專利名稱：牛膝多糖衍生物、制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖免疫調(diào)節(jié)劑及其制備方法和用途，特別是牛膝多糖衍生物類免疫調(diào)節(jié)劑。
牛膝多糖的分子末端為一個(gè)α-D-批喃葡萄糖，后面接2→6連接或2→1連接的β-D-呋喃果糖，牛膝多糖的ESI質(zhì)譜顯示其包括四糖～二十一糖，以六糖～十五糖為主。牛膝多糖具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的作用。
近年來(lái)，多糖衍生物的抗病毒作用已引起國(guó)內(nèi)外藥物學(xué)家和病毒學(xué)家的極大興趣。例如，不少含有硫酸酯、磷酸酯的多糖具有獨(dú)特的生物活性。如β-(1→3)-D-葡聚糖磷酸化后，活性大大提高；羥乙基化的茯苓聚糖顯示了較好的抗腫瘤活性，但高取代的羥乙基化茯苓聚糖卻無(wú)抗腫瘤活性[Chem.Pharm.Bull.，1989，37，1838]。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖磷酸化和羥烷基化的研究不多，且取代度不高，這極不利于對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)于功能關(guān)系的研究。本發(fā)明對(duì)牛膝多糖進(jìn)行了磷酸化及羥炕基化。
本發(fā)明對(duì)牛膝多糖進(jìn)行了衍生化，包括磷酸酯化或羥烷基化，制得了牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖。 寡糖和多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性給寡糖和多糖的結(jié)構(gòu)分析帶來(lái)了極大的困難。本發(fā)明的牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖據(jù)分析其取代度、糖數(shù)具有如右所示結(jié)構(gòu)右式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q=2～19。尤以下述結(jié)構(gòu)為主 其中牛膝多糖磷酸酯(鹽)的13C-NMR圖譜數(shù)據(jù)例如果糖呋喃環(huán)上的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ63.3～63.6、106.0～107.0、79.4～80.9、77.5～78.4或83.0～84.1、65.0～66.2ppm，葡萄糖吡喃環(huán)上的碳的化學(xué)位移數(shù)據(jù)δ95.5、74.1、75.5、82.8、74.6、63.0ppm。牛膝多糖磷酸酯(鹽)的紅外圖譜的數(shù)據(jù)例如3700～3000cm-1的強(qiáng)寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收，2950～2870cm-1為C-H鍵伸縮振動(dòng)，1266cm-1為P＝O鍵振動(dòng)，950～1050cm-1為P-O-C不對(duì)稱振動(dòng)，1000～1100cm-1為C-O-C醚鍵不對(duì)稱伸縮振動(dòng)。對(duì)牛膝多糖磷酸酯(鹽)產(chǎn)物中的磷含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得其取代度在0.1～2左右，其計(jì)算公式如下D.S.＝(162*P)/(3100-124*P)。其中D.S.為取代度，P為磷的百分含量。例如

其中羥乙基牛膝多糖的13CNMR(D2O)譜例如果糖呋喃環(huán)上的異頭碳的化學(xué)位移δ105.9～107.0；葡萄糖吡喃環(huán)上的異頭碳的化學(xué)位移δ95.2；羥乙基上的1位亞甲基的化學(xué)位移δ74.5、74.9、75.4，2位亞甲基的化學(xué)位移δ63.1、63.2、63.3、63.4。羥乙基牛膝多糖的IR(KBr)譜例如3370cm-1的強(qiáng)寬峰為分子間及分子內(nèi)羥基吸收，2950、2900cm-1為C-H伸縮，羥乙基化后該吸收峰比母體有所增強(qiáng)，1457cm-1為亞甲基的剪式振動(dòng)，1357cm-1為C-H的非平面搖擺振動(dòng)，1150～1000cm-1強(qiáng)寬峰為糖環(huán)上醚鍵C-O-C不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和鍵伸縮振動(dòng)的疊加，937cm-1為呋喃環(huán)伸縮振動(dòng)。892cm-1為-CH2-CH2-的平面搖擺振動(dòng)。羥乙基牛膝多糖的元素分析例如C，42.87％；H，6.82％。
本發(fā)明的牛膝多糖衍生物可通過(guò)如下方法合成在0～100℃下，用磷酸化試劑或羥烷基化試劑，在有機(jī)溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖，所述的羥烷基化試劑是分子式為(CH2)kO的環(huán)氧烷或分子式為X(CH2)kOH的取代烷烴，所述的磷酸化試劑是三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸、五氧化二磷等，所述的牛膝多糖與磷酸化試劑或羥烷基化試劑的摩爾比為1∶1～9。推薦的反應(yīng)時(shí)間為0.5～72小時(shí)。其中通過(guò)改變反應(yīng)溶劑、反應(yīng)試劑的量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度，可生成不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖。