據(jù)粘度測(cè)定結(jié)果提供的。此外，實(shí)例序號(hào)與圖1中的化合物號(hào)相對(duì)應(yīng)。
實(shí)例1PG-CPT[方法1]向預(yù)先在真空下干燥4h的20(S)-喜樹(shù)堿(132mg，0.38mmol)和聚(L-谷氨酸)(33kD，530mg)的混合物中，加入無(wú)水二甲基甲酰胺(20mL)。溶液在冰浴中冷卻，然后加入雙(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯(174mg，0.68mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(167mg，1.37mmol)和二異丙基乙胺(74mg，0.57mmol)。讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝亍嚢?日后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，然后在25min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(45mL)。該混合物通過(guò)加入0.5M鹽酸(3.5mL)被酸化到pH2.5，并在室溫?cái)嚢?h。濾出沉淀，用水(4×50mL)洗滌，然后在真空下干燥12h。固體研磨成粉末之后，懸浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。攪拌3h后，固體通過(guò)離心進(jìn)行分離并潷析掉上清液。重復(fù)該洗滌過(guò)程4遍以便完全除掉未反應(yīng)喜樹(shù)堿。固體在真空下干燥2日，獲得PG-CPT(521mg，87％質(zhì)量平衡，按回收的20(S)-喜樹(shù)堿重量(64.5mg)計(jì))。1H NMR(300MHz在DMSO-d6)δ12.10(s，-COOH)，6.90-8.80(m)，5.15-5.8(m)，3.10-4.35(m)，1.42-2.62(m，)，0.90(br s，19-CH3).按如下所述確定在本實(shí)例中PG-CPT的20(S)-喜樹(shù)堿重量加載百分?jǐn)?shù)。向PG-CPT(100mg)在甲醇-水(1∶1，4mL)中的懸浮液中，加入1M氫氧化鈉水溶液(2mL)。該黃色溶液攪拌16h，通過(guò)加入1M鹽酸酸化到pH5，然后用二氯甲烷(4×20mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物用硫酸鎂干燥，然后在減壓下濃縮，從而產(chǎn)出20(S)-喜樹(shù)堿(13mg)。該樣品的質(zhì)子NMR和TLC與20(S)-喜樹(shù)堿純真樣品的相同。根據(jù)上述結(jié)果，在本實(shí)例中20(S)-喜樹(shù)堿在PG-CPT中的重量加載百分?jǐn)?shù)是13％。
PG-CPT[方法2]向在真空下干燥6h的20(S)-喜樹(shù)堿(64mg，0.18mmol)和聚(L-谷氨酸)(50kD，256mg)的混合物中，加入無(wú)水二甲基甲酰胺(15mL)。溶液在冰/鹽浴中冷卻至-5℃之后，在氬氣氛下加入碘化2-氯甲基吡啶鎓(85mg，0.33mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(81mg，0.66mmol)。讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?日后，將混合物冷卻至0℃，然后在25min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(35mL)。該混合物通過(guò)加入0.5M鹽酸(3.5mL)被酸化到pH2.5，并在室溫?cái)嚢?h。濾出沉淀，用水(4×30mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體研磨成粉末之后，懸浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。攪拌3h后，固體通過(guò)離心進(jìn)行分離并潷析掉上清液。重復(fù)該洗滌過(guò)程4遍以便完全除掉未反應(yīng)的喜樹(shù)堿。固體在真空下干燥，結(jié)果獲得PG-CPT(295mg，97％質(zhì)量平衡，按回收的20(S)-喜樹(shù)堿重量(13mg)計(jì))。
1H NMR(300MHz在DMSO-d6)δ12.10(s，-COOH)，6.90-8.80(m)，5.15-5.8(m)，3.10-44.35(m)，1.42-2.62(m)，0.90(br s，19-CH3).采用按方法1在PG-CPT合成中所述方法，在本實(shí)例中PG-CPT的20(S)-喜樹(shù)堿重量加載百分?jǐn)?shù)的測(cè)定值是16％。
實(shí)例2PG-(10-OAc-CPT)20(S)-10-乙酰氧基喜樹(shù)堿按照美國(guó)專利4,545,880(Miyasaka等人)中描述的方法制備，在此將文獻(xiàn)全文收作參考。
聚(L-谷氨酸)(50kD，235mg)和10-乙酰氧基喜樹(shù)堿(53mg，0.13mmol)在二甲基甲酰胺(8mL)中的懸浮液，在溫和加熱下進(jìn)行溶解。當(dāng)獲得的溶液冷卻至室溫時(shí)，順序加入碘化氯甲基吡啶鎓(75mg，0.29mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液和4-二甲氨基吡啶(73mg，0.60mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液。攪拌18h后，混合物在冰浴中冷卻，然后在劇烈攪拌下、在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(30mL)。通過(guò)緩慢加入0.5M鹽酸酸化至pH1～2之后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝兀贁嚢?0min。通過(guò)離心收集固體，潷析掉上清液。固體懸浮在水(200mL)中，離心后再次離析出來(lái)。該洗滌過(guò)程重復(fù)兩遍，然后固體在真空下干燥。該固體在2％甲醇-氯仿(25mL)中的懸浮液用超聲波處理90min，然后過(guò)濾。重復(fù)該洗滌過(guò)程，固體在真空下干燥，從而獲得黃色粉末狀PG-(10-OAc-CPT)(174mg，61％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.5(多重寬信號(hào)，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.85(三重寬峰，C-18CH3).
實(shí)例3PG-(10-OH-CPT)向20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿(317mg，0.87mmol)在二甲基甲酰胺(8mL)和吡啶(1.5mL)中的溶液中，加入二叔丁基二碳酸酯(328mg，1.5mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液。在室溫?cái)嚢?h后，讓混合物在氯仿(100mL)與水(100mL)之間進(jìn)行分配。氯仿相用1M鹽酸(2×100mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，然后在真空下干燥。固體進(jìn)行重結(jié)晶(氯仿-己烷)從而獲得20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜樹(shù)堿(358mg，91％收率)，呈黃色粉末狀。
1H NMR(300MHz.CDCl3)8.34(s，1H)，8.23(d，J＝8Hz，1H)，7.75(d，J＝2Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.66(dd，J＝8,2Hz，1H)，5.75(d，J＝17Hz，1H)，5.31(d，J＝17Hz，1H)，5.27(s，2H)，1.91(sep.，J＝6Hz，2H)，1.62(s，9H)，1.06(t，J＝6Hz，3H).
聚(L-谷氨酸)(507mg，3.9mmol游離羧酸酯)與20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜樹(shù)堿(103mg，0.23mmol)在二甲基甲酰胺(20mL)中的懸浮液，在溫和加熱下進(jìn)行溶解。當(dāng)獲得的溶液冷卻至室溫時(shí)，順序加入碘化氯甲基吡啶鎓(129mg，0.5mmol)在二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液和4-二甲氨基吡啶(131mg，1.1mmol)在二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液。攪拌80h后，混合物在冰浴中冷卻，然后在劇烈攪拌下、在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(65mL)。通過(guò)緩慢加入0.5M鹽酸酸化至pH1～2之后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，再攪?0min。通過(guò)離心收集固體，潷析掉上清液。固體懸浮在水(200mL)中，離心后再次離析出來(lái)。該洗滌過(guò)程重復(fù)兩遍，然后固體在真空下干燥。該固體在2％甲醇-氯仿(25mL)中的懸浮液用超聲波處理90min，然后過(guò)濾。重復(fù)該洗滌過(guò)程，固體在真空下干燥，從而獲得黃色粉末狀PG-(10-叔丁氧基羰氧基喜樹(shù)堿)(20-結(jié)合的)(471mg，78％質(zhì)量平衡)。加載百分?jǐn)?shù)經(jīng)測(cè)定結(jié)果是10％，按從甲醇-氯仿洗滌溶液中回收的20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜樹(shù)堿(53mg)計(jì)。
1H NMR(300MHz.d6-DMSO)δ7.2-8.5(多重寬信號(hào)，Ar-H)，5.45，5.20(br.s，C-17，C-5 CH2)，1.55(s，10-O-Boc)，0.85(brs，C-18 CH3).
該P(yáng)G-(10-叔丁氧基羰氧基喜樹(shù)堿)(20-結(jié)合的)(288mg)分成4份在30min時(shí)間內(nèi)加入到三氟乙酸(50mL)中。攪拌24h后，混合物在真空下濃縮，獲得PG-(10-OH-CPT)(251mg，87％質(zhì)量平衡)。1H NMR譜的積分指出5％的重量加載百分?jǐn)?shù)。1H NMR(300MHz，TFA-d)δ9.15(br.s.，Ar-H)；7.2-8.5(多重寬信號(hào)，Ar-H)；5.6-6.0(多重信號(hào)，C-17，C-5 CH2)；1.05(三重寬峰，C-18 CH3).
