專利名稱：在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基材表面改性方法，特別是一種在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法。
殼聚糖以其獨有的生物活性、生物相容性、良好的粘合性、較強(qiáng)的成纖和成膜能力及特殊的吸附性能在水處理方面也有很重要的應(yīng)用價值。它可用于染料廢水的脫色、飲用水的凈化、重金屬離子的回收、硬水軟化、糖蜜及果汁的澄清、工業(yè)廢水處理、氨基酸蛋白質(zhì)的分離和回收等。另外其在氣相色譜分離金屬離子方面的應(yīng)用也很廣泛。殼聚糖在電分析化學(xué)中可用來測定Au、Pb、Pt、Pd、Ag、Cu。
由于殼聚糖無毒，具有生物相容性等優(yōu)良的生物學(xué)性能，制成膜后，無色透明，具有較好的物理機(jī)械性能，穩(wěn)定的化學(xué)性能。豐富的氨基，可以與酶共價偶聯(lián)，殼聚糖已被廣泛地用于固定化酶及生物傳感器。以殼聚糖固定化酶，可采用簡單的吸附法、凝膠包埋法、戊二醛交聯(lián)法等等。為使酶通過化學(xué)鍵與殼聚糖結(jié)合，戊二醛是最常用的交聯(lián)劑。不過Krajewska等用戊二醛的方法將尿激酶固定于殼聚糖膜上，這種方法很容易使殼聚糖膜變黃、變硬、變脆，膜很容易破碎，不易制備敏感膜。
近年來殼聚糖在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用研究越來越受到人們的關(guān)注。殼聚糖在水溶液中呈現(xiàn)陽離子性質(zhì)和高電荷密度，這是其被廣泛應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域的重要原因。因為帶正電荷的殼聚糖表面與帶負(fù)電荷的細(xì)胞易產(chǎn)生靜電引力，這有利于細(xì)胞的粘附。而且，高電荷密度使殼聚糖與許多水溶性陰離子聚合物形成不溶的聚電解質(zhì)配合物。例如，殼聚糖可與陰離子糖胺聚糖(GAGs)和藻酸鈉以及合成聚陰離子如聚丙烯酸形成離子配合物(PEC)。由于殼聚糖電荷密度具有PH依賴性，當(dāng)將這些PEC移至生理PH環(huán)境導(dǎo)致部分固定的聚陰離子解離。這一性質(zhì)可用于原位負(fù)載生物活性聚陰離子如GAGs和DNA。例如，從殼聚糖-肝素PEC中釋放出的肝素可以促進(jìn)移植物附近炎癥細(xì)胞釋放生長因子，從PEC中釋放出的DNA能保護(hù)核酸酶降解所生成的質(zhì)粒，同時有利于與細(xì)胞膜有關(guān)的細(xì)胞遷移。殼聚糖具有許多生物活性已被眾多實驗所證實。例如，殼聚糖齊聚物具有對巨噬細(xì)胞刺激的效果，這與其含有N-乙酰葡聚胺組分密切相關(guān)。殼聚糖及甲殼素都具有體內(nèi)外嗜中性粒細(xì)胞趨化效應(yīng)。許多研究考察了殼聚糖及其衍生物支架對組織的反應(yīng)，總的來說，這些材料引起的異體反應(yīng)小，幾乎觀察不到纖維膠囊，形成的是正常的粒狀組織，加快血管生成，呈現(xiàn)典型的治愈過程，短時期內(nèi)(小于7天)，嗜中性粒細(xì)胞明顯在移植物附近堆積，但又迅速分散，慢性炎癥反應(yīng)不會擴(kuò)展。上面提到的殼聚糖及殼聚糖中的組分對免疫細(xì)胞的刺激作用，會引發(fā)原位細(xì)胞遷移，最終使得支架材料與組織鰲合。