反應(yīng)后將反應(yīng)溶液中和，再經(jīng)分離純化得純品。其中羥烷基牛膝多糖的制備方法推薦在堿性水溶液中，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作為羥烷基化試劑，與牛膝多糖反應(yīng)，生成羥烷基牛膝多糖。所述的X＝Cl、Br、I，所述的k＝2～4。其中牛膝多糖磷酸酯(鹽)的制備方法推薦在0～50℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸或五氧化二磷為磷酸化試劑，在有機(jī)溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，生成牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所述的有機(jī)溶劑是乙腈、吡啶、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷-5-烯(DBN)、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯(DBU)或四氫呋喃等；所述的堿性水溶液是無(wú)機(jī)堿的水溶液或無(wú)機(jī)堿和無(wú)機(jī)鹽的混合水溶液，所述的無(wú)機(jī)堿如NaOH、KOH等，例如NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液，推薦的NaOH的水溶液的濃度為1％～30％，推薦的NaCl的水溶液的濃度為0～30％。
經(jīng)生物活性試驗(yàn)，研究結(jié)果顯示牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖具有較好的抑制Lewis肺癌和S-180肺癌的效果，并能提高小鼠NK細(xì)胞活性，具有增強(qiáng)免疫活性的作用。
本發(fā)明用簡(jiǎn)便的合成方法，制備了牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖，大大提高了衍生物的取代度，克服了以往其它多糖取代度低困難。本發(fā)明的牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖有利于構(gòu)效關(guān)系的研究，且具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫力的作用，適于工業(yè)化。
圖4是羥乙基牛膝多糖的13C-NMR圖譜。
圖5是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的紅外光譜圖。樣品掃描數(shù)32；背景掃描數(shù)32。
圖6是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的13C-NMR圖譜。
圖7是牛膝多糖磷酸酯(鹽)的31P譜圖8是牛膝多糖(AbPS)的質(zhì)譜總圖。
實(shí)施例2取5ml二甲亞砜，加入300mg牛膝多糖攪拌溶解，攪拌下滴加1ml三氯氧磷，加入吡啶使pH在中性左右。在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)2小時(shí)后，傾入冰水中，用氫氧化鈉中和，丙酮沉淀，離心，將沉淀溶解、透析、冰凍干燥，再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所得產(chǎn)物磷酸根的取代度為0.8，具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫活性。
實(shí)施例3取10ml乙腈加入2ml吡啶，在冰水浴下滴加2ml三氯氧磷，滴加0.3ml雙蒸水，攪拌，將500mg牛膝多糖溶于8ml磷酸三甲酯中，在加入上述反應(yīng)液中，加入吡啶使pH在7左右。在冰水浴下攪拌反應(yīng)5小時(shí)后，用氫氧化鈉調(diào)pH至中性。丙酮沉淀，離心，將沉淀溶解、透析、冰凍干燥，再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。所得產(chǎn)物磷酸根的取代度為1.5，具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫活性。
實(shí)施例4取20ml吡啶，加入1.3g P2O5，攪拌，加入幾滴蒸餾水，加入經(jīng)充分?jǐn)嚢璧呐Ｏザ嗵沁拎ひ海浦?00℃油浴中，加熱反應(yīng)1hr后，傾入冰水中，2N NaOH中和。丙酮沉淀，溶解，透析，濃縮，冰凍干燥。再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
實(shí)施例5稱260mg三聚磷酸鈉溶于水，調(diào)pH至12，加入牛膝多糖250mg。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4hr。2N HCl中和，丙酮沉淀，溶解，透析，濃縮，冰凍干燥。再經(jīng)A-50和G-50柱層析純化，即得牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
實(shí)施例6牛膝多糖500mg溶于1％～30％氫氧化鈉與0％～30％氯化鈉的混合溶液中，在冰浴中加入環(huán)氧乙烷0.5ml，加完后，0～50℃反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用1M鹽酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，離心，透析，冷凍干燥，Sephadex G-25柱層析純化。