實(shí)例4PG-甘氨酰-CPT向在冰浴(4～6℃)中冷卻的20(S)-喜樹(shù)堿(17.0g，48.8mmol)、N-(叔丁氧羰基)-甘氨酸(12.82g，73.2mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(170mL)中的混合物中，在15min內(nèi)分?jǐn)?shù)份加入4-二甲氨基吡啶(7.75g，63.5mmol)，隨后在20min內(nèi)分?jǐn)?shù)份加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(14.03g，73.2mmol)。在5～10℃(冰/水浴)下攪拌3.5h后，混合物在冰浴(4℃)中進(jìn)行冷卻，并在劇烈攪拌下在30min內(nèi)加入水(275mL)。再攪拌15min后，固體濾出，用水(2×150mL)，冰冷卻的0.1M鹽酸(300mL)和水(3×100mL)洗滌。冷凍干燥20h后，固體從乙酸乙酯-甲醇(1∶4，500mL)中重結(jié)晶。過(guò)濾后，固體用冰冷的甲醇(2×100mL)洗滌，干燥后獲得20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)喜樹(shù)堿(22.5g，91％收率)。質(zhì)子NMR與純真樣品相同。
向在冰浴中冷卻的20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)喜樹(shù)堿(48.6g，93.6mmol)在無(wú)水乙酸乙酯(125mL)中的懸浮液中，在30min內(nèi)加入三氟乙酸(250mL)。3.5h后，溶劑在減壓下蒸發(fā)。從己烷-甲醇-乙酸乙酯(1∶1∶20，575mL)重結(jié)晶，獲得的固體經(jīng)過(guò)濾，用乙酸乙酯(150mL)洗滌，然后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(46.4g，93％收率)。
1HNMR(TFA-d)δ9.35(s，1H)，8.25-8.45(m，3H)，8.05(t，J＝7.3Hz，1H)，7.82(s，1H)，5.80(d，J＝18.1Hz，1H)，5.70(s，2H)，5.55(d，J＝18.1Hz，1H)，4.42(d，J＝17.6Hz，1H)4.30(d，J＝17.6Hz，1H)，2.10-2.30(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向聚-(L-甘氨酸)(1.24g)在無(wú)水二甲基甲酰胺(31mL)中的溶液中，加入20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(1.0g，1.9mmol)。冷卻至0℃后，分?jǐn)?shù)份加入二甲氨基吡啶(707mg，5.79mmol)，隨后在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(292mg，2.32mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液。讓混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?日后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻并在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(75mL)?；旌衔锿ㄟ^(guò)加入1M鹽酸而酸化至pH2.5。在室溫?cái)嚢?h后，固體過(guò)濾，用水(4×100mL)洗滌，然后在真空下干燥。該固體懸浮在2％甲醇-二氯甲烷(75mL)中，攪拌1h，然后過(guò)濾。重復(fù)該洗滌過(guò)程，用2％甲醇-二氯甲烷3遍，用乙腈(100mL)一遍并用水(100mL)一遍。固體在真空下干燥2日，結(jié)果獲得黃色粉末狀PG-甘氨酰-CPT(1.88g，93％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，芳烴質(zhì)子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烴質(zhì)子)，7.95(s，芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.72(s，5-H2)5.60(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.80(br s)，4.30-4.70(m，甘氨酸亞甲基質(zhì)子)，2.00-2.70(m)，1.10(br s).
實(shí)例5PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(2.60g，5.0mmol)和N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(2.63g，15.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(50mL)中的混合物攪拌30min后，在冰浴中冷卻，然后加入4-二甲氨基吡啶(1.83g，15.0mmol)。在30min內(nèi)加入二異丙基碳化二亞胺(1.89g，15.0mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物用水(100mL)處理并用二氯甲烷(3×100mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用水(100mL)、0.1M鹽酸(100mL)和水(100mL)洗滌，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥。在減壓下濃縮后，殘余物通過(guò)在在硅膠上的閃色譜術(shù)提純，其中用4％甲醇-二氯甲烷作洗脫液，結(jié)果產(chǎn)出20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)喜樹(shù)堿(1.30g，45％收率)呈黃色粉末。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.10(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.10(brs，1H)，3.70-4.45(m，4H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.38(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)喜樹(shù)堿(1.20g，2.10mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，4mL)中的溶液，在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)溶劑之后，殘余物與乙酸乙酯(50mL)一起研制。固體濾出，用二氯甲烷(40mL)洗滌并在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(1.0g，82％收率)。
1H NMR(TFA-d)δ9.45(s，1H)，8.10-8.50(m，3H)，7.95(s，1H)，5.90(d，J＝18.3Hz，1H)，5.80(s)，5.65(d，J＝18.3Hz，1H)，4.10-4.60(m，4H)，2.20-2.50(m，2H)，1.10(t，J＝7.4Hz，3H).
向在冰浴中冷卻的20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(220mg，0.38mmol)和聚-L-谷氨酸(532mg)在無(wú)水二甲基甲酰胺(14.5mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(140mL，1.15mmol)。在20min內(nèi)，加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(58mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。然后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，在氬氣氛下攪?5h后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，然后在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(35mL)。攪拌1h后，混合物用1M鹽酸酸化至pH2.5。濾出固體物，用水(3×75mL)洗滌，在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗滌，在真空下干燥，用乙腈(100mL)洗滌，用水(100mL)洗滌，然后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT(625mg，88％質(zhì)量平衡)。
1HNMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.20-5.10(m)，32.10-2.90(m)，1.00(s).
實(shí)例6PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT向冷卻至0℃的((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)甘氨酸(1.99g，6.88mmol)和20(S)-喜樹(shù)堿(1.20g，3.44mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中，加入N，N-二甲氨基吡啶(630mg，5.16mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(0.96g，7.6mmol)，并讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，用水(55mL)處理，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)和水(2×50mL)洗滌，然后用硫酸鈉干燥。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物用硅膠閃色譜提純，其中以4％甲醇-二氯甲烷作洗脫液，結(jié)果獲得黃色粉末狀20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)甘氨酰)喜樹(shù)堿(1.52g，71％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.40(s，1H)，8.25(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.05(br s，1H)，5.65(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.15(br s，1H)，3.70-4.45(m，6H)，2.15-2.35(m，2H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)甘氨酰)喜樹(shù)堿(1.50g，2.42mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，5mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物與乙酸乙酯(30mL)一起研制。濾出固體物，用二氯甲烷(50mL)洗滌，并在真空下干燥，結(jié)果獲得黃色粉末狀20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(1.3g，85％收率)。
1HNMR(DMSO-d6)δ8.78(s，1H)，7.70-8.65(m，4H)，7.10(s，1H)，5.55(s，2H)，3.95-4.30(m，2H)，3.85(s，2H)，3.51(s，2H)，2.10-2.25(m，2H)，0.95(t，J＝7.4Hz，3H).
向在冰浴中冷卻的20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(940mg，1.49mmol)和聚(L-谷氨酸)(956mg)在無(wú)水二甲基甲酰胺(29.5mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(545mg，4.47mmol)。在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(275mg，1.78mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氬氣氛下攪拌3日后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，然后在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(69mL)。攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1M鹽酸酸化至pH2.5。濾出固體物，用水(3×75mL)洗滌，在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(3×50mL)洗滌，在真空下干燥，用乙腈(100mL)洗滌，用水(100mL)洗滌，最后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT(1.50g，87％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.50(芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.10-5.00(m)，2.05-2.75(m)，1.05(s).
實(shí)例7PG-丙氨酰-CPT向冷卻至0℃的N-(叔丁氧羰氧基)丙氨酸(568mg，3.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜樹(shù)堿(348mg，1.0mmol)和二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(379mg，3.0mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物用水(50mL)處理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氫鈉水溶液(2×25mL)，最后用水(2×50mL)洗滌。用硫酸鈉干燥后，在減壓下蒸發(fā)掉溶劑。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-二氯甲烷為洗脫液，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(N-(叔丁氧羰基氧基)-丙氨酰)喜樹(shù)堿(420mg，81％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.95(br s，1H)，4.45(br t，1H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.55(d，3H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基氧基)丙氨酰)喜樹(shù)堿(300mg，0.57mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物與10％甲醇-氯仿(12mL)一起研制。過(guò)濾后，獲得黃色粉末狀20-O-(丙氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(318mg，87％收率)，然后立即用于下一步反應(yīng)中。在攪拌下向20-O-(丙氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(114mg，0.21mmol)、聚(L-谷氨酸)(280mg)和N，N-二甲氨基吡啶(77mg，0.63mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(8.5mL)中的懸浮液中，在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(34.5mg，0.273mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液?；旌衔镌跉鍤夥障聰嚢?日。在冰浴中冷卻后，在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(21mL)。攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1N鹽酸調(diào)節(jié)到pH2.5。濾出固體物，用水(5×25mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗滌，在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-丙氨酰-CPT(330mg，81％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.80-6.05(m)，3.80-4.50(m)，1.20-2.80(m)，1.70(br s)，1.00(s).
