專利名稱：生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球及其反相懸浮聚合制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于材料科學(xué)與工程和生物分離工程領(lǐng)域，更確切的說是涉及一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球及其反相懸浮聚合制備方法。
背景技術(shù)：
分子識(shí)別和識(shí)別專一性是整個(gè)生物學(xué)普遍存在和特有的特點(diǎn)，在生物進(jìn)化中起著特殊而重要的作用。模板印跡就是基于對(duì)生物學(xué)的仿生，采用人工方法制備對(duì)特定分子(模板分子或印跡分子)具有識(shí)別專一性的聚合物的技術(shù)。近來，以該技術(shù)制備的分子印跡聚合物(MIPs)已在分離提純、免疫分析、模擬酶以及生物傳感器等方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景，成為新世紀(jì)最具潛力的新材料之一。
目前，盡管模板印跡技術(shù)已在許多領(lǐng)域，諸如相似化合物的分離、抗體結(jié)合模擬、酶模擬、生物模擬傳感器等很多方面得到了廣泛而深入的研究，但模板分子的選擇主要集中在小分子上。由于生物大分子的分子量大并具有生物活性而易變性，因此，其印跡與識(shí)別都是十分困難的，研究的廣度和深度也遠(yuǎn)不如小分子。
目前，生物大分子模板印跡方法主要有包埋法(Hjerten SJ，Liao JL，Nakazato K，Wang Y，Zamaratskaia G，Zhang H-X.Gels mimicking antibodiesin their selective recognition of protein，Chromatography，1997，44227-234)、微球表面印跡法(Glad M，Narrlow O，Sellergren B，Siegbahn N，Mosbach K.Use of silane monomers for molecular imprinting and enzymeentrapment in polysiloxane-coated porous silica，J Chromatogr，1985，34711-23)、平板表面印跡法(Shi H，Tsai W-B，F(xiàn)errari S，Ratner BD.Template imprinted nanostructural surfaces for protein，Narure，1999，398593-597.)和抗原決定簇法(Rachkov A，Minoura N.Towards molecularlyimprinted polymers selective to peptides and protein.The epitopeapproach，Biochimica et Biophysica Acta，2001，1544255-266)等。包埋法制備過程簡單，但后處理過程煩瑣，須經(jīng)模板分子的洗脫、研磨、篩分等過程才能完成；微球表面印跡法是一種比較有前途的印跡方法，但由于其不含磁性組分無法用磁場進(jìn)行簡單和方便的分離，只適合用做色譜的固定相而進(jìn)行靜態(tài)分離；平板表面印跡法只能得到片材(或膜材)，只能用于醫(yī)學(xué)上的診斷和監(jiān)測；抗原決定簇法同樣不含磁性組分無法用磁場進(jìn)行簡單和方便的分離，且只適用于暴露的片斷結(jié)構(gòu)非常清楚的生物大分子的印跡及暴露的片斷結(jié)構(gòu)完全不同的生物大分子的分離。另外，以上幾種現(xiàn)有方法得到的印跡聚合物皆為剛性的聚合物，對(duì)于非剛性、體積龐大的模板生物大分子從印跡聚合物上洗脫和識(shí)別過程中模板生物大分子重新進(jìn)入“結(jié)合孔穴”顯然是不利和困難的。
當(dāng)在聚合物微球內(nèi)部埋入磁響應(yīng)性材料，如鐵、鈷、鎳或其氧化物時(shí)，復(fù)合微球則具有在外加磁場作用下簡便、快速的磁分離特性(C Bor Fuh，S Y Chen.Magnetic split-flow thin fractionationnew technique for separation ofmagnetically susceptible particles，Journal of Chromatography A，1998，813313-324)。當(dāng)在模板印跡聚合物中埋入磁響應(yīng)性材料后，便可在其完成對(duì)模板分子的“主動(dòng)”吸附與識(shí)別后在外加磁場作用下很容易將其分離出來。
采用反相懸浮聚合可以直接制備凝膠微球。但現(xiàn)有技術(shù)制備的凝膠微球由于未經(jīng)印跡無法進(jìn)行精確的分離，并由于不含磁性組分無法用磁場進(jìn)行簡單和方便的動(dòng)態(tài)分離，只能進(jìn)行靜態(tài)分離(D Wistuba，V Schurig.Enantiomerseparation of chiral pharmaceuticals by capillary electrochromatography，Journal of Chromatography A，2000，875255-276)；若進(jìn)行動(dòng)態(tài)分離，則需經(jīng)離心等過程分離掉模板印跡聚合物微球，操作過程煩瑣、復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在通過反相懸浮聚合法將模板印跡技術(shù)與磁敏感性相結(jié)合，制備出非剛性的生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球(簡稱模板印跡凝膠復(fù)合微球)，并賦予其一定的磁響應(yīng)性，使制得的模板印跡凝膠復(fù)合微球在其完成對(duì)模板生物大分子的“主動(dòng)”吸附與專一性識(shí)別后在外加磁場作用下很容易將其分離出來，達(dá)到主動(dòng)識(shí)別和方便分離的目的。