實(shí)施例7牛膝多糖500mg溶于20％氫氧化鈉與3％氯化鈉的混合溶液中，在冰浴中加入環(huán)氧乙烷1.0ml，加完后，35℃反應(yīng)12小時(shí)。然后，再次在冰浴中加入環(huán)氧乙烷1.0ml，35℃反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用1M鹽酸中和至pH＝7，丙酮沉淀，離心，透析，冷凍干燥，Sephadex G-25柱層析純化。
實(shí)施例8 牛膝多糖磷酸酯(鹽)的生物活性研究我們對(duì)不同取代度的牛膝多糖磷酸酯(鹽)送檢生物活性測(cè)定，其結(jié)果如下1、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對(duì)小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗(yàn)

*表示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比p＜0.012、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對(duì)小鼠S-180肉癌(腋皮下接種)的試驗(yàn)結(jié)果

*表示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比p＜0.013、牛膝多糖磷酸酯(鹽)對(duì)荷Lewis肺癌小鼠NK活性的影響

#為(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞OD均值)-效應(yīng)細(xì)胞OD均值*表示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比p＜0.0權(quán)利要求
1.一種牛膝多糖衍生物，其特征是包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖，所述的牛膝多糖磷酸酯(鹽)或羥烷基牛膝多糖具有如下結(jié)構(gòu) 式中R＝H、PO3Na2或(CH2)kOH，其中k＝2～4，a，b，c，d，o，p，q＝2～19，a+b+c+d+o+p+q＝2～19。
2.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是具有如下結(jié)構(gòu) 式中m、n＝2～19，m+n＝2～19，R如權(quán)利要求1所述。
3.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征是所述的PO3Na2取代度在0.1～2左右。
4.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是包括如下步驟(1)或步驟(2)(1)在0～100℃下，用(CH2)kO或X(CH2)kOH作為羥烷基化試劑，所述的k＝2～4，所述的X＝Cl、Br、I，在堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，其中牛膝多糖與羥烷基化試劑的摩爾比為1∶1～9，生成羥烷基牛膝多糖；(2)在0～100℃下，用三氯氧磷、二聚磷酸鈉、多聚磷酸或五氧化二磷為磷酸化試劑，在有機(jī)溶劑或堿性水溶液中與牛膝多糖反應(yīng)，其中牛膝多糖與磷酸化試劑的摩爾比為1∶1～9，生成牛膝多糖磷酸酯(鹽)。
5.如權(quán)利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑是乙腈、吡啶、二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷-5-烯、1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯或四氫呋喃。
6.如權(quán)利要求4所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的堿性水溶液是無(wú)機(jī)堿的水溶液或無(wú)機(jī)堿和無(wú)機(jī)鹽的混合水溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的牛膝多糖衍生物的制備方法，其特征是所述的無(wú)機(jī)堿的水溶液或無(wú)機(jī)堿和無(wú)機(jī)鹽的混合水溶液是NaOH的水溶液或NaOH、NaCl的混合水溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的牛膝多糖衍生物，其特征在于所述的牛膝多糖衍生物具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及牛膝多糖衍生物包括牛膝多糖磷酸酯(鹽)及羥烷基牛膝多糖，其是用磷酸化試劑或羥烷基化試劑，在相應(yīng)條件下與牛膝多糖生成不同取代度的牛膝多糖衍生物，這一系列不同取代度的牛膝多糖衍生物經(jīng)生物活性試驗(yàn)表明，具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能的作用。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1397565SQ0211098
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者田庚元, 陳曉明, 張健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 浙江京新藥業(yè)股份有限公司