實(shí)例8PG-(β-丙氨酰)-CPT向冷卻至0℃的N-叔丁氧羰基-β-丙氨酸(568mg，3.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜樹(shù)堿(348mg，1.0mmol)和二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(379mg，3.0mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物用水(50mL)稀釋并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氫鈉水溶液(2×25mL)，最后用水(2×50mL)洗滌。用硫酸鈉干燥后，在減壓下蒸發(fā)掉溶劑。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脫，結(jié)果產(chǎn)出淺黃色粉末狀20-O-(N-叔丁氧羰基-β-丙氨酰)喜樹(shù)堿(431mg，83％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40 (d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.15(br s，1H)，3.30-3.50(m，2H)，2.55-2.80m(m，2H)，2.15-2.25(m，2H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基-β-丙氨酰)喜樹(shù)堿(250mg，0.48mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物與甲醇-己烷-二氯甲烷(1∶2∶7)一起研制。過(guò)濾后，獲得黃色粉末狀20-O-(β-丙氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(241mg，94％收率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.78(s，1H)，8.05-8.50 m，2H)，7.60-7.94(m，2H)，7.15(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，2.80-3.60(m，4H)，2.15-2.25(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
在攪拌下向20-O-(β-丙氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(241mg，0.45mmol)、聚(L-谷氨酸)(326mg)和N，N-二甲氨基吡啶(165mg，1.35mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(12.5mL)中的混合物中，在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(74mg，0.59mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。混合物在氬氣氛下攪拌2日。在冰浴中冷卻后，在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(30mL)。攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1M鹽酸酸化至pH2.5。濾出固體物，用水(5×25mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗滌，然后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-(β-丙氨酰)-CPT(485mg，94％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.70-5.10(m)，3.65-3.90(m)，2.00-3.10(m)，1.00(s).
實(shí)例9PG-(4-NH-丁酰)-CPT向冷卻至0℃的4-(叔丁氧羰基氨基)丁酸(203mg，3.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜樹(shù)堿(348mg，1.0mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。隨后，慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(379mg，3.0mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物用水(50mL)處理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氫鈉水溶液(2×25mL)，和水(2×50mL)洗滌。用硫酸鈉干燥后，在減壓下蒸發(fā)掉溶劑。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脫，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(4-(叔丁氧羰基氨基)丁酰)喜樹(shù)堿(432mg，81％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.85(brs，1H)，3.05-3.30(m，2H)，2.40-2.60(m，2H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.75-1.90(m，2H)，1.40(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(4-(叔丁氧羰基氨基)丁酰)喜樹(shù)堿(400mg，0.751mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物與10％甲醇-二氯甲烷(12mL)一起研制。過(guò)濾后，獲得黃色固體20-O-(4-氨基丁酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(331mg，83％收率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.78(s，1H)，8.05-8.45(m，2H)，7.65-7.94(m，2H)，7.05(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，2.60-2.85(m，4H)，2.00-2.25(m，2H)，1.70-1.90(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向20-O-(4-氨基丁酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(250mg，0.46mmol)、聚(L-谷氨酸)(414mg)和N，N-二甲氨基吡啶(168mg，1.38mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(13.5mL)中的懸浮液中，在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(75mg，0.6mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液?；旌衔镌跉鍤夥障聰嚢?日，在冰浴中冷卻后，在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(35mL)。攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1M鹽酸酸化至pH2.5。濾出固體物，用水(5×25mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗滌，然后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-(4-NH-丁酰)-CPT(574mg，94％質(zhì)量平衡)。
1HNMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，芳烴質(zhì)子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烴質(zhì)子)，7.95(s，芳烴質(zhì)子)，7.20(s，芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.70-5.05(m)，3.45-3.70(m)，2.02-3.00(m)，1.05(br s).
實(shí)例10PG-(2-O-乙酰)-CPT按照Greenwald等人，《Bioorg.Med.Chem.》6551～562(1998)所述程序制備20-O-(2-羥基乙酰)喜樹(shù)堿。
碘化氯甲基吡啶鎓(163mg，0.64mmol)和4-二甲氨基吡啶(89mg，0.73mmol)順序地加入到20-O-(2-羥基乙酰)喜樹(shù)堿(80mg，0.20mmol)和聚(L-谷氨酸)(411mg)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中。攪拌18h后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，并在1h時(shí)間內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(50mL)。所獲混合物的pH值通過(guò)加入0.1M鹽酸而降低到2。離心后收集沉淀，并將其懸浮在水(25mL)中，再次離心后收集。該程序再重復(fù)兩遍，固體在真空下干燥。固體懸浮在氯仿-甲醇(95∶5，10mL)中并用超聲波處理90min?；旌衔镞M(jìn)行過(guò)濾，固體在真空下干燥，結(jié)果獲得淺黃色固體PG-(2-O-乙酰)-CPT(404mg，86％質(zhì)量平衡)。根據(jù)回收到的20-O-(2-羥基乙酰)喜樹(shù)堿的重量計(jì)算的重量加載百分?jǐn)?shù)是15％。
1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ7.6-8.7(多重寬信號(hào)CPT Ar-H)，7.15(s，CPT Ar-H)，4.8-5.6(寬信號(hào)，CPT 內(nèi)酯，C5-CH2-)，3.7-4.3(寬信號(hào)，PG α-CH)，3.1-3.4(寬單峰，PG)，1.7-2.4(寬信號(hào)，PG)，1.0(寬信號(hào)，CPT-CH2CH3).
實(shí)例11PG-(4-O-丁酰)-CPT向冷卻至0℃的20(S)-喜樹(shù)堿(300mg，0.86mmol)和4-芐氧基丁酸(501mg，2.58mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(12mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(210mg，1.72mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(326mg，2.58mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?5h后，混合物用水(50mL)處理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)、水(2×50mL)洗滌并用硫酸鈉干燥。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脫，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(4-芐氧基丁酰)喜樹(shù)堿(432mg，81％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz 1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.20-7.40(m，6H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.52(brs，2H)，3.45-3.60(m，2H)，2.60-2.75(m，2H)，1.90-2.35(m，4H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
向20-O-(4-芐氧基丁酰)喜樹(shù)堿(1.0g，1.90mmol)和10％披鈀炭(50％水，200mg)懸浮在乙醇-1，4-二噁烷(4∶1，20mL)中的混合物中，加入環(huán)己烯(0.78g，9.5mmol)。在緩緩回流下加熱15h后，混合物進(jìn)行冷卻并過(guò)濾除掉催化劑。在減壓下濃縮后，固體殘余物用甲醇(8.0mL)進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)果獲得淺黃色粉末20-O-(4-羥基丁酰)喜樹(shù)堿(679mg，82％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ8.40(s，1H)，8.05(d，J＝8.38Hz 1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.30(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，3.50(t，3H)，2.50(t，2H)，1.70-2.30(m，4H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
向20-O-(4-羥基丁酰)喜樹(shù)堿(114mg，0.26mmol)和聚(L-谷氨酸)(265mg，1.8mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(7.5mL)中的混合物中，加入二甲氨基吡啶(6mg，0.052mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(43mg，0.34mmol)，反應(yīng)混合物在氬氣氛下攪拌5h。在冰浴中冷卻后，滴加10％氯化鈉水溶液(18mL)。pH值通過(guò)加入1N鹽酸調(diào)節(jié)到2.5。在室溫?cái)嚢?h后，混合物進(jìn)行過(guò)濾。固體用水(3×30mL)洗滌，然后在真空下干燥。粉末用2％甲醇-二氯甲烷(4×30mL)洗滌，然后在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末PG-(4-O-丁酰)-CPT(360mg，95％質(zhì)量平衡)。
1HNMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，芳烴質(zhì)子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烴質(zhì)子)，7.95(s，芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s，)5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.90(br s)，4.40(s)，2.00-2.90(m)，1.10(brs).