本發(fā)明需要解決金屬(或其氧化物)粉末與聚合物的相容性問題，實(shí)現(xiàn)聚合物凝膠對(duì)無機(jī)物的包埋，從而賦予凝膠復(fù)合微球一定的磁響應(yīng)性，并同時(shí)完成對(duì)模板生物大分子的印跡過程，使模板印跡凝膠復(fù)合微球?qū)δ０迳锎蠓肿泳哂袑Ｒ蛔R(shí)別性能，達(dá)到特定分離的目的。
本發(fā)明需要解決模板印跡凝膠復(fù)合微球的有限溶脹問題，以確保在生物大分子的印跡和識(shí)別過程中印跡孔穴的形狀和大小相對(duì)穩(wěn)定。
本發(fā)明需要保證模板印跡過程中生物大分子的生物活性不改變。
本發(fā)明需要選擇適合于反相懸浮聚合的分散劑，以確保表面印跡凝膠復(fù)合微球的種球和其自身的形成與穩(wěn)定。
本發(fā)明根據(jù)模板印跡技術(shù)的原理，以不同的生物大分子做為模板分子，不同的金屬(或其氧化物)做為磁性組分，不同的高分子穩(wěn)定劑為分散劑，采用反相懸浮聚合法制得對(duì)模板生物大分子具有專一識(shí)別性能并具有“動(dòng)態(tài)”特性的網(wǎng)狀多孔生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球。
所制得的生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，是在生物大分子模板印跡凝膠微球中復(fù)合有磁性響應(yīng)材料，在凝膠磁性復(fù)合微球表面是網(wǎng)狀多孔的。
本發(fā)明具體方法包括以下步驟1)模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將非極性有機(jī)溶劑加入帶有攪拌器、通氣管的反應(yīng)器中，加入分散劑，攪拌使之溶解。將丙烯酰胺(AM)、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)和模板生物大分子加入水中，溶解后加入經(jīng)研磨的磁性粉末，攪拌分散均勻后加入反應(yīng)器中，繼續(xù)攪拌；將氧化劑和還原劑溶于水中后滴加到反應(yīng)器中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)0.5～4h。反應(yīng)結(jié)束后，濾除有機(jī)溶劑部分，得到模板印跡凝膠復(fù)合微球；2)生物大分子的洗脫將所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。
然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡2～24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于40～90℃用真空烘箱干燥至恒重。
其中非極性有機(jī)溶劑為苯、甲苯、煤油、汽油、環(huán)己烷、溶劑油；分散劑為甲基纖維素、乙基纖維素；模板生物大分子為蛋白質(zhì)、多肽、核酸、細(xì)胞；磁性材料為Fe、Co、Ni或其氧化物、合金；氧化劑為過硫酸鉀、過硫酸鈉、過硫酸銨；還原劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉；本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于1.將磁敏感性(磁響應(yīng)性)與模板印跡技術(shù)相結(jié)合制備出生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子準(zhǔn)確、快速的分離目的。
2.丙烯酰胺與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物與金屬(或其氧化物)粉末具有良好的相容性，具有包覆容易、制備方便等特點(diǎn)。
3.丙烯酰胺與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚條件溫和，能夠保持生物大分子的生物活性而不變性。
4.所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球因其對(duì)生物大分子的識(shí)別主要靠模板生物大分子與“結(jié)合孔穴”在大小和形狀上的相互吻合，故該印跡凝膠復(fù)合微球可分離分子量相同但形狀(空間結(jié)構(gòu))不同的生物大分子，也可分離形狀相同(或相近)但分子量不同的生物大分子。
5.所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球，因其“結(jié)合孔穴”可根據(jù)環(huán)境的改變而變化，即具有刺激響應(yīng)性，使得模板生物大分子洗脫較為容易。
本發(fā)明的模板印跡凝膠復(fù)合微球結(jié)合了模板印跡聚合物精確的專一性識(shí)別特性和磁性復(fù)合微球方便的外磁場分離特性雙重功能，將在生物分離領(lǐng)域，特別是生物大分子，如蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞的分離等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，并使以往煩瑣的分離過程(如高速離心等)大大簡化?，F(xiàn)有用于生物分離工程領(lǐng)域的模板印跡聚合物微球由于不含磁性組分無法用磁場進(jìn)行簡單和方便的分離，且皆為剛性聚合物，對(duì)于非剛性、體積龐大的模板生物大分子從印跡聚合物上的洗脫和識(shí)別過程中模板生物大分子重新進(jìn)入“結(jié)合孔穴”都是不利和困難的；而現(xiàn)有的磁性復(fù)合微球由于未經(jīng)生物分子印跡不具有生物識(shí)別專一性，不能實(shí)現(xiàn)精確的分離。
本發(fā)明所選擇的丙烯酰胺與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物與金屬(或其氧化物)粉末具有良好的相容性，具有包覆容易、制備方便等特點(diǎn)，且制備條件溫和，能夠保持生物大分子的生物活性而不變性。
本發(fā)明所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球可分離分子量相同但形狀(空間結(jié)構(gòu))不同的生物大分子，也可分離形狀相同(或相近)但分子量不同的生物大分子，適用范圍較廣。