有關(guān)殼聚糖與哺乳動物細(xì)胞相互作用已見報道，涉及的細(xì)胞包括成骨細(xì)胞、成纖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角膜細(xì)胞以及腎上腺細(xì)胞等。從組織修復(fù)和再生的角度來說，大多數(shù)情況下殼聚糖在與細(xì)胞的相互作用時，材料引起的異體反應(yīng)少。Popowicz等報道上皮細(xì)胞可在殼聚糖膜上生長，成纖維細(xì)胞可在膠原與殼聚糖復(fù)合膜上生長，引入殼聚糖可增加細(xì)胞粘附但會抑制細(xì)胞的生長。聚乙烯醇(PVA)與殼聚糖共混形成的高彈性水凝膠，當(dāng)殼聚糖的組分超過15wt％時，L929細(xì)胞在水凝膠上的貼壁率隨殼聚糖含量增加而增加，當(dāng)組分達(dá)到40wt％時，細(xì)胞的粘附與生長超過膠原；PVA/殼聚糖的復(fù)合膜比PVA膜更合適于細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)更易于鋪展，細(xì)胞更易于粘附與生長。更重要的是殼聚糖鏈的吡喃環(huán)上含有活性的羥基和氨基，它們能進(jìn)行衍生化反應(yīng)，結(jié)果不但能賦予殼聚糖特殊的生物活性，而且能夠調(diào)節(jié)殼聚糖的力學(xué)性質(zhì)。例如，通過殼聚糖分子中的伯胺，對其進(jìn)行側(cè)基離子改性，使殼聚糖晶體結(jié)構(gòu)受到破壞，非晶態(tài)部分增加，溶解性得以提高，力學(xué)性能得以調(diào)節(jié)。當(dāng)然，特定的性質(zhì)依賴于側(cè)基的性質(zhì)，如碳原子大于5的N-烷基化衍生物溶解性會降低，在溶液中易于形成膠束。在殼聚糖表面所衍生的基團(tuán)上固定生物活性分子，賦予其生物特性的報道較多，如多孔性的殼聚糖-羥基磷酸鈣復(fù)合固定抗生素，緩慢釋放的藥物能預(yù)防骨髓炎；殼聚糖-GAG配合物固定菌落細(xì)胞分泌的生長因子，可抑制平滑肌細(xì)胞生長；殼聚糖海綿支架固定血小板衍生生長因子(PDGF-BB)，緩慢釋放出生長因子能夠誘發(fā)或刺激骨形成。此外，殼聚糖硫?；苌飳ぞ厶堑年栯x子、止血、高PH值不溶解性質(zhì)相應(yīng)地逆轉(zhuǎn)成陰離子、搞凝血性及水溶的特性。殼聚糖可以衍生的基團(tuán)多不甚舉。殼聚糖易于發(fā)生衍生化反應(yīng)為拓寬其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用提供了無限的潛力。以上列舉的殼聚糖性質(zhì)決定了其在組織工程材料領(lǐng)域獨特的應(yīng)用價值，而眾所周知，材料表面化學(xué)對其組織的生物相容性至關(guān)重要。因此，生物相容性很好的殼聚糖廣泛地被人們用以修飾基材表面。在基材表面固定殼聚糖目前通常采用的方法是表面預(yù)涂法及表面截留法。表面預(yù)涂法存在涂層的穩(wěn)定性及長久性較差，而且殼聚糖預(yù)涂的效果明顯依賴于基材表面的性質(zhì)；而表面截留法同樣存在涂層的穩(wěn)定性差及截留量受限制的缺陷。這兩種表面固定方法都缺乏化學(xué)鍵合，而用Methyl4-azidobenzoimidate(MABI)hydrochloride來錨固殼聚糖與基材，因為合成原料難得，合成工藝復(fù)雜，制備周期長，所以難以進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