實(shí)例12PG-(γ-谷氨酰)-CPT向冷卻至0℃的N-(叔丁氧羰基)谷氨酰-γ-叔丁酯(910mg，3.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜樹(shù)堿(348mg，1.0mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(379mg，3.0mmol)，然后讓反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?6h后，混合物用水(50mL)處理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物依次用0.1M鹽酸(2×50mL)、水(2×50mL)，0.1M碳酸氫鈉水溶液(2×25mL)和水(2×50mL)洗滌。用硫酸鈉干燥后，在減壓下蒸發(fā)掉溶劑。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脫，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀20-O-(N-(叔丁氧羰基)-γ-谷氨酰)喜樹(shù)堿α-叔丁酯(432mg，81％收率)。
1H NMR(CDCl3)δ8.40(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.65-7.85(m，2H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.05(br d，1H)，4.10(brs，1H)，1.85-2.70(m，6H)，1.45(s，18H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基)谷氨酰)喜樹(shù)堿α-叔丁酯(300mg，0.47mmol)在二氯甲烷-三氟乙酸(1∶1，1mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?0min。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑后，殘余物與甲醇-二氯甲烷-己烷(1∶2∶2，10mL)一起研制。過(guò)濾后獲得黃色固體20-O-(γ-谷氨酰)喜樹(shù)堿α-叔丁酯三氟乙酸鹽(239mg，79％收率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.78(s，1H)，7.70-8.20(m，3H)，7.05(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，(brs，1H)，1.90-2.85(m，6H)1.50(s，9H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向20-O-(γ-谷氨酰)喜樹(shù)堿α-叔丁酯三氟乙酸鹽(239mg，0.37mmol)、聚(L-谷氨酸)(395mg，2.69mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(135.6mg，1.11mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(12.5mL)中的混合物中，在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(61mg，0.48mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氬氣氛下攪拌2日后，混合物在冰浴中進(jìn)行冷卻，在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(30mL)。攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1M鹽酸酸化至pH2.5。濾出固體物，用水(4×30mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗滌并在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出黃色粉末狀PG-(γ-谷氨酰)-CPTα-叔丁酯(556mg，94％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.90-8.60(m，芳烴質(zhì)子)，7.25(s，芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.60-5.0(m)，2.05-3.00(m)，1.55(s)，1.10(br s).
PG-(γ-谷氨酰)-CPTα-叔丁酯(550mg)在三氟乙酸(5mL)中的溶液，在室溫?cái)嚢?6h。在減壓下濃縮后，殘余物用水(100mL)洗滌，然后在真空下干燥，從而獲得黃色粉末狀PG-(γ-谷氨酰)-CPT(460mg)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，7.90-8.60(m，芳烴質(zhì)子)，5.92(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，內(nèi)酯質(zhì)子)，4.60-5.0(m)，2.05-3.00(m)，1.05(br s).
實(shí)例13PG-(10-O-CPT)聚(L-谷氨酸)鈉鹽(50kD，740mg)在二甲基甲酰胺(30mL)中的懸浮液在冰浴中冷卻。加入甲磺酸(0.3mL，4.6mmol)，混合物攪拌30min。順序加入10-羥基喜樹(shù)堿(166mg，0.45mmol)、碘化氯甲基吡啶鎓(190mg，0.74mmol)和4-二甲氨基吡啶(168mg，1.4mmol)。讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，并劇烈攪?0h?；旌衔镌诒≈羞M(jìn)行冷卻，并在45min內(nèi)在劇烈攪拌下加入10％氯化鈉水溶液(100mL)。通過(guò)緩慢加入0.5M鹽酸酸化至pH1～2之后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，再攪?0min。離心收集固體并潷析除掉上清液。固體懸浮在水(200mL)中，再次離心后離析。再重復(fù)上述洗滌過(guò)程兩遍，固體在真空下干燥。固體在2％甲醇-氯仿(25mL)中的懸浮液用超聲波處理90min，然后過(guò)濾。重復(fù)該洗滌過(guò)程，固體在真空下干燥后獲得黃色粉末狀PG-(10-O-CPT)(674mg，93％質(zhì)量平衡)。
1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.6(多重寬信號(hào)，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.85(三重寬峰，C-18 CH3).
根據(jù)從甲醇-氯仿洗滌液中回收到的20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿重量，測(cè)得加載百分?jǐn)?shù)是13％。
替代地，PG-(10-O-CPT)按上述方法合成，但采用聚(L-谷氨酸)代替聚(L-谷氨酸)鈉鹽和甲磺酸。
實(shí)例14PG-甘氨酰-(10-O-CPT)N-叔丁氧羰基甘氨酸(603mg，3.4mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液用二異丙基碳化二亞胺(0.27mL，1.7mmol)處理。攪拌15min后，該溶液被加入到20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿(406mg，1.11mmol)和吡啶(0.9mL)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中。攪拌4h后，混合物倒入水(300mL)中，并用氯仿(4×75mL)萃取。合并的氯仿萃取物用0.1M鹽酸(2×100mL)洗滌，隨后用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×100mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并在真空下濃縮。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用2％甲醇-氯仿作洗脫，結(jié)果獲得淺黃色粉末狀20(S)-10-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氧基)喜樹(shù)堿(247mg，43％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)8.32(s，1H)，8.21(d，J＝8Hz，1H)，7.70(d，J＝3Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.56(dd，J＝8,3Hz，1H)，5.73(d，J＝15Hz，1H)，5.28(d，J＝15Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.17(m，1H)，4.26(d，J＝7Hz，2H)，1.88(sep.，J＝6Hz，2H)，1.49(s，9H)，1.04(t，J＝6Hz，3H).
20(S)-10-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氧基)喜樹(shù)堿(206mg，0.39mmol)在二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(5mL)中的溶液攪拌90min。在真空下濃縮后，殘余物溶解在氯仿(50mL)中，然后在真空下濃縮。殘余物溶解在甲苯(50mL)中，并在真空下濃縮，從而獲得20(S)-10-(甘氨酰氧基)喜樹(shù)堿。
20(S)-10-(甘氨酰氧基)喜樹(shù)堿在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液加入到聚(L-谷氨酸)(50kD，641mg)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中，隨后加入4-二甲氨基吡啶(151mg，1.2mmol)和二異丙基碳化二亞胺(0.08mL，0.5mmol)。劇烈攪拌60h后，混合物在冰浴中冷卻，并在劇烈攪拌下、1h內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(75mL)。通過(guò)緩慢加入0.5M鹽酸酸化至pH1～2以后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝兀嚢?0min。離心收集固體并潷析除掉上清液。固體懸浮在水(200mL)中，再次離心后離析。再重復(fù)上述洗滌程序兩遍，固體在真空下干燥。固體在2％甲醇-氯仿(25mL)中的懸浮液用超聲波處理90min，然后過(guò)濾。重復(fù)該用2％甲醇-氯仿洗滌的程序。固體在真空下干燥后獲得黃色粉末狀PG-甘氨酰-(10-O-CPT)(560mg，70％)。
1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.8(多重寬信號(hào)，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.9(br s，C-18 CH3).
實(shí)例15PG-(9-NH-CPT)向在真空下干燥4h后的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿(157mg，0.43mmol)和聚(L-谷氨酸)(38kD，628mg)的混合物中，加入無(wú)水二甲基甲酰胺(35mL)。在冰浴中冷卻后，加入碘化2-氯甲基吡啶鎓(199mg，0.78mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(200mg，1.64mmol)，讓混合物溫?zé)嶂潦覝?。攪?日后，混合物冷卻至0℃，然后在25min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(82mL)?；旌衔锿ㄟ^(guò)加入1M鹽酸(3.5mL)酸化至pH2.5，然后在室溫?cái)嚢?h。過(guò)濾出沉淀，用水(4×50mL)洗滌，然后在真空下干燥。固體研磨成粉末并懸浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。攪拌3h后，離心分離出固體，潷析除掉上清液。重復(fù)該洗滌過(guò)程4遍，以便完全除掉未反應(yīng)的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿。固體在真空下干燥，結(jié)果產(chǎn)出PG-(9-NH-CPT)(592mg，80％質(zhì)量平衡，按回收的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿(45mg)計(jì))。
1H NMR(300MHz在DMSO-d6)12.10(s，-COOH)，8.80(s)，6.50-8.5(m)，5.15-5.8(m)，3.10-4.35(m)，1.42-2.62(m，)，0.90(br s，19-CH3).
在本例中，PG-(9-NH-CPT)的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿重量加載百分?jǐn)?shù)是14％，按偶聯(lián)反應(yīng)期間消耗的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿的重量(115mg)計(jì)。
實(shí)例16PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)按照Wall等人，《J.Med.Chem.》1993，36，2689～2700中描述的方法的修改方案制備20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)喜樹(shù)堿。向N-叔丁氧羰基甘氨酸(526mg，3.0mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中，加入20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿(363mg，1.0mmol)，隨后在30min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(379mg，3.0mmol)。在氮?dú)夥障聰嚢?2h后，混合物用水(2×50mL)處理，然后用二氯甲烷(3×100mL)萃取。合并的有機(jī)萃取物用水(50mL)、0.1M鹽酸(2×50mL)、0.1M飽和碳酸氫鈉水溶液和水(50mL)洗滌。溶液用硫酸鈉干燥并在減壓下濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)結(jié)晶(甲醇-氯仿(1∶9))后，獲得黃色粉末狀20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)-喜樹(shù)堿(354mg，68％收率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.10(s，1H)，8.79(s，1H)，8.03(d，J＝7Hz，1H)，7.85(t，J＝7Hz，1H)，7.79(d，J＝7Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.19(t，J＝6Hz，1H)，6.53(s，1H)，5.44(s，2H)，5.29(s，2H)，3.92(m，2H)，1.88(m，2H)，1.44(s，9H)，0.89(t，J＝7Hz，3H).