本發(fā)明所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球，因其“結(jié)合孔穴”可根據(jù)環(huán)境的改變而變化，即具有刺激響應(yīng)性，使得模板生物大分子洗脫較為容易。
本發(fā)明所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球在水溶液中表面具有規(guī)整的網(wǎng)狀孔穴，增加了微球比表面積和吸附容量，增加了生物大分子在微球內(nèi)的傳質(zhì)速率。


圖1實(shí)施例1所制得的網(wǎng)狀多孔生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球的單個(gè)粒子的ESEM照片(濕態(tài)，平均粒徑約300μm)圖2實(shí)施例1所制得的模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球的SEM照片(干態(tài)，平均粒徑約240μm，F(xiàn)e3O4含量1.86％)
具體實(shí)施例方式
1、牛血清白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將100ml甲苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g乙基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0330g牛血清白蛋白(BSA)加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe3O4粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬酰胤磻?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到BSA模板印跡凝膠復(fù)合微球。
2、牛血清白蛋白的洗脫將所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，是在牛血清白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe3O4磁性材料，F(xiàn)e3O4含量為1.86％，孔徑約為4μm，分別以溶菌酶和卵白蛋白為對(duì)比分子，其對(duì)牛血清白蛋白的分離因子分別為4.17和3.95。
1、溶菌酶模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將100ml甲苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g乙基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0144g溶菌酶加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe3O4粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到溶菌酶模板印跡凝膠復(fù)合微球。
2、溶菌酶的洗脫將所制備的凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，是在溶菌酶模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe3O4磁性材料，F(xiàn)e3O4含量為1.96％，孔徑約為3μm，分別以牛血清白蛋白和卵白蛋白為對(duì)比分子，對(duì)溶菌酶的分離因子分別為5.14和4.67。
1、卵白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將100ml苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g甲基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0215g卵白蛋白加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe2O3粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到卵白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球。
2、卵白蛋白的洗脫將所制備的凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
所制得的生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，是在卵白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe2O3磁性材料，F(xiàn)e2O3含量為2.85％，u徑約為3μm，分別以牛血清白蛋白和溶菌酶為對(duì)比分子，對(duì)卵白蛋白的分離因子分別為3.86和3.58。
權(quán)利要求
1.一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，其特征是在生物大分子模板印跡凝膠微球中復(fù)合有磁性響應(yīng)材料，在凝膠磁性復(fù)合微球表面是網(wǎng)狀多孔的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，其特征是在牛血清白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe3O4磁性材料，F(xiàn)e3O4含量為1.86％，孔徑約為4μm，分別以溶菌酶和卵白蛋白為對(duì)比分子，其對(duì)牛血清白蛋白的分離因子分別為4.17和3.95。
3.如權(quán)利要求1所述的一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，其特征是在溶菌酶模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe3O4磁性材料，F(xiàn)e3O4含量為1.96％，孔徑約為3μm，分別以牛血清白蛋白和卵白蛋白為對(duì)比分子，對(duì)溶菌酶的分離因子分別為5.14和4.67。