2、技術(shù)方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法，其特征在于該方法首先是將疊氮基團(tuán)鍵合在殼聚糖上；然后用含疊氮基殼聚糖溶液澆鑄在基材上，使之形成含疊氮苯基團(tuán)的殼聚糖涂層；將上述涂層在紫外燈照射下，使疊氮基團(tuán)光解為碳烯；碳烯與基材發(fā)生插入反應(yīng)，同時使殼聚糖鏈交聯(lián)，結(jié)果使殼聚糖鍵合在基材表面。所述的含疊氮基殼聚糖溶液的制備方法是將殼聚糖粉未、雙環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)以及4-疊氮苯甲酸加入到有機(jī)溶劑中，然后室溫攪拌，過濾，用甲醇或二氯甲烷充分洗滌，過濾，干燥即得含疊氮基殼聚糖，然后將其溶解在稀醋酸和乙二醇單甲醚的混合溶劑中，以形成疊氮基殼聚糖溶液。本發(fā)明選用的光敏雜-雙官能交聯(lián)劑如4-疊氮苯甲酸，它的酸基與殼聚糖中的氨基通過相互作用，可形成含0.5％～0.6％摩爾含量的疊氮基團(tuán)的殼聚糖。含疊氮基殼聚糖涂層在紫外燈照射下，疊氮基團(tuán)光解為碳烯，活潑的碳稀可以與基材發(fā)生插入反應(yīng)，同時也能使殼聚糖本體交聯(lián)，結(jié)果通過光敏雜-雙官能交聯(lián)劑將殼聚糖鍵合在基材表面。 3、有益效果4-疊氮苯甲酸在一定條件下(加脫水劑，室溫，反應(yīng)8小時)可以與殼聚糖中的氨基相互作用生成酰胺鍵，從而將紫外光敏疊氮基團(tuán)引入到殼聚糖中。由于反應(yīng)可在非均相中進(jìn)行，所以產(chǎn)物易分離。而且4-疊氮苯甲酸很容易制備，價格低廉。改性的殼聚糖溶液，只要先預(yù)涂在基材表面，涼干以后，紫外光照即可將殼聚糖鍵合在基材表面。本發(fā)明可操作性特別強(qiáng)，對基材是否具有活性基團(tuán)沒有特殊要求，既可在玻碳電極上鍵合殼聚糖來固定酶及生物大分子制備成生物傳感器，也可以制備球狀樹脂用于水處理劑；更特出的應(yīng)用是這種方法可以用來修飾生物材料，從而賦予生物材料特殊的生物活性，同時也可以進(jìn)一步固定其它生物大分子。
圖2是Az-CS粉末的傅利葉紅外譜圖(FTIR)。
圖3、圖4是聚乳酸(PLA)和PLA/CS的全反射紅外譜圖(ATR-FTIR)。
圖5、圖6是空白PU片和PU/CS/Hp的掃描電鏡照片(SEM)。
圖7是修飾玻碳電極的循環(huán)-伏安圖，其中1-CS修飾，2-CS/DNA修飾。
1、在聚乳酸膜表面共價鍵合殼聚糖的方法將殼聚糖固定在聚乳酸(PLA)膜表面，將0.1％的Az-CS溶液澆鑄在PLA膜表面，在棕色干燥器中涼干，膜距離8W的紫外燈10cm，光照10min，然后將膜順序用5％的醋酸、0.05NaOH溶液和水洗滌，最后真空干燥。
2、在聚氨酯表面共價鍵合殼聚糖的方法將殼聚糖固定在聚氨酯(PU)表面(固定方法同1)，然后將肝素(Hp)以離子配合物固定在殼聚糖修飾的PU片表面形成PU/CS/Hp表面，然后按照血小板粘附實驗來檢驗PU表面改性前后的抗凝血性能。
3、在玻碳電極表面共價鍵合殼聚糖的方法將殼聚糖按1的方法固定在玻碳電極表面，然后將DNA以離子配合物固定在殼聚糖修飾的玻碳電極表面。
4、表征

圖1中272.6nm的吸收是Az-CS分子中疊氮基團(tuán)的特征吸收，與4-疊氮苯甲酸中疊氮基團(tuán)的特征吸收(268.4nm)相比，吸收峰明顯向高波長移動，這是由于疊氮基團(tuán)的環(huán)境變化所造成的。