20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)喜樹(shù)堿(80mg，0.15mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，4mL)中的溶液在室溫?cái)嚢?h。在減壓下蒸發(fā)掉溶劑，然后固體進(jìn)行重結(jié)晶(二氯甲烷-二乙醚(3∶7，50mL)，結(jié)果獲得褐黃色粉末狀20(S)-9-甘氨酰氨基)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(78mg，82％收率)。
在攪拌下向20(S)-9-(甘氨酰氨基)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(78mg，0.15mmol)、聚(L-谷氨酸)(38kD，222mg)和N，N-二甲氨基吡啶(46mg，0.37mmol)在無(wú)水二甲基甲酰胺(5.5mL)中的懸浮液中，在20min內(nèi)加入1，3-二異丙基碳化二亞胺(17mg，0.14mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氬氣氛下攪拌2日后，混合物在冰浴中冷卻，然后在30min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(15mL)。再攪拌1h后，混合物通過(guò)加入1M鹽酸(1.5mL)酸化至pH2.5，然后過(guò)濾。固體用水(5×25mL)洗滌，并在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(3×50mL)洗滌，在真空下干燥，從而獲得褐黃色粉末狀PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)(255mg，92％質(zhì)量平衡)。在本例中，PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿重量加載百分?jǐn)?shù)是20％，按偶聯(lián)反應(yīng)中消耗的20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿的重量計(jì)。
實(shí)例17PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)二異丙基碳化二亞胺(0.36mg，2.3mmol)加入到20(S)-10-叔丁氧羰基氧基喜樹(shù)堿(350mg，0.77mmol)、N-叔丁氧羰基甘氨酸(403mg，2.3mmol)和4-二甲氨基吡啶(283mg，2.3mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中。攪拌20h后，混合物用氯仿(150mL)稀釋，并用1M鹽酸(2×100mL)洗滌，隨后用飽和碳酸氫鈉水溶液-水(1∶1，2×50mL)洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用1％甲醇-氯仿洗脫，結(jié)果獲得黃色粉末狀20-O-(N-叔丁氧羰基甘氨酰)-10-(叔丁氧羰基氧基)喜樹(shù)堿(250mg，52％收率)。
1H NMR(300MHz.CDCl3)8.34(s，1H)，8.23(d，J＝8Hz，1H)，7.74(d，J＝2Hz，1H)，7.67(dd，J＝8,2Hz，1H)，5.70(d，J＝17Hz，1H)，5.41(d，J＝17Hz，1H)，5.27(s，2H)，4.96(m，1H)，4.29-4.03(m，2H)，2.23(d.sex.，J＝31，6Hz，2H)，1.63(s，9H)，1.43(s，9H)，1.00(t，J＝6Hz，3H).
20-O-(N-叔丁氧羰基甘氨酰)-10-(叔丁氧羰基氧基)喜樹(shù)堿(250mg，0.4mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液與三氟乙酸(10mL)一起攪拌60min。在真空下濃縮后，殘余物溶解在甲醇(10mL)中。加入甲苯(50mL)，然后溶液在真空下濃縮。重復(fù)該程序兩遍，結(jié)果獲得20-O-甘氨酰-10-羥基-喜樹(shù)堿。前一步驟中合成的20-O-甘氨酰-10-羥基喜樹(shù)堿溶解在二甲基甲酰胺(5mL)中，并用N，N-二異丙基乙胺(0.2mL，1.1mmol)處理。該溶液被加入到聚(L-谷氨酸)(37.7kD，640mg)與二異丙基碳化二亞胺(0.1mL，0.64mmol)在二甲基甲酰胺(25mL)中的溶液中。攪拌18h后，混合物在冰浴中冷卻，并在劇烈攪拌下加入10％氯化鈉水溶液(75mL)。通過(guò)加入0.5M鹽酸酸化至pH1～2以后，讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，并攪?h。離心收集固體，并潷析除掉上清液。固體懸浮在水(200mL)中，再次重復(fù)離心后離析的程序。該洗滌過(guò)程再重復(fù)兩遍，固體在真空下干燥。固體在2％甲醇-氯仿(25mL)中的懸浮液用超聲波處理90min。重復(fù)該洗滌過(guò)程。然后，固體在真空下干燥，結(jié)果獲得黃色粉末狀PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)(663mg，83％質(zhì)量平衡)1H NMR(300MHz，d6-DMSO)7.1-8.5(多重寬信號(hào)，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.9(br s，C-18 CH3).
實(shí)例18PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)20(S)-7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN38)(333mg，0.85mmol)溶解在二甲基甲酰胺(6mL)與吡啶(2mL)的混合物中。加入二叔丁基二碳酸酯(294mg，1.35mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液，然后混合物在室溫?cái)嚢?9h?；旌衔镌谡婵障聺饪s，殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脫，結(jié)果獲得黃色粉末狀20(S)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜樹(shù)堿(337mg，80％收率)。
1H NMR(300MHz.CDCl3)δ8.24(d，J＝12Hz，1H)，7.88(d，J＝4Hz，1H)，7.63-7.70(m，2H)，5.75(d，J＝16Hz，1H)，5.31(d，J＝16Hz，1H)，5.27(s，2H)，3.28(q，J＝7Hz，2H)，1.90(sep.，J＝8Hz，2H)，1.61(s，9H)，1.43(t，J＝7Hz，3H)，1.08(t，J＝8Hz，3H).
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(192mg，1.0mmol)加入到10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜樹(shù)堿(150mg，0.30mmol)、N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(178mg，1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(137mg，1.1mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中。攪拌24h后，混合物用氯仿(75mL)稀釋并用1M鹽酸(2×50mL)，以及碳酸氫鈉飽和水溶液與水(1∶1，2×50mL)進(jìn)行洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮。殘余物利用色譜術(shù)在硅膠上提純，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脫，結(jié)果獲得黃色粉末狀20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜樹(shù)堿(41mg，20％收率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.27(d，J＝9Hz，1H)，7.90(d，J＝3Hz，1H)，7.68(dd，J＝9，3Hz，1H)，5.72(d，J＝17Hz，1H)，5.42(d，J＝17Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.96(m，1H)，4.29-4.03(m，2H)，3.17(q，J＝7Hz，2H)，2.23(d.sex.，J＝31,6Hz，2H)，1.63(s，9H)，1.48-1.38(m，12H)，1.00(t，J＝6Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜樹(shù)堿(40mg，0.06mmol)溶解在二氯甲烷(25mL)中，然后加入三氟乙酸(15mL)。攪拌1h后，混合物在真空下濃縮。殘余物溶解在甲醇(20mL)中，然后加入甲苯(20mL)。溶液在真空下濃縮。再重復(fù)該程序兩遍。獲得的固體溶解在二甲基甲酰胺(3mL)中并用N，N-二異丙基乙胺(0.03mL，0.17mmol)處理。該溶液加入到聚(L-谷氨酸)(168mL)和二異丙基碳化二亞胺(0.02mL，0.13mmol)在二甲基甲酰胺(6mL)中的溶液中。攪拌21h后，混合物在冰浴中冷卻，在劇烈攪拌下、在60min內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(30mL)?；旌衔飌H值通過(guò)加入0.5M鹽酸降低到1～2。讓混合物溫?zé)嶂潦覝?，并再攪?0min?；旌衔镫x心分離，并潷析除掉上清液。固體懸浮在水(75mL)中，并再次離心分離。再重復(fù)該程序兩遍，固體在真空下干燥24h。固體懸浮在氯仿-甲醇(92∶2，25mL)中，獲得的淤漿用超聲波處理90min?；旌衔镞^(guò)濾，并重復(fù)該程序。固體在真空下干燥，結(jié)果獲得黃色粉末狀PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)(112mg，54％質(zhì)量平衡)。1H NMR譜表明重量加載百分?jǐn)?shù)是12％。
1H NMR(300MHz.d-TFA)δ8.5-7.7(多重寬信號(hào)，Ar-H)，6.0-5.6(寬信號(hào)，C-17，C-5 CH2)，4.6(m，gly CH2)，3.5(m，7-乙基CH2)，1.6(br.t，7-乙基CH3)，0.9(br t，C-18 CH3).