4.如權(quán)利要求1所述的一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球，其特征是在卵白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球中復(fù)合有Fe2O3磁性材料，F(xiàn)e2O3含量為2.85％，孔徑約為3μm，分別以牛血清白蛋白和溶菌酶為對(duì)比分子，對(duì)卵白蛋白的分離因子分別為3.86和3.58。
5.一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球的反相懸浮聚合制備方法，包括以下步驟1)模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將非極性有機(jī)溶劑加入帶有攪拌器、通氣管的反應(yīng)器中，加入分散劑，攪拌使之溶解。將丙烯酰胺(AM)、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)和模板生物大分子加入水中，溶解后加入經(jīng)研磨的磁性粉末，攪拌分散均勻后加入反應(yīng)器中，繼續(xù)攪拌；將氧化劑和還原劑溶于水中后滴加到反應(yīng)器中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)0.5～4h。反應(yīng)結(jié)束后，濾除有機(jī)溶劑部分，得到模板印跡凝膠復(fù)合微球；2)生物大分子的洗脫將所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡2～24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于40～90℃用真空烘箱干燥至恒重。
6.如權(quán)利要求5所述的一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球的反相懸浮聚合制備方法，其特征為所述的非極性有機(jī)溶劑為苯、甲苯、煤油、汽油、環(huán)己烷、溶劑油；分散劑為甲基纖維素、乙基纖維素；模板生物大分子為蛋白質(zhì)、多肽、核酸、細(xì)胞；磁性材料為Fe、Co、Ni或其氧化物、合金；氧化劑為過硫酸鉀、過硫酸鈉、過硫酸銨；還原劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉；
7.如權(quán)利要求5所述的一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球的反相懸浮聚合制備方法，包括以下步驟1)模板印跡凝膠復(fù)合微球的制備將100ml甲苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g乙基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0330g牛血清白蛋白(BSA)加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe3O4粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到BSA模板印跡凝膠復(fù)合微球。2)生物大分子的洗脫將所制備的模板印跡凝膠復(fù)合微球用丙酮沖洗后，用蒸餾水反復(fù)沖洗。然后用乙酸和十二烷基硫酸鈉的水溶液浸泡，浸泡24h后濾去溶液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，然后于80℃用真空烘箱干燥至恒重。
8.如權(quán)利要求7所述的一種分子印跡聚合物磁性復(fù)合微球的懸浮聚合制備方法，其特征是所述的步驟1)為將100ml甲苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g乙基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0144g溶菌酶加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe3O4粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬?，常溫反?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到溶菌酶模板印跡凝膠復(fù)合微球。
9.如權(quán)利要求7所述的一種分子印跡聚合物磁性復(fù)合微球的懸浮聚合制備方法，其特征是所述的步驟1)為將100ml苯加入帶有攪拌器、通氣管的250ml的三口燒瓶中，加入0.2g甲基纖維素，攪拌使之溶解。將9gAM、1g Bis和0.0215g卵白蛋白加入20ml水中，溶解后加入0.2g經(jīng)研磨的磁性Fe2O3粉末，攪拌分散均勻后加入三口燒瓶中，繼續(xù)攪拌；將0.1g過硫酸鉀和0.05g亞硫酸氫鈉溶于10ml水中后滴加到三口燒瓶中。通氮?dú)獬酰胤磻?yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用180目篩網(wǎng)濾除有機(jī)溶劑部分，得到卵白蛋白模板印跡凝膠復(fù)合微球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物大分子模板印跡凝膠磁性復(fù)合微球及其反相懸浮聚合制備方法。根據(jù)模板印跡(分子印跡)技術(shù)的原理，以不同的生物大分子做為模板分子，不同的金屬(或其氧化物)做為磁性組分，采用反相懸浮聚合法制得對(duì)模板生物大分子具有專一識(shí)別性能并具有“動(dòng)態(tài)”特性的網(wǎng)狀多孔生物大分子模板印跡聚合物凝膠磁性復(fù)合微球。該產(chǎn)品可用于生物大分子的分離，比以往的分離技術(shù)更加精確，并使以往的分離過程大大簡化。
文檔編號(hào)C08F2/44GK1390859SQ0212148
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月26日
發(fā)明者成國祥, 陸書來, 龐興收, 張立廣 申請(qǐng)人:天津大學(xué)