由圖2可見，與殼聚糖的FTIR譜圖相比，Az-CS的譜圖中明顯增加了2127cm-1，這是疊氮基團(tuán)的特征紅外吸收。圖1、圖2說明通過生成酰胺鍵疊氮基團(tuán)已鍵合在CS分子上。
由圖3、圖4可見，與PLA譜圖相比，在PLA/CS譜圖上，明顯增加了3363和1594cm-1處的特征吸收，這說明殼聚糖已固定在PLA膜的表面。
圖5、圖6表明，與全血充分接觸后，未經(jīng)改性的空白PU片，粘附較多的血小板，而經(jīng)修飾過的表面，觀察不到任何血小板的痕跡。這充分說明肝素已通過殼聚糖以離子配合物固定在PU表面，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的抗凝血涂層。
圖7(掃描范圍-0.2～0.6V，掃描速率100V/s，Co(phen)33+的濃度4×10-4mol/L，pH7.04，底液Tris-KCl-NaCL)表明，與CS相比，CS/DNA修飾過的玻碳電極具有較大的峰電流，即表現(xiàn)出更好的電極可逆性，這說明DNA已通過CS鍵合層固定在玻碳電極表面。
以上列舉了用本方法使CS化學(xué)鍵合在三種不同的基材(PLA，PU以及玻碳電極)上，附圖表明，該方法的有效性。
權(quán)利要求
1.一種在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法，其特征在于該方法是(1)將疊氮基團(tuán)鍵合在殼聚糖上；(2)用含疊氮基殼聚糖溶液澆鑄在基材上，使之形成含疊氮基團(tuán)的殼聚糖涂層；(3)將上述涂層在紫外燈照射下，使疊氮基團(tuán)光解為碳烯；(4)碳烯與基材發(fā)生插入反應(yīng)，同時使殼聚糖鏈交聯(lián)，結(jié)果使殼聚糖鍵合在基材表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法，其特征在于所述的含疊氮基殼聚糖溶液的制備方法是將殼聚糖粉未、雙環(huán)已基碳酰亞胺(DCC)以及4-疊氮苯甲酸加入到有機(jī)溶劑中，然后室溫攪拌，過濾，用甲醇或二氯甲烷充分洗滌，過濾，干燥即得疊氮基殼聚糖，然后將其溶解在稀醋酸和乙二醇單甲醚的混合溶劑中，以形成疊氮基殼聚糖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在基材表面共價鍵合殼聚糖的方法,其方法是:將疊氮基團(tuán)鍵合在殼聚糖上;用含疊氮基殼聚糖溶液澆鑄在基材上,形成含疊氮基團(tuán)的殼聚糖涂層;在紫外燈照射下,疊氮基團(tuán)光解為碳烯;碳烯與基材發(fā)生插入反應(yīng),使殼聚糖鏈交聯(lián),結(jié)果使殼聚糖鍵合在基材表面。含疊氮基殼聚糖溶液的制法是將殼聚糖粉末、雙環(huán)已基碳酰亞胺、4－疊氮苯甲酸加入到有機(jī)溶劑中,然后攪拌,過濾,用甲醇或二氯甲烷洗滌,過濾,干燥即得疊氮基殼聚糖,然后將其溶解在稀醋酸和乙二醇單甲醚的混合溶劑中即可。該方法的優(yōu)點是改性的殼聚糖溶液,只要先預(yù)涂在基材表面,晾干后,紫外光照即可將殼聚糖鍵合在基材表面,操作性強(qiáng),對基材是否具有活性基團(tuán)沒有要求。
文檔編號C08L5/00GK1358783SQ02112539
公開日2002年7月17日 申請日期2002年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月15日
發(fā)明者沈健, 朱愛萍, 林思聰 申請人:南京南大表面和界面化學(xué)工程技術(shù)研究中心有限責(zé)任公司