實(shí)例19PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)向20(S)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-10-羥基喜樹(shù)堿(DB67；Bom等人，《J.Med.Chem.》433970～80(2000))(38mg，0.08mmol)在二氯甲烷(0.5mL)與吡啶(0.1mL，1.2mmol)的混合物中的溶液中，加入乙酐(0.04mL，0.42mmol)。攪拌20h后，反應(yīng)混合物在真空下濃縮。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脫，結(jié)果獲得黃色粉末狀10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜樹(shù)堿(29mg，70％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，1H，J＝10hz)，8.08(d，1H，J＝2Hz)，7.67(s，1H)，7.53(dd，1H，J＝10,2Hz)，5.75(d，1H，J＝15Hz)，5.34(s，2H)，5.30(d，1H，J＝15Hz)，2.39(s，3H)，1.88(hep，2H，J＝9Hz)，1.06(t，3H，J＝9H)，0.98(s，9H)，0.69(s，6H).
1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(35mg，0.18mmol)加入到10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜樹(shù)堿(30mg，0.058mmol)、N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(33mg，0.19mmol)和4-二甲氨基吡啶(16mg，0.13mmol)在二氯甲烷中的溶液中。攪拌20h后，混合物用二氯甲烷(25mL)稀釋，獲得的溶液用1M鹽酸(2×20mL)洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾后在真空下濃縮。殘余物用硅膠閃色譜提純，其中用1％甲醇-氯仿洗脫，結(jié)果獲得黃色粉末狀10-乙酰氧基-20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜樹(shù)堿(24mg，61％收率)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，1H，J＝10hz)，8.11(d，1H，J＝2Hz)，7.56(dd，1H，J＝10,2Hz)，7.22(s，1H)，5.68(d，1H，J＝15Hz)，5.40(d，1H，J＝15Hz)，5.29(s，2H)，4.95(brs，1H)，4.27-4.00(m，2H)，2.40(s，3H)，2.36-2.13(m，2H)，1.43(s，9H)，1.01-0.95(m，12H)，0.70(s，6H).
向10-乙酰氧基-20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜樹(shù)堿(21mg，0.031mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入三氟乙酸(2.5mL)。攪拌90min后，混合物在真空下濃縮。殘余物溶解在甲醇-甲苯(1∶1，4mL)中。溶液在真空下濃縮。再重復(fù)該程序兩遍，結(jié)果獲得10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽，后者不經(jīng)進(jìn)一步提純直接用于下一步驟中。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.21-8.11(m，2H)，7.68-7.63(m，1H)，7.42(s，1H)，5.69-5.38(m，4H)，4.22(q，2H，J＝18Hz)，2.39(s，3H)，2.33-2.20(m，2H)，1.07(t，3H，J＝8Hz)，1.00(s，9H)，0.75(s，6H).
4-二甲氨基吡啶(12mg，0.098mmol)和二異丙基碳化二亞胺(0.37mL 0.1M在二甲基甲酰胺中的溶液)順序地加入到10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-20-O-(甘氨酰)喜樹(shù)堿三氟乙酸鹽(0.03mmol)和聚(L-谷氨酸)(64mg)在二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液中。攪拌20h后，混合物在冰浴中冷卻，然后在30min時(shí)間內(nèi)加入10％氯化鈉水溶液(20mL)?；旌衔锏膒H值通過(guò)緩慢加入0.1M鹽酸降低到2。離心收集沉淀。固體懸浮在水(10mL)中，并再次離心后離析。再重復(fù)兩遍該程序，然后固體在真空下干燥。隨后，固體懸浮在5％甲醇-氯仿(10mL)中并用超聲波處理90min。將混合物過(guò)濾，收集到的固體在真空下干燥，結(jié)果獲得淺黃色固體PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)(69mg，84％質(zhì)量平衡)。1H的積分表明，重量加載百分?jǐn)?shù)是15％。
1HNMR(300MHz，CF3CO2D)δ8.71(br s CPT Ar-H)，8.17(s，CPT Ar-H)，7.99-7.91(m，CPT Ar-H)，6.00-5.58(m，CPT內(nèi)酯，C5-CH2-)，5.00-4.77(m，PGα-CH)，3.84(s，Gly CH2)，2.78-2.59(m，PG-CH2-)，2.38-2.05(m，PG-CH2-)，1.30(br s，CPT-CH2CH3)，1.12(br s，CPT(CH3)3CSi(CH3)2)，0.88(br s，CPT(CH3)3CSi(CH3)2).
實(shí)例20活體內(nèi)生物活性A.喜樹(shù)堿結(jié)合物首先，采用單一IP注射在攜帶皮下B16黑瘤的C57BL/6小鼠中試驗(yàn)PG-CPT結(jié)合物的最大耐受劑量(MTD)和相對(duì)療效。盡管B16黑瘤對(duì)20(S)-喜樹(shù)堿僅有微弱響應(yīng)，但是之所以采用此種模型來(lái)考察各種不同化合物以做出初步療效評(píng)估，是因?yàn)槠渲噩F(xiàn)性好及其在短時(shí)間內(nèi)便可評(píng)估化合物的能力。腫瘤是通過(guò)皮下注射在補(bǔ)充了2％FBS的0.2mL體積PBS(磷酸緩沖鹽水)中的1.0×105鼠科黑瘤細(xì)胞(B16-FO；ATTCCRL-6322)而生長(zhǎng)在右肩胛間隙區(qū)域的肌肉中的。試驗(yàn)化合物和載體對(duì)照樣在腫瘤細(xì)胞移植后7或8日，當(dāng)腫瘤已長(zhǎng)到5±1mm3時(shí)給藥的(每20g體重0.5mL)。喜樹(shù)堿結(jié)合物通過(guò)在45℃、超聲波處理45～60min溶解在0.1M磷酸氫鈉溶液中。天然喜樹(shù)堿溶解在8.3％CremophorEL/8.3％乙醇在0.75％鹽水中的混合物中。所有注射都通過(guò)腹腔內(nèi)(IP)進(jìn)行。每一個(gè)治療組由10只隨機(jī)分派到每個(gè)組的小鼠組成。腫瘤體積按照公式(長(zhǎng)×寬×高)/2計(jì)算。腫瘤等于或大于2000mm3的小鼠則通過(guò)頸椎脫位使之安樂(lè)死。試驗(yàn)化合物的腫瘤療效，通過(guò)計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)延緩(TGD)來(lái)確定治療組中腫瘤達(dá)到某一固定體積以天數(shù)表示的平均時(shí)間減去對(duì)照組中腫瘤達(dá)到同樣體積的平均時(shí)間。為確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，做了未配對(duì)Student的t-試驗(yàn)。以各種不同濃度對(duì)化合物進(jìn)行了試驗(yàn)，以確定它們的MTD。MTD是最大耐受當(dāng)量喜樹(shù)堿劑量。PG-20(S)-喜樹(shù)堿結(jié)合物的MTD，據(jù)發(fā)現(xiàn)，比游離20(S)-喜樹(shù)堿大約高出兩倍，因此允許較高劑量的喜樹(shù)堿給藥，從而產(chǎn)生提高的抗腫瘤療效。對(duì)于直接偶聯(lián)的20(S)-喜樹(shù)堿，即PG-CPT來(lái)說(shuō)，最大加載為約14％(20(S)-喜樹(shù)堿重量/結(jié)合物總重量)。甘氨酸連接基(PG-甘氨酰-CPT)允許加載高達(dá)39％，和提高的水中溶解度。
B.采用動(dòng)物模型的各種PG-喜樹(shù)堿結(jié)合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響總的來(lái)說(shuō)，據(jù)發(fā)現(xiàn)，20(S)-喜樹(shù)堿的PG-甘氨酸結(jié)合物優(yōu)于采用其他連接基制備的PG-CPT結(jié)合物(生理學(xué)上，即，療效和毒性和/或就水介質(zhì)中溶解度而言，以及容易合成和在PG主鏈上能夠加載的喜樹(shù)堿數(shù)量)，而與由下列組成的PG-甘氨酰-結(jié)合物大致相同20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿、20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿、20(S)-7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿(SN38)和20(S)-10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜樹(shù)堿(10-O乙酰DB 67)。支持這一論斷的數(shù)據(jù)總括在下文中。
在某些實(shí)驗(yàn)中，PG結(jié)合物與未結(jié)合的20(S)-喜樹(shù)堿或市售供應(yīng)的托泊替堪做了比較。在所有情況下，PG-結(jié)合物都顯示出比游離藥物好的抗腫瘤效果。
另外，在其他兩種腫瘤模型(MCA-4乳腺癌和OCA-1卵巢癌)中的單劑量效果研究表明，PG-CPT，無(wú)論是直接偶聯(lián)還是利用甘氨酸連接基，都具有在其MTD劑量水平比天然20(S)-喜樹(shù)堿提高的療效，而且，PG-結(jié)合物的MTD為天然CPT的MTD的TMD約2倍。除了上面提到的模型之外，還使用了一種其他同基因模型，即，LL/2路易斯肺(ATTCCRL-1642)和使用2種異種模型，即，人體NC1-H460肺癌(ATTCHTB-177)模型和HT-29人體直腸癌(ATTC HTB-38)。在這些異種模型中，替代有免疫能力的C57BL/6小鼠，采用一種免疫受損的ncr nu/nu小鼠。除了為產(chǎn)生腫瘤而植入的腫瘤細(xì)胞數(shù)目之外，試驗(yàn)規(guī)定和程序與B-16/FO模型的一樣。
除了甘氨酸之外，總共使用了6種連接基來(lái)制造20(S)-喜樹(shù)堿的PG-結(jié)合物。在所有的結(jié)合物中，PG取自同一批并具有50kD的平均MW(分子量)。在許多實(shí)驗(yàn)中采用B-16模型試驗(yàn)了不同的結(jié)合物，并與PG-甘氨酰-CPT做了比較。首先，已證明甘氨酸結(jié)合物在所有3種試驗(yàn)的20(S)-喜樹(shù)堿濃度下都比2-羥基乙酸(乙醇酸)結(jié)合物療效明顯。其次證明，甘氨酸結(jié)合物在B-16模型中比采用谷氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸制備的結(jié)合物都明顯。
這些結(jié)合物的加載量從β-丙氨酸連接的20(S)-喜樹(shù)堿的22％到甘氨酸連接的20(S)-喜樹(shù)堿的37％不等。另一種做了評(píng)估并與甘氨酸比較的連接基是4-羥基丁酸。這兩種結(jié)合物具有同樣的20(S)-喜樹(shù)堿加載量(35％)并在一系列試驗(yàn)中采用B-16/FO、LL/2和HT-29模型做了比較。結(jié)果表明，甘氨酸結(jié)合物的療效等于或高于4-羥基丁酸結(jié)合物。另外，4-羥基丁酸結(jié)合物較難合成，水中溶解度比甘氨酸結(jié)合物低且可能具有不可心的效應(yīng)。
在一系列實(shí)驗(yàn)中利用HT-29和NC1-H460模型做了研究了連接基長(zhǎng)度的影響。比較了由甘氨酸(例如，PG-甘氨酰-CPT)、甘氨酰-甘氨酰(二聚體)(例如，PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT)或甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰(三聚體)(例如，PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT)作為連接基連接相等數(shù)量20(S)喜樹(shù)堿(加載量)組成的結(jié)合物的療效。有關(guān)這方面的基本原理是，(理論上)連接基越長(zhǎng)，所形成的PG-CPT結(jié)合物就越穩(wěn)定。似乎，在相同％20(S)-喜樹(shù)堿加載量和等當(dāng)量的20(S)-喜樹(shù)堿濃度條件下，含三聚體的結(jié)合物效果比單體和含二聚體的結(jié)合物(顯示相同效果)更有效。然而，在相同20(S)-喜樹(shù)堿當(dāng)量濃度下，含三聚體的結(jié)合物毒性比單-甘氨酸結(jié)合物大。另外，含二聚體-和三聚體結(jié)合物的合成比甘氨酸結(jié)合物更費(fèi)時(shí)，且含三聚體結(jié)合物的水中溶解度顯著低于單-甘氨酸結(jié)合物的溶解度。能夠決定結(jié)合物療效和毒性的重要參數(shù)尤其是，PG的平均分子量和％20(S)-喜樹(shù)堿加載量。采用B-16和HT-29模型已證明，PG-甘氨酰-CPT結(jié)合物，當(dāng)采用50kD的PG時(shí)要比采用74kD或33kD的PG制備的更有效。因此決定，僅著重研究50kD PG-甘氨酰-結(jié)合物，并研究改變20(S)-喜樹(shù)堿加載量對(duì)抗腫瘤效果的影響。在采用HT-29結(jié)腸癌的初步試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用35％加載量明顯比25％、20％或15％加載量的結(jié)合物更有效，其間小鼠接受相同數(shù)量20(S)-喜樹(shù)堿當(dāng)量。將加載量從35％增加到37％和39％，進(jìn)一步增加在HT-29，同樣也在NC1-H460模型中的療效。加載量增加到47％，并未產(chǎn)生更好的療效；事實(shí)上，其療效比35％加載量的材料低。結(jié)合物的水中溶解度在35％～39％之間呈下降趨勢(shì)，該較高的加載量材料最難溶解。
一種采用HT-29模型的實(shí)驗(yàn)顯示，一種50kD PG-甘氨酰-CPT的腹腔內(nèi)(ip)單劑量的療效按如下投藥可進(jìn)一步提高給小鼠4次服用，每次間隔一周，總共累積喜樹(shù)堿劑量為單劑量的3倍。這樣的服藥方法小鼠耐受情況非常好。理想的PG-甘氨酰-CPT結(jié)合物由平均分子量50kD(按粘度測(cè)定)的PG、(單)甘氨酸作為連接基以及35～37％20(S)-喜樹(shù)堿組成。在雄性ncr nu/nu小鼠中的MTD是40mg/kg20(S)-喜樹(shù)堿當(dāng)量并且是游離20(S)-喜樹(shù)堿的MTD的約2倍。
C.其他人類腫瘤模型研究了GP-甘氨酰-CPT(33kD，37％加載量)對(duì)在雌性裸鼠(無(wú)胸腺)皮下接種的NC1-H322(ATTC CRL-5806)人類肺癌的抗腫瘤活性。該藥物是，當(dāng)腫瘤尺寸長(zhǎng)到7～8mm直徑時(shí)，在第9、13、17和21日以40mg/kg的20(S)-喜樹(shù)堿當(dāng)量劑量靜脈注射的。TGD是40日。具有7～8mm皮下NC1-H460人類非小細(xì)胞肺癌異種移植物的雌性裸鼠在第1、5、9和13日以每次注射40mg/kg20(S)-喜樹(shù)堿的劑量用PG-甘氨酰-CPT進(jìn)行治療。該40毫克當(dāng)量20(S)-喜樹(shù)堿/kg每第4日×4的試驗(yàn)劑量超過(guò)MTD一些。盡管沒(méi)有死的，但比開(kāi)始體重減輕了約20％。該P(yáng)G-甘氨酰-CPT進(jìn)行治療的小鼠，其絕對(duì)腫瘤生長(zhǎng)延緩(規(guī)定為，腫瘤從8mm長(zhǎng)到12mm在進(jìn)行治療與對(duì)照組之間相差的天數(shù))是43天。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，按相同方案(腹腔內(nèi))試驗(yàn)了直接結(jié)合的PG-CPT，也產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的生長(zhǎng)延緩，且沒(méi)有顯著毒性。
PG-甘氨酰-CPT也在皮下接種了1.5×106個(gè)細(xì)胞/個(gè)老鼠的NC1-H1299(ATTC CRL-5803)人類肺癌細(xì)胞的雌性裸鼠中進(jìn)行了試驗(yàn)。鑒于在此前的裸鼠實(shí)驗(yàn)中以40毫克當(dāng)量20(S)-喜樹(shù)堿/kg的劑量給藥導(dǎo)致體重過(guò)分減輕，故劑量減少到30毫克當(dāng)量20(S)-喜樹(shù)堿/kg，按每4日一次共4次。該劑量的耐受情況很好，觀察到TGD為32日。
D.10-羥基喜樹(shù)堿結(jié)合物20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿的PG-結(jié)合物在B16模型中進(jìn)行了初步研究。該研究中，活性最大的結(jié)合物是直接結(jié)合的或通過(guò)20-羥基基團(tuán)連接的甘氨酸結(jié)合的材料。在初步試驗(yàn)中，直接偶聯(lián)的材料PG-(10-OAc-CPT)似乎在50毫克當(dāng)量20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿/kg的劑量時(shí)的活性比GP-甘氨酰-(10-O-CPT)更大。然而，該劑量低于這兩種化合物的MTD，而且PG-(10-OAc-CPT)溶液非常粘稠，該化合物在約30min后便從溶液中沉淀出來(lái)，這就使其實(shí)際上無(wú)法使用。
在50毫克當(dāng)量20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿/kg的劑量時(shí)，PG-(10-OAc-CPT)產(chǎn)生5.3天的TGD(p＜0.01，與對(duì)照例相比)。有趣的是，PG-(10-OH-CPT)的MTD介于10～50毫克當(dāng)量20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿/kg。然而，即便在50mg/kg這樣的毒性劑量，其療效也不如PG-(10-OAc-CPT)或PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)那樣高。
有趣地注意到，在采用B-16/FO模型的直接比較中，50kD PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)結(jié)合物的效果，在相同加載百分?jǐn)?shù)和SN38濃度條件下，是PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)的大約兩倍。當(dāng)我們采用H-29模型比較PG-甘氨酰-CPT與PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)時(shí)也觀察到同樣的情況。總之，據(jù)發(fā)現(xiàn)，PG-20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿結(jié)合物和10-羥基喜樹(shù)堿衍生物或(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)的PG結(jié)合物，不如PG-甘氨酰-20(S)喜樹(shù)堿結(jié)合物那樣有效、耐受性好或容易溶解在水溶液中，不論它們直接連接或甘氨酸連接，或者連接在不同部位。
E.9-氨基喜樹(shù)堿結(jié)合物研究表明，PG-9-NH-CPT具有活性并且MTD超過(guò)25毫克當(dāng)量20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿/kg。然而卻發(fā)現(xiàn)，20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿結(jié)合物不如PG-甘氨酰-20(S)喜樹(shù)堿結(jié)合物那樣有效、耐受性好或容易溶解在水溶液中，不論它們直接連接或甘氨酸連接，或通過(guò)酯鍵或酰胺鍵連接，或者連接在不同部位。
F.總結(jié)和數(shù)據(jù)比較在與PG-甘氨酰-20(S)-CPT結(jié)合物的直接比較中，不論由20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿制備的PG-結(jié)合物抑或由20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿制備的那些，都不如PG-甘氨酰-CPT結(jié)合物那樣有效、耐受性好和容易溶解在水溶液中，不論它們直接連接或甘氨酸連接或者通過(guò)酯鍵或酰胺鍵連接，或者連接在不同部位。
雖然已結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，在不偏離本發(fā)明真諦和范圍的前提下尚可做出各種各樣改變，和等價(jià)替代。另外，為使具體情況、材料、物料組成、方法、一個(gè)或多個(gè)工藝步驟適應(yīng)本發(fā)明目標(biāo)實(shí)質(zhì)和范圍，可做出多種修改。所有這些修改都應(yīng)包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文援引的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物一律全文收作參考。
表2

其中R4＝H

表3

譯注gly＝甘氨酰
權(quán)利要求
1.一種組合物，它包含一種聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物，其通式為 其中PG是聚谷氨酸聚合物；X是單鍵、氨基?；B接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羥基酰基連接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；喜樹(shù)堿是20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物；m是5～65的正整數(shù)；喜樹(shù)堿-X通過(guò)酯或酰胺鍵共價(jià)連接到所述聚合物的羧基基團(tuán)上；n是1～10的整數(shù)；以及p是1～10的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中X是單鍵。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中X是氨基?；B接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羥基?；B接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；n是1～10的整數(shù)；以及p是1～10的整數(shù)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約5000～約100,000。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約20,000～約80,000。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約25,000～約60,000。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述喜樹(shù)堿類似物選自20(S)-喜樹(shù)堿、20(S)-托泊替堪、20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿、20(S)-9-硝基喜樹(shù)堿、20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿、SN-38、20(S)-10，11-亞甲二氧基喜樹(shù)堿、lurtotecan、伊立替康、DX-8951F或DB 67。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述喜樹(shù)堿類似物選自20(S)-喜樹(shù)堿、20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿、20(S)-9-硝基喜樹(shù)堿、20(S)-7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿、20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿或20(S)-10-乙酰氧基喜樹(shù)堿。
9.權(quán)利要求2的組合物，其中所述聚谷氨酸喜樹(shù)堿結(jié)合物具有如下通式 且所述喜樹(shù)堿選自(a)20(S)-喜樹(shù)堿，其中R1、R2、R3和R4各自是氫；(b)20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿，其中R1是-NH2，且R2、R3和R4各自是氫；(c)20(S)-9-硝基喜樹(shù)堿，其中R1是-NO2，且R2、R3和R4各自是氫；(d)20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿，其中R1、R3和R4各自是氫，且R2是-OH；或者(e)20(S)-10-乙酰氧基喜樹(shù)堿，其中R1、R3和R4各自是氫，且R2是-O-C(O)-CH3。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約25,000～約60,000。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述喜樹(shù)堿是20(S)-喜樹(shù)堿，且所述20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約16wt％。
12.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚谷氨酸喜樹(shù)堿結(jié)合物選自通式III、通式IV或通式V 其中Y是N或O。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約30,000～約60,000。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約16wt％。
15.權(quán)利要求3的組合物，其中所述聚谷氨酸喜樹(shù)堿結(jié)合物結(jié)構(gòu)選自通式VI或通式VII 其中Y是N或O；R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；R1是-NH2或H；R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；R3是-H或烷基；以及R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中R’是H。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約30,000～約60,000。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約50wt％。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約15％～約38wt％。
20.一種包含PG-甘氨酰-CPT、PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)或GP-甘氨酰-(9-NH-CPT)的組合物，其中所述PG的分子量介于約25,000～約60,000，且所述20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約50wt％。
21.一種制備包含具有下列通式的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的組合物的方法， 其中PG是聚谷氨酸聚合物；X是單鍵、氨基?；B接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羥基?；B接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；喜樹(shù)堿是20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物；m是5～65的正整數(shù)；喜樹(shù)堿-X通過(guò)酯或酰胺鍵共價(jià)連接到所述聚合物的羧基基團(tuán)上；n是1～10的整數(shù)；以及p是1～10的整數(shù)，其中所述方法包括(a)提供MW(分子量)介于約25,000～約60,000道爾頓，按粘度測(cè)定，的聚谷氨酸聚合物，以及20(S)-喜樹(shù)堿以便結(jié)合在其上；以及(b)在足以使每摩爾聚合物連接至少5摩爾20(S)-喜樹(shù)堿的條件下使所述20(S)-喜樹(shù)堿共價(jià)地連接到所述聚谷氨酸聚合物上，從而生成所述聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述20(S)-喜樹(shù)堿選自20(S)-9-氨基喜樹(shù)堿、20(S)-10-羥基喜樹(shù)堿或20(S)-喜樹(shù)堿。
23.權(quán)利要求22的方法，其中20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約16wt％。
24.一種制備包含聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的組合物的方法，包括(a)提供質(zhì)子化形式的聚谷氨酸聚合物和20(S)-喜樹(shù)堿或生物活性20(S)-喜樹(shù)堿類似物以便結(jié)合在其上；(b)使所述聚谷氨酸聚合物與所述20(S)-喜樹(shù)堿在惰性有機(jī)溶劑中、在雙(20-氧代-3-噁唑烷基)次磷酸存在下，在足以生成聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的條件下起反應(yīng)；以及(c)通過(guò)加入過(guò)量體積的鹽水溶液使所述聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物從溶液中沉淀出來(lái)。
25.權(quán)利要求24的方法，進(jìn)一步包括(d)洗滌所述沉淀以除掉未反應(yīng)的20(S)-喜樹(shù)堿。
26.權(quán)利要求24的方法，其中用碘化氯甲基吡啶鎓代替步驟(b)中的雙(20-氧代-3-噁唑烷基)次磷酸。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述聚谷氨酸聚合物的MW介于約25,000～約60,000道爾頓，按粘度測(cè)定。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述20(S)-喜樹(shù)堿占結(jié)合物重量的約10％～約16wt％。
29.一種藥物組合物，它包含抗腫瘤和/或抗白血病有效量的權(quán)利要求1、11或14中任何一項(xiàng)的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物或其可藥用鹽以及可藥用載體和/或稀釋劑。
30.一種藥物組合物，它包含抗腫瘤和/或抗白血病有效量的權(quán)利要求20的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物或其可藥用鹽以及可藥用載體和/或稀釋劑。
31.一種治療白血病或固體腫瘤的方法，包括對(duì)需要此種治療的患者施用權(quán)利要求30的藥物組合物，從而實(shí)現(xiàn)所述白血病或所述固體腫瘤的治療。
32.一種包含按權(quán)利要求21～28之一的方法制備的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的組合物。
33.一種包含具有通式III、通式IV或通式V的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的組合物 其中PG是聚谷氨酸聚合物；Y是N或O；R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；n是1～10的整數(shù)；以及p是1～10的整數(shù)，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約30,000～約60,000。
34.一種包含具有通式VI或通式VII的聚谷氨酸-喜樹(shù)堿結(jié)合物的組合物 其中Y是N或O；R’是天然存在的氨基酸的側(cè)鏈；R1是-NH2或H；R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；R3是-H或烷基；以及R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于約30,000～約60,000。
全文摘要
本發(fā)明提供聚谷氨酸－治療劑結(jié)合物及其制備方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C08G69/48GK1429121SQ01809441
公開(kāi)日2003年7月9日 申請(qǐng)日期2001年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月17日
發(fā)明者R·巴特, P·德弗里斯, J·P·克萊恩, R·A·路易斯, J·W·辛格, J·圖林斯基 申請(qǐng)人:細(xì)胞治療公司